專利名稱：標(biāo)記河豚毒素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及放射標(biāo)記的河豚毒素及其在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)特別是藥代動(dòng)力學(xué)、藥學(xué)研究用試劑中的應(yīng)用，特別涉及標(biāo)記河豚毒素的制備方法以及它在器官和組織放射自顯影試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
河豚毒素產(chǎn)品，由于其獨(dú)特的藥理作用，受到了人們的廣泛的關(guān)注和重視。早在20世紀(jì)三十年代，就已有人用粗制河豚毒素提取物，進(jìn)行生物堿類藥物成癮性綜合癥(俗稱“戒毒”)的臨床治療。在中草藥大詞典中也有關(guān)于以河豚籽入藥的詞條。在以后的幾十年來，國內(nèi)外不斷有使用河豚毒素治療諸如鎮(zhèn)痛、戒毒、鎮(zhèn)靜等等的報(bào)道。但迄今為止河豚毒素還未被作為正式臨床用藥而獲批準(zhǔn)。綜觀其主要原因，是因?yàn)閷?duì)河豚毒素的藥理學(xué)研究、藥理學(xué)作用原理和藥代動(dòng)力學(xué)分析等還不夠充分明確。因而制約了河豚毒素作為正式臨床用藥的發(fā)展。
河豚毒素若將作為正式獲得批準(zhǔn)的臨床用藥，就必須完成理化分析、藥理學(xué)試驗(yàn)、藥效學(xué)研究等等一系列大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。河豚毒素本身是一個(gè)劇毒物質(zhì)(LD50＝10ug/kg腹腔注射)。因而在藥物試驗(yàn)過程中的使用劑量是極低的，若藥物再分布到機(jī)體的各器官組織中時(shí)，其藥物含量是無法用常規(guī)的儀器和檢測(cè)手段來進(jìn)行準(zhǔn)確分析測(cè)定。因此，一般傳統(tǒng)的藥理學(xué)試驗(yàn)方法，根本無法完成藥理、藥效學(xué)研究中，藥物代謝、藥物在體內(nèi)的分布和藥物殘留等一系列必須完成的試驗(yàn)分析。有人曾報(bào)道采用數(shù)學(xué)模擬計(jì)算的方法，得到藥物動(dòng)力學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果。(顏松民海洋藥物雜志，1985；2.)但該方法僅能通過計(jì)算死亡機(jī)率，來求證藥物動(dòng)力學(xué)。它不能證實(shí)藥物的代謝、分布和殘留等重要問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決采用一般傳統(tǒng)的藥理學(xué)試驗(yàn)方法，根本無法完成河豚毒素在藥理、藥效學(xué)研究中的藥物代謝、藥物在體內(nèi)的分布和藥物殘留等一系列必須完成的試驗(yàn)分析的問題，提供一種標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品及其制備方法和在動(dòng)物體內(nèi)給藥后、確定河豚毒素在體內(nèi)分布、代謝及藥物殘留的檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的標(biāo)記河豚毒素，是以同位素3H標(biāo)記河豚毒素，即其中至少一個(gè)氫原子被3H取代。本發(fā)明包括一、標(biāo)記河豚毒素的制備
1)精確稱取待標(biāo)記的河豚毒素產(chǎn)品；2)加入精確稱取的催化劑5％鈀—炭，其加入量按重量計(jì)為，待標(biāo)記物∶催化劑＝1∶2-2.5；3)按重量體積比mg/ml加入二氧六環(huán)1∶0.1-1和2.5％HCl甲醇溶液0.1-0.5；4)將上述試劑置于同一反應(yīng)瓶中，并連接到真空系統(tǒng)上，用液氮冷卻反應(yīng)瓶；5)將系統(tǒng)抽真空至10-3mmHg，通入與待標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的、豐度為1-5％氚—?dú)浠旌蠚怏w，通入量為1∶1ml 