專利名稱：苯并噻二唑衍生物及其合成方法和誘導(dǎo)抗病活性的篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案涉及與碳環(huán)稠合的含1，2-二唑的雜環(huán)化合物，具體地說(shuō)是涉及苯并噻二唑衍生物。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期的實(shí)踐證明，傳統(tǒng)農(nóng)藥作用于有害生物的同時(shí)很難逃避“農(nóng)藥公害”的產(chǎn)生。迫于安全、生態(tài)和環(huán)境方面的壓力，新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)周期逐漸延長(zhǎng)，投入經(jīng)費(fèi)逐年增加，開(kāi)發(fā)成功率也日趨下降，按照這種模式進(jìn)行新農(nóng)藥的創(chuàng)制已不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需要?，F(xiàn)在，人們正在借鑒醫(yī)藥開(kāi)發(fā)的模式，從靶標(biāo)逆向進(jìn)行新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)，以期加快新農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)速度并提高其成功率，與此同時(shí)，開(kāi)發(fā)利用植物自身防御系統(tǒng)來(lái)防病治蟲(chóng)的研究也取得了重要進(jìn)展，植物抗病激活劑的研制和開(kāi)發(fā)就是其中重要成果之一。植物抗病激活劑(elicitor或plant activiator)是指本身及其代謝物無(wú)直接的殺菌活性，但能誘導(dǎo)植物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生廣譜、持久和滯后的系統(tǒng)獲得抗病性能的化學(xué)物質(zhì)及其前體。它可分為生物源和非生物源兩類。非生物源植物抗病激活劑又分為內(nèi)源的和外源的兩類。
原汽巴-嘉基公司在開(kāi)發(fā)磺酰脲除草劑時(shí)發(fā)現(xiàn)苯并噻二唑的衍生物S-甲基苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸酯(英文縮寫(xiě)為BTH，英文通用名稱acibenzolar-S-methyl)具有誘導(dǎo)抗病的活性，它是目前一種商品化最成功的外源的非生物源植物抗病激活劑，能激發(fā)植物的免疫系統(tǒng)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生具有廣譜、持久和滯后的系統(tǒng)獲得抗病性能(SAR)(Kunz等，Thechemistry of benzothiadiazole plant activators.Pestic.Sci.，1997，50，275-282.)。BTH能迅速被植物吸收和傳導(dǎo)，激活植物抗性反應(yīng)并影響病原菌生活的多個(gè)環(huán)節(jié)。它可誘導(dǎo)植物對(duì)由細(xì)菌、真菌和病毒引發(fā)的病害如霜霉病(Peronospora parasitica)、晚疫病、稻瘟病、炭疽病、葉斑病(Pseudomonas lach rymans)、細(xì)菌角斑病、煙草野火病(pseudomonassyringae pv.tabaci)、黑星病(Cladosporium)產(chǎn)生廣譜的系統(tǒng)抗性。就保護(hù)植物及抵抗病原物種類的多樣性而言，BTH是一種廣譜的利用植物防衛(wèi)機(jī)制的化學(xué)植物抗病激活劑。
BTH的基本骨架比較簡(jiǎn)單。后來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)與BTH類似的不同取代的苯并噻二唑衍生物也同樣具有廣譜的誘導(dǎo)抗性。US 4931581、US 4968344、US 5066661、US 5051436、US 5126358、US 5248683、US 5384321對(duì)與BTH類似的不同取代的苯并噻二唑衍生物的誘導(dǎo)抗性做了報(bào)道，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式的改造可以用下列所示化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I)-(V)的通式進(jìn)行描述
X＝H、鹵原子、OH、CH3、OCH3、COOH、或COOM；Y＝H、鹵原子、SO3H、SO3M、NO2；OH、或NH2；Z＝CN、或COA；M＝堿金屬或堿土金屬的離子；A＝OH、SH、或以上兩個(gè)基團(tuán)中的H可以被有機(jī)或無(wú)機(jī)的陽(yáng)離子取代。
X1，X2＝H或鹵原子；R＝H、C1-C4烷基、C3-C5鏈烯基或SR1；R1＝被3-6個(gè)F或Cl取代的C1-C3烷基；R2＝C1-C4烷基、C1-C6烷氧基、被1-3個(gè)鹵原子取代的C1-C3烷基、或被1-3個(gè)鹵原子取代的呋喃和二噻吩；R3＝H、或C1-C4烷基。
X1，X2＝H、或鹵原子；A＝磺?；⒒螋驶?；Y＝苯基、或被C1-C1烷基、C1-C2烷氧基、鹵原子、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷氧基羰基、CN、NO2取代的苯基；R＝H、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、C3-C5鏈烯基、C3-C5炔基、 或 A1＝亞甲基、羰基、或磺酰基；X3＝H、CH3、或鹵原子；m＝2、3、或4；n＝0、或1。

A1，A2分別為CO-C1-C4烷基、COO-C1-C4烷基、CO-CF3；CO-N(R)2、或CN、或A1，A2同是CO(X)N-C1-C3-鏈烯基-(Xn)CO、或以上基團(tuán)被C1-C4烷基、COOR、CON(R)2、CN、苯基取代、苯環(huán)上可以被鹵原子、甲基，OCH3、NO2、或CN取代；R＝H、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基、或C3-C6炔基；X＝O、或S；X1，X2，X3＝H、鹵原子、CH3、SCH3、OCH3、或NO2；n＝0、或1。
X1，X2，X3＝H、CH3、OCH3、SCH3、NO2、或鹵原子；A＝一個(gè)被3X-C1-C4烷基取代的C1-C2烷基、被2-3個(gè)鹵原子取代的甲基、被OH或少于4個(gè)鹵原子取代的乙基、未被取代或被少于3個(gè)鹵原子取代的乙烯基、乙炔基、炔炳基、甲?；⒁阴；?；被C(R)＝N-N(R2)R3、C(N＝N-U1)＝N-NH-U1、CH(R)-[N(R1)]n-N(R2)R3，C(R)(CN)OR4、C(R)＝N(O)NR3、CH(R)-O-N＝C(R1)R2、CH(R)-O-N＝C(CN)-CONH-R5，C(R6)＝N-(O)NR、CH(R)-Y-E-R3、CO-[C(OR)2]NQ、C(Q)＝CH-OR、或T-Q取代的乙?；?；n＝0、或1；X，Y＝O、或S；R，R1＝H、或C1-C2烷基；R3＝H、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基；C3-C7環(huán)烷基；芐基、或芳基U；R4＝H、C1-C6烷基、Si(C1-C6烷基)3、或OCOC1-C3烷基；R6＝N(R1)R2、肼或Q；E＝CO、或SO2；U和U1＝苯基；T＝C1-C2烯基、被NH2、OH、鹵原子取代的甲烯基、或被鹵原子或CN取代的乙烯基；Q＝COXR、或CN。
WO 9937636報(bào)道了一類有較好誘導(dǎo)抗性效果的苯并噻二唑衍生物，能誘導(dǎo)多種植物抵御稻瘟病，灰斑病，火疫病，白粉病，銹病，炭疽病等多種真菌，細(xì)菌和病毒引起的疾病。其結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(VI)。
呋喃、三唑、或這些雜環(huán)可被苯并或取代；R2＝H、CN、C1-C4烷基、C2-C4烯基、苯基、或呋喃；R3＝H、C1-C4烷基、羰基、芐基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基-羰基或 US6153763報(bào)道了另外一類苯并噻二唑衍生物的誘導(dǎo)抗性，生測(cè)結(jié)果顯示該類化合物對(duì)Plasmodiophoromycetes、Oomycetes、Basidiomycetes和Fungi imperfecti有較好的誘抗效果。Michael(2001)報(bào)道了該類化合物也能保護(hù)和免疫植物抗害蟲(chóng)、螨和線蟲(chóng)。US6153763公開(kāi)的苯并噻二唑衍生物的結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(VII)。
