專利名稱：一種降解固體瓊膠制備低聚糖的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于低聚糖類化合物的制備工藝，涉及一種用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法。
背景技術：
瓊膠是我國產量最大的海洋三大多糖(褐藻膠、瓊膠、卡拉膠)之一，它的主鏈是由1，3連接的β-D-吡喃半乳糖或1，4連接的3，6-內醚-α-L-吡喃半乳糖等二糖單元交替連接而成的中性多糖。瓊膠是無毒、無害且應用廣泛的食品及化工原料。
近年來，由于瓊膠寡糖所表現出的重要的生物學活性，如中國專利CN20041002-4380.9所主張的瓊膠寡糖具有益生元的作用，CN03138973.2所主張的將分子量1-10kD分子量范圍的瓊膠低聚糖混合物用作制備降血糖的藥物或者食品添加劑的要求等，瓊膠低聚糖的生物學活性特別是瓊膠低聚糖制備方法成為研究熱點。
目前，人們主要采用化學方法或者酶制劑降解瓊膠制備瓊膠低聚糖。如中國專利CN01115094.7，CN02132573.1，CN03138971.6等分別主張采用的不同化學方法降解瓊膠獲取低聚糖，但是由于化學方法具有反應條件劇烈，不易控制且對環(huán)境存在比較嚴重的污染等不足，因此，酶法制備瓊膠低聚糖更加備受青睞。中國專利CN03112515.8，CN03112518.2，CN200310114439.9等主張的應用微生物所產的天然酶制劑或者基因工程重組酶制劑進行瓊膠低聚糖的制備。但是，無論是天然酶還是基因工程重組酶，酶制劑的制備對儀器、設備要求高，使得相關經費成本上升，且酶的制備使得整體工藝復雜化。目前僅有美國使用大西洋假單胞菌的瓊膠酶制備瓊膠低聚糖，價格昂貴，難以滿足科研開發(fā)和生產中的大量需求，因此尋求新的瓊膠低聚糖制備工藝成為必然。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在克服現有技術中的不足，提供一種用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，本發(fā)明無須制備瓊膠酶制劑，對生產設備要求低，工藝簡單，且成本低廉，能夠滿足工業(yè)化生產的需要。
本發(fā)明的內容是一種采用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是以Microscilla sp.MY04菌株作為酶源，直接降解瓊膠固體，制備具有不同聚合度的瓊膠低聚糖。
本發(fā)明的具體內容是一種采用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是包括下列步驟(1)將含有NaCl重量百分濃度為2～3％、牛肉膏重量百分濃度為0.5-1.5％、pH值為7.0～7.5的LB液體培養(yǎng)基滅菌，移入并培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株，培養(yǎng)條件為18～30℃，菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0；(2)將菌液采用步驟(1)所述滅菌的LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍，移取(一定體積的)稀釋菌液，涂布于滅菌的以瓊膠為唯一碳源的固體平板上繼續(xù)培養(yǎng)；(3)待培養(yǎng)物中固體瓊膠反應、溶解變成液體后(一般應有大量液體產生，或目視無明顯瓊膠固體存在后)，過濾培養(yǎng)物，將所得到的液體在100℃條件下加熱5～15min，冷卻至室溫(一般2～6h)；液體不發(fā)生凝固，固體瓊膠多糖則已經被降解為一系列低聚糖；過濾是為了去除菌體和殘留的瓊膠固體，加熱是為了終止殘余的降解反應；(4)加入2～5倍液體體積的有機溶劑，充分搖勻液體混合物，在室溫環(huán)境中靜置2～6h，以使溶液中的蛋白質、多糖等生物大分子變性并從溶液中析出；
(5)將液體混合物離心分離或過濾，所得到的清液中以低聚糖為主，轉移清液至旋轉蒸發(fā)儀中蒸干液體，得到半固體的浸膏，即得到產物低聚糖混合物。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(1)中的菌液是置于恒溫培養(yǎng)振蕩器或其它微生物反應器中培養(yǎng)。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(2)還可以是將步驟(1)所述菌液與瓊膠混和，混和比例是瓊膠重量(克)菌液體積(毫升)為1∶1～10，再將混合物培養(yǎng)于18～30℃的恒溫環(huán)境。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(2)還可以是將步驟(1)所述菌液直接劃線在以瓊膠為唯一碳源的固體斜面上。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(3)中的過濾是使用滅菌后的多層(一般為8層)紗布或篩絹過濾。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(4)有機溶劑是乙醇、丙酮或正丁醇。
本發(fā)明的具體內容中所述步驟(5)中的離心分離是離心力10,000×g，離心時間30～60min。
本發(fā)明的具體內容中所述菌液置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)時，恒溫培養(yǎng)振蕩器的轉速為100～150r/min。
