專利名稱：用梔子果實(shí)制備梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種從梔子果實(shí)中分離純化高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法。
背景技術(shù)：
梔子又名山梔子，是茜草科植物山梔Gardenia jasminoides Ellis.的果實(shí)，性苦寒，無毒。梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有利膽、促胰腺分泌、降壓、鎮(zhèn)靜、降溫、抗菌抗炎作用。臨床主要用于治療小兒發(fā)熱、食管炎和口瘡、扭挫外傷、冠心病、急性病毒性肝炎高膽紅素血癥、急性卡他性結(jié)膜炎等。其主要的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜、黃酮、三萜、有機(jī)酸酯等，此外還有d-苷露醇、甾醇類、三萜皂苷類、長(zhǎng)鏈烷烴、醇以及色素等，梔子苷(geniposide)和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷(genipin-1-β-D-geniobioside)屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，是梔子果實(shí)中的主要活性成分[王鋼力，陳德昌等.梔子屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展.中國中藥雜志，1996，21(2)67；黃勝陽.中國梔子屬植物的研究概況.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，3(1)59]，它們的結(jié)構(gòu)式如下 梔子苷
京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷目前，國內(nèi)外用梔子果實(shí)制備梔子多采用柱色譜法和重結(jié)晶等傳統(tǒng)方法分離純化梔子果實(shí)中的有效單體，這類方法或需使用有毒有機(jī)溶劑，如硅膠柱層析使用氯仿、甲醇，會(huì)造成環(huán)境污染；或成本高且操作繁瑣，如中性氧化鋁填料，價(jià)格昂貴[Inouye H，et al.Chem Pharm Bull.1970，18(5)1066；Inouye H，et al.Phytochemistry.1974，132219；Endo T，et al.ChemPharm Bull.1973，21(12)2684]，而且所用固定相對(duì)樣品有不可逆性吸附作用。也有采用制備液相色譜法分離純化梔子苷的[王蘭，張鑒.RP-HPLC制備色譜法分離梔子苷單體.2003，25(9)764]，但其前處理仍需借助上述傳統(tǒng)柱層析法，并且采用多次重復(fù)制備進(jìn)行純化造成梔子苷損失較多。高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一種較新的液液分配色譜技術(shù)，它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統(tǒng)分離方法對(duì)樣品的不可逆性吸附作用，因而樣品回收率高，同時(shí)還具有應(yīng)用范圍廣、儀器操作簡(jiǎn)單、分離量大等優(yōu)點(diǎn)，但目前國內(nèi)外還未見有將高速逆流色譜應(yīng)用于梔子中單體化合物的分離純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備工藝簡(jiǎn)單快速、回收率高、純度高且適于工業(yè)化生產(chǎn)的用梔子果實(shí)制備梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法。
梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷是梔子果實(shí)中的主要成分，鑒于其極性在環(huán)烯醚萜苷類成分中相對(duì)較弱，故本發(fā)明先用大量水將雜質(zhì)和強(qiáng)極性環(huán)烯醚萜苷類成分洗去，再以低濃度乙醇選擇性洗脫，得到梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷含量占95％以上的提取物。然后再用高速逆流色譜和制備液相色譜進(jìn)行分離和純化。
本發(fā)明方法包括如下步驟1.制備梔子果實(shí)粗提物按常規(guī)將干燥梔子果實(shí)粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，過濾，將濾液減壓濃縮至稀浸膏，再真空干燥得梔子果實(shí)粗提物，得率為25％～30％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化將上述制得的梔子果實(shí)粗提物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂柱。先用水充分洗脫直至洗脫液無色，水的洗脫體積通常不少于4倍樹脂量，棄去洗脫液，再用10％～30％低濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥，即得提取物，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，含有95％以上梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷，得率為4％～6％；(2)用高速逆流色譜和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，取步驟(1)中所得的提取物溶于少量下相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分“I”、“II”。采用高效液相色譜法對(duì)所得流分進(jìn)行純度檢測(cè)(峰面積歸一化法)，測(cè)得流份“II”純度高于99％，流份“I”純度高于85％。再應(yīng)用制備液相色譜對(duì)流份“I”分離純化，得流份“III”，按上述高效液相色譜法檢測(cè)，純度高于99％。揮干溶劑后對(duì)流分“II”“III”進(jìn)行MS、1HNMR和13CNMR分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，流分“II”為梔子苷，流分“III”為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。
本發(fā)明采用大孔吸附樹脂對(duì)樣品進(jìn)行前處理，只使用水和低濃度乙醇洗脫，成本低廉，不污染環(huán)境；在洗脫過程中，由于京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和梔子苷在環(huán)烯醚萜類化合物中極性偏小，故首先以大量水洗脫除去其它強(qiáng)極性環(huán)烯醚萜苷類成分，再以低濃度乙醇洗脫，得到含京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和梔子苷95％以上的提取物，操作簡(jiǎn)單。最后采用高速逆流色譜和制備液相色譜對(duì)該提取物中的梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷進(jìn)行分離純化，方法簡(jiǎn)單快速且回收率高，克服了傳統(tǒng)制備方法操作繁瑣、分離周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并具有分離效率高、產(chǎn)品純度好、簡(jiǎn)便、適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為經(jīng)大孔吸附樹脂純化的提取物的高效液相色譜2為經(jīng)大孔吸附樹脂純化的提取物的高速逆流色譜(HSCCC)的色譜3為本發(fā)明京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的制備液相色譜的色譜4為HSCCC分離流分“I”(高速逆流分離所得含京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的流份)高效液相色譜5為制備液相色譜流分“III”(京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷)高效液相色譜6為HSCCC分離流份“II”(梔子苷)高效液相色譜圖具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