或 R1＝H、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、苯基、氰基-C1-C4烷基、C1-C2-烷氧基-C1-C4烷基、C1-C2-烷硫基-C1-C4烷基、C1-C2-烷氧羰基-C1-C4烷基、C2-C4烯基、苯基、鹵原子取代的苯基或C1-C4烷基取代的苯基；R2，R3＝H、或C1-C4烷基。
國(guó)內(nèi)關(guān)于對(duì)BTH化學(xué)結(jié)構(gòu)式改造的文獻(xiàn)較少。CN 1389114A及侯學(xué)太等人(侯學(xué)太等，N-烷基-苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺類化合物的合成及生物活性農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3(2)19-23)披露了合成新的N-烷基-苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺類和苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼類衍生物。
其中，R＝C3-C18的直鏈或支鏈烷基以及含雜環(huán)的酰氨基。其中部分化合物表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)黃瓜抗黃瓜灰霉病的效果。
以上專利公開(kāi)的苯并噻二唑衍生物，均未涉及其誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒(簡(jiǎn)稱TMV)的活性，也未進(jìn)行過(guò)相關(guān)的生物活性篩選的研究。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)對(duì)BTH的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造并用于誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的誘導(dǎo)抗病活性的篩選的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并噻二唑衍生物及其合成方法和誘導(dǎo)抗病活性的篩選。
本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并噻二唑衍生物具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 其中，R為I.氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氨衍生物類 或 或II.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的雙酰肼衍生物類 或 或III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物類 或 或IV.硫代苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸酯類 本發(fā)明的誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并噻二唑衍生物的合成方法如下總的合成路線是
具體分為以下步驟A.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸的來(lái)源，選用以下三種方法中的任意一種I.采用公知的方法制備苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸，合成路線是 II.采用下列方法合成上述的中間體3-氨基-2-巰基苯甲酸 在250mL的三口瓶安裝上回流冷凝管，溫度計(jì)和機(jī)械攪拌，將所需量的2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑懸浮于乙二醇中，每克2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑約需12mL乙二醇，一次性加入氫氧化鉀，每克2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑約需加1.30g的氫氧化鉀，加熱到160℃反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)在常壓下進(jìn)行，然后冷卻至室溫，將反應(yīng)混合物倒入約3倍體積的水中，用醋酸調(diào)pH＝2，過(guò)濾生成固體產(chǎn)品，反應(yīng)收率為64.9％，再進(jìn)一步利用中間體3-氨基-2-巰基苯甲酸采用公知的方法合成苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸；III.采用商品化的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸；B.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制備在500mL的三口瓶中加入所需量的由A步制取的或直接購(gòu)進(jìn)商品化的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸、及經(jīng)過(guò)無(wú)水處理的甲苯、DMF和二氯亞砜，每克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸約加入7.4mL經(jīng)過(guò)無(wú)水處理的甲苯、0.037mL的DMF和0.7mL的二氯亞砜，緩慢升溫度至80～90℃，保持此溫度繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液減壓蒸除多余的二氯亞砜并脫溶得產(chǎn)品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯，產(chǎn)品無(wú)須純化并保存在干燥器中備下一步反應(yīng)直接使用；C.誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的制備I.氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氨衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol氨基氰、20mL二氯甲烷和8mmol的三乙胺，在冰浴下滴加5mmol的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物，然后用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為2∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮??；II.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的雙酰肼衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol酰肼、3滴DMF，10mL無(wú)水1，2-二氯乙烷和7.2mmol三乙胺加熱回流下，慢慢滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反應(yīng)溫度80～90℃，繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，冷卻，分別用稀鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，水洗后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物，用體積比為甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重結(jié)晶得到純品，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮?。?
