專利名稱：一種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子及其純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子的純化。
背景技術(shù)：
稻瘟病(rice blast disease)由子囊菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr(其無性世代為Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.)引起，廣泛分布于水稻栽培的國家和地區(qū)。它是水稻三大病害之一，嚴(yán)重限制水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。稻瘟病常年均有不同程度的發(fā)生，流行年份一般減產(chǎn)10-20％，嚴(yán)重的達(dá)50％以上。90年代以來，我國稻瘟病年發(fā)生面積均在380萬公頃以上，年均損失稻谷達(dá)數(shù)億公斤。
目前對稻瘟病主要采取選育抗病品種和化學(xué)防治為主的防治措施。長期的生產(chǎn)實踐證明，水稻抗瘟性品種的選育和利用是防治稻瘟病行之有效的措施。但由于稻瘟病菌的遺傳背景復(fù)雜，易于變異，而抗瘟品種相對單一化，主栽品種的遺傳同質(zhì)性，使抗病育種難以跟上致病性稻瘟病菌生理小種的變異速度，常常導(dǎo)致一個新的具有抗稻瘟性的水稻品種在大面積種植3-5年后就嚴(yán)重感病。化學(xué)防治常常造成稻米中農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染，不斷引起人們的關(guān)注，因此，從深層次揭示水稻抗稻瘟病的本質(zhì)，尋求更為有效、安全、經(jīng)濟(jì)、合理的防治措施是一項急待解決的重要任務(wù)。近年來受到廣泛關(guān)注的激發(fā)子研究，為防治稻瘟病提供了新的途徑。
激發(fā)子是能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的信號分子。在植物與病原物互作系統(tǒng)中，植物通過細(xì)胞表面或亞細(xì)胞表面組分中的受體分子與病原物激發(fā)子結(jié)合，啟動級聯(lián)信號系統(tǒng)，調(diào)控防衛(wèi)基因表達(dá)，最終表現(xiàn)對病原物的抗病性。激發(fā)子誘導(dǎo)抗病性具有無污染、抗病譜廣、持續(xù)時間長等特點，無疑在稻瘟病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。
糖蛋白是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，稻瘟病菌菌絲細(xì)胞壁中獲得的糖蛋白具有激發(fā)子活性。目前有關(guān)稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子的研究報道有Kanoh等(1993)利用Celite535過濾、DEAE-Toyo PEARL650M離子交換柱、凝膠過濾層析等方法，從稻瘟病菌中純化獲得一種分子量為25kDa的糖蛋白激發(fā)子，能夠誘導(dǎo)活性氧的進(jìn)發(fā)；Schaffrath等(1995)利用超濾、親和層析等方法從稻瘟病菌中純化獲得分子量為15.6kDa的糖蛋白激發(fā)子，活性位點是糖基團(tuán)；李云峰等(2004)從稻瘟病菌中純化獲得分子量為101.2kDa的糖蛋白激發(fā)子。與已報道的這些激發(fā)子不同，我們從稻瘟病菌菌絲細(xì)胞壁中純化獲得一種新的分子量為49.08kDa，等電點是6.01的糖蛋白激發(fā)子，并對其性質(zhì)及蛋白質(zhì)鑒定進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
目前國內(nèi)有關(guān)稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子的研究除本研究室外，尚未見其它報道。我們從稻瘟病菌ZC13小種菌絲細(xì)胞壁提取液中經(jīng)系列層析，純化獲得一種分子量為49kDa、等電點是6.01的新的糖蛋白激發(fā)子，命名為MGJ1(中文名稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1；漢語拼音Dao wen bing jun tang dan baiji fa zi MGJ1；英文名Glycoprotein elicitor MGJ1 isolated fromMaganporthe grisea)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定是稻瘟病菌70-15染色體III重疊群2954中的MG05155.4開放閱讀框推測編碼的hypothetical protein MG05155.4。該激發(fā)子液體樣品-20℃保存半年生物活性無損失，能夠誘導(dǎo)不同親和性互作水稻葉片的抗病相關(guān)酶活增強。我們對該激發(fā)子的研究旨在為開發(fā)廣譜抗病的工程菌株及無公害農(nóng)藥提供新依據(jù)。
稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子中的MGJ1及其純化方法(1)稻瘟病菌粗激發(fā)子的提取將活化的稻瘟病菌菌絲體進(jìn)行液體培養(yǎng)8-10天，紗布過濾，雙蒸水反復(fù)洗滌3次，凍存于-20℃下。將凍存的菌絲反復(fù)凍融5-7次，破碎菌絲細(xì)胞。用雙蒸水懸浮凍融的菌絲，用高速組織搗碎機12,000r/min反復(fù)勻漿5-7次。將勻漿液用磁力攪拌器攪拌10-12小時，離心取上清液。用PM-10膜超濾上清液，所獲的濃縮液即為粗激發(fā)子。粗激發(fā)子經(jīng)凍融1-2次后，進(jìn)一步用蛋白層析系統(tǒng)(可以使用Amersham Biosiciences的AKTA Purifier-100全自動蛋白層析系統(tǒng))進(jìn)行以下層析步驟。
