專利名稱：一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物中有效成分提取方法領(lǐng)域。具體地說(shuō)，涉及一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。
背景技術(shù)：
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook f.)，衛(wèi)矛科，雷公藤屬，主產(chǎn)于福建、浙江、安徽、湖南等地。同屬的植物還有昆明山海棠(Tripterygium Hypoglaucum(Levl.)Hukeda)、蒼山雷公藤(Tripterygium Forretii Dials)、東北雷公藤(Tripterygium RegelliSprague et Taketa)等。雷公藤中含有多種具有多種生物活性的化合物，是著名的藥用和殺蟲(chóng)植物之一，用于抗癌及殺蟲(chóng)已有上百年的歷史，還有顯著的抗炎、抗生育及免疫調(diào)節(jié)作用。在臨床上已廣泛用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合癥、抗腫瘤以及免疫性疾病等多種疾病的治療。在植物農(nóng)藥方面的研究和開(kāi)發(fā)也得到很大的發(fā)展，如專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N01141888.5、CN03115750.5、CN0310108822.3等專利申請(qǐng)的主要是雷公藤植物提取物作為農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用。
國(guó)內(nèi)外對(duì)雷公藤的化學(xué)成分已進(jìn)行了大量的研究工作，至今已從雷公藤中分離到上百種成分，主要為生物堿類(lèi)、二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、衛(wèi)矛醇、衛(wèi)矛堿以及苷類(lèi)等多種化合物。提取雷公藤中有效成分的方法有浸漬法、滲濾法、回流法、超臨界提取法、超聲提取法等，提取溶劑一般為水、乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯等。工藝規(guī)模制備雷公藤有效成分都采用物理提取法，較成熟的有雷公藤內(nèi)酯醇、生物堿及多苷制備工藝。
兒茶素類(lèi)化合物在植物中的分布非常廣泛，其中以兒茶、兒茶鉤藤、大黃、山茶、紅七葉樹(shù)等植物中最多，此外在銀杏、沙棗、麻黃、日本苦楝、杜仲等多種植物也有分布。兒茶素類(lèi)化合物普遍具有顯著的抗癌、抗炎、抗氧化以及防治心血管疾病等多種生物活性，已在醫(yī)藥、日用化工、食品添加劑等領(lǐng)域大量應(yīng)用。其中兒茶素的結(jié)構(gòu)式為 至今未見(jiàn)有從雷公藤屬植物中提取、分離兒茶素及表兒茶素的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)雷公藤屬植物的提取、分離、純化研究，獲得了兒茶素及表兒茶素，發(fā)明了此提取方法，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法，它包括如下步驟(1)將雷公藤屬植物的植物組織粉碎后制成原料A備用；(2)取原料A加入溶媒進(jìn)行提取，制得提取物B備用；(3)將提取物B離心，取上清液，加入萃取劑進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，減壓濃縮，制得C液備用；(4)將C液進(jìn)行柱層析分離，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集含有兒茶素及表兒茶素的組分進(jìn)行結(jié)晶，制得結(jié)晶D；(5)將結(jié)晶D用結(jié)晶液進(jìn)行重結(jié)晶，制得兒茶素及表兒茶素。
本發(fā)明中雷公藤屬植物選自雷公藤、昆明山海棠、蒼山雷公藤、東北雷公藤中的一種或多種；植物組織選自根、莖、葉中的一種或多種。
本發(fā)明中溶媒媒是由酸、堿、水中的一種或多種與有機(jī)溶劑組成，其pH 1～11；其中有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或多種。
本發(fā)明中萃取劑選自乙醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一種或多種。
本發(fā)明中洗脫劑選自石油醚、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇中的一種或多種，有選的洗脫劑為石油醚和乙醚，按體積計(jì)用量比為2∶3。
本發(fā)明中柱層析分離所使用的柱填充物為100目～300目硅膠，優(yōu)選的柱填充物為200目～300目硅膠。
本發(fā)明中結(jié)晶液選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚中的一種或多種。
所述方法詳述如下(1)粉碎植物材料將雷公藤屬植物的根、莖、葉等植物組織洗凈，切片，曬干，粉碎，制成原料A備用。
(2)用溶媒進(jìn)行提取方法1稱取原料A，按1∶3～10(W/V)加入溶媒(2％～30％有機(jī)溶劑+0.2％～15％濃鹽酸+水)，采用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過(guò)濾。濾渣重復(fù)提取三次，過(guò)濾，合并濾液，制得提取物B。
方法2稱取原料A，用氨水(5％～20％)浸潤(rùn)，按1∶3～10(W/V)加入有機(jī)溶劑，采用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過(guò)濾；濾渣重復(fù)提取三次，過(guò)濾，合并濾液，制得提取物B。
方法3稱取原料A，用蒸餾水浸潤(rùn)，按1∶3～10(W/V)加入有機(jī)溶劑，采用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過(guò)濾；濾渣重復(fù)提取三次，過(guò)濾，合并濾液，制得提取物B。