所述的Microscilla sp.MY04菌株，菌體桔黃色，其16S rRNA的基因序列已經被GenBank收錄，收錄號為AY849869；該菌株已經于2005年10月8日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心收藏，其地址為北京市海淀區(qū)中關村北一條13號中國科學院微生物研究所，其保藏編號為CGMCC No.1474。
采用本發(fā)明制得的低聚糖混合物，可以采取如下步驟分析所得到低聚糖混合物的分子量分布情況(1)取低聚糖混合物，加入一定體積的滅菌的蒸餾水，使低聚糖混合物完全溶解，得到低聚糖溶液；(2)用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾滅菌的蒸餾水，用于充分溶漲Sephadex G-25葡聚糖凝膠，裝柱后用水壓2～4柱床體積，所說的Sephadex G-25葡聚糖凝膠優(yōu)選Amersham Phamacia公司的產品；(3)將一定體積的步驟(1)中所說低聚糖溶液裝柱，自然重力條件下水沖，流速控制在0.2～1.5mL/min，室溫下采用自動分步收集器收集柱子中流出的液體，每試管3mL，根據接收樣品先后順序將試管依次標記為1，2，3...等；(4)繼續(xù)采用改良的苯酚-硫酸法測定每管中糖的含量，依次測定樣品在490nm特征波長測定吸收值，并采用美國微軟公司Excel辦公軟件描點成線作圖，這是進行Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析后，瓊膠低聚糖組分由于分子量大小不同而產生的分布狀況圖，根據面積積分法可以計算其中某一部分組分占總低聚糖組分的質量百分含量；(5)對照分布狀況圖，繼續(xù)取其中的某一個峰所對應的試管中的低聚糖樣品，點樣于硅膠板，進行薄層層析，流動相條件為1-丁醇∶乙酸∶水的體積比是2∶1∶1，使用濃度為10％的硫酸溶液顯色，與同樣條件下處理的分子量標準品進行比較，初步判定分子量，所說的硅膠板優(yōu)選Merck公司產品Silica gel 60，所說的分子量標準品優(yōu)選Sigma公司D-半乳糖，新瓊四糖和新瓊六糖作為分子量標準。
(6)分析結果表明，根據樣品出峰位置可以判斷水溶性差的瓊膠多糖已經被降解為水溶性好且分子量小于5kD的低聚糖，從圖推測主要組分聚合度在30左右。
步驟(4)所說的改良的苯酚-硫酸法測定糖的含量按照參考文獻進行(文獻中國藥學雜志，1996年31卷第9期550-553頁)。
本發(fā)明直接應用Microscilla sp.MY04菌株作為酶源，降解固體瓊膠多糖生產瓊膠低聚糖，具有反應條件溫和、瓊膠多糖降解完全，對環(huán)境污染小等優(yōu)點，且該方法不需要制備酶的制劑，對儀器設備要求低，工藝簡單且成本低廉，適合于工業(yè)化生產，能夠彌補上述已有發(fā)明的不足。


圖1為權利要求5中所說的Microscilla sp.MY04菌株，在瓊膠為唯-碳源的固體斜面上生長的照片。A，B，C三個樣品經過相同處理，生長時間分別為12h，48h和72h的樣品；其中A樣品仍然基本保持固體狀態(tài)；B樣品由于瓊膠固體被降解導致完全崩潰，體積變小，流動性增加；C樣品由于寡糖大量產生而具有更大流動性，因而在相同條件下表面積增大；圖2為實施例1所說的采用Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析后，瓊膠低聚糖由于分子量大小不同而產生的分布狀況圖。其中，橫坐標最大值為145，代表試管數目；縱坐標最大值為3，代表樣品經改良的硫酸-苯酚法測定時在490nm特征波長的吸收值；在橫坐標上，從左至右，不同點所代表的瓊膠低聚糖樣品的分子量依次降低；圖3為實施例1所說的將分布狀況圖(圖2)中的標號為A的峰所對應的低聚糖樣品進行薄層層析，硫酸溶液顯色后的效果圖。其中，1號泳道是圖2中A峰所對應的低聚糖樣品的層析結果；2，3，4號泳道依次是分子量標準品D-半乳糖，新瓊四糖和新瓊六糖在相同處理條件下的層析結果；該圖明確表明，圖2中A峰所對應樣品為新瓊四糖。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1使用以瓊膠為唯一碳源的固體平板制備瓊膠低聚糖將含有NaCl重量百分濃度為2％，牛肉膏重量百分濃度為0.8％，pH值為7.0的LB液體培養(yǎng)基滅菌，培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株，條件為18℃，恒溫培養(yǎng)振蕩器的轉速為100rpm，菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6；將菌液采用上述無菌LB液體培養(yǎng)基稀釋106后，移取100μL稀釋物并涂布于無菌固體平板，平板成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為2.5％，pH值7.2。培養(yǎng)于25℃的恒溫環(huán)境。
在培養(yǎng)物有大量液體產生后，使用滅菌后的八層紗布過濾上述培養(yǎng)物，將所得到的液體在100℃條件下加熱5min，冷卻至室溫，液體不發(fā)生凝固，則繼續(xù)加入2倍體積的無水乙醇，充分搖勻液體混合物，在室溫環(huán)境中靜置2h；繼續(xù)將液體混合物離心，離心力10,000×g，時間30min，轉移上清液至旋轉蒸發(fā)儀中蒸干液體，得到半固體的浸膏，即得到低聚糖混合物。繼續(xù)加入一定體積的無菌蒸餾水，完全溶解低聚糖混合物，得到低聚糖溶液。
