專利名稱：固相多肽合成胸腺五肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺五肽的制備方法，具體涉及胸腺五肽的固相多肽合成制備方法。
背景技術(shù)：
胸腺五肽，英文名為Thymopoietin pentapeptide；TP-5；Thymopentin，結(jié)構(gòu)式為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH，分子式及分子量C30H49N9O9，679.77。
胸腺五肽臨床用于免疫增強(qiáng)劑，用于艾滋病早期治療，慢性肝炎，惡性腫瘤，手術(shù)及嚴(yán)重感染，還可用于糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病，還具有抗衰老作用等。
胸腺五肽最早由Johnson & Johnson公司開發(fā)，于1985年在意大利、德國(guó)作為免疫增強(qiáng)劑及免疫調(diào)節(jié)劑上市，商品名為Timunox。
目前，常規(guī)的胸腺五肽的制備方法是以氯甲基樹脂為起始原料，如《化工進(jìn)展》2003年第2期153-156，“固相合成胸腺五肽的研究進(jìn)展”，公開的技術(shù)。接肽收率低，生產(chǎn)成本高，工藝復(fù)雜，使用劇毒的氟化氫和三氟乙酸，三廢污染嚴(yán)重，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Arg-OH；(2)將切肽試劑加入步驟(1)的產(chǎn)物進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂將CTC樹脂(1.0mmol/g)用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干，獲得(A)；將溶解于DMF中的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW403.4)和DIPEA加入(A)中，10～40℃反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，加甲醇，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，吹干，分別用DMF、乙醇DMF分別洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；DMF中，CTC樹脂的重量濃度為5～15％，CTC樹脂與甲醇的重量比例為CTC樹脂∶甲醇＝1∶5～15；CTC樹脂與脫帽試劑的重量比例為CTC樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；所說的CTC樹脂為一種2-氯-三苯基氯樹脂，可采用天津和成科技有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品；所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶2～6，體積比；(2)制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Tyr(tBu)樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應(yīng)15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Val-OH(FW339.4)、TBTU(FW321)和HOBT(FW135.1)溶解于接肽試劑，20～30℃反應(yīng)1.0～2小時(shí)，吹干，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Val-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
樹脂與脫帽試劑的重量比例為樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(3)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應(yīng)15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(FW411.5)、TBTU和HOBT溶解于接肽試劑，20～35℃反應(yīng)1.0～2小時(shí)，其余操作同(2)，獲得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍。
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應(yīng)15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)、TBTU和HOBT溶解于接肽試劑，20～30℃反應(yīng)1.0～2小時(shí)，DMF、乙醇、DMF分別洗滌三次，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；(5)制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，20～35℃反應(yīng)15～45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。加入Boc-Arg-OH(FW310.81)、TBTU和HOBT，溶解于接肽試劑，20～35℃反應(yīng)1.0～2小時(shí)，其余操作同(2)，獲得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，Boc-Arg-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍，TBTU和HOBT的摩爾比為樹脂的2～5倍。
Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂與脫帽試劑的重量比例為Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；上述步驟中，所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶2～5，體積比；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的2～5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的2～5倍。
所說的原料樹脂指的是CTC樹脂或每一步反應(yīng)的起始樹脂，如步驟(3)中的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂。
按照本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，切肽包括如下步驟將切肽試劑加入Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂，15～35℃反應(yīng)1.5～3小時(shí)，加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，得粗品；所說的切肽試劑為(TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml)；
按照本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，分離純化包括如下步驟將粗品溶于醋酸銨的水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品(MW680)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計(jì))。
醋酸銨的水溶液的濃度為0.05～0.15M。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明采用CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，每步接肽收率≥98％，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化工藝，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少。采用C18柱進(jìn)行分離純化，避免使用三氟乙酸，減小三廢，純化收率≥50％，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率為88％，分離純化收率為52％，總收率約為44％。本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實(shí)施。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1實(shí)施例中采用的原料和物質(zhì)列表如下


下述步驟中脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶4，體積比；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶10；接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的3.5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的3.5倍。
制備Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂取50g CTC樹脂(1.0mmol/g樹脂，50mmol)，用800mlDMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干。
1)取20g(FW403.4，50mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、55mlDIPEA，，用500mlDMF溶解，入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)60分鐘。加甲醇50ml，室溫反應(yīng)60分鐘2)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂1)加1000ml脫帽試劑，室溫反應(yīng)30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