III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol胺、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和5mmol氫化鈉，制備相應(yīng)胺的鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)并冷卻混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2小時(shí)，逐漸升溫并回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為3∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮??；IV.硫代苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸酯的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol巰基雜環(huán)、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和5mmol氫化鈉，制備相應(yīng)胺的鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)并冷卻混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2小時(shí)，逐漸升溫并回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為3∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮小。
本發(fā)明的苯并噻二唑衍生物用于誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒，其誘導(dǎo)抗病活性的篩選方法如下I.標(biāo)準(zhǔn)植物抗病激活劑的選擇選擇苯并噻二唑和DL-β-氨基丁酸為標(biāo)準(zhǔn)的植物抗病激活劑，離體篩選采用2000、1000、500、100、50、10μg/mL 6個(gè)濃度梯度；直接的活體抗病效果篩選采用500μg/mL；活體誘導(dǎo)效果的評(píng)價(jià)苯并噻二唑采用100、50、10μg/mL 3個(gè)濃度梯度，DL-β-氨基丁酸采用2000、1000、500、100μg/mL 4個(gè)濃度梯度；II.離體直接抗病毒活性的篩選方法按所需濃度稱量供試化合物，加入5滴，約80μL丙酮或3滴，約50μL二甲基甲酰胺使其溶解，兌入含有微量表面活性劑土溫80的清水，配成500μg/mL的溶液，用磷酸緩沖液將TMV病毒粗提液稀釋至適宜的濃度，摩擦接種于撒有金剛砂的適齡葉片，待葉面收干，剪下，沿葉片中脈對(duì)剖，左右半葉分別浸入供試化合物溶液和清水中，分別代表處理和空白對(duì)照，30分鐘后取出，置搪瓷盤(pán)中，控制溫度23±1℃，并在光照下保濕培養(yǎng)，使病毒與藥液、寄主葉片組織同時(shí)接觸，3天后觀察其產(chǎn)生枯斑的數(shù)量，記錄發(fā)病情況，按下式計(jì)算出供試化合物抗TMV的直接相對(duì)效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，除空白對(duì)照外再設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照；測(cè)試化合物的相對(duì)效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為，A級(jí)相對(duì)效果＞50％，為優(yōu)；B級(jí)相對(duì)效果30～50％，為良；C級(jí)相對(duì)效果20～30％，為中；D級(jí)相對(duì)效果＜20％，為差，X=CK-ACK×100]]>其中，X為化合物對(duì)TMV的直接抑制率或相對(duì)效果，單位％CK為清水對(duì)照半葉的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)A為藥劑處理半葉的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)；III.活體直接抗病毒活性的篩選方法將苗齡一致的普通煙，3盆為一組，先在煙葉上摩擦接種TMV，立即噴施供試化合物溶液，將煙苗置于其生長(zhǎng)適宜溫度及光照下培養(yǎng)3天后，檢查發(fā)病情況，綜合病斑數(shù)目，按下式計(jì)算出供試化合物對(duì)TMV的直接抗病毒效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，對(duì)照分空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照2種；測(cè)試化合物的直接抗病毒效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為A級(jí)抗病毒效果＞50％，為優(yōu)；B級(jí)抗病毒效果50～30％，為良；C級(jí)抗病毒效果20～30％，為差；D級(jí)抗病毒效果＜20％視為無(wú)直接的抗病毒效果，Y=CK-TCK×100]]>其中，Y為新化合物抗TMV活性的直接效果，單位％CK為清水對(duì)照葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)T為經(jīng)化合物處理后葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)；IV.活體誘導(dǎo)抗病毒活性的篩選方法將苗齡一致的普通煙，3盆為一組，分別于接種前7天前處理過(guò)的煙苗，處理方式包括噴施供試化合物溶液2到3次，每次20mL，或灌根處理煙苗2到3次，每次20mL，第7天于新長(zhǎng)出的煙葉上摩擦接種TMV，將煙苗置于其生長(zhǎng)適宜溫度及光照下培養(yǎng)3天后，檢查發(fā)病情況，綜合病斑數(shù)目按下式計(jì)算出供試化合物對(duì)TMV的誘導(dǎo)抗病毒效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，對(duì)照分空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照2種；測(cè)試化合物的相對(duì)效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為A級(jí)誘導(dǎo)效果＞70％，為優(yōu)；B級(jí)誘導(dǎo)效果70～50％，為良；C級(jí)誘導(dǎo)效果30～50％，為差；D級(jí)誘導(dǎo)效果＜30％視為無(wú)誘導(dǎo)效果，R=CK-ICK×100]]>其中，R為新化合物對(duì)煙草抗TMV的誘導(dǎo)效果，單位％CK為清水對(duì)照葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)I為經(jīng)化合物誘導(dǎo)處理后葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)。
上述篩選方法也可以用于標(biāo)準(zhǔn)化合物。
