專(zhuān)利名稱(chēng)：雞ibdv vp3蛋白b細(xì)胞抗原表位ⅰ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子的免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一系列雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位。
二.
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞的急性、高度接觸性、殺淋巴細(xì)胞性的傳染病，1957年在美國(guó)的Delaware州的Gumboro鎮(zhèn)的肉雞群中首次發(fā)生，又稱(chēng)甘布羅病，1962年Winterfield分離鑒定出IBDV。該病在美國(guó)及世界各國(guó)均有發(fā)生和流行，1988～1992年在我國(guó)大面積暴發(fā)流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，IBD是一種以體液免疫反應(yīng)為主的免疫損傷性疾病，IBDV屬于雙RNA病毒科(Birnaviridae)，禽雙RNA病毒屬(avianbirnavirus)，該病毒有兩個(gè)血清型，血清I型對(duì)雞致病，II型僅感染火雞但不致病，IBDV病毒粒子為單層衣殼，無(wú)囊膜，呈二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑為60-70nm，氯化銫中浮密度為1.31-1.34，對(duì)乙醚和氯仿不敏感，高度抗酸。
雞傳染性法氏囊病病毒IBDV為雙鏈RNA病毒，其基因組由A、B兩個(gè)片段組成。A片段由3200-3300bp核苷酸組成，B片段由2800-2900核苷酸組成。A片段含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架(ORF)和一個(gè)小ORF。大ORF編碼有1012個(gè)氨基酸組成的病毒前體多聚蛋白(polyprotein)，分子量約為110kD。該前體蛋白由VP3，VP4和VP3組成。小ORF編碼分子量約17kD的VP5蛋白。B片斷編碼病毒蛋白VP1，該蛋白為RNA依賴(lài)性的RNA聚合酶，與病毒的復(fù)制和組裝有關(guān)。
VP3蛋白為IBDV的主要保護(hù)性抗原，含有中和性B細(xì)胞抗原表位，保護(hù)性抗原是作為疫苗使用的推薦抗原。在保護(hù)性抗原中具有中和作用的B細(xì)胞抗原表位在刺激中和性抗體產(chǎn)生中起重要作用?？乖砦挥址Q(chēng)抗原決定簇，是指能夠被抗體、TCR/MHC復(fù)合物結(jié)合并識(shí)別的抗原片斷，其中，能夠被抗體結(jié)合并識(shí)別的抗原表位稱(chēng)為B細(xì)胞抗原表位；能夠被TCR/MHC復(fù)合物結(jié)合并識(shí)別的抗原表位稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞抗原表位。當(dāng)病毒抗原進(jìn)入機(jī)體后，保護(hù)性抗原與B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體分子sIgM和IgD結(jié)合而導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞活化和克隆化增值，并產(chǎn)生針對(duì)特異性B細(xì)胞抗原表位的抗體，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。因此，B細(xì)胞抗原表位決定著機(jī)體產(chǎn)生抗體的特異性，是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位，對(duì)特定病毒的蛋白質(zhì)抗原來(lái)說(shuō)，鑒定其B細(xì)胞抗原表位便是揭示病毒體液免疫的本質(zhì)。
蛋白質(zhì)抗原B細(xì)胞抗原表位鑒定中常用的方法有基因工程定點(diǎn)突變表達(dá)抗原蛋白分析法、隨機(jī)噬菌體肽庫(kù)技術(shù)和合成多肽檢測(cè)技術(shù)等。定點(diǎn)突變表達(dá)抗原蛋白方法是最常用的技術(shù)之一，該方法方便、簡(jiǎn)單、成本低，但是，該方法只能粗略地鑒定出蛋白質(zhì)抗原中發(fā)揮抗原性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，不能最終確定該抗原表位的最短氨基酸序列，也不能區(qū)分出該抗原表位是屬于線(xiàn)性表位還是構(gòu)像性表位。噬菌體肽庫(kù)技術(shù)能夠模擬表達(dá)與特異性配體結(jié)合的多肽序列，經(jīng)過(guò)多輪篩選后可以測(cè)序分析出與某一抗原特定抗體結(jié)合的抗原表位，不僅可以測(cè)定線(xiàn)性抗原表位，而且還能模擬構(gòu)像性抗原表位。合成多肽技術(shù)可以最明確地鑒定出某一蛋白抗原中特定的線(xiàn)性B細(xì)胞表位。本項(xiàng)發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)重疊(overlapping)表達(dá)IBDV的VP3結(jié)構(gòu)蛋白，用體外免疫反應(yīng)初步確定VP3中與特異性中和性單抗結(jié)合的區(qū)域；然后，應(yīng)用肽庫(kù)技術(shù)和overlapping合成多肽技術(shù)確定該結(jié)構(gòu)蛋白上的線(xiàn)性最短氨基酸序列及模擬構(gòu)像表位；最后，再應(yīng)用合成多肽技術(shù)驗(yàn)證表位的正確性。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一系列雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白中和性B細(xì)胞抗原表位。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為786H-Leu-Ser-Val-Phe-Met-Trp-Leu-OH 792。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列擴(kuò)展，擴(kuò)展后的多肽氨基酸序列為781H-Leu-Phe-Gln-Ser-Ala-Leu-Ser-Val-Phe-Met-Trp-Leu-Glu-Glu-Asn-Gly-OH 796。
