專利名稱：沙蒿AdZFP1轉錄因子基因及其在培育耐旱植物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從沙蒿中克隆了一個新的編碼區(qū)為1335bp的干旱相關的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因(AdZFP1)，及以轉基因技術利用其來提高植物抗旱性，研究其可能功能的方法。
背景技術：
干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要逆境因子，在許多地域是農業(yè)發(fā)展的一大障礙。干旱對農作物造成的損失在所有的非生物脅迫中居首位，僅次于生物脅迫病蟲害所造成的損失。利用基因工程技術改良植物的遺傳性狀，對于農業(yè)的發(fā)展具有深遠的意義。近年來的研究顯示，轉錄因子在植物對干旱、低溫和高鹽等脅迫條件下的信號傳導及基因表達調控中起著重要的作用，而且一個轉錄因子往往可以調控多個基因的表達(Chen et al，2002)。因此，在提高植物對環(huán)境脅迫抗性的分子育種中，與導入某個功能基因的常規(guī)方法相比，導入一個關鍵的轉錄因子基因，通過它促使多個功能基因發(fā)揮作用，獲得綜合改良效果，是提高植物抗逆性更為有效的途徑。
轉錄因子是具備調控DNA轉錄作用的DNA結合蛋白，通常含有能與DNA特異性結合的基元。目前研究表明有四類結構不同的DNA結合蛋白控制著DNA的轉錄螺旋-轉折-螺旋(HTH)、亮氨酸拉鏈(Leucine zipper)、鋅指蛋白(zinc finger)和β帶(β-ribbon)。鋅指蛋白是目前發(fā)現(xiàn)種類最多，在真核生物轉錄因子中最普遍存在的一類DNA結合基元。從酵母到人體，已在560多種蛋白中發(fā)現(xiàn)了4100多種不同的鋅指序列，它們對基因的表達調控起著重要作用(Henikoff，1997)。
在鋅指蛋白中，幾個保守的氨基(通常是Cys和His)與一個Zn2+結合，形成一個相對獨立的可以自我折疊的“手指狀”蛋白結構域。由于鋅指結構最早是從RNA聚合酶II和III的轉錄因子中發(fā)現(xiàn)的，所以一般認為，某個蛋白如果擁有一個或多個成簇的鋅指結構域，那么它很可能就是轉錄因子(朱玉賢，2002)。根據(jù)鋅指結構域中Cys和His殘基的數(shù)量和排列方式的不同；鋅指蛋白可分為C2H2、C3H、C2C2、C3HC4和C2HC5等五類(Li，1998)。目前研究得比較多的是C2H2型鋅指蛋白。1992年，Takatsuji從矮牽牛中克隆了ZPT21基因，是植物中克隆的第一個C2H2型鋅指蛋白基因，迄今，已經從擬南芥、矮牽牛、小麥、馬鈴薯、向日葵、豌豆等植物克隆了近30個C2H2型鋅指蛋白基因。研究表明某些C2H2型鋅指蛋白可能作為轉錄因子參與植物對逆境脅迫反應的調控(Takatsuji，1994)。
RING zinc finger是C3HC4型鋅指(即環(huán)指型鋅指)，于1991年首次被發(fā)現(xiàn)，其典型結構為Cys-X2-Cys-X(9-39)-Cys-X(1-3)-His-X(2-3)-Cys/His-X2-Cys-X(4-48)-Cys-X2-Cys，包括C3HC4和C3H2C3(RING-H2)兩種形式。與其他鋅指不同，該類鋅指呈雙向不對稱結構，每個鋅指單元由4個Cys或3個Cys和一個His分別結合兩個鋅原子。由于其結構的特殊性，對該類鋅指的研究倍受重視(RING被認為是Really Interesting New Gene的縮寫)。10余年間，已經在人類、動物、植物、真菌、病毒等生物體內發(fā)現(xiàn)了80多個環(huán)指型鋅指蛋白。研究表明，該類蛋白可能作為轉錄因子在基因轉錄調控和信號傳導中起重要作用(Freemont，1993；Saurin，1996)，它不僅僅作為核酸結合蛋白發(fā)揮作用，更重要的是它可能參與蛋白質與蛋白質之間的互作(Saurin，1996)。目前，植物中僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾個RING型鋅指蛋白，且大多數(shù)是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，其中COP1(constitutive photomorphogenic 1)是目前研究得相對最清楚的含RING鋅指基元的調控蛋白。在暗處COP1作為擬南芥光形態(tài)建成的阻遏物，但其突變型即使在暗處也能導致組成型光形態(tài)建成，突變型分析和轉基因實驗可以充分說明COP1蛋白在光特異性信號轉導途徑中作為光抑制阻遏物發(fā)揮作用(MeNellis，1996)。研究還表明，COP1蛋白還參與調控病原物侵染、低氧脅迫、發(fā)育進程的信號轉導途徑(Mayer，1996)。因此，COP1很可能作為核酸調節(jié)蛋白充當多種基因表達的阻遏物，以此調控生物體多種信號的轉導途徑(Takatsuji，1998)。擬南芥BRH1編碼C-端RING型鋅指蛋白，該基因的表達受病原物的誘導和油菜素類固醇的負調控(Molnar，2002)。最近研究表明，擬南芥的RIE1基因編碼RING型鋅指蛋白，該基因在種子發(fā)育過程中起著極為重要的作用(Ruqiang，2003)。
沙蒿是生長在我國西北沙漠地帶的一種菊科蒿屬植物，主要分布在寧夏、甘肅、陜西、新疆、內蒙古等省區(qū)的騰格里沙漠、毛烏素沙漠、巴丹吉林沙漠地區(qū)以及青海省等地，是一種良好的耐旱野生植物(白壽寧等2000)。沙蒿根系十分發(fā)達，是一種優(yōu)良的防風固沙先鋒植物。沙蒿膠是沙蒿籽種皮上的多糖類植物膠，遇水后膠質迅速溶脹，形成蛋清樣粘稠而滑膩的膠凝體。沙蒿膠化學性質十分穩(wěn)定，是一種有廣闊開發(fā)前景的天然植物膠。目前對于沙蒿的研究僅限于組培、化學成分分析及其食用價值等方面，而將其作為耐旱植物對其分子生物學方面的研究還少見報道，而有關從耐旱植物沙蒿中分離抗旱相關的RING型鋅指蛋白轉錄因子的研究在國內外尚未見報道。
本實驗采用mRNA差異顯示技術及RACE技術從沙蒿中獲得一個RING型鋅指蛋白轉錄因子基因，構建了該基因的植物表達載體，并在轉基因試驗系統(tǒng)中研究了該基因的功能，對于從分子水平上揭示沙蒿的耐旱機理，改良植物耐旱品質有很重要的作用。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個主要目的是為植物抗旱育種提供有價值的轉錄因子基因，通過該轉錄因子基因，調控轉基因植物中一系列干旱相關基因的表達，從而使植物的抗旱性能得到綜合的根本性改良，最終獲得抗(耐)旱能力明顯增強的優(yōu)良植物品種。
技術方案1從沙蒿中獲得新的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1(1)采用mRNA差異顯示技術分離RING型鋅指蛋白轉錄因子基因片段mRNA差異顯示技術是1992年由哈佛大學Liang Peng建立起來的一種用于檢測基因表達改變較簡捷而靈敏的方法，目前已廣泛應用于基因克隆等領域。本實驗即采用mRNA差異顯示技術從沙蒿中分離RING型鋅指蛋白轉錄因子基因片段。
