專利名稱：一種奧曲肽的固相合成工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種奧曲肽的合成工藝，特別涉及一種奧曲肽的固相合成工藝。
背景技術：
1973年，Guillemin從下丘腦分離得到一種抑制生長激素(GH)分泌的物質(zhì)somatostatin(STT)，它用于治療存在許多缺陷與困難，它的半衰期短，缺乏選擇性，而且注射給藥也只有幾分鐘作用時間，所以瑞士的科研人員對其進行了結構修飾及選擇，從1974年開始人工合成，經(jīng)過5年后，環(huán)八肽SMS201-995-奧曲肽問世，藥品名為Sandostatin，中文名為善得定。它及其類似物被廣泛地應用于各種腫瘤的治療，具有抑制作用，它還可以抑制各種消化液和消化道激素的分泌，也適用于肢端肥大癥的治療。另外，奧曲肽與DTPA偶合，并用IIIIn標記后，在診斷中還是一種非常有用的腫瘤造影劑，所以對于奧曲肽的人工合成也一直是個熱點。
奧曲肽的結構如式1所示，是C端為羥基，含有一對硫硫鍵的環(huán)八肽，作為一個肽醇，奧曲肽首先被提出運用液相片斷縮合法合成，Neugebauer，W.；Escher，E.Helv.Chim.Acta 1989，72，1319-1323介紹了這種液相合成法，液相合成存在制備時間長，每一步產(chǎn)品均需要進一步純化并且在最后轉(zhuǎn)鹽過程耗時且浪費有機溶劑以及容易污染環(huán)境等缺陷，而后主要采用固相合成。固相法一般采用連接劑及還原切除的方法來獲得肽醇，采用連接劑方法見Mergler，M.；Nyfeler，R.Inpeptides 1992Schneider C.H.Eberle.A.N.，Eds.；EscomLeiden.TheNethertands 1993；PP 177-178以及Edwards，W.B.，F(xiàn)ields，C.G，Anderson，C.J.，Pajeau，T.S.，Welch，M.J.，and Fields，G.B.(1994)J.Med.Chem.37，3749-3757。還原切除的方法見Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Yu，H.-M.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Tetrahedron Lett.1998，39，1783-1784。麻省理工學院的Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1797-1803，先通過SPPS合成前面帶保護的七肽，而后再與蘇氨醇組合，最后成形等。但是根據(jù)文獻顯示，合成都比較復雜而且分離產(chǎn)率比較低，分別為3.1％、8％、14％。近幾年，隨著組合化學技術的不斷發(fā)展，更多樹脂及連接劑的涌現(xiàn)與應用，為奧曲肽的合成能簡單、方便、高產(chǎn)率提供了可能性。而在尋求比較理想的合成方法中，Yasush、Arano等人使用2-chlorotrityl chloride Resin來合成奧曲肽(合成路線見式2)，見Bauer，W.，Briner，U.，Donepfner，W.，Haller，R.，Huguenin，R.，Marbach，P.，Petcher，T.J.& Pless，J.(1982)Life Sci，31，1133-1140。更有意思的是臺灣學者吳英泰等人設計的方案，Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1797-1803和Lorin A.Thompson；Jonathan A.EllmanTetrahedron Lett.1994，35，9333-9336，使用對甲酸苯甲醛作為連接劑，靈巧的利用蘇氨醇特有的雙羥基形成縮醛，再縮合到Rink Amide AM resin上去(式3)。但是式2和式3的固相合成法在其還原切除法中存在消旋問題。
式1 式2 式
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種奧曲肽的固相合成工藝。本發(fā)明需要解決的技術問題是選擇一種連接劑，使其滿足(1)在多肽合成中具有穩(wěn)定性；(2)既可以方便地與載體連接，也可以方便地與氨基酸單體縮合；(3)同時，肽鏈可以在比較溫和的條件下從連接劑樹脂上切除。解決現(xiàn)有連接劑在還原切除法中會發(fā)生消旋的技術問題。本發(fā)明的技術方案為一種奧曲肽的固相合成工藝，其合成工藝步驟如下使用氯甲基樹脂作載體，首先用氫化鈉溶液及2-羥甲基-3，4-二氫吡喃在二甲乙酰胺中室溫與氯甲基樹脂反應，得到3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂(DHP HM Resin)，再在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下將芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)蘇氨醇(Fmoc-Thr(tBu)-ol)連到DHP HM Resin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個連上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液將肽從樹脂上切下，得到的粗品，粗品采用空氣氧化法氧化形成硫硫鍵，經(jīng)制備HPLC純化冷凍得到奧曲肽。
本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義Fmoc芴甲氧羰基TBu叔丁基HOBt1-羥基苯駢三唑Phe苯丙氨酸Cys半胱氨酸Trp色氨酸Thr蘇氨酸Lys賴氨酸Trt三苯甲基THP四氫吡喃羥甲基DMFN，N-二甲基酰胺Piperidine六氫吡啶Boc叔丁氧羰基DHP HM Resin3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂PPTS對甲苯磺酸吡啶鹽THF四氫呋喃DCC二環(huán)己基碳二亞胺TFA三氟醋酸EDT乙二硫醇合成路線如下 在DHP HM Resin加保護基反應中需將DHP HM Resin加入到新蒸的THF中浸濕20-40分鐘，加Fmoc-Thr(tBu)-ol及PPTS，在惰性氣體保護下，50-70℃反應12-18小時，冷卻過濾，用CH2Cl2，DMF/H2O(1∶1)，DMF，CH2Cl2，Et2O洗滌，干燥。