一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為982H-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Asn-Ala-Pro-Thr-Gln-OH 993。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列擴(kuò)展，擴(kuò)展后的多肽氨基酸序列為977H-Pro-Arg-Arg-Ala-Leu-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Asn-Ala-Pro-Thr-Gln-Arg-Pro-Pro-Gly-Arg-Leu-Gly-OH 1000。
一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為818H-Leu-Ala-Asn-Ala-Pro-Gln-Ala-Gly-Ser-Lys-Ser-Gln-Arg-Ala-OH831。
一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為961H-Gln-Met-Lys-Asp-Leu-Leu-Leu-Thr-Ala-Met-Glu-Met-Lys-OH973。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位為合成多肽。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位為翻譯或轉(zhuǎn)錄該多肽的核苷酸序列。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位在N端或C端進(jìn)行化學(xué)修飾。
所述的化學(xué)修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
由本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位組成的免疫原或疫苗，至少包括權(quán)利要求中提及的一個(gè)抗原表位至全部抗原表位，這些多肽通過(guò)自身連接、相互連接或與載體連接，并輔以T細(xì)胞抗原表位，包括Th1和/或Th2表位多肽。這些T細(xì)胞抗原表位可以來(lái)源于雞傳染性法氏囊病病毒IBDV病毒蛋白或其它動(dòng)物蛋白中具有刺激機(jī)體細(xì)胞免疫活性的多肽序列。
檢測(cè)雞IBDV病毒可以應(yīng)用針對(duì)VP3的單克隆抗體或者應(yīng)用針對(duì)VP3多肽抗體，檢測(cè)方法可以包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、快速檢測(cè)試紙條免疫膜層析技術(shù)等。
檢測(cè)雞IBDV抗體，包括母源抗體、疫苗免疫抗體、野毒感染產(chǎn)生抗體、抗雞IBDV單克隆抗體等。檢測(cè)方法可以包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、快速檢測(cè)試紙條免疫膜層析技術(shù)等。
本發(fā)明的積極有益效果是1.由本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位設(shè)計(jì)的免疫原或疫苗免疫動(dòng)物機(jī)體后能夠產(chǎn)生針對(duì)IBDV的中和性抗體，并能夠在體內(nèi)或體外中和IBDV，阻止病毒感染動(dòng)物機(jī)體。
2.由本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位設(shè)計(jì)的免疫原或疫苗能夠在體內(nèi)或體外中和或預(yù)防雞IBD經(jīng)典毒株、超強(qiáng)毒株或/和變異毒株的感染。
3.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位與載體連接或自身連接或相互連接，能夠免疫動(dòng)物，在免疫動(dòng)物時(shí)產(chǎn)生的抗多肽抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體能夠在體內(nèi)外中和雞傳染性法氏囊病病毒IBDV并產(chǎn)生免疫保護(hù)。
4.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位或其連接物在免疫動(dòng)物時(shí)產(chǎn)生的抗多肽抗體或抗IBDV抗體能夠檢測(cè)IBDV病毒或其多肽。
5.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位或其連接物能夠檢測(cè)抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗體。