(2)采用RACE技術獲得RING型鋅指蛋白轉錄因子基因全長cDNARACE技術是基于PCR的由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法，由Frohman在1988年首次報道(M.A.Frohman，1988)。近年來在全長cDNA基因的克隆方面有較多的應用。本實驗采用5′RACE技術獲得RING型鋅指蛋白轉錄因子基因5端未知序列。序列拼接后在兩端設計引物，再次RT-PCR獲得全長cDNA序列。
2.構建RING型鋅指蛋白轉錄因子基因的植物表達載體我們首先選用了啟動能力很強的、在雙子葉植物中最常用的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35s啟動子，將得到的沙蒿AdZFP1基因連于其后，構建成功雙元表達載體，采用農桿菌介導法轉化煙草。載體構建示意圖見圖4。
同時我們又將AdZFP1基因置于在單子葉中高效表達的Ubi啟動子驅動下，通過基因槍法導入廣泛應用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草等植物中。載體構建示意圖見圖5。
3.以煙草及草坪草為材料進行植物轉基因操作本發(fā)明以煙草及草坪草為轉化受體，導入RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1，以便進一步探討其可能的功能。
此外，還應該特別指出以下事項本發(fā)明利用我們所得到的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1，構建植物表達載體，但這并不意味著此基因只有這一個應用價值。使用本發(fā)明中的基因進行其他方面的應用均在本發(fā)明權利要求之內。
這里應特別指出的是，在本發(fā)明的一個實施方案中，我們選用煙草及草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麥草)作為轉基因植物材料。但這并不意味著本發(fā)明所構建的轉基因載體只能用于轉化煙草及草坪草(早熟禾、高羊茅、黑麥草)，還包括其它植物。使用含本發(fā)明中AdZFP1的正義及反義表達載體轉化其他植物材料，均在本發(fā)明的權利要求之內。因為本領域的技術人員可以利用本專利構建好的AdZFP1基因表達載體，利用本專利提供的植物遺傳轉化方法轉化其它植物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，AdZFP1基因被置于CaMV35s啟動子和nos polyA終止子的調控之下，再連至CAMBIA公司的雙元表達載體pCAMBIA3300，構成一個植物表達載體，用于雙子葉植物的轉化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了pCAMBIA3300之外，還可以選用CAMBIA公司的其它表達載體或者本領域技術人員所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表達載體，有關pCAMBIA3300載體的詳細信息可以在CAMBIA公司網站www.cambia.org.au中得到詳細說明。
在本發(fā)明的一個實施方案中，AdZFP1基因被置于Ubiquitin啟動子和nos polyA終止子的調控之下，再連至表達載體pAHC25，構成一個植物表達載體，用于單子葉植物的轉化。根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了pAHC25之外，還可以選用其它適合于單子葉植物的表達載體，或者本領域技術人員所熟悉的其它載體。有關pAHC25載體的詳細信息可以在www.defra.gov.uk網站中得到詳細說明。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，植物篩選所用的抗生素為除草劑，具體選用何種篩選要看選用植物表達載體所對應的標記基因。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農桿菌菌株為LBA4404。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，所選用的農桿菌菌株除了LBA4404外，還應包括農桿菌的其它菌株，如EHA101。這些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白區(qū)，能夠幫助轉入的植物表達載體中的T-DNA轉移到植物的基因組中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，植物表達載體導入農桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領域技術人員非常熟悉的技術操作，不是本發(fā)明的關鍵。通過PCR檢測陽性的農桿菌菌株，用于轉化煙草、草坪草等。本發(fā)明中對于靶植物的轉化方法不是關鍵，可以使用本領域技術人員所熟悉的各種不同的轉化技術將重組DNA序列導入待轉化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限于農桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本領域技術人員可以通過參考有關文獻獲得詳情。
本發(fā)明中用于將轉化細胞再生成植株的方法不是關鍵，可以使用任何對靶植物合適的方法。本領域技術人員可以通過參考有關文獻得到詳情。
有益效果1.得到一個新的來源于耐旱野生植物沙蒿的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1。
2.構建了該基因的植物表達載體，將此基因導入各類植物中，以提高植物的耐旱性。以煙草為例，將該基因轉入煙草后，在水分脅迫條件下，轉基因煙草表現(xiàn)出了明顯的耐旱特征(圖9，10，11，12)。在模擬干旱條件下，把轉基因煙草T1代種子置于含有15％PEG6000的濾紙中萌發(fā)，轉基因煙草的萌發(fā)速率明顯高于對照植株(

圖13)，說明AdZFP1基因在煙草中的表達不僅能夠提高轉基因煙草植株的耐旱性能，同時也能夠提高轉基因煙草種子在萌發(fā)過程中對干旱的抵抗能力。
附圖簡要說明圖1 由AdZFP1推測的氨基酸結構分析采用NCBI的Protein Conservation Domain analyse軟件分析，在AdZFP1蛋白質的C端，具有RING型鋅指結構域。
圖2 AdZFP1 RING鋅指結構域與其它鋅指蛋白RING結構域的序列比對由上至下分別為沙蒿AdZFP1，擬南芥AAC79588.1、AAN31869.1、NP_200582，菠蘿AAM28286.1，假絲酵母EAR98859.1，挪威鼠TM26_RAT，豬TM26_PIG，黑猩猩XP_518326.1和人RING TM26_HUMAN。
圖3 AdZFP1 RING鋅指結構域與其它鋅指蛋白RING結構域的系統(tǒng)數(shù)分析圖4 是植物表達載體p3300-AdZFP1構建流程的示圖。
圖5 是植物表達載體pAHC-AdZFP1構建流程的示圖。
圖6 AdZFP1基因轉化煙草的PCR檢測。
圖中擴增條帶大小為1.4kb，電泳帶從左到右編號依次為M，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。M表示分子標記Marker，1為正對照，2為負對照，3-12為不同轉基因株系。
圖7 AdZFP1基因轉化煙草的Southern檢測。