1-5％氚—?dú)浠旌蠚怏w；6)通入氚—?dú)錃怏w后，解凍反應(yīng)瓶，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4小時(shí)；7)反應(yīng)結(jié)束后，將剩余的氚—?dú)浠厥盏解櫡燮績?nèi)；8)從氚化系統(tǒng)上取下反應(yīng)瓶，將反應(yīng)液減壓抽濾干燥；9)用熱水洗干燥物，抽濾除去熱水；每次用熱水1-5倍，重復(fù)3~5次，以除去不穩(wěn)定的氚；10)經(jīng)熱水洗后的干燥物，使用1∶1pH＝4.5的檸檬酸鹽水溶液溶解濾去不溶物，將標(biāo)記物調(diào)整為1mg/ml，即得標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品。
本法所制備的3H-河豚毒素產(chǎn)品為無色透明液體，產(chǎn)品每毫升含3H-河豚毒素1mg，每毫升含相當(dāng)于1個(gè)毫居里的放射性，產(chǎn)品經(jīng)薄層檢測(cè)與未標(biāo)記河豚毒素相同，標(biāo)記后河豚毒素與未標(biāo)記河豚毒素生物活性一致。
二、標(biāo)記河豚毒素的檢測(cè)1、薄層(紙層析)層析色譜法按常規(guī)方法制備薄層硅膠板和紙板，將河豚毒素產(chǎn)品和標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品分別點(diǎn)樣，點(diǎn)樣前樣品需經(jīng)事先預(yù)處理。(處理方法為分別取3H-TTX和TTX樣品各100μl。加入100μl 1.5N NaOH加熱水解，40分鐘后，立即點(diǎn)樣、展開。)用展開劑展開(展開劑為正丁醇+醋酸+水＝4∶1∶2)用紫外光檢測(cè)230nm光斑位置，或?qū)⒄归_后硅膠板到160℃烘干20分鐘，檢測(cè)斑點(diǎn)。結(jié)果顯示標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品與未標(biāo)記產(chǎn)品薄層展開位置相同，說明二者無明顯區(qū)別。
2、放射性測(cè)定為測(cè)定3H標(biāo)記物對(duì)河豚毒素的標(biāo)記結(jié)果，分別量取3H-TTX500μl(1μg/ml標(biāo)記河豚毒素)和1μg/ml TTX樣品500μl，各加入通用閃爍計(jì)數(shù)液4.5ml混勻后進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)，以通用閃爍計(jì)數(shù)液作為測(cè)定本底，測(cè)定結(jié)果為標(biāo)記河豚毒素γ-液閃計(jì)數(shù)90631未標(biāo)記河豚毒素γ-液閃計(jì)數(shù)21結(jié)果證實(shí)標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品已標(biāo)記3H標(biāo)記物。
3、LD50(半致死劑量測(cè)定)采用改良寇氏法(陳奇；中藥藥理研究方法人民衛(wèi)生出版社1994；114)分別對(duì)標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品和未標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品進(jìn)行LD50測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為3H-TTX LD50＝10.30μg/kgTTX LD50＝10.87μg/kg二者結(jié)果顯示標(biāo)記后河豚毒素產(chǎn)品與標(biāo)記前河豚毒素產(chǎn)品結(jié)果基本一致，表明河豚毒素在用3H標(biāo)記后產(chǎn)品生物活性未改變。
