專利名稱：固相多肽合成依非巴特的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種依非巴特的制備方法，具體涉及固相多肽合成依非巴特的制備方法。
背景技術(shù)：
依非巴特，英文名為Eptifibatide，結(jié)構(gòu)式為 分子式為C35H49N11O9S2依非巴特在臨床上為一種可以靜注的特異性GP IIb/IIIa受體拮抗劑。通過阻止纖維原與GP IIb/IIIa受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集和防止血栓形成，臨床上本品作為肝素或阿司匹林的輔助用藥。
依菲巴特為人工合成的環(huán)狀七肽，是血小板糖蛋白GP IIb/IIIa受體拮抗劑，可阻斷由各種激活劑引起的血小板聚集反應(yīng)，是已知最強的特異性血小板聚集抑制劑，主要用于防止心肌供氧動脈閉塞，心臟病發(fā)作，不穩(wěn)定性心絞痛、無Q波心肌梗塞、冠脈介入治療引起的猝死。
該品種由美國COR Therapeutics公司開發(fā)，于1998年由COR Therapeutics公司與Schering-Plough公司合作使其在美國上市，商品名Integrelin。
中國專利申請?zhí)?2145292.X公開了一種依菲巴特的制備方法，以Fmoc-Rink AmideAM樹脂為啟始原料，第五個保護氨酸為S-三苯基巰基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸，原料來源困難，不容易制備，推廣應(yīng)用有困難。存在著使用劇毒、腐蝕性試劑的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種固相多肽合成依非巴特的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))；
所說的Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為一種常用的氨基樹脂，可采用市售產(chǎn)品，如天津南開和成科技有限公司牌號為HC RAm04-1的產(chǎn)品；(2)然后加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集還原型依非巴特粗品(MW＝833.96)；(4)將還原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水調(diào)節(jié)PH到7.5-10.0，通空氣氧化，收集氧化型依非巴特粗品；(5)將收集的粗品通過C18柱分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物?？偸章士蛇_到23％以上。
按照本發(fā)明，以Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))的方法包括如下步驟Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂——→Fmoc-Cys-樹脂——→Fmoc-Pro-Cys-樹脂——→Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂——→Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂——→Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂——→Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂。
更為具體的包括如下步驟(1)樹脂的預(yù)處理將Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂，用DMF浸泡使樹脂充分溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，10～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹濾去除六氫吡啶，DMF洗滌，氮氣吹干。
六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶∶DMF＝1∶3～5體積比；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide MBHA樹脂的濃度比為1克/5～15ml。
(2)Fmoc-Cys(Trt)-樹脂的制備將步驟(1)預(yù)處理的樹脂與Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU(MW321)、HOBT(MW135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，將混合物在20～35℃的條件下反應(yīng)0.5～1.5小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；
HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；然后加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干，獲得Fmoc-Cys(Trt)-樹脂；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為應(yīng)通式為 (3)Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Pro-OH(MW337.4)、TBTU(MW321)、HOBT(MW135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為 (4)Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(3)的Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Trp-OH(MW426.5)、TBTU(MW321)、HOBT(MW135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Fmoc-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為 (5)Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(4)的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW411.5)、TBTU MW321)、HOBT(MW135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，將混合物20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為
(6)Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(5)的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Fmoc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為 (7)Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(6)的Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Har(Pbf)-OH(MW662.8)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Fmoc-Har(Pbf)-OH的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，六氫吡啶的體積濃度為10～40％；六氫吡啶的DMF溶液中，樹脂的重量的體積濃度為1克/5～15ml；反應(yīng)通式為 (8)Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(7)的Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。加入Map(SBzl)-OH(MW196)、TBTU、HOBT、NMM和DMF，將混合物20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比；反應(yīng)體系中Map(SBzl)的摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；TBTU摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；HOBT摩爾數(shù)為樹脂摩爾數(shù)的2-6倍；甲醇洗滌，抽干，氮氣吹干，得保護還原型依非巴特樹脂；反應(yīng)通式為