譜帶從左到右編號依次為1，2，3，4，5，6，7，8。1-7為不同轉基因株系，8為負對照。
圖8 AdZFP1基因轉化煙草的Northern檢測。
譜帶從左到右編號依次為1，2，3，4，5，6，7。1-6表示不同轉基因株系，7為負對照。
圖9 轉AdZFP1基因煙草單葉葉片的脫水處理實驗左邊葉片為對照煙草葉片，右邊為轉基因煙草葉片。
圖10 轉AdZFP1基因煙草整株耐旱性檢測(土壤含水量8％)左邊葉片為對照煙草葉片，右邊為轉基因煙草葉片。
圖11 轉AdZFP1基因的煙草在漸進的水分脅迫下的光合速率圖12 轉AdZFP1基因的煙草復水過程的光合速率檢測圖13 轉AdZFP1基因的煙草T1代種子在15％PEG處理時的萌發(fā)情況培養(yǎng)皿左半部分為對照煙草T1代種子，右半部分為轉AdZFP1基因的煙草。
實施方式實驗所涉及的藥品均購自Invitrogen，Promega公司，Takara公司，Sigma公司及上海生工公司。具體實驗操作依據(jù)《分子克隆》及相關文獻。
實施例1RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1的獲得1 RING型鋅指蛋白轉錄因子基因片段的獲得為獲得沙蒿中干旱脅迫下差異表達的序列標簽，我們采用了mRNA差異顯示(mRNAdifferent display)結合反向Northern(Reverse Northern blotting)的方法。分別抽取干旱誘導(失水約35％)及自然環(huán)境下生長未經干旱處理的沙蒿總RNA，定量后進行差異顯示，獲得可能差異表達的cDNA片段，用T7&M13引物重新擴增cDNA片段，用地高辛(DIG)標記的干旱誘導和未誘導的沙蒿cDNA作為探針，與差異顯示所獲得的cDNA片段進行反向Northern雜交，排除假陽性。
采用The HIEROGLYPHTM mRNA Profile Kit System for Differential DisplayAnalysis試劑盒進行。試劑盒中提供的引物ARP175’-ACAATTTCACACAGGA CTGCTAGGTA-3’ARP185’-ACAATTTCACACAGGA TGATGCTACC-3’ARP195’-ACAATTTCACACAGGA TTTTGGCTCC-3’ARP205’-ACAATTTCACACAGGA TCGATACAGG-3’)
TMR-T7(dT12)AP35’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGG-3’TMR-T7(dT12)AP65’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCC-3’TMR-T7(dT12)AP75’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCG-3’TMR-T7(dT12)AP105’-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAG-3’(注TMR為熒光標記)(1)沙蒿總RNA的獲得(ConcertTM Plant RNA Reagent Invitrogen)取0.1g～0.2g沙蒿葉片放入研缽中，加液氮迅速研磨成粉沫；將粉沫轉入盛有0.5ml ConcertTM Plant RNA Reagent的DEPC處理的1.5ml離心管中；室溫靜置5min，室溫小于12000g離心2min；將上清液轉入新離心管，加入100ul 5mol/L NaCl，混勻；在加入300氯仿，混勻，4℃小于12000g離心10min；將上清液轉入新離心管，加0.5ml異丙醇，15-30℃放置10min；4℃小于12000g離心10min；去上相，加1ml 75％乙醇渦懇洗滌沉淀；室溫小于12000g離心1min；自然干燥(不要干透)，槍頭吹打溶于50-100ulRNase-free water；用RNase-free的DNase I處理總RNA，在PE UV/VIS spectrometer Lambda Bio40上測定A230nm至280nm波長范圍內的吸光值，并計算A260/A280和A260/A230比值以檢測樣品的純度。據(jù)RNA(ug/mL)＝OD260×37ug/ml×稀釋倍數(shù)，計算樣品的RNA濃度。
(2)RT-PCR將對照組和處理組總RNA分別稀釋成0.1μg/μl，各取2μl，用不同的anchored primer進行逆轉錄。
在0.2ml PCR管中加入(50μl體系)ddH2O 1.95μl10×PCR buffer II 1.0μl25mM MgCl21.5μl250μM dNTPs2.0μl5’ARP(2μM)1.75μl3’TMR-AP(5μM) 0.7μl逆轉錄產物 1.0μlAmpli Taq(5U/μl) 0.1μlPCR擴增條件為預變性 95℃ 2min4個循環(huán) 92℃ 15s； 50℃ 30s；72℃ 2min30個循環(huán) 92℃ 30s； 60℃ 30s；72℃ 2min延伸 72℃ 7min用High resolution fluoroDD Gel分離TMR標記的PCR片段，GenomyxSC FluorescentImaging Scanner進行DD凝膠成像分析，回收差異片段，用T7&M13引物重擴增。
(3)反向Northern雜交逆轉錄標記探針將1-5μg總RNA溶于8μl DEPC H2O，加入5μl Oligo(dT)18(Biolab，NewEngland)，混勻；70℃變性10min，迅速置于冰浴；按下列順序，加入第一鏈合成Master Mix6.0μl 5×First strand buffer；2.5μl 0.1M DTT；1.5μl RNaseOUT(40U/μl)；5.0μl dNTP labelling mix(1mMdATP，dGTP，dCTP，0.65mMdTTP，0.35mMdUTP)混勻，42℃ 2分鐘；加入1μl SuperScript II RT(200U/μl)，混勻；42℃ 10分鐘50℃ 50分鐘；70℃ 15分鐘，以終止反應。
確定探針的濃度后將差異顯示所獲cDNA片段固定于尼龍膜上。將T7&M13引物重擴增的PCR樣品，進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠轉膜，預雜交，雜交，洗膜，地高辛檢測(參見分子克隆)。
2 RING型鋅指蛋白轉錄因子基因全長cDNA的獲得根據(jù)所獲得的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因片段設計三條反向基因特異引物，參照5′RACE的操作說明進行操作。設計的三條反向基因特異引物序列如下GSP1CGAGGTCTTGGTCAACTGTGCTAACGSP2GATGGGTGCGGCTAGGGCAGAAGGSP3GACCACAATCTTGAACCTCG5 RACE試劑盒提供的引物如下AAP5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3AUAP5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3將所獲得目的片段回收，與pGEM-T easy載體連接后轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進行測序，并對序列進行分析，發(fā)現(xiàn)已得到了基因的起始序列。將5′RACE序列與差異顯示所獲得的序列拼接，獲得拼接的基因序列，在此序列兩端設計引物，再次RT-PCR擴增全長基因，并進行序列測定。擴增全長基因所用的引物DD20S15’-CGGGATCCATGGGACAGAATCTTAGC-3’(含BamHI和NcoI酶切位點)DD20A15’-CAGAGCTCCACAAAGCACAATACTCGCC-3’(含SacI酶切位點)實施例2植物表達載體的構建植物表達載體p3300-AdZFP1的結構見圖4。