本發(fā)明的有益效果是苯并噻二唑是一種標(biāo)準(zhǔn)的植物抗病激活劑，利用本發(fā)明的苯并噻二唑衍生物成功誘導(dǎo)了煙草植株對(duì)TMV產(chǎn)生很好的抗病毒活性，具體效果見(jiàn)實(shí)施例18～實(shí)施例21；本發(fā)明還針對(duì)國(guó)內(nèi)的狀況首次建立了科學(xué)合理和規(guī)范化的植物抗病激活劑生物活性篩選和評(píng)價(jià)體系，具體的生物活性篩選和評(píng)價(jià)體系見(jiàn)上述的“本發(fā)明的苯并噻二唑衍生物用于誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒，其誘導(dǎo)抗病活性的篩選方法”及下面的實(shí)施例18。分析實(shí)施例18、實(shí)施例19和實(shí)施例20得出以下結(jié)論離體條件具備抗病毒活性的物質(zhì)不叫植物抗病激活劑；離體條件下無(wú)抗病毒活性、但活體條件下有直接的抗病毒作用的化合物也不叫植物抗病激活劑；只有在離體和活體條件下同時(shí)不具備直接的抗病毒活性，而在活體誘導(dǎo)條件下具有抗病毒活性的物質(zhì)或化合物才是植物抗病激活劑。對(duì)比試驗(yàn)證明，本發(fā)明的部分苯并[1，2，3]噻二唑衍生物對(duì)煙草的誘導(dǎo)活性與BTH基本一致而較BABA高，因此，進(jìn)行新型植物激活劑的篩選最好選擇本發(fā)明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物為標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理的對(duì)照，本發(fā)明完全可用于創(chuàng)制新型植物抗病激活劑誘導(dǎo)抗病生物活性的篩選和已知植物抗病激活劑之間誘導(dǎo)活性的效果評(píng)價(jià)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1合成3-氨基-2-巰基苯甲酸在250mL的三口瓶安裝上回流冷凝管，溫度計(jì)和機(jī)械攪拌，13.0g即62.44mmol的2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑懸浮于150mL乙二醇中，一次性加入17.0g的氫氧化鉀，加熱到160℃反應(yīng)20小時(shí)，然后冷卻至室溫，將反應(yīng)混合物倒入450mL水中，用醋酸調(diào)pH＝2，過(guò)濾生成的固體得到6.86g產(chǎn)品，反應(yīng)收率為64.9％。
實(shí)施例2利用中間體3-氨基-2-巰基苯甲酸合成苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸在500mL的三口瓶安裝上回流冷凝管，溫度計(jì)和機(jī)械攪拌，加入33.8g的3-氨基-2-巰基苯甲酸和18％的稀鹽酸280mL，控制溫度在-5℃，緩慢滴加含27.6g亞硝酸鈉配制的濃度為40％的水溶液，滴加時(shí)溫度不超過(guò)0℃，滴加完后在低溫下繼續(xù)反應(yīng)1～2小時(shí)，水洗，過(guò)濾得固體初產(chǎn)品36g。
實(shí)施例3苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制備在500mL的三口瓶中加入27.0g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸，200mL經(jīng)過(guò)無(wú)水處理的甲苯，1mL的DMF，20mL的SOCl2，緩慢升溫度至80～90℃，保持此溫度繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液減壓脫溶得產(chǎn)品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯28g，產(chǎn)品無(wú)須純化并保存在干燥器中備下一步反應(yīng)直接使用。
實(shí)施例4BBLFL8的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入1.98g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼、5滴DMF，20mL無(wú)水1，2-二氯乙烷和1.7mL三乙胺加熱回流下，慢慢滴加1.62g對(duì)氟苯甲酰氯與20mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反應(yīng)溫度80～90℃，繼續(xù)反應(yīng)3h。冷卻，分別用稀鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，水洗后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物2.28g，收率71.0％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重結(jié)晶得到純品。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合。
實(shí)施例5BBLFL9的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.66g對(duì)甲苯磺酰肼、3滴DMF，10mL無(wú)水1，2-二氯乙烷和0.49mL三乙胺加熱回流下，慢慢滴加0.7g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL 1，2二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反應(yīng)溫度80～90℃，繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。冷卻，分別用稀鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，水洗后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物0.74g，收率60.3％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重結(jié)晶得到純品。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合。
實(shí)施例6BBLFL14的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.80g 2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和0.24g氫化鈉，有氫氣放出，并形成鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)后，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2小時(shí)，然后回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮得粗產(chǎn)物1.04g，收率63.5％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合。
實(shí)施例7BBLFL17的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.65g 2-氨基-2，4-二甲基戊氰、20mL二氯甲烷和1mL三乙胺，在冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2h，回流3h，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物1.06g，收率73.0％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例8BBLFL18的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.85g 3-氨基-2-甲基-4-吡唑甲酸乙酯、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和0.24g氫化鈉，有氫氣放出，并形成鈉鹽懸浮液，回流3h后，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15ml絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2h，然后回流6h，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮得粗產(chǎn)物0.95g，收率57.2％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例9BBLFL19的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.42g 