(3)離心、萃取將提取物B用氨水調(diào)至pH 8～10，離心；將上清液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，立即用萃取劑萃取三次。合并有機(jī)層，減壓濃縮，制得C液，低溫保存?zhèn)溆谩?br> (4)柱層析分離純化將C液用100目～300目硅膠拌樣，C液與硅膠的比例視C液的濃度而定。置于紅外燈下烘干，經(jīng)100目～300目硅膠柱層析，用洗脫劑洗脫；經(jīng)高效液相色譜法跟蹤檢測(cè)，收集不同流份，進(jìn)行結(jié)晶，制得得結(jié)晶D。
(5)重結(jié)晶將結(jié)晶D用結(jié)晶液進(jìn)行重結(jié)晶，制得兒茶素及表兒茶素。
兒茶素及其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)鑒定兒茶素白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp154℃-156℃(甲醇)；1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ3.42(1H，dd，J＝8.4，16.0Hz，H-4a)，3.78(1H，dd，J＝5.5，16.0Hz，H-4b)，4.69(1H，ddd，J＝5.5，7.7，8.4Hz，H-3)，5.31(1H，d，J＝7.7Hz，H-2)，6.73(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.78(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，7.31(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，7.32(1H，d，J＝8Hz，H-6′)，7.65(1H，s，H-2′)。13C-NMR(C5D5N，500MHz)δ29.8(C-4)，68.3(C-3)，83.4(C-2)，95.7(C-8)，96.8(C-6)，101.1(C-10)，116.2(C-2′)，116.4(C-5′)，119.8(C-6′)，132.3(C-1′)，147.2(C-3′)，147.3(C-4′)，157.4(C-9)，158.5(C-5)，158.9(C-7)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(《Journal ofChinese Pharmaceutical Sciences》2004，13(3)214～216)報(bào)道的兒茶素catechin一致。
表兒茶素白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp249～251℃；1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ3.55(1H，dd，J＝3.2，16.2Hz，H-4a)，3.46(1H，dd，J＝4.5，16.2Hz，H-4b)，4.78(1H，s，H-2)，5.37(1H，s，H-3)，6.67(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.70(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.31(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，7.36(1H，dd，J＝1.5，8.2Hz，H-6′)，7.91(1H，d，J＝1.2Hz，H-2′)。13C-NMR(C5D5N)δ81.3(C-2)，66.7(C-3)，29.8(C-4)，156.7(C-9)，157.2(C-5)，157.8(C-7)，96.4(C-6)，95.5(C-8)，99.5(C-10)，132.2(C-1′)，115.3(C-2′)，115.7(C-5′)118.7(C-6′)，146.8(C-3′)，146.9(C-4′)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(《云南植物研究》1997，19(2)201～206)報(bào)道的表兒茶素(-)epicatechin一致。
本發(fā)明從雷公藤屬植物中提取兒茶素的方法所采用的設(shè)備簡(jiǎn)單，即使用的是常規(guī)的柱層析法及常規(guī)的硅膠，而不需要葡聚糖凝膠、超臨界流體提取儀、高速逆流色譜儀等昂貴的試劑或儀器。大大簡(jiǎn)化了兒茶素單體分離純化設(shè)備，方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，回收率高，且產(chǎn)品純度可達(dá)99％以上，易于推廣使用。


圖1兒茶素的高效液相色譜圖。
圖2表兒茶素的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取雷公藤根的木質(zhì)部切片，風(fēng)干，粉碎。粉碎細(xì)度20目。按體積計(jì)用量，水80％、乙醇17％、濃鹽酸3％的比例混勻制成提取溶媒。取粉碎好的雷公藤藥材1公斤，加提取溶媒3升，浸泡過(guò)夜。然后65℃提取50min。冷卻后，將提取液用氨水調(diào)至pH 9，4000rpm/min離心20min，去沉淀。取上清液，按體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取三次，合并酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進(jìn)行柱層析分離。采用硅膠(200目～300目)作為固定相，流動(dòng)相為石油醚-乙醚梯度洗脫，分離物經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)后分部收集各組分，揮去流動(dòng)相。得純度為97.5％的兒茶素251mg，純度為91.2％的表兒茶素84mg。再將上述粗品用少量的丙酮溶解后，加石油醚-乙醚(1∶2)重結(jié)晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實(shí)施例2取昆明山海棠根皮1公斤，經(jīng)干燥、粉碎后，加少量蒸餾水浸泡潤(rùn)濕過(guò)夜，再用10升乙醇熱回流提取。冷卻后，將提取液用氨水調(diào)至pH 9，3000rpm/min離心25min，去沉淀。將上清液用正丁醇萃取(體積比1∶3)三次，合并酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進(jìn)行柱層析分離。