植物表達載體p3300-AdZFP1的構建將pCAMBIA3300以HindIII和XbaI酶切，連入35S啟動子，然后再以SacI和EcoRI酶切，連入Tnos終止子，然后以BamHI和SacI酶切pCAMBIA3300，回收載體；同時將AdZFP1基因連接到pGEM-Teasy載體上，并命名為pT-AdZFP1，以BamHI和SacI酶切pT-AdZFP1，回收約1.4kb的小片段，以T4 DNA ligase將載體與1.4kb目的片斷連接，轉化DH5α并進行PCR和酶切鑒定后得到p3300-AdZFP1。AdZFP1基因的啟動子為35S，終止子為Tnos；篩選標記基因為Bar，bar基因的啟動子亦為35S，終止子為Tnos。
植物表達載體pAHC-AdZFP1的結構見圖5。
植物表達載體pAHC-AdZFP1的構建將AdZFP1基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端調控區(qū)，在單子葉植物中組成型表達)啟動子的調控之下，構建了適合于單子葉的植物表達載體pAHC-AdZFP1。將該基因連接到pGEM-Teasy載體上，并命名為pT-AdZFP1。NotI酶切pT-AdZFP1，回收約1.4kb的小片段，連接到pGEM-5Z上，得到中間載體p5Z-AdZFP1。將p5Z-AdZFP1用EcoRV和SacI酶切，回收小片段，同時將pAHC25用SmaI和SacI酶切，回收大片段，連接小片段和大片段，轉化DH5α并進行PCR和酶切鑒定后得到pAHC-AdZFP1。該表達載體由于沒有LB(Left Border)、RB(Right Border)，因此不能通過農桿菌介導的方法轉化植物，而采取基因槍的方法轉化植物。AdZFP1基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos；篩選標記基因為Bar，bar基因的啟動子亦為Ubiquitin，終止子為Tnos。
實施例3農桿菌的轉化(1)農桿菌感受態(tài)的制備a.挑取土壤農桿菌單菌落接種于5ml含適當抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；b.按1∶25-50接種于20ml含適當抗生素的LB/YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；c.4℃，5,000rpm離心10min，去上清；d.用600μl冰預冷的TE緩沖液(PH7.5)洗滌菌體；e.4℃，5,000rpm離心10min，去上清；f.用200μl冰預冷的液體LB/YEB重懸菌體，液氮冷凍，于-70℃保存。
(2)轉化a.將感受態(tài)農桿菌置冰浴中溶化，然后加入約0.5-1.0μg質粒DNA，輕輕混勻，冰上放置5min；b.置于液氮中5min；c.37℃溫育5min；d.加入800μl LB/YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)5-6h；e.6,000rpm離心5min，去大部分上清，剩50μl左右，懸浮菌體，f.均勻涂布于含適當抗生素的LB/YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
實施例4煙草的遺傳轉化及再生在本發(fā)明的這一實施方案中，轉化煙草的方法為農桿菌介導的葉盤法。
(1)接種轉化菌單菌落于含適當抗生素的2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)1-2天，轉接入20ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.5；(2)將健壯的煙草葉片剪成0.5-1cm見方，放入MS液體培養(yǎng)基稀釋過的農桿菌中，浸泡10-15分鐘，其間不斷輕搖幾次；(3)取出材料，用無菌紙吸去多余菌液，于MS固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)兩天；(4)用無菌紙吸去生長過度的菌體，把材料轉入含選擇壓PPt 5mg/L、Cb 500mg/L和6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的分化培養(yǎng)基中，25℃光下培養(yǎng)，每兩周換一次培養(yǎng)基，至分化出愈傷組織，直至長出芽；(5)將長至1cm以上的芽轉入含PPt 5mg/L、Cb 500mg/L的生根培養(yǎng)基上誘導生根；實施例5 對草坪草的遺傳轉化基因槍法轉化過程包括種子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麥草、)誘導愈傷組織、基因槍轟擊、抗性愈傷篩選、苗的分化、植株鑒定。
種子誘導愈傷的步驟成熟種子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培養(yǎng)基上，讓其萌動3天，露出小芽時，將胚縱切后轉接于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上，形成愈傷(約30天左右)后，每次挑選色澤鮮、增殖快、質地硬的愈傷組織繼代培養(yǎng)，繼代愈傷可供基因槍轉化；幼穗誘導愈傷的步驟取長約0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超凈臺內剝出幼穗，接種于誘導誘導培養(yǎng)基上，形成愈傷后，每20天繼代培養(yǎng)一次，供基因槍轉化；基因槍的轉化及苗的分化質粒提取的質粒濃度調整為1μg/μL。子彈配制30mg金粉或鎢粉加1mL 100％乙醇旋渦洗滌15分鐘，無菌水洗3次，加500μL 50％甘油備用。取上述鎢或金粉懸液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亞精胺，旋渦，冰上靜置15分鐘，離心數(shù)秒，70％乙醇142μL洗一次，離心數(shù)秒，100％ 140μL乙醇洗一次，離心數(shù)秒，加50μL 100％乙醇，供5槍用。
供試基因槍PDS-1000/He(美國伯樂公司)基因槍可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25InHg，6cm射擊距離，每皿射擊一槍。槍擊前的愈傷組織在含0.4M甘露醇的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～8小時，槍擊16小時后移入正常繼代培養(yǎng)基。槍擊后的愈傷組織一周后轉至含除草劑2-5mg/L的繼代篩選2～4輪，每輪20天。篩選后得到的抗性愈傷組織轉入含50g糖的培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20天，然后轉入去掉2，4-D的分化培養(yǎng)基中分化成苗。當小苗長到4-5片葉時，取少量葉片提取植物總DNA，進行PCR檢測。小苗長至5～10cm大小時，移入蛭石∶松針土為1∶1的土中，塑料袋保溫一周后，苗即成活。