實(shí)施例11.制備梔子果實(shí)粗提物取干燥梔子果實(shí)藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實(shí)粗提物，得率為29.8％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實(shí)粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經(jīng)預(yù)處理過的1300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時(shí)。用6000ml水洗脫(棄去)。再用6000ml 20％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末29.51g，得率為5.9％，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷總含量為95.3％。
(2)應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，逆流色譜柱體積為300ml，固定相保留率60％，流速2.0ml/min，轉(zhuǎn)速800rpm，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，取步驟(1)所得提取物粉末300mg溶解于10ml下相中，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分“I”、“II”，見圖1。對(duì)該部分進(jìn)行HPLC分析表明“II”為單一色譜峰，峰純度為99.7％，流份“I”純度為87.6％。再應(yīng)用制備液相色譜分離純化流份“I”。HPLC制備條件為色譜柱YWG C18(10.0×200mm i.d.10μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水＝10∶90；流速2.0ml/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm。根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成份，得流分“III”，對(duì)該流分進(jìn)行高效液相分析表明其為單一色譜峰，峰純度為99.8％。制備液相色譜圖見圖2。HPLC分析條件為色譜柱Lichrospher C18(4.6×250mm i.d.5μm)；流動(dòng)相為乙腈∶1％醋酸水溶液＝10∶90；流速0.9ml/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm。在此條件下所得各高效液相色譜圖見圖3、圖4、圖5、圖6，其中峰1為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷，峰2為梔子苷。將分離得到的“II”、“III”流分揮干，得流分“II”黃色粉術(shù)209.4mg，得率為4.1％；流分“III”黃色粉末47.1mg，得率為0.9％。對(duì)流分“II”、“III”在VarianINOVA-500型核磁共振儀和Varian MAT-212型質(zhì)譜儀上，進(jìn)行1HNMR、13CNMR和MS分析，經(jīng)結(jié)構(gòu)解析確定流分II為梔子苷，流分III為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。所得數(shù)據(jù)為流分“II”UVλmax(nm MeOH)239。ESI-MS389(M+1)，227，209(M-glu)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.12(1H，d，J＝7.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.6(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ95.7(C-1)，151.5(C-3)，110.9(C-4)，45.9(C-5)，37.9(C-6)，125.4(C-7)，144.1(C-8)，51(C-9)，59.3(C-10)，166.9(C-11)，34.4(C-12)，98.6(C-1′)，73.3(C-2′)，77.2(C-3′)，70(C-4′)，76.6(C-5′)，61(C-6′)。流分“III”UVλmax(nm MeOH)239。ESI-MS549(M-H)，573(M+Na)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.12(1H，d，J＝8.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.7(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)，4.24(1H，d，J＝8.0Hz，H-1″)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ96.4(C-1)，151.4(C-3)，110.6(C-4)，45.5(C-5)，37.9(C-6)，125.9(C-7)，143.9(C-8)，50.8(C-9)，59.2(C-10)，166.8(C-11)，34.6(C-12)，98.9(C-1′)，73.5(C-2′)，76.5(C-3′)，70.1(C-4′)，76.5(C-5′)，68(C-6′)，103.2(C-1″)，76.5(C-2″)，73(C-3″)，70(C-4″)，76.5(C-5″)，61(C-6″)。
實(shí)施例21.制備梔子果實(shí)粗提物取干燥梔子果實(shí)藥材粗粉500g，用10倍量水回流提取2次，每次2小時(shí)，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實(shí)粗提物，得率為28.7％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實(shí)粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經(jīng)預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時(shí)。用7000ml水洗脫(棄去)。再用4000ml 30％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實(shí)大孔吸附樹脂提取物粉末32.88g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占94.5％)，得率為6.6％。
(2)應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1.5∶3。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定的方法、步驟同實(shí)施例1。梔子苷得率為4.3％，純度為99.6％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為1.1％，純度為99.7％。
