專利名稱：一種從胡蘆巴種子中分離4－羥基異亮氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從胡蘆巴種子分離4-羥基異亮氨酸的新方法。
背景技術(shù)：
4-羥基異亮氨酸是存在于胡蘆巴屬植物中的一種非蛋白氨基酸，這種氨基酸主要存在于胡蘆巴種子中，約占該種子中游離氨基酸總含量的80％。4-羥基異亮氨酸共有八個異構(gòu)體，到目前為止，已從胡蘆巴種子中得到4-羥基異亮氨酸的兩種非對映異構(gòu)體，主要成分的構(gòu)型為2S， 3R，4S，它約占種子中總4-羥基異亮氨酸含量的90％，次要成分的構(gòu)型為2R，3R，4S，它們的核磁共振譜不同。胡蘆巴(Trigonella foenum-graecum)是豆科胡蘆巴屬的一種一年生草本植物，廣泛分布于亞洲、歐洲和非洲。胡蘆巴種子是傳統(tǒng)的中藥材，主要藥理作用是抗糖尿病和降膽固醇。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道從胡蘆巴種子中分離得到的(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸能促進(jìn)胰島素分泌，而這種促進(jìn)作用也解釋了胡蘆巴種子的抗糖尿病活性。目前，4-羥基異亮氨酸的分離方法主要有兩種，一是利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(Zeokarb 225和Dowex 50，H+-型)進(jìn)行反復(fù)的柱層析分離，二是利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(Amberlite IR 120，H+-型)和硅膠(硅60)柱層析進(jìn)行分離得到4-羥基異亮氨酸混合物，最后通過HPLC半制備柱拆分得到(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸。這兩種分離方法都是直接從葫蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸，因種子中氨基酸的種類很多，直接分離很麻煩，分離材料價格比較高，分離步驟繁瑣，總收率也比較低，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、適于工業(yè)化生產(chǎn)的4-羥基異亮氨酸分離方法。
為達(dá)到本發(fā)明的目的所采取的分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是先將葫蘆巴種子中4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯化，采用柱層析或固液萃取法分離得到4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯，再水解得到4-羥基異亮氨酸。具體步驟如下1、用5％～95％的甲醇或乙醇溶液(最佳為70％的乙醇溶液)提取胡蘆巴種子，在提取物中加入鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸(最佳為1mol/L的鹽酸)水溶液，在20～100℃(最佳為90～100℃)攪拌下反應(yīng)10分鐘后，用硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測發(fā)現(xiàn)，胡蘆巴提取物中4-羥基異亮氨酸己內(nèi)酯化。
2、將上述內(nèi)酯化溶液蒸干，用柱層析法(分離材料是硅膠、聚酰胺、大孔吸附樹脂、活性炭，洗脫溶劑是氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯)或固液萃取法(溶劑為乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇等，最佳為丙酮)進(jìn)行分離，(2S， 3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯從溶劑混合物中優(yōu)先結(jié)晶析出；3、用水或醇溶解(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯晶體，加入LiOH、NaOH、KOH，20～100℃攪拌20分鐘，硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測發(fā)現(xiàn)，4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯已完全水解。然后向反應(yīng)液中加入冰醋酸(100％醋酸，除掉過量的堿)，攪拌10分鐘，減壓蒸干，用95％乙醇重結(jié)晶，得到4-羥基異亮氨酸；母液用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂分離，先用水沖洗，再用0.2mol/L氨水洗脫，又得4-羥基異亮氨酸，總收率為96.8％。
采用本發(fā)明從胡蘆巴種子分離4-羥基異亮氨酸，不僅高收率得到高純度(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸，而且分離純化路線簡便可行，具有工業(yè)化生產(chǎn)價值。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法將通過以下實(shí)施例，進(jìn)一步給予說明。
實(shí)施例1胡蘆巴種子中4-羥基異亮氨酸的內(nèi)酯化將胡蘆巴種子900g用70％的乙醇溶液提取，得到18.945g提取物，加入1mol/L HCl 50mL，100℃攪拌下進(jìn)行反應(yīng)。硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測反應(yīng)，10分鐘后發(fā)現(xiàn)，胡蘆巴提取物中4-羥基異亮氨酸己內(nèi)酯化。
4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯的分離方法1將上述反應(yīng)液冷卻后蒸干，直接用普通硅膠柱層析(硅膠30g，顆粒度為80-100目)分離，CHCl3∶CH3OH(10∶1，體積/體積)洗脫，硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測，將含有4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯組分合并，向其中加入丙酮(20mL)，析出白色針狀晶體(總1.561g)，在無水乙醇(150mL)中重結(jié)晶得到1.453g，通過將其光譜及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，確定其為(2S，3R,4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯。