四.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位片斷的基因克隆SPF種蛋孵育至11日齡，取雞胚胎制備雞胚成纖維細(xì)胞，接種IBDV-H4株病毒，37℃培養(yǎng)96小時(shí)，收取病毒。以超速離心和40~60％蔗糖密度梯度離心分離病毒，獲得病毒粒子。用TRIZOL法抽提病毒總RNA，用蛋白酶K處理基因組RNA，降解RNA雙鏈分子，以此為模板應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增IBDV A片斷基因。回收純化PCR產(chǎn)物，并與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建A片斷基因克隆。
根據(jù)VP3結(jié)構(gòu)特征和抗原性分析結(jié)果設(shè)計(jì)用于overlapping表達(dá)病毒蛋白的系列引物，PCR擴(kuò)增VP3及VP3基因片斷。構(gòu)建VP3及其片斷的原核表達(dá)載體，并在pET系統(tǒng)原核表達(dá)病毒抗原，表達(dá)的病毒抗原經(jīng)溶解復(fù)性后，制備免疫原，免疫BALB/C小鼠，制備單克隆抗體。
根據(jù)Biolabs公司的噬菌體肽庫(kù)手冊(cè)進(jìn)行IBDV中和性單抗的系列篩選。①用LB/IPTG/xgal擴(kuò)增M13噬菌體肽庫(kù)并進(jìn)性滴度測(cè)定；②IBDV單抗標(biāo)記免疫親和磁珠；③免疫親和磁珠與2×1011擴(kuò)增的噬菌體反應(yīng)60min；④PBST洗10次，洗去未結(jié)合的噬菌體；⑤應(yīng)用免疫親和磁分離技術(shù)收集與IBDV單抗結(jié)合的噬菌體；⑥洗脫與單抗結(jié)合的噬菌體；⑦洗脫噬菌體的擴(kuò)增與滴度測(cè)定；⑧重復(fù)③~⑦步操作進(jìn)行肽庫(kù)的第二至三輪淘選；⑨第三輪淘選后從LB/IPTG/xgal平板上挑選藍(lán)斑菌落進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體DNA并進(jìn)行序列測(cè)定；⑩用IBDV快速檢測(cè)試紙條進(jìn)一步鑒定噬菌體展示多肽的反應(yīng)性。最后應(yīng)用肽庫(kù)抗原表位分析程序分析確定克隆物質(zhì)為雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位。
實(shí)施例二Fmoc固相多肽合成法overlapping合成系列VP3抗原肽片斷并進(jìn)行Dot-ELISA篩選根據(jù)原核表達(dá)VP3及overlapping表達(dá)VP3抗原片斷的間接ELISA單抗反應(yīng)譜，以及噬菌體肽庫(kù)技術(shù)篩選的VP3中和抗體位點(diǎn)序列，確定overlapping合成多肽的初步序列。并應(yīng)用Chou and Fasman算法用計(jì)算機(jī)分析這些多肽片斷的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、親水性、抗原性、表面可及性等特性，設(shè)計(jì)合成多肽的序列。并應(yīng)用peptide程序分析合成難度特性，設(shè)計(jì)多肽合成程序，應(yīng)用多肽合成儀進(jìn)行自動(dòng)合成和手工合成相結(jié)合的方法合成多肽序列。具體流程如下設(shè)計(jì)合成多肽序列→peptide程序分析→設(shè)計(jì)合成程序→按樹(shù)脂的取代值計(jì)算并稱(chēng)取Fmoc-AA-Wang-resin或Rink resin→DMF溶漲樹(shù)脂→*加20％piperidine脫Fmoc保護(hù)，攪動(dòng)6min→*加下一位氨基酸和HBTU進(jìn)行?；磻?yīng)，N2攪動(dòng)反應(yīng)30min→*用Kaiser法或TNBS法測(cè)試反應(yīng)的完成情況→*DMF洗5次，每次1min→重復(fù)帶有*的步驟，在樹(shù)脂上連接下一位氨基酸，直到該多肽序列合成完成→根據(jù)組成肽鏈氨基酸不同選取適當(dāng)?shù)脑噭┯肨FA法裂解肽鏈與樹(shù)脂的連接→冷乙醚沉淀TFA多肽→Sephadex G-25脫鹽純化→LC-MS和HPLC分析鑒定和純化多肽 →多肽與載體的偶聯(lián)→Dot-ELISA測(cè)試中和性單抗與多肽的反應(yīng)性→分析IBDV中和性單抗反應(yīng)性B細(xì)胞抗原表位。
實(shí)施例三雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位的合成根據(jù)VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列，應(yīng)用固相多肽合成技術(shù)，采用自動(dòng)多肽合成儀或人工多肽合成方法。固相樹(shù)脂采用Fmoc保護(hù)的氨基酸Wang樹(shù)脂或其它樹(shù)脂，樹(shù)脂經(jīng)DMF溶漲、piperidine脫Fmoc保護(hù)后，根據(jù)氨基酸序列順序，加入Fmoc保護(hù)的氨基酸，在HBTU存在情況下進(jìn)行?；磻?yīng)。?；磻?yīng)完成后經(jīng)過(guò)洗滌，再加入第二位的Fmoc-氨基酸進(jìn)行酰化反應(yīng)，并洗滌。如此循環(huán)，從多肽序列C末端起始向N末端，按照序列順序合成完整的多肽鏈。合成完成后，根據(jù)組成肽鏈氨基酸不同選取適當(dāng)?shù)脑噭┯肨FA法裂解肽鏈與樹(shù)脂的連接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，經(jīng)脫鹽純化、LC-MS和HPLC分析鑒定后備用。在整個(gè)合成過(guò)程中，每個(gè)氨基酸?；磻?yīng)后可以應(yīng)用Kaiser法或TNBS法測(cè)試反應(yīng)的完成情況。為了便于使表位多肽和載體蛋白連接，在合成多肽時(shí)可以在多肽序列的N末端添加一個(gè)半胱氨酸。
