專利名稱：含有hiv轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的生存素突變體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有HIV蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的生存素(Survivin)突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
生存素(Survivin)是1997年耶魯大學的Aitieric DC等利用效應(yīng)細胞蛋白酶受體ECR-1(Effector cell protease receptor-1，EPR-1)在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一個最新成員。Survivin是至今為止克隆出的最小的IAP，它通過阻斷半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7等調(diào)節(jié)通路抑制細胞凋亡，使一些轉(zhuǎn)化細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而無法清除，從而異常存活、積累，形成優(yōu)勢克隆參與腫瘤的發(fā)生。與其他凋亡抑制因子不同，survivin表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，在終末分化的成人組織中不表達，但在人類大多數(shù)的腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細胞中大量表達。進一步研究表明survivin在不同癌細胞中的表達水平高低與腫瘤的病理演進直接相關(guān)，而且其表達情況與腫瘤的預后密切相關(guān)，因此，患者體內(nèi)的survivin抗體可作為一個較為普遍的腫瘤標志物之一，用于腫瘤的早期診斷和腫瘤治療的預后判定，目前國外已經(jīng)在乳腺癌、膀胱癌的早期診斷中，取得了一定進展。
近兩年來，國內(nèi)外學者對Survivin抑制癌細胞凋亡的機理進行了深入的研究，認為Survivin可能主要通過兩條途徑來抑制細胞凋亡其一是通過直接抑制凋亡終末效應(yīng)分子caspase-3和caspase-7的活性，從而阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程，如紫外線，多種化藥，紫杉醇等，進而增加了癌細胞對多種抗癌藥物的耐藥性和物理作用的抵抗性；其二是Survivin也可通過P21間接抑制caspase-3，從而抑制癌細胞凋亡。因此survivin在惡性腫瘤細胞的耐受和抵抗藥物治療、放療和化療中起著重要作用。
目前的研究認為，抑制或干擾Survivin的作用，可以起到促進癌細胞凋亡的作用。Mesri等把含有磷酸化缺失的Survivin突變體(Thr34Ala)的腺病毒PADT34-A體外分別轉(zhuǎn)染乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌和結(jié)腸癌細胞后都發(fā)生自發(fā)性地凋亡，線粒體釋放細胞色素C，caspase-3的活性增加。將PADT34-A注射入3只移植有乳腺癌細胞的裸鼠體內(nèi)，結(jié)果PADT34-A抑制了新生腫瘤的形成，已形成的腫瘤生長抑制了40％，而且腹膜內(nèi)腫瘤的擴散減少。但是直接以工程病毒攜帶治療性基因進入體內(nèi)在有效性、可操作性和安全性等方面面臨著不少問題，尤其是導致基因突變和生殖毒性問題，制約了Survivin(Thr34Ala)基因治療在臨床上的應(yīng)用。
將Survivin(Thr34Ala)蛋白作為治療性藥物，是克服基因治療缺陷的一個方向，然而蛋白質(zhì)大分子不能高效的進入到細胞內(nèi)，是本領(lǐng)域長期存在的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠有效導入到細胞的生存素突變體，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足；本發(fā)明的另一目的是提供上述含有HIV蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的突變體的制備方法；本發(fā)明的再一目的是提供上述突變體的應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的在Survivin(Thr34Ala)基因的上游可操作的插入一種蛋白轉(zhuǎn)導域(protein transduction domain，PTD)序列，表達得到含有蛋白轉(zhuǎn)導域的Survivin(Thr34Ala)融合蛋白，該蛋白可以有效導入細胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供了一種含有HIV蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的生存素突變體，即TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白，在Survivin(T34A)的N端插入了經(jīng)突變的來自HIV-1Tat(Trans-Activating Transduction protein)的蛋白轉(zhuǎn)導域(TatPTD)，該轉(zhuǎn)導域的序列為Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。
本發(fā)明的融合蛋白具有如下氨基酸序列SEQ ID NO.1Met Try Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg Met Gly Ala1 5 10 15Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg20 25 30Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys35 40 45Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr50 55 60Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu65 70 75Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys80 85 90Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe95 100 105Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Pro Glu Pro110 115 120Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu
125 130 135Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Pro Pro Ala Ile Glu Gln Leu140 145 150Ala Ala Met Asp在一個優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的融合蛋白具有如下核酸序列SEQ ID NO.2 ctgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgcttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcattcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaatttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataagaagaaagaatttgaggaactgcgaagaaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcc 本發(fā)明的另一個技術(shù)方案是提供了一種TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的方法，包括如下步驟構(gòu)建TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因；將融合蛋白基因插入表達載體；將帶有融合蛋白基因的表達載體轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的表達細胞；培養(yǎng)該表達細胞；誘導表達；收集并純化表達產(chǎn)物。
TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因的構(gòu)建采用PCR方法在Survivin(T34A)基因的5‘端分2步引入HIV-1 Tat蛋白轉(zhuǎn)導域序列，引入突變的PCR引物序列為Ptat15’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCA TGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’；Ptat25’-CGCATATGTAC GCT CGT AAA GCT CGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’，在Ptat2的5’端均設(shè)計有NdeI限制性酶切位點。
將本發(fā)明中TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因與表達載體重組，形成重組表達載體，不限于特定的表達載體，可采用真核表達載體或原核表達載體。將本發(fā)明中重組表達載體可按常規(guī)方法導入適宜的宿主細胞，適宜的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞，本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能表達所述重組表達載體。
在一個優(yōu)選的方案中，表達載體為pREST-B，宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)在大腸桿菌中以包涵體形式表達，包涵體經(jīng)洗滌，溶解后，經(jīng)陽離子交換層析、凝膠層析，得到98％純度的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白。
TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白對乳腺癌細胞系B-CAP-37和宮頸癌細胞系Hela的抑制活性。TAT(M)-Survivin(Thr34Ala)能顯著抑制B-CAP-37和Hela細胞的生長，并有劑量依賴性，而且對B-CAP-37的抑制率明顯高于對Hela細胞的抑制率。
本發(fā)明的另一個技術(shù)方案是提供一種TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的用途，用于制備治療腫瘤疾病的藥物。
本發(fā)明所提及的腫瘤疾病可以是任何類型的腫瘤，進一步優(yōu)選的為乳腺癌和宮頸癌。
本發(fā)明所提及的治療腫瘤疾病藥物包括TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白制劑和藥學上可以接受的藥物載體。
在本發(fā)明中，使用如下定義本文中，“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。更佳地，“藥學上可被接受”是指不影響蛋白活性的無毒物質(zhì)。
本文中，“藥物載體”是用于將蛋白傳送給動物或人的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體，可根據(jù)給藥方式而選擇的。
本發(fā)明的特點與優(yōu)點在于本發(fā)明得到的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白，能夠有效導入把細胞、進而殺傷靶細胞。相對于Survivin(T34A)基因治療，可以避免基因突變和生殖毒性。
TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白對B-CAP-37和Hela細胞的生長具有顯著抑制活性，并有劑量依賴性，同時對前者的抑制作用較后者更明顯，MTT檢測結(jié)果顯示體外活性抑制率達60％(120μg/ml 48h)，因此，該基因工程蛋白預示著作為良好的抗癌藥物，尤其是抗乳腺癌藥物的前景。


圖1生存素cDNA克隆、34位氨基酸突變過程與重組表達載體pRSET-B-TAT(m)-survivin(T34A)的構(gòu)建策略示意圖；圖2PCR擴增結(jié)果與酶切鑒定結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3重組表達載體pREST-B-TAT(m)(m)-survivin(T34A)構(gòu)建結(jié)果的序列測定與分析；圖4TAT(m)-survivin(T34A)融合蛋白表達的SDS-PAGE和Western Blotting電泳結(jié)果；圖5TAT(m)-survivin(T34A)蛋白經(jīng)陽離子交換(左)與分子排阻(右)純化的色譜圖；圖6重組TAT(m)-survivin(T34A)蛋白純化結(jié)果的SDS-PAGE分析結(jié)果1為標準分子量蛋白；2為陽性表達株誘導表達的總蛋白；3為重組蛋白經(jīng)SPSepharose陽離子交換柱純化結(jié)果；4為重組蛋白經(jīng)superdex-75分子排阻層析純化結(jié)果。
圖7重組蛋白TAT(m)-survivin(T34A)對乳腺癌細胞系B-cap37和宮頸癌細胞系Hela細胞的凋亡抑制效果的MTT法檢測結(jié)果。
本發(fā)明利用RT-PCR從乳腺癌細胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的全長編碼區(qū)DNA序列，進行定點突變得到Survivin(T34A)，然后利用PCR在其N-末端引入突變的HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列(TAT(m))，然后構(gòu)建入表達載體中，形成重組表達載體再轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行誘導表達及表達產(chǎn)物的純化。