三、標(biāo)記河豚毒素在動(dòng)物體內(nèi)給藥后、確定河豚毒素在體內(nèi)分布、代謝及藥物殘留的檢測(cè)中的應(yīng)用選取一組動(dòng)物小鼠，以標(biāo)記河豚毒素1μg/ml注射小鼠，肌肉注射140μl/只；分別在第一天給藥后，于第2、3、4、5、6、7天按上步給藥一次，同時(shí)逐日處死部分動(dòng)物；采集已處死的各部分動(dòng)物組織器官；將各器官組織0.5g，加入0.5ml通用閃爍液，用玻璃研磨器分別各自充分研磨組織，研磨至漿狀，放入炮彈管內(nèi)高速離心，12000轉(zhuǎn)/分，2分鐘；吸取離心后上清0.5ml，再加入通用閃爍液4.5ml，用γ-液閃儀計(jì)數(shù)，得出各組織器官分布、殘留河豚毒素的結(jié)果。(見附表)，該試驗(yàn)結(jié)果顯示3H-標(biāo)記河豚毒素(3H-TTX)對(duì)組織、器官具有特異性親合作用，因此可以作為制備用于組織和器官放射自顯影試劑，用于準(zhǔn)確、直觀的定位河豚毒素在體內(nèi)的分布、殘留、積累，以及河豚毒素在體內(nèi)的代謝狀況，從根本上解決了分析河豚毒素藥品的藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)，所需使用樣品的微劑量問題，同時(shí)，標(biāo)記河豚毒素還可以通過同位素示蹤的方法，了解河豚毒素的作用靶向器官，為研究河豚毒素的戒毒、鎮(zhèn)痛機(jī)理等，提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)手段及所需的試劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明所公開的標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品可利用藥代動(dòng)力學(xué)原理，證實(shí)河豚毒素藥物在體內(nèi)分布、藥物代謝、藥物殘留及藥物與療效之間的關(guān)系等一系列使用其它試驗(yàn)手段而無法解決的相關(guān)課題。本發(fā)明產(chǎn)品，可以準(zhǔn)確、直觀的定位河豚毒素在體內(nèi)的分布、殘留、積累，以及河豚毒素在體內(nèi)的代謝狀況。從根本上解決了分析河豚毒素藥品的藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)，所需使用樣品的微劑量問題。同時(shí)，標(biāo)記河豚毒素還可以通過同位素示蹤的方法，了解河豚毒素的作用靶向器官，為研究河豚毒素的戒毒、鎮(zhèn)痛機(jī)理等，提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)手段及所需的試劑。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1、一、標(biāo)記河豚毒素的制備1)精確稱取河豚毒素50mg(約為0.00017mg分子)和5％鈀—炭催化劑120mg置反應(yīng)瓶中；2)再加入25ml二氧六環(huán)和12ml 2.0％Hcl甲醇溶液；3)將反應(yīng)瓶與真空系統(tǒng)連接，用液氮容器冷凍反應(yīng)瓶，同時(shí)將反應(yīng)瓶抽真空至10-3mmHg，這時(shí)通入50ml豐度為1-5％氚—?dú)浠旌蠚怏w；4)解凍反應(yīng)瓶，在室溫條件下用磁力攪拌器，攪拌反應(yīng)4小時(shí)；5)反應(yīng)結(jié)束，將剩余氚氣回收到鈾粉瓶內(nèi)保存；6)從真空系統(tǒng)上取下反應(yīng)瓶減壓蒸發(fā)至干，用熱水80℃ 10ml洗干燥物3次(每次用抽濾方法除去熱水)；7)pH＝4.5檸檬酸鹽溶液50ml，溶解干燥物；抽濾除去殘?jiān)脴?biāo)記河豚毒素產(chǎn)品50ml。(1mg/ml)該標(biāo)記河豚毒素可用作器官和組織的放射自顯影試劑。
實(shí)例2、標(biāo)記河豚毒素在體內(nèi)的分布、代謝及藥物殘留的檢測(cè)1)取標(biāo)記河豚毒素100μl(1mg/ml)稀釋至1μg/ml；2)注射小鼠，肌肉注射(后退大腿內(nèi)側(cè)肌)140μl/只，各組給藥方式見附表1；
3)分別在第一天給藥后，于第2、3、4、5、6、7天給藥一次，給藥量同上步，同時(shí)處死一部分動(dòng)物。采集各部分動(dòng)物組織器官(包括血、大腸、胃小腸、腎、糞便、心、腦、肺、肝等)；4)取各器官組織0.5g，加入0.5ml通用閃爍液，用玻璃研磨器分別各自充分研磨組織，研磨至漿狀，放入炮彈管內(nèi)高速離心。12000轉(zhuǎn)/分，2分鐘；5)吸取離心后上清0.5ml，再加入通用閃爍液4.5ml；6)將各提取樣本用γ-液閃儀計(jì)數(shù)，得出各部位存留河豚毒素結(jié)果(見附表)。