以氨基酸序列81H-Lys-Phe-Asp-Gln-Met-Leu-OH86為例合成5μmol多肽所需試劑和操作流程如下主要試劑N，N-二甲基甲酰氨(DMF)；脫保護(hù)試劑I20％Piperidine/DMF；脫保護(hù)試劑II二氯甲烷(DCM)；縮合、活化試劑2-(1H-苯并三哇)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)溶于NMM(N-甲基嗎啡啉)/DMF；切割試劑94％三氟乙酸(TFA)；20種Fmoc保護(hù)氨基酸(25μmol/L)Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-Asn(tBu)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH。主要樹(shù)脂F(xiàn)moc-Leu-Wang-Resin；Symphony多肽合成儀美國(guó)Protein Technology公司。
多肽合成中氨基酸偶聯(lián)步驟根據(jù)目的肽鏈產(chǎn)量，稱(chēng)量10mg Fmoc-Leu-WangResin放入反應(yīng)瓶；(1)加入1.25ml DMF，混合10分鐘，用N2吹掉DMF，重復(fù)3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分鐘，用N2吹掉液體，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合反應(yīng)15分鐘；(3)重復(fù)步驟(1)；(4)加入1.25ml 25μM的Fmoc-Met-OH；加入1.25ml 0.4NMM/DMF，混合反應(yīng)45分鐘以上，用N2吹掉液體；(5)重復(fù)步驟(1)；(6)重復(fù)步驟1～5依次加入Fmoc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH完成多肽序列中每個(gè)氨基酸的偶聯(lián)；(7)氮?dú)獯蹈蓸?shù)脂。
已合成完畢的目的肽的切割基本步驟如下(1)加入1.25ml DMF，混合10分鐘，用N2吹掉DMF，重復(fù)3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分鐘，用N2吹掉液體，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合15分鐘；(3)重復(fù)步驟(1)；(4)用DCM洗滌三次以上；(5)加入94％TFA混合反應(yīng)2小時(shí)以上；(6)收集切割產(chǎn)物。
多肽合成產(chǎn)物粗提將無(wú)水乙醚緩緩加入收集的產(chǎn)物中，冰浴10分鐘，3000rpm，離心10分鐘，留沉淀，棄上清，重復(fù)3次，沉淀物用凍干機(jī)干燥，-20℃保存?zhèn)溆?。取少量樣品用于HPLC，GC-MS檢測(cè)。
實(shí)施例四雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位的化學(xué)修飾按照實(shí)施例三的方法合成的多肽片斷，其N(xiāo)末端為自然氨基修飾，C末端為自然羧基修飾。
N末端乙?；揎椃椒ò凑找陨辖榻B的多肽合成方法合成至最后一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸偶聯(lián)結(jié)束，并進(jìn)行N末端Fmoc保護(hù)集團(tuán)的去除，然后進(jìn)行以下操作。取150μl(2.6μmol)乙酸酐和20μl(0.1μmol)EIPEA溶于4.8mlDME中，充分混合并在冰浴中冷卻。然后將以上混合溶液加入多肽合成反應(yīng)瓶中反應(yīng)5分鐘。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5分鐘。氮?dú)獯蹈珊蟀凑涨笆龀Ｒ?guī)合成方法進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)集團(tuán)的去除、裂解、純化和鑒定。
C末端酰胺化修飾方法C末端酰胺化的多肽合成時(shí)應(yīng)選用樹(shù)脂為Rink樹(shù)脂。執(zhí)行合成程序時(shí)應(yīng)對(duì)樹(shù)脂用DMF溶漲20分鐘，然后從C末端第一位氨基酸開(kāi)始執(zhí)行合成程序，同前述Fmoc-wang樹(shù)脂合成方法。
實(shí)施例五雞IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位與載體蛋白KLH和BSA的連接實(shí)驗(yàn)材料包括表位多肽；血藍(lán)蛋白(KLH)，Pierce公司；牛血清白蛋白(BSA)，DMSO，Sigma公司；連接劑Sulfo-SMCC，Pierce公司產(chǎn)品。
載體蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS緩沖液，pH7.2，加入1.0mg連接劑Sul fo-SMCC，充分溶解后在室溫孵育60分鐘或37℃孵育30分鐘。應(yīng)用Sephadex G-25脫鹽柱或透析法純化Sulfo-SMCC處理的載體蛋白，并用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce公司)測(cè)定蛋白含量，備用。
表位多肽合成完畢后，準(zhǔn)確稱(chēng)量4mg，加入0.5ml雙蒸餾水溶解多肽，若多肽溶解性不好可以加適量DMSO促溶。然后將溶解后的多肽與Sulfo-SMCC處理的載體蛋白混合，4℃孵育2小時(shí)或過(guò)夜，備用。
實(shí)施例六雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位氧化實(shí)現(xiàn)自身的連接含半胱氨酸的表位多肽可以通過(guò)巰基的氧化反應(yīng)形成自身連接。一般情況下應(yīng)用DMSO介導(dǎo)的氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接，根據(jù)多肽的酸堿性，氧化反應(yīng)可以在微酸或微堿性情況下進(jìn)行。