(2)DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析用pH7.4的20mmol/LTis-HCl起始緩沖液平衡HiPrep 16/10 DEAE FF離子交換柱2倍柱床體積，流速3mL/min，將粗激發(fā)子上樣，未結(jié)合洗脫2倍柱床體積，用0.75mol/LNaCl梯度洗脫10倍柱床體積，在A280波段檢測(A280蛋白特異吸收峰)。收集各峰，超濾離心管濃縮脫鹽，進(jìn)行水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，取活性峰，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)ConA-Sepharose 4B親和柱層析裝適量ConA-Sepharose 4B(Pharmacia)填料于XK16/20空柱中，用pH7.4含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl2、1mmol/LCaCl2、1mmol/LMnCl2的20mmolTris-HCl起始緩沖液平衡，將經(jīng)DEAE離子交換柱層析獲得的活性蛋白峰樣上樣，在上述起始緩沖液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖進(jìn)行梯度洗脫，收集各峰，超濾離心管濃縮脫鹽，進(jìn)行水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，取活性峰，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)S-100凝膠柱層析獲得MGJ1稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子用pH7.4的20mmo/LlTis-HCl起始緩沖液平衡Sephacryl S-100 HighResolution凝膠柱，將經(jīng)ConA-Sepharose 4B親和柱層析獲得的活性蛋白峰樣上樣，洗脫1.5倍柱床體積，收集各峰，超濾離心管濃縮脫鹽，進(jìn)行水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，取活性峰，凍干后于-20℃保存即為稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1。
對所獲得的這種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1進(jìn)行蛋白含量測定(Bradford方法)，糖含量測定(蒽酮-濃硫酸法)，純度鑒定(SDS-PAGE電泳銀染色和高碘酸-Schiff糖染色)，質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定以及誘導(dǎo)寄主水稻抗病性(對過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的誘導(dǎo))的測定。
稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子中的MGJ1的特征特性用質(zhì)譜儀(Applied Biosystems Voyager System 4307)測定，稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的相對分子量是49.08kDa，經(jīng)薄層等電聚焦電泳測定其等電點為6.01。經(jīng)質(zhì)譜(Finnigan LTQ)測試獲得肽指紋圖譜，在稻瘟病菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中分析，鑒定該糖蛋白激發(fā)子MGJ1是稻瘟病菌70-15染色體III重疊群2954中的MG05155.4開放閱讀框推測編碼的hypothetical proteinMG05155.4，氨基酸殘基數(shù)是449，激發(fā)子MGJ1與hypothetical proteinMG05155.4相匹配重疊的肽段質(zhì)量數(shù)是15947.7，占hypothetical proteinMG05155.4總質(zhì)量數(shù)的32.58％。該激發(fā)子對C101A51(完全非親和互作)、C101LAC(高度非親和互作)、C104PKT(中度非親和互作)及CO39(親和互作)4個近等基因系水稻葉片中的抗病相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)均具有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)完全非親和互作C101A51及高度非親和互作C101LAC品系的PAL酶活增值分別為127.59％和121.945％，而誘導(dǎo)親和互作CO39和中度非親和互作C104PKT品系的PAL酶活增值分別為105.38％和91.72％，誘導(dǎo)非親和性互作水稻品系中PAL的升高明顯高于對親和性互作水稻品系中的誘導(dǎo)。該激發(fā)子誘導(dǎo)水稻POD酶活升高的最低有效濃度是1.5nmol/L。該激發(fā)子液體樣品-20℃保存半年激發(fā)子活性無損失，其性質(zhì)穩(wěn)定。