采用硅膠(100目～200目)作為固定相，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，分離物經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)后分部收集各組分，揮去流動(dòng)相。得純度為93.5％的兒茶素194mg，純度為90.8％的表兒茶素95mg。再將上述粗品用甲醇重結(jié)晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實(shí)施例3取蒼山雷公藤莖粉1公斤，用10％氨水浸泡潤(rùn)濕，再加6升丙酮室溫浸提24小時(shí)。將提取液用氨水調(diào)至pH 10，5000rpm/min離心15分鐘，去沉淀。將上清液用乙醚萃取(體積比1∶2)三次，合并酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進(jìn)行柱層析分離。采用硅膠(200目～300目)作為固定相，流動(dòng)相為石油醚-甲醇梯度洗脫，分離物經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)后分部收集各組分，揮去流動(dòng)相。得純度為93.5％的兒茶素205mg，純度為90.8％的表兒茶素63mg。再將上述粗品用石油醚-甲醇(19∶1)重結(jié)晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實(shí)施例4取東北雷公藤根的木質(zhì)部切片，風(fēng)干，粉碎。粉碎細(xì)度20目。按體積計(jì)用量水82％、甲醇15％、濃鹽酸3％的比例混勻成為提取溶媒。取粉碎好的雷公藤藥材1公斤，加提取溶媒3升，浸泡過(guò)夜。然后90℃提取50min。冷卻后，將提取液用氨水調(diào)至pH 9，4000rpm離心20分鐘，去沉淀。上清液用乙酸乙酯萃取(體積比1∶1)三次，合并酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進(jìn)行柱層析分離。采用硅膠(200目～300目)作為固定相，流動(dòng)相為石油醚-乙醚梯度洗脫，分離物經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)后分部收集各組分，揮去流動(dòng)相。得純度為97.5％的兒茶素232mg，純度為91.2％的表兒茶素90mg。再將上述粗品用少量的丙酮溶解后，加石油醚-乙酯乙酯的(9∶1)重結(jié)晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實(shí)施例5取蒼山雷公藤葉粉1公斤，用5％氨水浸泡潤(rùn)濕，再加5升乙酸乙酯室溫浸提24小時(shí)。將提取液用氨水調(diào)至pH 10，4000rpm離心20分鐘，去沉淀。上清液用乙酸乙酯萃取(體積比1∶1)三次，合并酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進(jìn)行柱層析分離。采用硅膠(200目～300目)作為固定相，流動(dòng)相為石油醚-甲醇梯度洗脫，分離物經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)后分部收集各組分，揮去流動(dòng)相。得純度為93.0％的兒茶素208mg，純度為91.8％的表兒茶素65mg。再將上述粗品用二氯甲烷重結(jié)晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
權(quán)利要求
1.一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法，它包括如下步驟(1)將雷公藤屬植物的植物組織粉碎后制成原料A備用；(2)取原料A加入溶媒進(jìn)行提取，制得提取物B備用；(3)將提取物B離心，取上清液，加入萃取劑進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，減壓濃縮，制得C液備用；(4)將C液進(jìn)行柱層析分離，用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集含有兒茶素及表兒茶素的組分進(jìn)行結(jié)晶，制得結(jié)晶D；(5)將結(jié)晶D用結(jié)晶液進(jìn)行重結(jié)晶，制得兒茶素及表兒茶素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中雷公藤屬植物選自雷公藤、昆明山海棠、蒼山雷公藤、東北雷公藤中的一種或多種；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中植物組織選自根、莖、葉中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中溶媒是由酸、堿、水中的一種或多種與有機(jī)溶劑組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的萃取劑選自乙醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中洗脫劑選自石油醚、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中洗脫劑為石油醚和乙醚，按體積計(jì)用量比為2∶3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中柱層析分離所使用的柱填充物為100目～300目硅膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中結(jié)晶液選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。將雷公藤屬植物的根、莖、葉組織經(jīng)提取，萃取、柱層析分離、重結(jié)晶后，得到兒茶素及表兒茶素。
文檔編號(hào)C07D311/62GK1884276SQ20051001198
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者曾水云, 吳華, 林開(kāi)春 申請(qǐng)人:武漢天惠生物工程有限公司, 武漢綠世紀(jì)生物工程有限責(zé)任公司