本發(fā)明包含以下步驟1.引物設(shè)計用PCR法得到Survivin的全長編碼區(qū)DNA序列，用重組法對Survivin34位Thr定點突變?yōu)锳la，并在N-端引入突變的HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列和兩端的不同酶切位點。
本發(fā)明設(shè)計的克隆引物Pb15’-TAG AAT TCG GCC GGC TGC GGG GCA TTCGC-3′；P25′-GTC GAA TTC TCA CAG GTC TGA GCA GCG ATC CTG CTT GCT-3’，在DNA片段的上游和下游分別引入EcoR I和Xhol I位點突變引物Pm15’-CTT GGA GGG CTG CGC CTG CGCCCCG GAG CGG ATGGCC GAG GC-3’and Pm25’-GCC TCG GCC ATC CGC TCC GGGGCGCA GGC GCAGCC CTC CAA G-3’。將蛋白的34位Thr突變?yōu)锳la。
HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列添加引物Ptat15’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCATGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’；and Ptat25’-CGCATATGTAC GCT CGT AAA GCTCGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’，Ptat2的5’端均設(shè)計有Nde I限制性酶切位點。
TAT(m)-Survivin(T34A)基因片段上游的酶切位點是NdeI，下游的酶切位點是XhoI。
2.基因克隆和定點突變利用克隆引物Pb1和P2經(jīng)RT-PCR從乳腺癌細胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的全長編碼區(qū)DNA序列，利用突變引物Pm1和Pm2經(jīng)重組法對Survivin蛋白的34位Thr突變?yōu)锳la，并將Survivin基因突變體加尾后裝入pEGM-T載體，測序鑒定。
3.原核表達載體pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)構(gòu)建利用HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列添加引物Ptat1和Ptat2為測序正確的Survivin基因突變體的5‘端添加高效蛋白轉(zhuǎn)導序列和適當?shù)拿盖形稽c，TAT(m)-Survivin(T34A)基因加尾后克隆pEGM-T載體，測序鑒定。測序正確的TAT(m)-Survivin(T34A)限制性內(nèi)切酶酶切后，亞克隆進表達載體pREST-B中，構(gòu)建原核表達載體pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)，并進行測序和酶切鑒定。
4.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的誘導表達根據(jù)《分子克隆》(科學出版社，第二版，2002年)，利用CaCl2法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，和42℃/90秒熱沖激方法進行重組表達載體的轉(zhuǎn)化，在LT液體培養(yǎng)基中，利用終濃度為0.5mM的IPTG 37℃誘導小量表達5小時，或者利用3.7L發(fā)酵罐發(fā)酵表達10小時后，6000rmp離心棄上清取沉淀。
5.融合蛋白TAT(m)-Survivin(T34A)的純化和復性融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)在大腸桿菌中以包涵體形式表達。發(fā)酵收集菌體超聲破碎后，所得包涵體經(jīng)洗滌，溶解后，將樣品上至陽離子層析柱，陽離子層析柱的洗脫組分上凝膠層析柱，不同組分分別收集，即可得到98％純度的TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白。
6.體外細胞活性本發(fā)明中檢測了融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)對乳腺癌細胞系B-CAP-37和宮頸癌細胞系Hela的抑制活性。在96孔板，待細胞80％-90％長滿時，按一定梯度加入經(jīng)純化和復性處理后融合蛋白TAT(M)-Survivin，并以相同緩沖液作為對照，對培養(yǎng)的細胞系通過MIT法進行活性測定。研究結(jié)果表明TAT(M)-Survivin(Thr34Ala)能顯著抑制B-CAP-37和Hela細胞的生長，并有劑量依賴性。而且對B-CAP-37的抑制率明顯高于對Hela細胞的抑制率。
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步地說明，但本發(fā)明并不受限于下述實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
材料以下實驗所用主要藥品來源乳腺癌細胞系B-cap37和宮頸癌細胞系Hela細胞購自ATCC；pEGM-T載體、pREST-B載體來自Invitrogen；ECL Western Blotting檢測試劑購自Amersham Pharmacia Biotech；工具酶、引物合成以及基因測序來自上海生工生物技術(shù)公司。
實施例1.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)載體系統(tǒng)的構(gòu)建從B-Cap-37中用Trizol試劑抽提總RNA，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。用提取的總RNA由引物Pb15’-TAG AAT TCG GCC GGC TGC GGG GCA TTC GC-3′和P25′-GTC GAA TTC TCA CAG GTC TGA GCA GCG ATC CTG CTT GCT-3’，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得擴增產(chǎn)物即為人Survivin基因編碼序列，將此Survivin段裝入pEGM-T載體。再以此為模板，用Survivin突變引物Pm15’-CTTGGAGGGCTGCGCCTGCGCCCCGGAGCGGATGGCCGAGGC-3’Pm25’-GCCTCGGCCATCCGCTCCGGGGCGCAGGCGCAGCCCTCCAAG-3’經(jīng)重組法對Survivin34位Thr定點突變?yōu)锳la，將突變后的Survivin基因裝入pEGM-T載體，測序正確。用HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列添加引物對Survivin基因突變體添加突變的高效HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導序列和酶切位點。經(jīng)NotI和XholI雙酶切，將此PCR擴增產(chǎn)物裝入經(jīng)NotI和XholI雙酶切pREST-B中。得到pREST-B-TAT(M)-Survivin(T34A)。至此完成了此載體系統(tǒng)的構(gòu)建。PCR鑒定電泳結(jié)果(如圖1所示)表明，TAT(M)-Survivin(T34A)段確已裝入表達載體，測序結(jié)果與分析如圖3所示。