實(shí)施例31.制備梔子果實(shí)粗提物取干燥梔子果實(shí)藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇浸泡提取2次，每次2小時(shí)，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實(shí)粗提物，得率為20.3％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實(shí)粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經(jīng)預(yù)處理過的1300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時(shí)。先用6000ml水洗脫(棄去)。再用8000ml 10％低濃度乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實(shí)大孔吸附樹脂提取物粉末23.47g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占97.5％)，得率為4.7％。
(2)應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為正丁醇∶水＝1∶1。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定的方法、步驟同實(shí)施例1。梔子苷得率為3.9％，純度為99.8％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為0.7％，純度為99.9％。
實(shí)施例41.制備梔子果實(shí)粗提物取干燥梔子果實(shí)藥材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，過濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至稀浸膏，真空干燥得梔子果實(shí)粗提物，得率為29.8％。
2.純化(1)用大孔吸附樹脂純化取上述梔子果實(shí)粗提物，加水混懸后總體積為2000ml。加入到裝有1500g經(jīng)預(yù)處理過的D101大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附2小時(shí)。先用7000ml水洗脫(棄去)。再用7000ml 30％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得梔子果實(shí)大孔吸附樹脂提取物粉末30.23g(梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷占97.2％)，得率為6.0％。
(2)應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的分離純化、純度檢測(cè)以及結(jié)構(gòu)鑒定的方法、步驟同實(shí)施例1。梔子苷得率為4.1％，純度為99.7％；京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷得率為0.9％，純度為99.8％。
權(quán)利要求
1.一種從梔子果實(shí)中制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，包括如下步驟1.1制備梔子果實(shí)粗提物按常規(guī)將干燥梔子果實(shí)粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，過濾，將濾液減壓濃縮至稀浸膏，再真空干燥得梔子果實(shí)粗提物；1.2純化1.2.1用大孔吸附樹脂純化將上述制得的梔子果實(shí)粗提物加適量水混懸后，過大孔吸附樹脂，先用水充分洗脫直至洗脫液無色，再用10％～30％低濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮干燥，得提取物；1.2.2用高速逆流色譜和制備液相色譜將梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷分離純化∶構(gòu)成高速逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1，在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，將步驟1.2.1中所得的提取物溶于少量下相中，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收流分“I”、“II”，再應(yīng)用制備液相色譜對(duì)流分“I”分離純化，得流分“III”，流分“II”、“III”分別為梔子苷和京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。
2.按權(quán)利要求1所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于制備梔子果實(shí)粗提物時(shí)，用50％乙醇回流提取。
3.按權(quán)利要求1或2所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時(shí)，水的洗脫體積不少于4倍樹脂量。
4.按權(quán)利要求1或2所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時(shí)，所說的低濃度乙醇為20％乙醇。
5.按權(quán)利要求3所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附樹脂純化時(shí)，所說的低濃度乙醇為20％乙醇。
6.按權(quán)利要求1或2或5所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
7.按權(quán)利要求3所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
8.按權(quán)利要求4所述的用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，其特征在于所說的大孔吸附樹脂為1300或D101或AB-8型大孔吸附樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種從梔子果實(shí)中分離純化高純度梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷的方法。包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制備梔子果實(shí)粗提物，采用大孔吸附樹脂先用大量水充分洗脫直至洗脫液無色，再用低濃度乙醇洗脫，減壓濃縮得梔子果實(shí)大孔吸附樹脂提取物，再采用高速逆流色譜和制備液相色譜相結(jié)合的方法對(duì)該提取物進(jìn)行分離純化，即得高純度梔子苷、京尼平－1－β－D－龍膽雙糖苷。本發(fā)明制備方法分離效率高、產(chǎn)品純度好、操作簡(jiǎn)便，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H17/00GK1706858SQ20051002614
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者范國榮, 周婷婷, 柴逸峰, 吳玉田, 洪戰(zhàn)英 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)