2-氨基-2，2-二甲基乙氰、20mL二氯甲烷和0.7mL三乙胺，在冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物0.75g，收率60.3％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例10BBLFL20的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.62g 1-氨基-1-氰基環(huán)己烷、20mL二氯甲烷和0.7mL三乙胺，在冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物0.89g，收率61.5％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例11BBLFL21的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入1.03g芳環(huán)取代的2-氨基-2-甲基苯丙氰、20mL二氯甲烷和0.7mL三乙胺，在冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物1.13g，收率61.5％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例12BBLFL22的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.81g 2-氨基-2-甲基苯丙氰、20mL二氯甲烷和0.60mL三乙胺，在冰浴下滴加1g即5mmol的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物0.97g，收率71.2％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例13BBLFL23的合成和結(jié)構(gòu)鑒定
實(shí)施例13BBLFL23的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.56g 2-氨基-2-甲基戊氰、20mL二氯甲烷和0.7mL三乙胺，在冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物0.98g，收率71.2％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例14BBLFL24的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.56g 2-氨基-2，3-二甲基丁氰、20mL二氯甲烷和0.7mL三乙胺，在冰浴下滴加1g即5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物1.05g，收率76.0％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M-1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例15BBLFL26的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.7g 2-巰基-4，6-二甲基嘧啶、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和0.24g氫化鈉，有氫氣放出，并形成鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)后，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯和15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃，冷卻下攪拌2小時(shí)，然后回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮得粗產(chǎn)物1.00g，收率65.4％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，元素分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M+1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例16BBLFL27的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.55g 2-氨基-4-甲基嘧啶、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和0.24g氫化鈉，有氫氣放出，并形成鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)后，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯和15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃，冷卻下攪拌2小時(shí)，然后回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮得粗產(chǎn)物0.11g，收率10.2％，然后用硅膠柱層析純分析結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)。該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合，MS出現(xiàn)相應(yīng)的M+1峰，IR出現(xiàn)相應(yīng)的骨架吸收峰。
實(shí)施例17BBLFL28的合成和結(jié)構(gòu)鑒定在100mL的三口瓶中加入0.58g 2-氨基-5-甲基噻二唑、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和0.24g氫化鈉，有氫氣放出，并形成鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)后，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯和15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃，冷卻下攪拌2小時(shí)，然后回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮得粗產(chǎn)物0.8g，收率57.6％，然后用硅膠柱層析純化得純品，洗脫劑為60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)見(jiàn)表2和表3，測(cè)定熔點(diǎn)和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)見(jiàn)表1、表2和表3，由表1、表2和表3可見(jiàn)，該化合物1H NMR顯示與其結(jié)構(gòu)相應(yīng)的化學(xué)位移，H的數(shù)目與其結(jié)構(gòu)吻合。