實施例6轉基因植株Southern雜交和Northern雜交檢測為了檢測目的基因是否已經整合到轉化植物的基因組中并且正常表達，我們在PCR檢測的基礎上，又對轉基因植物進行了Southern雜交和Northern雜交檢測。
轉基因植株基因組DNA的制備(SDS法)(1)稱取0.2g植物材料，液氮研磨，加入0.75ml提取緩沖液中，混勻；(2)加40μl 20％SDS溶液使終濃度為1％，劇烈振蕩，混勻，65℃保溫15分鐘；(3)加160μl 5M KAc，劇烈振蕩，混勻，冰浴20-30分鐘；(4)4℃20000g離心10分鐘；(5)取上清，加入2/3體積異丙醇，混勻，-20℃放置30-40分鐘；(6)15000g離心10-15分鐘；(7)沉淀干燥，溶解于100-200μl 50×TE緩沖液中，若不溶解，65℃加熱助溶；(8)加入RNase A 37℃保溫15分鐘；(9)苯酚/氯仿，苯酚/氯仿/異戊醇，各抽提一次；(10)取上清，加入1/10體積3M NaAc，2體積無水乙醇；(11)12000g離心10分鐘；(12)70％乙醇洗滌；(13)干燥，溶于TE緩沖液中，65℃加熱10分鐘助溶。
轉基因植株基因組RNA的制備(TRIzol法)(1)每50-100mg組織中加入1mL TRIZOL，組織體積≤10％總體積；(2)勻漿液混勻后，于15-30℃放置5分鐘，于12000g離心10分鐘去渣；(3)每1mL TRIZOL加入0.2mL氯仿，振蕩15秒，于15-30℃放置2-3分鐘；(4)2-8℃，≤12000g離心15分鐘，分三層，上層無色水相約占總體積60％；(5)移出水相，每1mL初始TRIZOL加0.5mL異丙醇，于15-30℃放置10分鐘；(6)2-8℃，≤12000g離心10分鐘，得膠狀RNA沉淀；(7)用75％乙醇≥1mL，振蕩，于2-8℃≤7500g離心5分鐘；(8)干燥，但不要過分干燥，否則難溶(部分溶解的RNA A260/280≤1.6)，加無菌水溶解，上下吹打，55-60℃保溫助溶。
Southern雜交(參見分子克隆)選擇基因內部沒有，而只在載體單側的存在的酶切位點BamHI，酶切不同的轉基因植株基因組DNA，采用不對稱PCR法標記探針。根據(jù)Boehringer Mannheim公司的PCR DIG探針合成試劑盒進行如下操作在50μl反應體系中加入5μl 10×PCR buffer，5μl 10×PCR DIG mix，50pmol上游引物，5pmol下游引物，0.75μl酶混合物，100pg模板DNA，同時用未標記DIG的dNTP作對照反應。反應條件根據(jù)不同的模板稍有變動。反應結束后電泳檢測標記效率，標記后的探針應比沒有標記的產物分子量大，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> Northern雜交(參見分子克隆)實施例7轉基因植株耐旱生理功能的檢測；選取在相同條件下生長的苗齡大小一致的轉基因煙草葉片和轉空載體的煙草葉片，于空氣中干燥脫水(2h～24h)，在漸進的水分脅迫條件下，轉基因煙草葉片均表現(xiàn)出了較之對照明顯增強的耐脫水能力(圖9)。
同行又對栽種在溫室土壤中的轉基因煙草進行了整株耐旱性檢測，中度失水條件下(土壤含水量8％)對照煙草明顯萎蔫，而轉基因煙草只表現(xiàn)出輕度萎蔫(圖10)。
對移栽在溫室的苗齡約兩個半月的轉基因煙草及對照煙草在水分脅迫下的生理指標進行了測定。植物光合強度的測定采用CI-301便攜式光合系統(tǒng)測定儀。
土壤水分含量在12％左右時(中度水分脅迫)，轉基因煙草與對照植株的光合強度都有降低，但對照植株降低更為明顯，而當土壤含水量在8％以下(重度水分脅迫)時所有植株的光合強度和呼吸強度明顯下降，但轉基因植株的光合速率仍略高于對照植株(圖11)。
轉基因煙草和對照煙草在重度水分脅迫之后，立即進行了復水，每隔半小時分別測定其光合速率，結果發(fā)現(xiàn)，轉基因煙草復水過程的光合速率明顯高于對照，在2小時左右光合速率基本恢復正常，完全復水，而對照株煙草大約4小時完全復水(圖12)。
在模擬干旱條件下，對T1代轉基因煙草種子在15％PEG處理的濾紙上進行了萌發(fā)實驗。(圖13)。
專利菌種說明此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代號為AdZFP1，保藏編號為CGMCC NO.1286，保藏日期為2005年1月5日。
總之，本發(fā)明克隆了一個新的編碼區(qū)為1335bp的干旱相關轉錄因子基因AdZFP1，并且利用此基因構建了植物表達載體，通過農桿菌介導和基因槍法遺傳轉化獲得了耐旱轉基因植物。PCR檢測和Southern檢測證明該基因整合到轉基因植株基因組中，Northern檢測證明該基因能在植物中高效表達，脫水處理實驗和生理指標的測定均證明轉基因株系比對照顯著提高了耐旱性能，轉基因植株T1代種子在模擬干旱條件下的萌發(fā)實驗更加證明了轉AdZFP1基因植株耐旱性能的提高。
參考文獻1 Chen W Q，Provart N J，Glazebrook J，et al.2002.Expression profile matrix of Arabidopsistranscription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stress.Plant Cell，14559-5742 Henikoff S，Greene EA，Pietrokovski S et al.1997.Gene familiestaxonomy of protein paralogsand chimeras.Science，278(5338)6093 朱玉賢，李毅編著，現(xiàn)代分子生物學(第二版)，2002，高等教育出版社4 Li Z，Thomas T L.1998.PEI1，an embryo-specific zinc finger protein gene required forheart-stage embryo formation on Arabidopsis.Plant Cell，10383-3985 Tkatsuji H.，Mori M.，Cua N.H.Characterization of a zinc finger DNA-binding proteinexpressed specially in petunia petals and seedlings.The EMBO Journal.1992，112416 Takatsuji H，Nakamura N and Katsumoto Y.1994.A new family of zinc finger proteins inpetuniastructure，DNA sequence recognitioin，and floral organ-specific expression.Plant Cell，6947-9587 Freemont P.S.，1993.The RING fingera novel protein sequence motif related to the zincinger.Ann.NY Acad Sci.684174-1928 Saurin，A J，Borden，K L M，Boddy M N and Freemont，P S.1996 Does this have a familiarRING？