本發(fā)明純化稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的優(yōu)點1、本發(fā)明以稻瘟病菌菌絲為原料，原料來源易培養(yǎng)、價格廉，適合開發(fā)應(yīng)用。
2、本發(fā)明采用蛋白純化層析平臺(AKTA Purifier-100)，上樣、洗脫、收集等步驟自動進(jìn)行，避免人為等外界影響因素，純化路線設(shè)計合理，重現(xiàn)性穩(wěn)定。
3、本發(fā)明純化的MGJ1激發(fā)子誘導(dǎo)寄主水稻POD酶活增強的最低有效濃度是1.5nmol/L，誘導(dǎo)活性高。液體樣品-20℃保存半年激發(fā)子活性無損失，性質(zhì)穩(wěn)定，利于保存及應(yīng)用開發(fā)。
具體實施方法將活化的稻瘟病菌菌絲體進(jìn)行液體培養(yǎng)(液體培養(yǎng)基酵母浸膏5g；一水葡萄糖22g；補足蒸餾水至1000mL。)，25℃恒溫振蕩培養(yǎng)8-10天，雙層紗布過濾，雙蒸水反復(fù)洗滌3次，凍存于-20℃下。將凍存的菌絲15℃-25℃解凍，再置于-20℃下冷凍，反復(fù)凍融5-7次，充分破碎菌絲細(xì)胞。用雙蒸水懸浮凍融的菌絲(5mL/g)，用高速組織搗碎機(DS-1組織搗碎機)12,000r/min反復(fù)勻漿5-7次。將勻漿液用磁力攪拌器于4℃攪拌10-12小時，10,000g離心30min，取上清液。濾紙過濾上清液，所得濾液用PM-10膜超濾，高純氮氣壓力0.45MPa，所獲的濃縮液(MW＞10kDa)即為粗激發(fā)子，-20℃下保存?zhèn)溆?。粗激發(fā)子經(jīng)凍融1-2次后，用全自動蛋白層析系統(tǒng)(AmershamBiosiciences的AKTA Purifier-100)對粗激發(fā)子進(jìn)一步層析純化(1)DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析獲得D4活性峰用pH7.4的20mmol/LTis-HCl的起始緩沖液平衡HiPrep 16/10 DEAE FF離子交換柱2倍柱床體積，流速3mL/min。將粗激發(fā)子上樣4mL，未結(jié)合洗脫2倍柱床體積，用0.75mol/LNaCl梯度洗脫10倍柱床體積，在A280波段檢測(A280蛋白特異吸收峰)。洗脫曲線主要有4個明顯的峰(D1、D2、D3、D4)，其中D1、D2峰不能被DEAE-Sepharose FF吸附，而D3、D4峰均能被DEAE-Sepharose FF吸附。收集各峰，超濾離心管濃縮脫鹽，經(jīng)水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，D4峰具有強激發(fā)子活性，收集D4峰尖處的洗脫液(見

圖1)，-20℃下保存即為D4活性峰樣備用。
(2)ConA-Sepharose 4B親和柱層析獲得C2活性峰裝適量ConA-Sepharose 4B(Pharmacia)填料于XK16/20空柱中，用pH7.4、含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl2、1mmol/LCaCl2、1mmol/LMnCl2的20mmolTris-HCl起始緩沖液平衡，將經(jīng)DEAE離子交換柱層析獲得的D4活性峰樣上樣2mL，流速0.2mL/min，在上述起始緩沖液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖進(jìn)行梯度洗脫，洗脫曲線主要有2個明顯的峰(C1、C2)，C1、C2均不能被ConA-Sepharose 4B吸附。收集各峰，超濾離心管濃縮脫鹽，經(jīng)水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，C2峰具有強激發(fā)子活性，收集C2峰尖的洗脫液(見圖2)，-20℃下保存即為C2活性峰樣備用。
(3)S-100凝膠柱層析獲得S1活性峰即MGJ1稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子用pH7.4的20mmo/LlTis-HCl的起始緩沖液平衡Sephacryl S-100 HighResolution凝膠柱，將經(jīng)ConA-Sepharose 4B親和柱層析獲得的活性蛋白樣品上樣1mL，流速0.5mL/min，洗脫1.5倍柱床體積，洗脫曲線主要有2個明顯的峰(S1、S2)。經(jīng)水稻幼苗4片葉接種過氧化物酶比活檢測，S1峰具有強激發(fā)子活性，收集S1峰尖處的洗脫液(見圖3)，超濾濃縮，冷凍干燥，-20℃下保存即獲得新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1。
稻瘟病菌菌絲體經(jīng)反復(fù)凍融、勻漿、離心、PM-10膜超濾等步驟獲得粗激發(fā)子。粗激發(fā)子經(jīng)DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析、ConA-Sepharose FF親和柱層析、S-100凝膠柱層析獲得新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1。對所獲得的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1進(jìn)行SDS-PAGE電泳銀染色和高碘酸-Schiff法糖染色均顯示單一條帶(見圖4、圖5)，表明達(dá)到電泳純。