方法2將上述反應(yīng)液冷卻后減壓蒸干后裝入索氏提取器中，丙酮提取(4次，每次50mL)，每次提取6小時，提取液濃縮后均有晶體析出，硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測發(fā)現(xiàn)其為4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯，總共得到1.381g，在無水乙醇(150mL)中重結(jié)晶得到1.294g，通過將其光譜及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，確定其為(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯，其特征在于顏色和形狀白色針狀晶體(乙醇)熔點(diǎn)208.1-210.5℃比旋光-18.0(c 1.4，CH3OH)紅外光譜主要的特征譜帶位于3433，2955，1771，1504，1354，1209，1024，944cm-1質(zhì)譜(ESI(+))130[M+H]+核磁共振氫譜(600MHz，D2O，δ為ppm，TMS為內(nèi)標(biāo))δ4.57(2H，m)，2.71(1H，br，quint，J＝7.0Hz)，1.39(3H，d，J＝6.7Hz)，1.10(3H，d，J＝7.3Hz)核磁共振碳譜(150MHz，D2O，δ為ppm，TMS為內(nèi)標(biāo))δ173.5，84.4，51.5，37.3，18.7，12.24-羥基異亮氨酸內(nèi)酯的水解取(2S , 3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯614mg，加入35.4mL水，再加入492mg NaOH，室溫20℃攪拌20分鐘，硅膠TLC(CHCl3∶CH3OH∶H2O＝10∶5∶1，體積/體積/體積)檢測發(fā)現(xiàn)，4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯己完全水解。然后向反應(yīng)液中加入冰醋酸213μL(100％醋酸，除掉過量的堿)，攪拌10分鐘，減壓蒸干，95％乙醇/水(350ml)重結(jié)晶，得到420mg 4-羥基異亮氨酸；母液用001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂分離，先用水沖洗，再用0.2mol/L氨水洗脫，又得到108mg 4-羥基異亮氨酸，共528mg，收率為96.8％。通過將其光譜及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，確定其為(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸，其特征在于顏色和形狀白色片狀晶體(95％乙醇/水)熔點(diǎn)206.1-210.2℃比旋光+32.1(c 1，H2O)紅外光譜主要的特征譜帶位于3422，2965，1631，1473，1311，1104，965cm-1質(zhì)譜(ESI(-))146[M-H]-核磁共振氫譜(600MHz，D2O，δ為ppm，TMS為內(nèi)標(biāo))δ3.81(1H，d，J＝4.3Hz)，3.77(1H，m)，1.84(1H，m)，1.16(3H，d，J＝6.4Hz)，0.87(3H，d，J＝7.0Hz)核磁共振碳譜(150MHz，D2O，δ為ppm，TMS為內(nèi)標(biāo))δ173.7，69.8，56.9，41.2，20.6，12.0
權(quán)利要求
1.一種從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是先用醇溶液提取葫蘆巴種子獲得4-羥基異亮氨酸提取物，用酸將提取物中4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯化，用柱層析或固液萃取法分離(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯，用堿水解該內(nèi)酯得到(2S，3R，4)-4-羥基異亮氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是提取胡蘆巴種子所用醇溶液為5％～95％的甲醇或乙醇溶液，最佳為70％的乙醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是所述的4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯化反應(yīng)式為
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯化所用的酸為鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸，最佳為1mol/L的鹽酸水溶液；適合的反應(yīng)溫度是20～100℃，最佳為90～100℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是柱層析分離4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯所使用的分離材料是硅膠、聚酰胺、大孔吸附樹脂、活性炭，洗脫溶劑是氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是固液萃取分離4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯所使用的溶劑為乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇等，最佳溶劑是丙酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯水解反應(yīng)式為
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從胡蘆巴種子中分離4-羥基異亮氨酸的方法，其特征是(2S，3R，4S)-4-羥基異亮氨酸內(nèi)酯水解所用的堿是LiOH、NaOH、KOH水溶液或醇溶液，反應(yīng)溫度為20～100℃。
全文摘要
一種從胡蘆巴種子中分離4－羥基異亮氨酸的方法，屬于植物化學(xué)研究領(lǐng)域。通過將胡蘆巴種子中的4－羥基異亮氨酸內(nèi)酯化，利用柱層析或固液萃取法直接分離得到(2S，3R，4S)－4－羥基異亮氨酸內(nèi)酯，該內(nèi)酯在堿性條件下水解得到(2S，3R，4S)－4－羥基異亮氨酸。采用本發(fā)明從胡蘆巴種子中分離4－羥基異亮氨酸，不僅高收率得到高純度(2S，3R，4S)－4－羥基異亮氨酸，而且分離純化路線簡便可行，具有工業(yè)化生產(chǎn)價值。
文檔編號C07C227/00GK1955160SQ20051002191
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者劉玲, 丁永良, 李伯剛, 張國林 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所