在接氨基酸過程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，F(xiàn)moc-AA縮合過量2-5倍，每一步縮合都經(jīng)過kaiser test檢測，如顏色呈陽性則重復接氨基酸，然后用20％DMF溶液脫Fmoc，最后用6-10ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液將肽從樹脂上切下，得到的粗品(7)產(chǎn)率為91.7％，HPLC為57.1％，粗品采用空氣氧化法氧化形成硫硫鍵，其水溶液的HPLC為87.5％。從上可以看出用此方法合成奧曲肽，產(chǎn)率及純度都比較理想。我們還在小試的基礎上，進行了大規(guī)模的合成實驗，同樣取得了良好的結果。另外，此法對合成其它氨基酸類的肽醇也具有一定的意義。
本發(fā)明的有益效果是我們選擇四氫吡喃羥甲基THP作為連接劑，一方面，它在堿性條件下是穩(wěn)定的，可以運用到固相Fmoc/tBu的方法中去，另一方面，氨基醇與DHP很容易連接形成THP鍵，而且最為重要的一點是，在用三氟醋酸切除時，可以保持醇的立體構型，避免了還原切除法中容易發(fā)生消旋的問題。
具體實施例方式實施例1，實施工藝中儀器和試劑的選用HPLCPE200-785AESIPE Mariner API-TOFIRBIO-RAO FTS-185元素分析儀Heraeus CHN-O恒溫搖床HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠)其它試劑均為市售分析試劑CF3COOH中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司苯甲硫醚購于Acros乙二硫醇購于TCINaH60％購于AldriehTHF用CaH2干燥重蒸接肽中所用試劑全部經(jīng)過MgSO4干燥處理1、芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)蘇氨醇DHP HM Resin(5)的制備 1.1.DHP HM resin(2)的合成60％的氫化鈉及2-羥甲基-3，4-二氫吡喃在二甲乙酰胺中室溫與氯甲基樹脂反應16小時，重復反應一次，測得氯含量＜0.5％，取代度為1.49mmol/g。
1.2.Fmoc-Thr(tBu)-ol的合成參照文獻Mergler，M.；Hellstern，H.；Wirth，W.；Langer，W.；Gysi，P.；Prikoszovich.W.A.In Abstracts of the Twelfth American Peptide Symposium，June 16-21，1991.Boston.MAMassachusetts Institute of TechnologyCambridge.1991，P-292.See alsoSandoz AG.Peptide Derivatives.International Patent Publication WO88/02756，1988，進行合成，產(chǎn)率為76％。，測試數(shù)值與文獻值相等。HPLC＞99％。
1.3.對甲苯磺酸吡啶鹽(PPTS)的合成對甲苯磺酸22.8g加吡啶50ml，室溫反應2hr，在60℃下濃縮，加乙醚，濃縮至干，加丙酮，得白色晶體。
1.4.芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)蘇氨醇DHP HM Resin(5)的合成將0.346g(2)加入到新蒸的THF5ml中浸濕半小時，加0.984gFmoc-Thr(tBu)-ol及0.258gPPTS，在N2保護下，70℃反應過夜，冷卻過濾，用CH2Cl2，DMF/H2O(1∶1)，DMF，CH2Cl2，Et2O洗滌，干燥，取代度為0.47mmol/g。
2.合成帶保護的八肽樹脂，即合成路線中式(6)取0.5g(5)放入接肽瓶中，加8ml 20％ piperidine(DMF)振蕩5min，抽干。再加8ml 20％ DMF振蕩15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，然后依次接Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，用1.175mmol的Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)縮合，脫Fmoc用20％DMF，脫2次，第一次5分鐘，第二次15分鐘。
3.合成直鏈八肽，即合成路線中式(7)將步驟2得到的樹脂(6)加入到10ml的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)，室溫振蕩2hr，過濾，用三氟醋酸洗樹脂二次，濾液濃縮，加無水乙醚，得白色或微黃固體。反復用無水乙醚洗滌，得到粗品0.22g。ESI1020(M+)，HPLC57.1％。
4.氧化稱取粗品633mg，加入到500ml 5％乙酸銨溶液(pH＝7)中，攪拌二天。溶液測ESI1018(M+)，HPLC87.5％。最后冷凍干燥得成品奧曲肽。
大規(guī)模合成Fmoc-Thr(tBu)-ol DHP HM Resin 30g放入接肽瓶中，加20％ DMF振蕩5分鐘，抽干。再加20％ DMF振蕩15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，然后依次接Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)縮合過量2.5倍，脫Fmoc用20％DMF，脫2次，第一次5分鐘，第二次15分鐘。