微酸性環(huán)境下的氧化反應(yīng)用適當(dāng)濃度的醋酸水溶解多肽，使多肽的濃度在0.5-1.5mM范圍內(nèi)，醋酸的終濃度不超過(guò)5％，用(NH4)2CO3調(diào)整多肽溶液的pH為6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反應(yīng)5-25h，氧化反應(yīng)的進(jìn)行程度可以通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)。然后，用1％TFA水和乙腈為流動(dòng)相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽，備用。
微堿性環(huán)境下的氧化反應(yīng)用0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.5，溶解多肽至終濃度1.0mM，加入終濃度1％的DMSO，25℃反應(yīng)過(guò)夜，氧化反應(yīng)的進(jìn)行程度可以通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)。然后，用1％TFA水和乙腈為流動(dòng)相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽，備用。
實(shí)施例七雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位應(yīng)用連接劑的連接含半胱氨酸的表位多肽以及不含半胱氨酸的表位多肽通過(guò)N端α氨基或賴(lài)氨酸ε氨基應(yīng)用戊二醛或碳化二亞胺(EDC)(Fluka公司產(chǎn)品)等同型雙功能試劑進(jìn)行自身連接、相互連接或與載體連接。
稱(chēng)取1mg BSA用活化緩沖液(0.1M MES，0.5M NaCl，pH5.7)配成濃度為1mg/ml的溶液，加入0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS(Fluka產(chǎn)品)，充分混合后室溫反應(yīng)15分鐘，加入終濃度為20mM的巰基乙醇，加入1.0mg表位多肽，室溫反應(yīng)2小時(shí)；然后，加入0.7mg鹽酸羥胺，室溫反應(yīng)30分鐘；最后，應(yīng)用Sephadex G-25脫鹽純化，以活化緩沖液為平衡洗脫溶液，280nm紫外波長(zhǎng)檢測(cè)，收集第一個(gè)流出組分為多肽連接物，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例八雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位間接ELISA檢測(cè)雞IBDV抗體的試驗(yàn)VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位或表位多肽與載體的連接物為包被抗原，以BSA為對(duì)照抗原，包被96孔酶標(biāo)板(聚苯乙烯微孔板)。用pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原至終濃度1.0μg/ml，按50μl/孔加入酶標(biāo)板中，4℃孵育過(guò)夜。然后用PBST洗液(PBS+0.05％Tween)洗滌酶標(biāo)板6次，2％BSA洗液封閉酶標(biāo)板2小時(shí)，用于檢測(cè)IBDV抗體。
檢測(cè)抗體時(shí)，依次進(jìn)行入下操作加入待檢血清(或進(jìn)行倍比稀釋血清用于檢測(cè)抗體效價(jià))，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標(biāo)板6次；加入羊抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)二抗(Goat-antichicken IgG-HRP)或抗雞IgG單抗-HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標(biāo)板6次；加入HRP底物和顯色劑，室溫避光孵育5-10分鐘觀察顏色反應(yīng)；待充分顯色后，加入2％硫酸終止顏色反應(yīng)；用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在波長(zhǎng)450nm讀取反應(yīng)板孔的吸光值；判定結(jié)果。
判定結(jié)果時(shí)，以樣品板孔的吸光值為對(duì)照板孔吸光值3倍時(shí)，判為反應(yīng)陽(yáng)性；以反應(yīng)陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)為該樣品血清的抗體效價(jià)。
實(shí)施例九雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位Dot-ELISA檢測(cè)雞IBDV抗體的試驗(yàn)VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位或表位多肽與載體的連接物為包被抗原，以BSA為對(duì)照抗原。用點(diǎn)膜儀(Bio-Dot)在硝酸纖維素膜(Millipore)上定量噴點(diǎn)包被抗原，1-2μg/點(diǎn)，37℃固定30分鐘，PBST洗滌6次，10％脫脂乳洗液封閉過(guò)夜，PBST洗滌6次，即可用于抗體檢測(cè)。