為進一步了解低聚糖的分子量分布狀況，采取如下步驟用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾滅菌的蒸餾水，用于充分溶漲Amersham Phamacia公司的產品Sephadex G-25葡聚糖凝膠，裝柱后用水壓2柱床體積。將2mL的低聚糖溶液裝柱，自然重力條件下水沖，流速控制在0.2mL/min，室溫下采用自動分步收集器收集柱子中流出的液體，3mL每試管，根據接收樣品先后順序將試管依次標記為1，2，3...等；繼續(xù)采用改良的苯酚-硫酸法測定每管中糖的含量，依次測定樣品在490nm特征波長測定吸收值，并采用美國微軟公司Excel辦公軟件描點成線作圖，得到Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析后，瓊膠低聚糖組分由于分子量大小不同而產生的分布狀況圖，這時可以根據面積積分法可以計算其中某一部分組分占總低聚糖組分的質量百分含量。
對照分布狀況圖，繼續(xù)取其中的A峰所對應的試管中的低聚糖樣品，點樣于硅膠板(Merck公司產品Silica gel 60)，進行薄層層析，流動相條件為1-丁醇∶乙酸∶水的體積比是2∶1∶1，使用10％硫酸溶液顯色，與同樣條件下處理的分子量標準品(Sigma公司D-半乳糖，新瓊四糖和新瓊六糖)進行比較，初步判定A峰為新瓊四糖。
實施例2使用以瓊膠為唯一碳源的固體平板制備瓊膠低聚糖方法與實施例1相似，區(qū)別在于本實施例將含有NaCl重量百分濃度為2.5％，牛肉膏重量百分濃度為1.0％，pH值為7.2的LB液體培養(yǎng)基滅菌，培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株，條件為25℃，恒溫培養(yǎng)振蕩器的轉速為125rpm，菌液培養(yǎng)至OD600值為0.8；將菌液采用上述無菌LB液體培養(yǎng)基稀釋106后，移取100μL稀釋物并涂布于無菌固體平板，平板成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為2.5％，pH值7.2。培養(yǎng)于25℃的恒溫環(huán)境；在培養(yǎng)物有大量液體產生后，使用滅菌后的八層紗布過濾上述培養(yǎng)物，將所得到的液體在100℃條件下加熱10min，冷卻至室溫，液體不發(fā)生凝固，則繼續(xù)加入3倍體積的無水乙醇，充分搖勻液體混合物，在室溫環(huán)境中靜置4h；繼續(xù)將液體混合物離心，離心力10,000×g，時間45min，轉移上清液至旋轉蒸發(fā)儀中蒸干液體，得到半固體的浸膏，即得到低聚糖混合物。繼續(xù)加入一定體積的無菌蒸餾水，完全溶解低聚糖混合物，得到低聚糖溶液。
實施例3使用以瓊膠為唯一碳源的固體平板制備瓊膠低聚糖方法與實施例1相似，區(qū)別在于本實施例將含有NaCl重量百分濃度為3％，牛肉膏重量百分濃度為1.5％，pH值為7.5的LB液體培養(yǎng)基滅菌，培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株，條件為30℃，恒溫培養(yǎng)振蕩器的轉速為150rpm，菌液培養(yǎng)至OD600值為1.0；將菌液采用上述無菌LB液體培養(yǎng)基稀釋106后，移取100μL稀釋物并涂布于無菌固體平板，平板成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為2.5％，pH值7.2。培養(yǎng)于25℃的恒溫環(huán)境；在培養(yǎng)物有大量液體產生后，使用滅菌后的八層紗布過濾上述培養(yǎng)物，將所得到的液體在100℃條件下加熱15min，冷卻至室溫，液體不發(fā)生凝固，則繼續(xù)加入5倍體積的無水乙醇，充分搖勻液體混合物，在室溫環(huán)境中靜置6h；繼續(xù)將液體混合物離心，離心力10,000×g，時間60min，轉移上清液至旋轉蒸發(fā)儀中蒸干液體，得到半固體的浸膏，即得到低聚糖混合物。繼續(xù)加入一定體積的無菌蒸餾水，完全溶解低聚糖混合物，得到低聚糖溶液。
實施例4；使用瓊膠粉直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例1相似，區(qū)別在于本實施例將所述的培養(yǎng)得到的Microscilla sp.MY04菌液按照瓊膠重量(克)∶菌液體積(毫升)比為1∶1的比例，將二者混勻后放置于恒溫環(huán)境即可。
實施例5使用瓊膠粉直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例2相似，區(qū)別在于本實施例將所述的培養(yǎng)得到的Microscilla sp.MY04菌液按照瓊膠重量(克)∶菌液體積(毫升)比為1∶5的比例，將二者混勻后放置于恒溫環(huán)境即可。
實施例6使用瓊膠粉直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例3相似，區(qū)別在于本實施例將所述的培養(yǎng)得到的Microscilla sp.MY04菌液按照瓊膠重量(克)∶菌液體積(毫升)比為1∶10的比例，將二者混勻后放置于恒溫環(huán)境即可。