將樹脂加入到6-10ml/克三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)，室溫振蕩2hr，過濾，用三氟醋酸洗樹脂二次，濾液濃縮，加無水乙醚，得白色或微黃固體。反復用無水乙醚洗滌，得到粗品13.2克。
氧化10克粗品10000ml 5％乙酸銨溶液(pH＝7)中，攪拌二天。上制備HPLC脫鹽，純化，冷凍干燥得到成品奧曲肽。
實施例23，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加保護基反應中需將3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加入到新蒸的THF中浸濕20分鐘，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚蘇氨醇及對甲苯磺酸吡啶鹽，在惰性氣體保護下，60℃反應18小時。
在氨基酸過程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，F(xiàn)moc-AA縮合過量3倍。
將肽從樹脂上切下用6ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液。其余與實施例1相同。
實施例33，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加保護基反應中需將3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加入到新蒸的THF中浸濕40分鐘，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚蘇氨醇及對甲苯磺酸吡啶鹽，在惰性氣體保護下，50℃反應13小時。
在氨基酸過程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，F(xiàn)moc-AA縮合過量4倍。
將肽從樹脂上切下用8ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液。其余與實施例1相同。
權利要求
1.一種奧曲肽的固相合成工藝，首先使用氯甲基樹脂作載體，首先用氫化鈉溶液及2-羥甲基-3，4-二氫吡喃在二甲乙酰胺中室溫與氯甲基樹脂反應，得到3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂，然后進一步合成八肽，其特征是合成八肽過程中首先將3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加保護基，即在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下將芴甲氧羰基-O-叔丁醚蘇氨醇連到3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個連上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液將肽從樹脂上切下，得到的粗品，粗品采用空氣氧化法氧化形成硫硫鍵，經(jīng)制備HPLC純化冷凍得到奧曲肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種奧曲肽的固相合成工藝，其特征是3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加保護基反應中需將3，4-二氫吡喃羥甲基樹脂加入到新蒸的THF中浸濕20-40分鐘，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚蘇氨醇及對甲苯磺酸吡啶鹽，在惰性氣體保護下，50-70℃反應12-18小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種奧曲肽的固相合成工藝，其特征是在氨基酸過程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA 1∶1∶1∶2，F(xiàn)moc-AA縮合過量2-5倍。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的一種奧曲肽的固相合成工藝，其特征是在接氨基酸過程中每一步縮合都經(jīng)過kaiser test檢測，如顏色呈陽性則重復接氨基酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種奧曲肽的固相合成工藝，其特征是將肽從樹脂上切下用6-10ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇92.5∶2.5∶2.5∶2.5的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種奧曲肽的合成工藝，特別涉及一種奧曲肽的固相合成工藝。解決現(xiàn)有連接劑在還原切除法中需進行消旋的技術問題。本發(fā)明的技術方案為一種奧曲肽的固相合成工藝，其合成工藝步驟如下使用氯甲基樹脂作載體，首先用氫化鈉溶液及2－羥甲基－3，4－二氫吡喃在二甲乙酰胺中室溫與氯甲基樹脂反應，得到3，4－二氫吡喃羥甲基樹脂(DHP HM Resin)，再在對甲苯磺酸吡啶鹽作用下將芴甲氧羰基－(O－叔丁醚)蘇氨醇(Fmoc－Thr(tBu)－ol)連到DHP HM Resin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法將氨基酸逐個連上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液將肽從樹脂上切下，得到的粗品，粗品采用空氣氧化法氧化形成硫硫鍵，經(jīng)制備HPLC純化冷凍得到奧曲肽。本發(fā)明提供了一種簡單易行可規(guī)模合成奧曲肽的工藝。
文檔編號C07K7/00GK1837232SQ20051002450
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月21日 優(yōu)先權日2005年3月21日
發(fā)明者徐紅巖, 金健林 申請人:吉爾生化(上海)有限公司