實施例2.pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)制備方法按《分子克隆》(科學出版社，第二版)的CaCl2法，從-80℃冰箱取感受態(tài)細胞50μl/管，常溫復蘇冷凍的菌株后，加入已構(gòu)建正確的pREST-B-TAT(m)-Survivin(T34A)表達載體1μl，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘，立即轉(zhuǎn)到42℃水浴中放置2分鐘，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃水浴中15分鐘后，37℃搖床輕搖45分鐘，取100μl轉(zhuǎn)化菌體，均勻涂布于含100mg/ml氨芐的瓊脂平板培養(yǎng)基上，室溫晾干后，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
實施例3.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的小量表達從LB(含AMP抗性)板上挑取7個克隆培養(yǎng)在50mlLB培養(yǎng)基中(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％NaCl，Ph7.0，0.5％AMP)，37℃，250rpm下培養(yǎng)至O.D.600＝0.6。加1mmol IPTG誘導蛋白表達。37℃、250rpm條件下培養(yǎng)4h，離心收集細胞，取少量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。
實施例4.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的大量表達。
挑選表達量最高的克隆進行大量表達，即在3.7升發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵?；A(chǔ)培養(yǎng)基1％酵母粉，1％蛋白胨，1％葡萄糖，1％甘油，pH7.0，0.5％AMP。發(fā)酵過程中用氨水調(diào)pH，OD600＝3.0加1mmol IPTG誘導蛋白表達5小時后離心收集菌體，-80℃保存。取少量進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。
實施例5.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的純化取1升發(fā)酵得菌體，加入20mM磷酸鹽緩沖液300ml，超聲破菌。10000rpm離心10分鐘，棄上清。沉淀用含2M尿素和0.5％Triton X-100的20mM磷酸鹽緩沖液洗滌，離心棄上請。沉淀用含8M尿素和5mM DTT的20mM磷酸鹽緩沖液進行溶解包含體。然后將樣品上至陽離子層析柱(SP Sepharose)，經(jīng)平衡液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.5，8M尿素，5mM DTT)充分平衡，用洗脫液(20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.5，1M NaCl)將目的蛋白洗下。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。陽離子層析柱的洗脫組分上凝膠層析柱(superdex-75)，緩沖液為20mM磷酸鹽緩沖液，pH6.5，不同組分分別收集，即可得到98％純度的TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖3所示實施例6.Western Blotting檢測融合蛋白將以上TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中包括未經(jīng)誘導的BL21細胞裂解液作為陰性對照。分離出的目的蛋白由semi-dry transferapparatus(Bio-Rad Laboratories)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜用封閉緩沖液(PBST中含有5％脫脂奶粉)封閉1小時。進行三次洗滌，每次用PBST洗10分鐘，之后室溫下與溫育1小時。同樣三次洗滌后，在由辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG1 1∶1000稀釋液中溫育1小時。再經(jīng)三次洗滌后，膜用ECL Western Blotting檢測試劑(AmershamPharmacia Biotech.)處理后送去暗室曝光。Western Blotting結(jié)果如圖4所示。
實施例7.TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白的活性檢測乳腺癌細胞系B-CAP-37和宮頸癌細胞系Hela復蘇后于細胞培養(yǎng)基含10％的FBS和抗生素(100u/ml penicillin-G和10U/ml streptomycin)RMPI1640中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞80％-90％長滿時，胰酶酶解消化，按每孔10000細胞接種于96孔板，待細胞80％-90％長滿時，按一定梯度加入經(jīng)純化和復性處理后重組蛋白TAT(m)-Survivin，并以相同緩沖液作為對照，對培養(yǎng)的細胞系通過MIT法進行活性測定。研究結(jié)果表明TAT(m)-Survivin(Thr34Ala)能顯著抑制B-CAP-37和Hela細胞的生長，并有劑量依賴性。而且對B-CAP-37的抑制率明顯高于對Hela細胞的抑制率。不同濃度的TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白對細胞生存率的影響見圖5。