經(jīng)Applied Biosystems Voyager System 4307質(zhì)譜測定，MGJ1分子量為49.07968kDa(見圖6)。經(jīng)薄層等電聚焦電泳測定MGJ1的等電點為6.01(見圖7)。經(jīng)LTQ質(zhì)譜測試、肽指紋圖譜分析鑒定MGJ1是稻瘟病菌70-15染色體III重疊群2954中的MG05155.4開放閱讀框推測編碼的hypothetical proteinMG05155.4(見圖8)，MGJ1與hypothetical protein MG05155.4相匹配重疊的斷肽段氨基酸殘基數(shù)是147個，占總氨基酸殘基數(shù)的32.74％(見表1，表2)。
稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1對4個近等基因系水稻葉片苯丙氨酸解氨酶PAL酶活均具有誘導(dǎo)作用。MGJ1誘導(dǎo)完全非親和互作C101A51及高度非親和互作C101LAC品系的PAL酶活增值升幅較大，分別為127.59％和121.945％，而誘導(dǎo)親和互作CO39和中度非親和互作C104PKT品系的PAL酶活增值升幅較小，分別為105.38％和91.72％(見圖9)。
將不同濃度(1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1采用壓傷斑法接種不同親和性互作的水稻葉片，誘導(dǎo)POD酶比活的變化如圖10所示，結(jié)果表明，10μg/mL及以上濃度的MGJ1激發(fā)子均可誘導(dǎo)不同品系的水稻葉片POD酶活的升高，并且隨著激發(fā)子濃度的升高，誘導(dǎo)活性增強，1μg/mL濃度及其以下的MGJ1處理則不能誘導(dǎo)水稻葉片POD酶活的升高，推測MGJ1激發(fā)子誘導(dǎo)活性的有效濃度是1.5nmol。稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子，MGJ1液體樣品在-20℃下保存半年激發(fā)子活性無損失，其性質(zhì)穩(wěn)定，利于保存及應(yīng)用開發(fā)。
表1激發(fā)子MGJ1與hypothetical protein MG05155.4相匹配重疊肽段分析表2hypothetical protein MG05155.4的氨基酸序列表說明書附1稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1 DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析2稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1 ConA-Sepharose 4B親和柱層析3稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1 Sephacryl S-100凝膠柱層析4稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的SDS-PAGE電泳銀染圖譜圖5稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的高碘酸-Schiff法糖染色圖譜圖6質(zhì)譜測定激發(fā)子MGJ1的相對分子量圖譜橫坐標(biāo)Mass(m/z)為質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)Intensity為強度。
圖7薄層等電聚焦電泳測定稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的等電點圖譜圖8稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的LTQ質(zhì)譜圖譜橫坐標(biāo)Time為時間，縱坐標(biāo)Relative為相對豐度。
圖9激發(fā)子MGJ1對不同親和性互作水稻葉片PAL酶活的誘導(dǎo)圖10不同濃度的激發(fā)子MGJ1對水稻葉片POD酶活的誘導(dǎo)表11 MAAPAHKFKV ADLSLAAFGR KEIELAENEM PGLMQTREKY AADQPLKGAR51 IAGCLHMTIQ TAVLIETLTA LGAEVTWTSC NIFSTQDHAA AAIAAAGVPV101 FAWKGETEEE YNWCLEQQLL AFKDGKKLNL ILDDGGDLTH LVHDKYPEML151 ADCYGVSEET TTGVHHLYKM LKEGKLLVPA INVNDSVTKS KFDNLYGCRE201 SLVDGIKRAT DVMIAGKIAV VAGYGDVGKG CAMALHGMGA RVIVTEIDPI251 NALQAAMAGF QVTTMEKAAS VGQIFVTTTG CRDILVGKHF EAMPNDAIVC301 NIGHFDIEID VAWLKANAKS VQNIKPQVDR FLMANGRHII LLAEGRLVNL351 GCATGHSSFV MSCSFTNQVL AQIMLYKNND AAFGQKYVEF AKSGKLEKKV401 YVLPKILDEE VAKLHLAHCN VELSTLTPVQ AEYLSLPAEG PYKPEHYRY