實(shí)施例18誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物誘導(dǎo)抗性篩選體系的測(cè)定利用本發(fā)明的誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物在上述“誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的生物活性的篩選方法”的條件下進(jìn)行離體煙草花葉病毒活性篩選，再在活體條件下進(jìn)行直接抗煙草花葉病毒活和誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒活性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，測(cè)定結(jié)果表明，BTH對(duì)離體煙草花葉病毒的活性均在10％以內(nèi)，活體的直接抗病毒效果在30％以內(nèi)，因此，BTH無(wú)直接的TMV抗病毒活性；BTH在10μg/mL以上就能誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生對(duì)TMV很好的抗病毒活性，且上壤灌根的誘導(dǎo)效果較葉面噴霧好，以上結(jié)果說(shuō)明，BTH具有植物抗病激活劑產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的特性。
實(shí)施例19對(duì)比試驗(yàn)植物激活劑BABA誘導(dǎo)抗性篩選體系的測(cè)定利用DL-β-氨基丁酸(BABA)在上述方法條件下進(jìn)行離體煙草花葉病毒活性篩選，再在活體條件下進(jìn)行直接抗煙草花葉病毒活和誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒活性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明，BABA對(duì)離體和活體煙草花葉病毒的直接抗病毒活性均在20％以內(nèi)，BABA無(wú)直接的TMV抗病毒活性；BABA只是在500μg/mL以上才能誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生對(duì)TMV的抗病毒活性，且土壤灌根的誘導(dǎo)效果較葉面噴霧好，說(shuō)明BABA具有植物抗病激活劑產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的特性，但其誘導(dǎo)的效果或強(qiáng)度均比本發(fā)明的誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物弱。
實(shí)施例20對(duì)比試驗(yàn)苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸和牛心撲子草的提取物對(duì)篩選體系的驗(yàn)證利用本發(fā)明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物在植物體內(nèi)的降解產(chǎn)物苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸和牛心撲子草提取物在上述方法條件下進(jìn)行離體煙草花葉病毒活性篩選，再在活體條件下進(jìn)行直接的抗病毒活性測(cè)定和誘導(dǎo)煙草抗TMV活性的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明的中使用的標(biāo)準(zhǔn)植物激活劑苯并[1，2，3]噻二唑以及本發(fā)明合成的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物在植株體內(nèi)的代謝物苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸無(wú)直接的離體煙草花葉病毒的活性，其離體的直接抑制率均在10％以下，活體的直接抗病毒效果均小于20％，也無(wú)直接的活體抗病毒效果；無(wú)論是土壤灌根還是葉面噴霧，苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸在1000μg/mL以上也不能誘導(dǎo)煙草植株產(chǎn)生對(duì)TMV產(chǎn)生抗病毒活性，因此，苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸不具備植物抗病激活劑產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病作用的活性，該化合物不是植物抗病激活劑。天然植物牛心撲子草的提取物對(duì)離體TMV有較高的抗病毒活性，5μg/mL就達(dá)到70％以上的離體抗病毒效果，高于目前商品化的所有抗病毒劑的活性，活體的抗病毒效果也基本與離體的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致，在20μg/mL以上就可以達(dá)到大于40％的活體抗病毒效果，因此，牛心撲的提取物是很好的TMV抑制劑；但無(wú)論是土壤灌根還是葉面噴霧，其活體誘導(dǎo)的抗病毒活性幾乎為0，因此，牛心撲子草的提取物不具備植物抗病激活劑產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病作用的特點(diǎn)，該提取物不是植物抗病激活劑。
實(shí)施例21本發(fā)明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的誘導(dǎo)抗病效果半葉枯斑法的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。表5表明，標(biāo)準(zhǔn)的植物抗病激活劑苯并[1，2，3]噻二唑和本發(fā)明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物除了BBLFL20外在離體條件下均對(duì)TMV無(wú)抑制作用；活體植株試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，表5的數(shù)據(jù)顯示，標(biāo)準(zhǔn)的植物抗病激活劑苯并[1，2，3]噻二唑和本發(fā)明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物除了BBLFL20外對(duì)活體TMV的直接作用效果均小于30％，因此，除了BBLFL20外，這些化合物無(wú)直接的活體抑制作用。誘導(dǎo)活性測(cè)定的結(jié)果表明，BBLFL8、BBLFL9、BBLFL17、BBLFL19、BBLFL26和BBLFL27葉面噴霧有較好的誘導(dǎo)效果，多數(shù)化合物土壤灌根也具有較好的誘導(dǎo)活性，且土壤灌根的誘導(dǎo)活性較葉面噴霧的效果好。特別值得指出的是，本發(fā)明合成的化合物BBLFL8、BBLFL9、BBLFL26和BBLFL27其誘導(dǎo)效果與商品化的品種BTH活性基本相當(dāng)，而B(niǎo)ABA的誘導(dǎo)活性明顯低于相同濃度的BTH。
化合物BBLFL20本身具有離體和活體的抗病毒效果，離體抗病毒活性大于80％，活體抗病毒活性大于85％，土壤處理和葉面噴霧均無(wú)誘導(dǎo)活性，因此，BBLFL20不具備植物抗病激活劑產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病作用的特點(diǎn)，該化合物不是誘導(dǎo)抗病劑，而是抗病毒劑，該化合物有待于進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。
表1本發(fā)明化合物的代號(hào)和結(jié)構(gòu)式