Trans Biochem.Sci.21208-2149 MeNellis，T W，Torii，K U and Deng X W.1996 Expression of N-terminal fragment ofCOP1confers a dominant-nagative effect on light-regulated seedling development inArabidopsis.Plant Cell，81491-150310 Mayer R，Raventos D and Chua N H.1996 edtl，copland cop9 mutations cause inappropriateexpression of several gene sets.Plant Cell，81951-195911 Takatsuji H.1998.Zinc-finger transcription factors in plants.CMLS，Cell.Mol.LifeSci，54582-59612 Molnar G，Bancos S，Nagy F and Sakeres M.2002.Characterization of BRH1，abrassinosteroid-responsive RING-H2 gene from Arabidopsis thaliana.Planta 215127-13313 Ruqiang Xu and Qingshun Quinn Li.2003.A RING-H2 zinc-finger protein gene RIE1 isessential for seed development in Arabidopsis.Plant Molecular Biology 5337-5014 白壽寧，雍彤五，云秀芳.沙蒿籽提取沙蒿油及沙蒿膠研究概況與前景.包裝與食品機械.2000，18(3)17-2316 Frohman，MA，Dush MK and Martin GR.Rapid Production of Full Length Cdna from RareTranscripts by Amplification Using a Single Gene-Specific Oligonueleotide Primer.Proc NatlAcad Sci.1988.858998-9002
<110>林忠平<120>沙蒿AdZFP1轉錄因子基因及其在培育耐旱植物中的應用<160>2<210>1<211>1723<212>DNA<213>沙蒿(Artemisia desertorum Spreng)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(70)<220>
<221>CDS<222>(71)...(1408)<220>
<221>3’UTP<222>(1409)...(1723)<400>1acaaccatct tcacaagtgg cttgtttccg acggaccaac cgccgtcgct aacaatcgtc 60actaaagaaa atg gga cag aat ctt agc tgt gga gta aaa gat gac aat ggt tta ttt 118Met Gly Gln Asn Leu Ser Cys Gly Val Lys Asp Asp Asn Gly Leu Phe1 5 10 15aca gca ata caa tat ggt gat ata gaa gtg gtg aaa cat gtt atg gaa aat gat gca aat 178Thr Ala Ile Gln Tyr Gly Asp Ile Glu Val Val Lys His Val Met Glu Asn Asp Ala Asn20 25 30 35ttt gtt gtt aag aaa aaa act gtt tat gat cgt cat tct gct ttg cat att gct gct gct 238Phe Val Val Lys Lys Lys Thr Val Tyr Asp Arg His Ser Ala Leu His Ile Ala Ala Ala40 45 50 55aat ggt cag atc gag att gta aac ttg ctg ttg gat aag tca tct gtt aat cct gat gct 298Asn Gly Gln Ile Glu Ile Val Asn Leu Leu Leu Asp Lys Ser Ser Val Asn Pro Asp Ala60 65 70 75tta aat cgt cga aaa caa act cca ttg atg ttg gct gca atg cac ggg aag att gct tgt 358Leu Asn Arg Arg Lys Gln Thr Pro Leu Met Leu Ala Ala Met His Gly Lys Ile Ala Cys80 85 90 95gtt gaa aag cta att gaa gct ggt gct aat att ttg atg ttt gat tca tta aat gga aga 418Val Glu Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Leu Met Phe Asp Ser Leu Asn Gly Arg100 105 110 115aca tgt ttg cac tat gct gct tat tat ggt cac tct gat tgt ctt gaa acc att ctt tcg 478Thr Cys Leu His Tyr Ala Ala Tyr Tyr Gly His Ser Asp Cys Leu Glu Thr Ile Leu Ser120 125 130 135tct gct aga act tcc cac gtt gcg gct tct tgg ggc ttt tcg cgg ttt gtg aat ata aga 538
Ser Ala Arg Thr Ser His Val Ala Ala Ser Trp Gly Phe Ser Arg Phe Val Asn Ile Arg140 145 150 155gat ggt aaa ggg gca aca cca ttg cat ttg gca gcc cgt caa aga cgt cca gaa tgt gtt 598Asp Gly Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gln Arg Arg Pro Glu Cys Val160 165 170 175cat ata ctt ctt gat agt gga gcc ctt gtt tgt gcc tca acc ggt gga tat ggt ctt cct 658His Ile Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Val Cys Ala Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Leu Pro180 185 190 195ggc agc acg cca