表2序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子及其純化方法<130>MG<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>449<212>PRT<213>Magnaporthe grisea<400>1Met Ala Ala Pro Ala His Lys Phe Lys Val Ala Asp Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Ala Phe Gly Arg Lys Glu Ile Glu Leu Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly20 25 30Leu Met Gln Thr Arg Glu Lys Tyr Ala Ala Asp Gln Pro Leu Lys Gly35 40 45Ala Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Ile Gln Thr Ala Val Leu50 55 60Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu Val Thr Trp Thr Ser Cys65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala85 90 95Gly Val Pro Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu Thr Glu Glu Glu Tyr Asn100 105 110Trp Cys Leu Glu Gln Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asp Gly Lys Lys Leu115 120 125Asn Leu Ile Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr His Leu Val His Asp130 135 140Lys Tyr Pro Glu Met Leu Ala Asp Cys Tyr Gly Val Ser Glu Glu Thr145 150 155 160Thr Thr Gly Val His His Leu Tyr Lys Met Leu Lys Glu Gly Lys Leu165 170 175Leu Val Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe180 185 190Asp Asn Leu Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Val Asp Gly Ile Lys Arg195 200 205Ala Thr Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Ile Ala Val Val Ala Gly Tyr210 215 220
Gly Asp Val Gly Lys Gly Cys Ala Met Ala Leu His Gly Met Gly Ala225 230 235 240Arg Val Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala245 250 255Met Ala Gly Phe Gln Val Thr Thr Met Glu Lys Ala Ala Ser Val Gly260 265 270Gln Ile Phe Val Thr Thr Thr Gly Cys Arg Asp Ile Leu Val Gly Lys275 280 285His Phe Glu Ala Met Pro Asn Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His290 295 300Phe Asp Ile Glu Ile Asp Val Ala Trp Leu Lys Ala Asn Ala Lys Ser305 310 315 320Val Gln Asn Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Phe Leu Met Ala Asn Gly325 330 335Arg His Ile Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys340 345 350Ala Thr Gly His Ser Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln355 360 365Val Leu Ala Gln Ile Met Leu Tyr Lys Asn Asn Asp Ala Ala Phe Gly370 375 380
Gln Lys Tyr Val Glu Phe Ala Lys Ser Gly Lys Leu Glu Lys Lys Val385 390 395 400Tyr Val Leu Pro Lys Ile Leu Asp Glu Glu Val Ala Lys Leu His Leu405 410 415Ala His Cys Asn Val Glu Leu Ser Thr Leu Thr Pro Val Gln Ala Glu420 425 430Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Glu Gly Pro Tyr Lys Pro Glu His Tyr Arg435 440 445Tyr
權(quán)利要求
1.一種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子的純化方法，其特征在于將活化的稻瘟病菌菌絲體液體培養(yǎng)8-10天，雙蒸水反復(fù)洗滌除去雜質(zhì)，經(jīng)15-25℃與-20℃反復(fù)凍融至完全破碎菌絲細(xì)胞，用雙蒸水懸浮凍融的菌絲，用高速組織搗碎機12,000r/min反復(fù)勻漿5-7次，將勻漿液磁力攪拌10-12小時，4℃離心取上清液，上清液用PM-10膜超濾，所獲得濃縮液即為粗激發(fā)子；粗激發(fā)子凍融1-2次后，上樣HiPrep 16/10DEAE FF離子交換柱，用pH7.4的20mmol/LTis-HCl起始緩沖液平衡2倍柱床體積，流速3mL/min，未結(jié)合洗脫2倍柱床體積，用0.75mol/LNaCl梯度洗脫10倍柱床體積，收集洗脫曲線中第四峰峰尖處的洗脫液，超濾濃縮獲得活性峰樣；活性峰樣進(jìn)一步上樣ConA-Sepharose 