2)加入50.9g(FW339.4，150mmol)Fmoc-Val-OH、48.2g(FW321，150mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)90分鐘。
3)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應(yīng)30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加61.7g(FW411.5，150mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、48.2g(FW321，240mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)90分鐘。其余操作同上。
制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應(yīng)30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加70.3(FW468.5，150mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、48.2g(FW321，240mmol)TBTU、23.3g(FW153，240mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)90分鐘。其余操作同上。
制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂加1000ml脫帽試劑，室溫反應(yīng)30分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
加49.3g(FW310.8 150mmol)Boc-Arg-OH 48.2g(FW321，150mmol)TBTU、23.3g(FW135.1，150mmol)HOBT，用500ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，室溫反應(yīng)90分鐘。分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
將保護(hù)5肽樹脂轉(zhuǎn)移至1000ml反應(yīng)器中，加入切肽試劑(TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml)，25℃～30℃攪拌2小時(shí)。減壓除去溶劑后，加入1000ml冷乙醚沉淀，過濾收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得粗品35g(FW680 51.5mmol)。
將35g粗品溶于100ml 0.1M醋酸銨中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為300ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后脫鹽，凍干，約得15g白色塊狀物成品(MW680，22mmol)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計(jì))。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Arg-OH；(2)將切肽試劑加入步驟(1)的產(chǎn)物進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Try(tBu)-樹脂在反應(yīng)容器中，加入CTC樹脂，用DMF溶脹后，吹干，加入Fmoc-Tyr(tBu)OH(FW403.4)、DIPEA及DMF，接肽反應(yīng)，加甲醇，反應(yīng)，吹干，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；加入脫帽試劑，反應(yīng)，分別用DMF、乙醇洗滌，吹干。接肽反應(yīng)中，樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH的摩爾比為樹脂的1～3倍；(2)制備Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂在上述Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌。再加入Fmoc-Val-OH(FW339.4)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，獲得Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應(yīng)中，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Val-OH的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍；(3)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；在上述Fmoc-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，再加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(FW411.5)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，獲得Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應(yīng)中，F(xiàn)moc-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍；(4)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂在上述Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，再加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂；接肽反應(yīng)中，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂的重量濃度為5～15％，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH的摩爾比為樹脂的2～5倍；(5)制備Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂將上述Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-樹脂中，加脫帽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，再加入Boc-Arg-OH(FW310.81)、TBTU、HOBT及接肽試劑，反應(yīng)，DMF洗滌，獲得Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-CTC樹脂；接肽反應(yīng)中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-CTC樹脂的重量濃度為5～15％，Boc-Arg-OH的摩爾比為CTC樹脂的2～5倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15；接肽試劑中，TBTU的摩爾為原料樹脂的2～5倍，HOBT的摩爾為原料樹脂的2～5倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，加入接肽試劑后，15～35℃反應(yīng)1.0～2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶3～5，體積比，加入脫帽試劑后15～35℃反應(yīng)15～45分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，切肽包括如下步驟將切肽試劑加入步驟(1)的產(chǎn)物中，15℃～35℃反應(yīng)1～3小時(shí)，加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，得粗品；所說的切肽試劑為TFA/H2O/TIS＝760ml/20ml/20ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分離純化包括如下步驟將粗品溶于醋酸銨的水溶液中，過濾，濾液經(jīng)反相C18或C8柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(95∶5)；流速為100ml～650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品(MW680)，總收率44％(以CTC樹脂的50mmol計(jì))。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中CTC樹脂與甲醇的重量比例為CTC樹脂∶甲醇＝1∶5～15；CTC樹脂與脫帽試劑的重量比例為CTC樹脂∶脫帽試劑＝1∶5～15；所說的脫帽試劑為六氫吡啶∶DMF＝1∶3～5，體積比。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成胸腺五肽的制備方法，包括如下步驟(1)以CTC樹脂(或Wang樹脂)為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt(或HBTU/HOBt)為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc－Arg－OH；將切肽試劑加入步驟(1)的產(chǎn)物進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明的方法，簡(jiǎn)化了工藝，三廢污染少，總收率約為44％，便于工業(yè)化實(shí)施。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1865279SQ20051002592
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者周達(dá)明 申請(qǐng)人:周達(dá)明