通過結(jié)果可以看出，河豚毒素在胃腸道的殘留積累最高(見附表)，這一結(jié)果與臨床上出現(xiàn)的病人用藥后，在第48小時(shí)開始有胃腸反應(yīng)的結(jié)果是一致的。同時(shí)結(jié)果還顯示，殘留與積累不隨給藥量而呈線性關(guān)系，表明體內(nèi)的代謝作用在后期有所增強(qiáng)。
附表 小鼠肌注3H-TTX給藥后，各組織同位素示蹤γ-計(jì)數(shù)
各組織同位素示蹤γ-計(jì)數(shù)
權(quán)利要求
1.一種標(biāo)記河豚毒素，其特征是以同位素3H標(biāo)記河豚毒素，即其中至少一個(gè)氫原子被3H取代。
2.一種權(quán)利要求1所述的標(biāo)記河豚毒素的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟1)精確稱取待標(biāo)記的河豚毒素產(chǎn)品；2)加入精確稱取的催化劑5％鈀—炭，其加入量按重量計(jì)為，待標(biāo)記物催化劑＝1∶2-2.5；3)按重量體積比mg/ml加入二氧六環(huán)1∶0.1-1和2.5％HCl甲醇溶液0.1-0.5；4)將上述試劑置于同一反應(yīng)瓶中，并連接到真空系統(tǒng)上，用液氮冷卻反應(yīng)瓶；5)將系統(tǒng)抽真空至10-3mmHg，通入與待標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的、豐度為1-5％氚—?dú)浠旌蠚怏w，通入量為1∶1ml 1-5％氚—?dú)浠旌蠚怏w；6)通入氚—?dú)錃怏w后，解凍反應(yīng)瓶，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4小時(shí)；7)反應(yīng)結(jié)束后，將剩余的氚—?dú)浠厥盏解櫡燮績?nèi)；8)從氚化系統(tǒng)上取下反應(yīng)瓶，將反應(yīng)液減壓抽濾干燥；9)用熱水洗干燥物，抽濾除去熱水；每次用熱水1-5倍，重復(fù)3-5次，以除去不穩(wěn)定的氚；10)經(jīng)熱水洗后的干燥物，用pH＝4.5的檸檬酸鹽水溶液溶解濾去不溶物，將標(biāo)記物調(diào)整為1mg/ml，即得標(biāo)記河豚毒素產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征是所制備的3H-河豚毒素產(chǎn)品為無色透明液體，產(chǎn)品每毫升含3H-河豚毒素1mg，每毫升含相當(dāng)于1個(gè)毫居里的放射性，產(chǎn)品經(jīng)薄層檢測(cè)與未標(biāo)記河豚毒素相同，標(biāo)記后河豚毒素與未標(biāo)記河豚毒素生物活性一致。
4.一種權(quán)利要求1所述的標(biāo)記河豚毒素的應(yīng)用，其特征是該標(biāo)記河豚毒素可用作器官和組織的放射自顯影試劑。
5.一種權(quán)利要求1所述的標(biāo)記河豚毒素在動(dòng)物體內(nèi)給藥后、確定河豚毒素在體內(nèi)分布、代謝及藥物殘留的檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于包括——選取一組動(dòng)物小鼠，以前述標(biāo)記河豚毒素1μg/ml注射小鼠，肌肉注射140μl/只；——分別在第一天給藥后，于第2、3、4、5、6、7天按上步給藥一次，同時(shí)逐日處死部分動(dòng)物；——采集已處死的各部分動(dòng)物組織器官；——將各器官組織0.5g，加入0.5ml通用閃爍液，用玻璃研磨器分別各自充分研磨組織，研磨至漿狀，放入炮彈管內(nèi)高速離心，12000轉(zhuǎn)/分，2分鐘；——吸取離心后上清0.5ml，再加入通用閃爍液4.5ml，用γ-液閃儀計(jì)數(shù)，得出各組織器官分布、殘留河豚毒素的結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用同位素
文檔編號(hào)C07D329/00GK1680383SQ20051001311
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日
發(fā)明者陳家童, 蘇同芳, 梁同春, 孫存禎, 林平生, 賀秉軍, 王同順 申請(qǐng)人:南開大學(xué)