檢測(cè)抗體時(shí)，將待檢血清樣品定量稀釋后和抗原包被膜37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，加入羊抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)二抗(Goat-antichickenIgG-HRP)或抗雞IgG單抗-HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標(biāo)板6次；加入AEC或DAB底物顯色，室溫避光孵育5-10分鐘觀察顏色反應(yīng)。
結(jié)果判定時(shí)，以包被抗原點(diǎn)呈現(xiàn)棕紅色顏色反應(yīng)，對(duì)照抗原點(diǎn)不出現(xiàn)顏色反應(yīng)進(jìn)行判定。
實(shí)施例十雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位免疫原的制備及免疫實(shí)驗(yàn)雞IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位抗原作為免疫原制備時(shí)的抗原。首免抗原用弗氏完全佐劑(Sigma)和抗原乳化，以每條多肽5-10μg免疫動(dòng)物；二、三免時(shí)應(yīng)用弗氏不完全佐劑(Sigma)和抗原乳化，以每條多肽5-10μg免疫動(dòng)物。免疫途徑為皮下或肌肉注射。免疫時(shí)間首免為7-14日齡，二免為首免后14日，以后根據(jù)免疫抗體水平可以進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
實(shí)施例十一應(yīng)用VP3單克隆抗體檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒IBDV的實(shí)例應(yīng)用VP3單克隆抗體檢測(cè)雞IBDV病毒可以采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)，以及雙單克隆抗體免疫膜層析試紙條試驗(yàn)等。待檢樣品可取雞法氏囊、肝臟、脾臟、腎臟等組織，將這些組織按1∶5比例用生理鹽水或PBS緩沖液勻漿處理，3000rpm離心30分鐘，取上清懸液待檢。
瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，在瓊脂平板中打7孔梅花孔，中間孔加入VP3單克隆抗體，周邊孔加入待檢樣品、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品和陰性樣品等，每孔各50μl，放入濕盒中，37℃孵育12-24小時(shí)，觀察結(jié)果。結(jié)果判定以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品和VP3單克隆抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線(xiàn)，陰性樣品與VP3單克隆抗體孔之間不出現(xiàn)沉淀線(xiàn)時(shí)，樣品孔與VP3單克隆抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線(xiàn)的樣品為陽(yáng)性樣品，否則為陰性樣品。
雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，以一株VP3單克隆抗體為包被抗體包被酶標(biāo)板，包被濃度為10μg/ml，包被方法按實(shí)施例八進(jìn)行。檢測(cè)時(shí)，將適當(dāng)稀釋的待檢樣品加入包被好的酶標(biāo)板，50μl/孔，37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，然后加入HRP標(biāo)記的另一株VP3單克隆抗體，50μl/孔，37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，用HRP底物顯色，判定結(jié)果。
雙單克隆抗體免疫膜層析試紙條檢測(cè)時(shí)，以一株VP3單克隆抗體和膠體金偶聯(lián)噴涂玻璃棉，將另一株VP3單抗及兔抗鼠IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)，然后按照試紙條的組裝方法將樣品墊、膠金棉、硝酸纖維素膜、吸水墊按試紙條的組裝方式組裝成免疫膜層析試紙條(詳細(xì)方法參照中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL99101537.1，“畜禽疫病快速檢測(cè)試紙條”張改平等，1999年)，用于檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，將試紙條的測(cè)試端插入適當(dāng)稀釋的待檢樣品液中10-20秒，取出后平放1-5分鐘，然后判定結(jié)果。試紙條出現(xiàn)兩條線(xiàn)(檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn))時(shí)判為陽(yáng)性，即該雞感染IBDV病毒，試紙條只出現(xiàn)一條對(duì)照線(xiàn)時(shí)判為陰性。
實(shí)施例十二應(yīng)用抗VP3表位多肽抗體檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒IBDV的實(shí)例雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位抗體的制備同實(shí)施例十，檢測(cè)雞IBDV病毒時(shí)樣品處理和檢測(cè)方法參照實(shí)施例十一。