序列表<110>華東理工大學<120>含有HIV轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的生存素突變體及制備方法和應(yīng)用<130>SPI058251<160>2<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>154<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<222>(46)<223>mutation<400>1Met Try Ala Arg Lys Ala Arg Arg Gln Ala Arg Arg Met Gly Ala1 5 10 15Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg20 25 30Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys35 40 45Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr50 55 60Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu65 70 75Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro lle Glu Glu His Lys80 85 90Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe95 100 105Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Pro Glu Pro110 115 120Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu125 130 135Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Pro Pro Ala Ile Glu Gln Leu140 145 150Ala Ala Met Asp<210>2<211>465<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>CDS<222>(136)<223>mutation<400>2atg tac gct cgt aaa gct cgt cgt caa gca cgt cgc atg ggt gcc45ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac cac cgc90atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc tgc135gcc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act180gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag225ctg gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa270aag cat tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt315gaa gaa tta acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga360gcc aag aac aaa att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa405ttt gag gaa act gcg aag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg450gct gcc atg gat tga46權(quán)利要求
1.一種生存素突變體，其特征在于，Survivin(T34A)蛋白的N端插入一種蛋白轉(zhuǎn)導肽。
2.如權(quán)利要求1所述的生存素突變體，其特征在于，所說的蛋白轉(zhuǎn)導肽是來自HIV-1 Tat(Trans-Activating Transduction protein)的蛋白轉(zhuǎn)導域(TatPTD)，該轉(zhuǎn)導域的序列為Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。
3.如權(quán)利要求1所述的生存素突變體，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1。
4.如權(quán)利要求1所述的生存素突變體，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO.2。
5.制備權(quán)利要求1所述的生存素突變體的方法，包括如下步驟構(gòu)建TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因；將融合蛋白基因插入表達載體；將帶有融合蛋白基因的表達載體轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的表達細胞；培養(yǎng)該表達細胞；誘導目的蛋白表達；收集并純化表達產(chǎn)物。TAT(m)-Survivin(T34A)融合蛋白基因的構(gòu)建采用PCR方法，在Survivin(T34A)基因的5‘端分2步引入HIV-1 Tat蛋白轉(zhuǎn)導域序列，引入突變的PCR引物序列為Ptat15’-CTC GTC GTC AAG CAC GTC GCA TGG GTG CCC CGA CGT TGC-3’Ptat25’-CG CATATG TAC GCT CGT AAA GCT CGT CGT CAA GCA CGT CGC-3’下游引物
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，表達載體為pREST-B，宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，融合蛋白TAT(M)-Survivin(T34A)包涵體經(jīng)洗滌，溶解后，經(jīng)陽離子交換層析、凝膠層析，得到TAT(M)-Survivin(T34A)融合蛋白純品。
8.權(quán)利要求1～4任一項所述的生存素突變體在制備治療腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤疾病為乳腺癌或?qū)m頸癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種Survivin點突變體融合蛋白基因TAT(m)－Survivin(T34A)及其重組表達載體、含有該表達載體的工程菌及其制備方法、表達產(chǎn)物TAT(m)－Survivin(T34A)制備以及其在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。經(jīng)過克隆、突變、酶切與酶連等一系列基因操作過程，重組得到TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白基因，構(gòu)建重組表達載體，重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌而得到表達TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白的工程菌。工程菌經(jīng)過發(fā)酵，離心沉淀，超聲破碎，陽離子層析，分子篩層析步驟獲得目的融合蛋白。本發(fā)明所述的TAT(m)－Survivin(T34A)融合蛋白基因重組表達載體構(gòu)建簡便，目的蛋白表達量高，純化工藝簡單，蛋白活性高，對癌細胞有明顯的促凋亡作用。
文檔編號C07K7/06GK1763093SQ20051002684
公開日2006年4月26日 申請日期2005年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日
發(fā)明者魏東芝, 馬興元, 鄭文云, 馬昱澍, 劉清海, 楊勝利 申請人:華東理工大學