ctt cat ttg gct gca aga ggg ggt tca atg gat tgc gtt cgc gaa tta 718Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly Ser Met Asp Cys Val Arg Glu Leu200 205 210 215tta gca tgg ggt gcg gat cga ctt cat aga gat gca tca ggg aga atc cca tat gcg gtt 778Leu Ala Trp Gly Ala Asp Arg Leu His Arg Asp Ala Ser Gly Arg Ile Pro Tyr Ala Val220 225 230 235gct tta aaa cac aat tat ggt gtg tgt gcg gct ttg cta aac cct tcg tcc gca gag cca 838Ala Leu Lys His Asn Tyr Gly Val Cys Ala Ala Leu Leu Asn Pro Ser Ser Ala Glu Pro240 245 250 255cta gta tgg cca tca cca tta aaa ttc att agt gag ctt aat caa gat gca aaa gct ttg 898Leu Val Trp Pro Ser Pro Leu Lys Phe Ile Ser Glu Leu Asn Gln Asp Ala Lys Ala Leu260 265 270 275tta gag caa gct cta atg gag att aat aga gaa agg gag aga agt atc tta aag ggt acg 958Leu Glu Gln Ala Leu Met Glu Ile Asn Arg Glu Arg Glu Arg Ser Ile Leu Lys Gly Thr280 285 290 295ggc tac tca gtt tca tct cca tca cat tct gat gcc acc ggc atg gat gat aac atc tct 1018Gly Tyr Ser Val Ser Ser Pro Ser His Ser Asp Ala Thr Gly Met Asp Asp Asn Ile Ser300 305 310 315gag gca agt gac tca caa tta tgt tgc ata tgc ttt gac caa cta tgc gca atc gag gtt 1078Glu Ala Ser Asp Ser Gln Leu Cys Cys Ile Cys Phe Asp Gln Leu Cys Ala Ile Glu Val320 325 330 335caa gat tgt ggt cac caa atg tgt gct caa tgc aca ctc gcg tta tgc tgc cac gac aag 1138Gln Asp Cys Gly His Gln Met Cys Ala Gln Cys Thr Leu Ala Leu Cys Cys His Asp Lys340 345 350 355cca aac cca aca act tct gcc cta gcc gca ccc atc tgc ccc ttt tgc cga agc aat ata 1198Pro Asn Pro Thr Thr Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ile Cys Pro Phe Cys Arg Ser Asn Ile360 365 370 375gaa cgc tta gca gtg atc aaa gtc aaa gct agc aca gtt gac caa ggc ctc gat gtt ttt 1258Glu Arg Leu Ala Val Ile Lys Val Lys Ala Ser Thr Val Asp Gln Gly Leu Asp Val Phe380 385 390 395tcc tca cct aag cag cgg aaa tct aga agg tca ata aac tta agt gaa gga agc agt agc 1318Ser Ser Pro Lys Gln Arg Lys Ser Arg Arg Ser Ile Asn Leu Ser Glu Gly Ser Ser Ser400 405 410 415ttt aga ggg tta tcg ggt gcc tca ttt ggg aaa atg gtg ggc cgt ggg tca ggt cgg gtc 1378Phe Arg Gly Leu Ser Gly Ala Ser Phe Gly Lys Met Val Gly Arg Gly Ser Gly Arg Val420 425 430 435
tca gct gac ctc gaa tgg gat aaa ccg tga aaagcattta caaaggatcg tgtataggaa 1438Ser Ala Asp Leu Glu Trp Asp Lys Pro *440445agcatttaca atggcgagta ttgtgctttg tggagctctg tttacttcag catgaaggag 1498taaaaggttc caaggggagt ctttggttat ttacttgtta cccaaatatt ctttttactg 1558tactattttt gttaccaaag gctagcaatt caaattcatg taggtggtgc tcaaaatgga 1618aaattggtga gaggttaatt gaaccccacc ctttgttttt attttcattg gtattgtagt 1678gtgacagttt atataataaa gtgattttga ttcaaaaaaa aaaaa 1723<210>2<211>445<212>PRT<213>沙蒿(Artemisia desertorum Spreng)<400>2Met Gly Gln Asn Leu Ser Cys Gly Val Lys Asp Asp Asn Gly Leu Phe Thr Ala Ile Gln15 10 15 20Tyr Gly Asp Ile Glu Val Val Lys His Val Met Glu Asn Asp Ala Asn Phe Val Val Lys21 25 30 35 40Lys Lys Thr Val Tyr Asp Arg His Ser Ala Leu His Ile Ala Ala Ala Asn Gly Gln Ile41 45 50 55 60Glu Ile Val Asn Leu Leu Leu Asp Lys Ser Ser Val Asn Pro Asp Ala Leu Asn Arg Arg61 65 70 75 80Lys Gln Thr Pro Leu Met Leu Ala Ala Met His Gly Lys Ile Ala Cys Val Glu Lys Leu81 85 90 95 100Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ile Leu Met Phe Asp Ser Leu Asn Gly Arg Thr