實施例7使用以瓊膠為唯一碳源的固體斜面直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例1相似，區(qū)別在于將實施例(1)所說菌液直接劃線于無菌斜面，斜面成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為2％，pH值7.0。培養(yǎng)于18℃的恒溫環(huán)境；實施例8使用以瓊膠為唯一碳源的固體斜面直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例2相似，區(qū)別在于繼續(xù)將菌液劃線于無菌斜面，斜面成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為2.5％，pH值7.2。培養(yǎng)于25℃的恒溫環(huán)境；實施例9使用以瓊膠為唯一碳源的固體斜面直接培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株用于制備瓊膠低聚糖方法與實施例3相似，區(qū)別在于繼續(xù)將菌液劃線于無菌斜面，斜面成分為瓊膠重量百分含量為1.5％，NaCl重量百分含量為3％，pH值7.5。培養(yǎng)于30℃的恒溫環(huán)境；
權利要求
1.一種采用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是以Microscilla sp.MY04菌株作為酶源，直接降解瓊膠固體，制備具有不同聚合度的瓊膠低聚糖。
2.按權利要求1所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是包括下列步驟(1)將含有NaCl重量百分濃度為2～3％、牛肉膏重量百分濃度為0.5-1.5％、pH值為7.0～7.5的LB液體培養(yǎng)基滅菌，移入并培養(yǎng)Microscilla sp.MY04菌株，培養(yǎng)條件為18～30℃，菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0；(2)將菌液采用步驟(1)所述滅菌的LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍，移取稀釋菌液，涂布于滅菌的以瓊膠為唯一碳源的固體平板上繼續(xù)培養(yǎng)；(3)待培養(yǎng)物中固體瓊膠反應、溶解變成液體后，過濾培養(yǎng)物，將所得到的液體在100℃條件下加熱5～15min，冷卻至室溫；(4)加入2～5倍液體體積的有機溶劑，充分搖勻液體混合物，在室溫環(huán)境中靜置2～6h；(5)將液體混合物離心分離或過濾，所得到的清液中以低聚糖為主，轉移清液至旋轉蒸發(fā)儀中蒸干液體，得到半固體的浸膏，即得到低聚糖混合物。
3.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(1)中的菌液是置于恒溫培養(yǎng)振蕩器或其它微生物反應器中培養(yǎng)。
4.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(2)還可以是將步驟(1)所述菌液與瓊膠混和，混和比例是瓊膠重量(克)∶菌液體積(毫升)為1∶1～10，再將混合物培養(yǎng)于18～30℃的恒溫環(huán)境。
5.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(2)還可以是將步驟(1)所述菌液直接劃線在以瓊膠為唯一碳源的固體斜面上。
6.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(3)中的過濾是使用滅菌后的多層紗布或篩絹過濾。
7.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(4)的有機溶劑是乙醇、丙酮或正丁醇。
8.按權利要求2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述步驟(5)中的離心分離是離心力10,000×g、離心時間30～60min。
9.按權利要求3所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述菌液置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)時，恒溫培養(yǎng)振蕩器的轉速為100～150r/min。
10.按權利要求1或2所述的降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，其特征是所述的Microscilla sp.MY04菌株，已經于2005年10月8日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心收藏，其地址為北京市海淀區(qū)中關村北一條13號中國科學院微生物研究所，其保藏編號為CGMCC No.1474。
全文摘要
一種采用Microscilla sp.MY04菌株降解固體瓊膠制備低聚糖的方法，將含有NaCl、牛肉膏的LB液體培養(yǎng)基滅菌，移入并培養(yǎng)MY04菌株至OD
文檔編號C07H3/06GK1896086SQ200510021919
公開日2007年1月17日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權日2005年10月24日
發(fā)明者阮期平, 古靜燕, 韓文君, 趙莉 申請人:綿陽師范學院