(8)切肽將切肽試劑加入保護的依非巴特樹脂，20～35℃反應(yīng)2～4小時，過濾，抽干，濾液加乙醚沉淀，過濾收集沉淀得還原型依非巴特粗品(MW＝833.96)，收率為96％；所說的切肽試劑為TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝800-900ml/25-40ml/5-20ml/40-60ml/20-30ml)；反應(yīng)通式為 (9)氧化(二硫鍵的形成)將還原型依非巴特粗品溶于水中，加入濃度為0.1～1.5mol/L的氨水，調(diào)節(jié)pH到7.5-10.0，通空氣15～30小時氧化，過濾；反應(yīng)通式為 (10)純化濾液流經(jīng)C18柱進行純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(85∶15)；流速為200-400ml/min；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液。樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法去鹽、除乙腈、凍干，約得白色疏松塊狀物成品(MW831.96)；總收率約23％(以Rink Amide-樹脂的61.9mmol計)。
S-芐基巰基丙酸(Map(SBzl)的制備將巰基丙酸300克及1000毫升蒸餾水，加入3000毫升的三頸瓶內(nèi)，加濃氨水至pH8以上，用冰水浴冷卻至10℃，猛烈攪拌。2小時內(nèi)滴加300毫升氯化芐，保持pH9左右，繼續(xù)在室溫攪拌2小時，過濾，用蒸餾水洗滌，然后取出固體，置于燒杯內(nèi)用蒸餾水研洗后過濾，再用95％乙醇洗滌，干燥后得約300克S-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的方法，采用Rink Amide MBHA樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸的方法，接肽收率高。選用Fmoc-Har(Pbf)-OH，原料來源方便，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))，簡化了工藝，降低了成本；采用切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)進行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，且提高收率，采用C18柱進行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進行純化，減少三廢，純化收率高達25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為95.4％，總收率為23％。由此可見，本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實施例方式實施例和前述過程中所采用的原料列表如下

實施例1肽鏈制備
稱取Rink Amide MBHA樹脂72克(150目，0.86mmol/g，61.9mmol)，裝入專用的反應(yīng)器中，開啟合成儀總電源，打開工作站，調(diào)用事先編著的接肽程序，用800mlDMF浸泡，使樹脂充分溶脹，氮氣吹干。加入800毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖35分鐘。氮氣吹濾去六氫吡啶，分別用DMF、洗滌三次，氮氣吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-樹脂的制備加Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)108.9g，TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備Fmoc-Pro-OH(MW337.4，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)62.8g，TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備加Fmoc-Trp-OH(MW426.5，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)79.3g，TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400ml DMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW411.5，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)76.5g TBT(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備加Fmoc-Gly-OH(MW297.3，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)55.3g、TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Fmoc-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備加Fmoc-Har(Pbf)-OH(662.8，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)123.3g、TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮氣吹干，用DMF洗滌五次，氮氣吹干。
Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備加Map(SBzl)-OH(MW196，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)36.5g、TBTU(MW321，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)59.7g，HOBT(MW135.1，樹脂摩爾數(shù)的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時。氮氣吹干，DMF洗滌三次，氮氣吹干。
再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空氮氣吹干器中氮氣吹干，稱重，得保護依非巴特樹脂約97g。
切肽取97g保護的依非巴特樹脂轉(zhuǎn)移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝850ml/34ml/l1ml/51ml/25ml)，25℃攪拌3小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約37g還原型依非巴特粗品(MW＝833.96，44.4mmol)，收率為95.4％。
氧化(二硫鍵的形成)將37g還原型依非巴特粗品溶于40L純化水中，在攪拌下緩慢加入1mol/L氨水，調(diào)節(jié)PH到8，通空氣，攪拌24小時，過濾。