Cys Leu His101 105 110 115 120Tyr Ala Ala Tyr Tyr Gly His Ser Asp Cys Leu Glu Thr Ile Leu Ser Ser Ala Arg Thr121 125 130 135 140Ser His Val Ala Ala Ser Trp Gly Phe Ser Arg Phe Val Asn Ile Arg Asp Gly Lys Gly141 145 150 155 160Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Gln Arg Arg Pro Glu Cys Val His Ile Leu Leu161 165 170 175 180Asp Ser Gly Ala Leu Val Cys Ala Ser Thr Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Gly Ser Thr Pro181 185 190 195 200Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly Ser Met Asp Cys Val Arg Glu Leu Leu Ala Trp Gly201 205 210 215 220Ala Asp Arg Leu His Arg Asp Ala Ser Gly Arg Ile Pro Tyr Ala Val Ala Leu Lys His
221 225 230 235 240Asn Tyr Gly Val Cys Ala Ala Leu Leu Asn Pro Ser Ser Ala Glu Pro Leu Val Trp Pro241 245 250 255 260Ser Pro Leu Lys Phe Ile Ser Glu Leu Asn Gln Asp Ala Lys Ala Leu Leu Glu Gln Ala261 265 270 275 280Leu Met Glu Ile Asn Arg Glu Arg Glu Arg Ser Ile Leu Lys Gly Thr Gly Tyr Ser Val281 285 290 295 300Ser Ser Pro Ser His Ser Asp Ala Thr Gly Met Asp Asp Asn Ile Ser Glu Ala Ser Asp301 305 310 315 320Ser Gln Leu Cys Cys Ile Cys Phe Asp Gln Leu Cys Ala Ile Glu Val Gln Asp Cys Gly321 325 330 335 340His Gln Met Cys Ala Gln Cys Thr Leu Ala Leu Cys Cys His Asp Lys Pro Asn Pro Thr341 345 350 355 360Thr Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ile Cys Pro Phe Cys Arg Ser Asn Ile Glu Arg Leu Ala361 365 370 375 380Val Ile Lys Val Lys Ala Ser Thr Val Asp Gln Gly Leu Asp Val Phe Ser Ser Pro Lys381 385 390 395 400Gln Arg Lys Ser Arg Arg Ser Ile Asn Leu Ser Glu Gly Ser Ser Ser Phe Arg Gly Leu401 405 410 415 420Ser Gly Ala Ser Phe Gly Lys Met Val Gly Arg Gly Ser Gly Arg Val Ser Ala Asp Leu421 425 430 435 440Glu Trp Asp Lys Pro441 44權利要求
1.從沙蒿中克隆的編碼區(qū)為1335bp的干旱相關RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1，該基因的特征在于該基因編碼一條由445個氨基酸組成的蛋白質，該蛋白質的324-372位氨基酸為RING型鋅指蛋白結構域。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因，該基因所編碼的氨基酸序列與擬南芥中的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因所編碼的氨基酸序列具有69％的同源性，擬南芥中該基因的GenBank登錄號gi|3927831|gb|AAC79588.1。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因，該基因可用于構建成適合在雙子葉植物中表達AdZFP1基因的植物表達載體p3300-AdZFP1和適合在單子葉植物中表達AdZFP1基因的植物表達載體pAHC-AdZFP1。
4.根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體p3300-AdZFP1，該植物表達載體的特征在于驅動AdZFP1基因的啟動子為35S，終止子為Tnos，篩選標記為bar基因，啟動子為35S，終止子為Tnos。
5.根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體pAHC-AdZFP1，該植物表達載體的特征在于驅動AdZFP1基因的啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos，篩選標記為bar基因，啟動子為Ubiquitin，終止子為Tnos。
6.根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體p3300-AdZFP1，該載體可通過農桿菌介導法導入植物細胞，生長出含有目的基因AdZFP1的轉基因植株。
7.根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體pAHC-AdZFP1，該載體可通過基因槍法導入植物細胞，生長出含有目的基因AdZFP1的轉基因植株。
8.根據(jù)權利要求6所述的植物，所指的植物是指煙草、矮牽牛。
9.根據(jù)權利要求7所述的植物，所指的植物是早熟禾、高羊茅、黑麥草。
全文摘要
本發(fā)明涉及從沙蒿中克隆了一個新的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因(AdZFP1)，并可利用此基因采用轉基因技術來提高植物抗旱性。采用mRNA差異顯示技術結合RACE技術從沙蒿中獲得RING型鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1，該基因編碼一條由445個氨基酸組成的蛋白質，該蛋白的324－372位氨基酸為RING型鋅指蛋白domain，該基因與擬南芥中的RING型鋅指蛋白轉錄因子基因(
文檔編號C07K14/415GK1632123SQ200510002009
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權日2005年1月12日
發(fā)明者林忠平, 楊秀紅, 胡鳶雷, 孫超 申請人:林忠平