表2本發(fā)明化合物的分子式、R基團(tuán)結(jié)構(gòu)式和理化參數(shù)產(chǎn)率 元素分析(實(shí)驗(yàn)值/理論值)化合物 R 外觀 分子式 m.p./℃％ C H NBBLFL8淡黃色晶體 C14H9FN4O2S250～251 71.0BBLFL9 淡黃色晶體 C14H12N4O3S2255～257 60.3BBLFL14 淡黃色晶體 C13H11N5O3S227～229 63.5BBLFL17 無(wú)色晶體C14H16N4OS 131 73.0 58.20(58.31) 5.62(5.59) 19.58(19.43)BBLFL18 無(wú)色晶體C14H15N5O3S217～218 57.2 50.75(50.75) 4.07(3.95) 21.19(21.14)BBLFL19 淡黃色晶體 C14H12N4O3S2255～257 60.3 53.53(53.64) 4.18(4.09) 22.58(22.75)BBLFL20無(wú)色晶體 C16H18N4OS 209～211 61.5 59.05(59.01) 3.87(3.85) 15.40(15.29)BBLFL21 無(wú)色晶體 C16H18N4OS 209～211 61.5 59.05(59.01) 3.87(3.85) 15.40(15.29)BBLFL22 無(wú)色晶體 C14H15ClN4OS 183～184 71.2 63.21(63.33) 4.38(4.38) 17.52(17.38)BBLFL23 無(wú)色晶體 C14H15ClN4OS183～184 71.2 63.21(63.33) 4.38(4.38) 17.52(17.38)BBLFL24 無(wú)色晶體 C15H18N4O3S 139～141 76.0 57.14(56.91) 5.59(5.14) 20.42(20.42)BBLFL26 無(wú)色晶體 C15H18N4OS 197～199 65.4 51.41(51.64) 3.40(3.33) 18.68(18.53)BBLFL27 淡黃色晶體C19H11N7O2S2202～203 10.2％ 52.48(52.65) 2.69(2.56) 22.51(22.62)BBLFL28無(wú)色晶體 C10H7N5OS2175～176 57.6
表3本發(fā)明化合物的1H NMR和MS以及IR數(shù)據(jù)

本發(fā)明的甲殼低聚糖的核磁譜圖分析，見(jiàn)圖5 圖中2.04 ppm的基團(tuán)峰是由于乙酰氨基未脫干凈，其上的甲基峰；其他氫(H2～H6)的基團(tuán)峰主要在3.2～4.2ppm。如表3表3 低聚糖核磁譜圖H的位移

表5新化合物誘導(dǎo)煙草對(duì)煙草花葉病毒的抗病毒效果

權(quán)利要求
1.苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 其中，R為 或
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
6.權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物的合成方法，其特征在于總的合成路線是 具體分為以下步驟A.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸的來(lái)源，選用以下三種方法中的任意一種I.采用公知的方法制備苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸，合成路線是 II.采用下列方法合成上述的中間體3-氨基-2-巰基苯甲酸在250mL的三口瓶安裝上回流冷凝管，溫度計(jì)和機(jī)械攪拌，將所需量的2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑懸浮于乙二醇中，每克2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑約需12mL乙二醇，一次性加入氫氧化鉀，每克2-氨基-7-甲氧羰基苯并噻唑約需加1.30g的氫氧化鉀，加熱到160℃反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)在常壓下進(jìn)行，然后冷卻至室溫，將反應(yīng)混合物倒入約3倍體積的水中，用醋酸調(diào)pH＝2，過(guò)濾生成固體產(chǎn)品，反應(yīng)收率為64.9％，再進(jìn)一步利用中間體3氨基-2-巰基苯甲酸采用公知的方法合成苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸；III.采用商品化的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸；B.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制備在500mL的三口瓶中加入所需量的由A步制取的或直接購(gòu)進(jìn)商品化的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸、及經(jīng)過(guò)無(wú)水處理的甲苯、DMF和二氯亞砜，每克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸約加入7.4mL經(jīng)過(guò)無(wú)水處理的甲苯、0.037mL的DMF和0.7mL的二氯亞砜，緩慢升溫度至80～90℃，保持此溫度繼續(xù)反應(yīng)6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液減壓蒸除多余的二氯亞砜并脫溶得產(chǎn)品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯，產(chǎn)品無(wú)須純化并保存在干燥器中備下一步反應(yīng)直接使用；C.誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的制備I.氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氨衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol氨基氰、20mL二氯甲烷和8mmol的三乙胺，在冰浴下滴加5mmol的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL二氯甲烷溶液，滴完后室溫反應(yīng)2小時(shí)，回流3小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物，然后用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為2∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮??；II.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的雙酰肼衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol酰肼、3滴DMF，10mL無(wú)水1，2-二氯乙烷和7.2mmol三乙胺加熱回流下，慢慢滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯與10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反應(yīng)溫度80～90℃，繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，冷卻，分別用稀鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，水洗后，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后，減壓脫溶得粗產(chǎn)物，用體積比為甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重結(jié)晶得到純品，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮??；III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol胺、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和5mmol氫化鈉，制備相應(yīng)胺的鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)并冷卻混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2小時(shí)，逐漸升溫并回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為3∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮??；IV.硫代苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸酯的制備在100mL的三口瓶中加入5mmol巰基雜環(huán)、絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃25mL和5mmol氫化鈉，制備相應(yīng)胺的鈉鹽懸浮液，回流3小時(shí)并冷卻混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL絕對(duì)無(wú)水四氫呋喃溶液，冷卻下攪拌2小時(shí)，逐漸升溫并回流6小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，用硅膠柱層析純化得純品，所用洗脫劑為60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它們的體積比為3∶1，上述化合物的用量可以按相應(yīng)比例擴(kuò)大或縮小。
7.權(quán)利要求1所述的苯并噻二唑衍生物用于誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒，其誘導(dǎo)抗病活性的篩選方法如下I.標(biāo)準(zhǔn)植物抗病激活劑的選擇選擇苯并噻二唑和DL-β-氨基丁酸為標(biāo)準(zhǔn)的植物抗病激活劑，離體篩選采用2000、1000、500、100、50、10μg/mL 6個(gè)濃度梯度；直接的活體抗病效果篩選采用500μg/mL；活體誘導(dǎo)效果的評(píng)價(jià)苯并噻二唑采用100、50、10μg/mL 3個(gè)濃度梯度，DL-β-氨基丁酸采用2000、1000、500、100μg/mL 4個(gè)濃度梯度；II.離體直接抗病毒活性的篩選方法按所需濃度稱量供試化合物，加入5滴，約80μL丙酮或3滴，約50μL二甲基甲酰胺使其溶解，兌入含有微量表面活性劑土溫80的清水，配成500μg/mL的溶液，用磷酸緩沖液將TMV病毒粗提液稀釋至適宜的濃度，摩擦接種于撒有金剛砂的適齡葉片，待葉面收干，剪下，沿葉片中脈對(duì)剖，左右半葉分別浸入供試化合物溶液和清水中，分別代表處理和空白對(duì)照，30分鐘后取出，置搪瓷盤(pán)中，控制溫度23±1℃，并在光照下保濕培養(yǎng)，使病毒與藥液、寄主葉片組織同時(shí)接觸，3天后觀察其產(chǎn)生枯斑的數(shù)量，記錄發(fā)病情況，按下式計(jì)算出供試化合物抗TMV的直接相對(duì)效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，除空白對(duì)照外再設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照；測(cè)試化合物的相對(duì)效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為，A級(jí)相對(duì)效果＞50％，為優(yōu)；B級(jí)相對(duì)效果30～50％，為良；C級(jí)相對(duì)效果20～30％，為中；D級(jí)相對(duì)效果＜20％，為差，X=CK-ACK×100]]>其中，X為化合物對(duì)TMV的直接抑制率或相對(duì)效果，單位％CK為清水對(duì)照半葉的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)A為藥劑處理半葉的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)；III.活體直接抗病毒活性的篩選方法將苗齡一致的普通煙，3盆為一組，先在煙葉上摩擦接種TMV，立即噴施供試化合物溶液，將煙苗置于其適宜溫度及光照下培養(yǎng)3天后，檢查發(fā)病情況，綜合病斑數(shù)目，按下式計(jì)算出供試化合物對(duì)TMV的直接抗病毒效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，對(duì)照分空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照2種；測(cè)試化合物的直接抗病毒效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為A級(jí)抗病毒效果＞50％，為優(yōu)；B級(jí)抗病毒效果50～30％，為良；C級(jí)抗病毒效果20～30％，為差；D級(jí)抗病毒效果＜20％視為無(wú)直接的抗病毒效果，Y=CK-TCK×100]]>其中，Y為新化合物抗TMV活性的直接效果，單位％CK為清水對(duì)照葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)T為經(jīng)化合物處理后葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)；IV.活體誘導(dǎo)抗病毒活性的篩選方法將苗齡一致的普通煙，3盆為一組，分別于接種前7天前處理過(guò)的煙苗，處理方式包括噴施供試化合物溶液2到3次，每次20ml，或灌根處理煙苗2到3次，每次20ml，第7天于新長(zhǎng)出的煙葉上摩擦接種TMV，將煙苗置于其生長(zhǎng)適宜溫度及光照下培養(yǎng)3天后，檢查發(fā)病情況，綜合病斑數(shù)目按下式計(jì)算出供試化合物對(duì)TMV的誘導(dǎo)抗病毒效果，每一處理設(shè)3次重復(fù)，對(duì)照分空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理對(duì)照2種；測(cè)試化合物的相對(duì)效果分為4級(jí)A、B、C、D，具體數(shù)據(jù)為A級(jí)誘導(dǎo)效果＞70％，為優(yōu)；B級(jí)誘導(dǎo)效果70～50％，為良；C級(jí)誘導(dǎo)效果30～50％，為差；D級(jí)誘導(dǎo)效果＜30％視為無(wú)誘導(dǎo)效果，R=CK-ICK×100]]>其中，R為新化合物對(duì)煙草抗TMV的誘導(dǎo)效果，單位％CK為清水對(duì)照葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)I為經(jīng)化合物誘導(dǎo)處理后葉片的平均枯斑數(shù)，單位個(gè)。
全文摘要
一種苯并噻二唑衍生物及其合成方法和誘導(dǎo)抗病活性的篩選，涉及與碳環(huán)稠合的含1，2－二唑的雜環(huán)化合物，它具有右式化學(xué)結(jié)構(gòu)式，其中包括7種氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑－7－甲酰氨衍生物，2種含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的雙酰肼衍生物，4種苯并[1，2，3]噻二唑－7－甲酰胺衍生物及1種硫代苯并[1，2，3]噻二唑－7－甲酸酯。本發(fā)明公開(kāi)了這些化合物的合成方法和誘導(dǎo)抗病活性的篩選。利用本發(fā)明的苯并噻二唑衍生物成功誘導(dǎo)了煙草植株對(duì)TMV產(chǎn)生很好的抗病毒活性，并首次建立了科學(xué)合理和規(guī)范化的植物抗病激活劑生物活性篩選和評(píng)價(jià)體系。
文檔編號(hào)C07D417/00GK1680342SQ20051001311
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日
發(fā)明者范志金, 劉鳳麗, 劉秀峰, 聶開(kāi)晟, 范志銀, 鮑麗麗, 張永剛, 李正名 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)