純化濾液經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(85∶15)；流速為300ml/min；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液。樣品峰合并后去鹽、除乙腈、凍干，約得11.8g白色疏松塊狀物成品(MW831.96，14.2mmol)；總收率約23％(以Rink Amide-樹脂的61.9mmol計)。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成依非巴特的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))；(2)然后加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集還原型依非巴特粗品；(4)將還原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水調(diào)節(jié)PH到7.5-10.0通空氣氧化，收集氧化型依非巴特粗品；(5)將收集的粗品通過C18柱分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以Rink Amide樹脂、Rink AmideMBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧-芐基巰基丙酸(Map(SBzl))的方法包括如下步驟Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂→Fmoc-Cys-樹脂→Fmoc-Pro-Cys-樹脂→Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂→Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂→Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂→Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樹脂的預(yù)處理將Rink Amide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂，用DMF浸泡使樹脂充分溶脹，氮氣吹干，加入六氫吡啶的DMF溶液，10～35□反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹濾去除六氫吡啶，DMF洗滌，氮氣吹干。(2)Fmoc-Cys(Trt)-樹脂的制備將步驟(1)的樹脂與Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應(yīng)0.5～1.5小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Cys(Trt)-樹脂；反應(yīng)通式為 在步驟(2)的Fmoc-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Pro-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂。反應(yīng)通式為 (4)Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(3)的Fmoc-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Trp-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂。反應(yīng)通式為 (5)Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(4)的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加Fmoc-Asp(OtBu)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂。反應(yīng)通式為 (6)Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(5)的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中、加入六氫吡啶的DMF溶液，20～35℃反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂。反應(yīng)通式為 (7)Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(6)的Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加入Fmoc-Har(Pbf)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，將混合物20～35℃反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干；獲得Fmoc-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂。反應(yīng)通式為 (8)Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂的制備在步驟(7)的Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，反應(yīng)20～40分鐘，氮氣吹干，用DMF洗滌，氮氣吹干。加入Map(SBzl)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，反應(yīng)0.5～2小時，氮氣吹干，DMF洗滌，氮氣吹干。甲醇洗滌，氮氣吹干，獲得帶保護基的還原型依非巴特樹脂。反應(yīng)通式為 (8)切肽將切肽試劑加入保護的還原型依非巴特樹脂，反應(yīng)2～4小時，過濾，抽干，濾液加乙醚沉淀，過濾收集沉淀得還原型依非巴特粗品；所說的切肽試劑為TFA/HBr/HAc/TIS/EDT的混合物；反應(yīng)通式為(9)氧化將還原型依非巴特粗品溶于水中，加入氨水，調(diào)節(jié)pH到7.5-10.0，通空氣15～30小時氧化，以HPLC跟蹤反應(yīng)進程；反應(yīng)通式為 (10)純化濾液流經(jīng)C18柱進行純化，流動相為0.1MNH4Ac和乙腈；流速為200-800ml/min；收集所需要的流出液，采用常規(guī)的方法去鹽、除乙腈、凍干，得成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(10)中，流動相為0.1MNH4Ac∶乙腈(75-85∶25-15)，體積比。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的切肽試劑的比例為(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝850ml/34ml/11ml/51ml/25ml)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，以Rink Amide MBHA樹脂或RinkAmide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸時的反應(yīng)溫度為20～35℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，切肽溫度為20～35℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固相多肽合成依非巴特的制備方法，包括如下步驟(1)以RinkAmide樹脂、Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈?zhǔn)褂肧－芐基巰基丙酸(Map(SBzl))；(2)然后加入切肽試劑(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚為溶劑，沉淀并收集還原型依非巴特粗品；(4)將還原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水調(diào)節(jié)pH到7.5－10.0通空氣氧化，收集氧化型依非巴特粗品；(5)將收集的粗品通過C
文檔編號C07K1/00GK1858060SQ20051002568
公開日2006年11月8日 申請日期2005年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月8日
發(fā)明者周達明 申請人:周達明