4B親和柱，用pH7.4、含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl2、1mmol/LCaCl2、1mmol/LMnCl2的20mmol的Tris-HCl起始緩沖液平衡，在上述起始緩沖液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫曲線中第二峰峰尖處的洗脫液，超濾濃縮獲得活性峰樣；活性峰樣進(jìn)一步上樣Sephacryl S-100High Resolution凝膠柱，用pH7.4的20mmo/L1Tis-HCl的起始緩沖液平衡，洗脫1.5倍柱床體積，收集洗脫曲線中的第一峰峰尖處的洗脫液，超濾濃縮，凍干后于-20℃下保存即獲得新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子，命名為MGJ1。
2.稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1的特征在于分別經(jīng)SDS-PAGE銀染和高碘酸-Schiff糖染色均顯示單一條帶，表明獲得的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1達(dá)到電泳純；該激發(fā)子相對分子量是49.08kDa，其等電點為6.01，經(jīng)質(zhì)譜鑒定該激發(fā)子是稻瘟病菌70-15染色體III重疊群2954中的MG05155.4開放閱讀框推測編碼的hypotheticalprotein MG05155.4，氨基酸殘基數(shù)是449，激發(fā)子MGJ1與hypothetical protein MG05155.4相匹配重疊的肽段質(zhì)量數(shù)是15947.7，占hypothetical protein MG05155.4總質(zhì)量數(shù)的32.58％，激發(fā)子MGJ1與hypothetical protein MG05155.4相匹配重疊的肽段用斜體表示1 MAAPAHKFKV ADLSLAAFGR KEIELAENEM PGLMQTREKY AADQPLKGAR51 IAGCLHMTIQ TAVLIETLTA LGAEVTWTSC NIFSTQDHAA AAIAAAGVPV101 FAWkGETEEE YNWCLEQQLL AFKDGKKLNL ILDDGGDLTH LVHDKYPEML151 ADCYGVSEET TTGVHHLYKM LKEGKLLVPA INVNDSVTKS KFDNLYGCRE201 SLVDGIKRAT DVMIAGKIAV VAGYGDVGKG CAMALHGMGA RVIVTEIDPI251 NALQAAMAGF QVTTMEKAAS VGQIFVTTTG CRDILVGKHF EAMPNDAIVC301 NIGHFDIEID VAWLKANAKS VQNIKPQVDR FLMANGRHII LLAEGRLVNL351 GCATGHSSFV MSCSFTNQVL AQIMLYKNND AAFGQKYVEF AKSGKLEKKV401 YVLPKILDEE VAKLHLAHCN VELSTLTPVQ AEYLSLPAEG PYKPEHYRY該激發(fā)子液體樣品-20℃下保存半年生物活性無損失，性質(zhì)穩(wěn)定；該激發(fā)子誘導(dǎo)寄主水稻抗病相關(guān)酶過氧化物酶酶活升高的最低有效濃度是1.5nmol/L；該激發(fā)子對4個近等基因系水稻葉片的抗病相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶PAL酶活均有誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)完全非親和互作C101A51及高度非親和互作C101LAC品系的PAL酶活增值分別為127.59％和121.945％，而誘導(dǎo)親和互作CO39和中度非親和互作C104PKT品系的PAL酶活增值分別為105.38％和91.72％，即稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子MGJ1誘導(dǎo)非親和性互作水稻品系中PAL酶活的升高明顯高于對親和性互作水稻品系中的誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明以稻瘟病菌菌絲為材料，經(jīng)培養(yǎng)凍融、勻漿離心，PM－10膜超濾，獲得粗激發(fā)子。粗激發(fā)子凍融后，經(jīng)系列層析純化獲得一種新的稻瘟病菌糖蛋白激發(fā)子，其分子量是49.08kDa，等電點為6.01，達(dá)到銀染電泳純。質(zhì)譜鑒定該激發(fā)子是稻瘟病菌MG05155.4開放閱讀框推測編碼的hypothetical protein MG05155.4。該激發(fā)子性質(zhì)穩(wěn)定，誘導(dǎo)非親和性互作水稻品系中苯丙氨酸解氨酶酶活的升高明顯高于對親和性互作品系的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)水稻過氧化物酶酶海升高的最低有效濃度是1.5nmol/L。本研究在稻瘟病生物防治中具有良好的應(yīng)用前景，能夠為開發(fā)廣譜抗病的工程菌株及無公害農(nóng)藥提供新依據(jù)。
文檔編號C07K1/00GK1721433SQ20051003409
公開日2006年1月18日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者紀(jì)春艷, 王振中 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)