序列表<110>河南科技學(xué)院<120>雞IBDV VP3蛋白中和性B細(xì)胞抗原表位多肽I<130>seq003<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>1Leu Ser Val Phe Met Trp Leu1 5<210>2<211>16<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>2Leu Phe Gln Ser Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly1 5 10 15<210>3<211>12
<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>3Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr Gln1 5 10<210>4<211>24<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>4Pro Arg Arg Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Ala Pro Thr1 5 10 15Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly20<210>5<211>14<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>5Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala1 5 10
<210>6<211>13<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>6Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為786 H-Leu-Ser-Val-Phe-Met-Trp-Leu-OH 792。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列擴(kuò)展，擴(kuò)展后的多肽氨基酸序列為781H-Leu-Phe-Gln-Ser-Ala-Leu-Ser-Val-Phe-Met-Trp-Leu-Glu-Glu-Asn-Gly-OH 796。
3.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為982H-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Asn-Ala-Pro-Thr-Gln-OH 993。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列向N端和C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白氨基酸序列擴(kuò)展，擴(kuò)展后的多肽氨基酸序列為977H-Pro-Arg-Arg-Ala-Leu-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Asn-Ala-Pro-Thr-Gln-Arg-Pro-Pro-Gly-Arg-Leu-Gly-OH 1000。
5.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為818H-Leu-Ala-Asn-Ala-Pro-Gln-Ala-Gly-Ser-Lys-Ser-Gln-Arg-Ala-OH831。
6.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列為961H-Gln-Met-Lys-Asp-Leu-Leu-Leu-Thr-Ala-Met-Glu-Met-Lys-OH973。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位為合成多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位為翻譯或轉(zhuǎn)錄該多肽的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位在N端或C端進(jìn)行化學(xué)修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位，其特征是所述的化學(xué)修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙?；?，或C端的自然羧基化或酰胺化。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域，主要涉及雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP3蛋白的系列多肽片斷，特別是涉及VP3蛋白中組成B細(xì)胞抗原表位的系列多肽片斷。由本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位設(shè)計(jì)的免疫原或疫苗免疫動(dòng)物機(jī)體后能夠產(chǎn)生針對(duì)IBDV的中和性抗體，并能夠在體內(nèi)或體外中和IBDV，阻止病毒感染動(dòng)物機(jī)體。本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位或其連接物在免疫動(dòng)物時(shí)產(chǎn)生的抗多肽抗體或抗IBDV抗體能夠檢測(cè)IBDV病毒或其多肽。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1687113SQ20051001745
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月29日
發(fā)明者王選年, 張改平, 王三虎, 李培慶, 唐海蓉, 劉寶國(guó), 李敬璽 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院