專利名稱：人胰高血糖素相關(guān)肽－2類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)是一種人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽。用本研究室構(gòu)建的新的長度30-70aa的活性多肽的融合表達(dá)制備技術(shù)平臺，構(gòu)建在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效融合表達(dá)人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的基因工程菌，人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物的N端位置2的丙氨酸(2Ala)殘基被Gly取代，同時N端接加2個脯氨酸殘基。在Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的N端設(shè)計一個酸敏感位點(Asp-Pro)，用酸切割融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2獲得目的肽Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽，Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽在體內(nèi)被二肽酶IV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly2]GLP-2。重組菌經(jīng)裂解→洗滌→再溶解→乙醇分級沉淀分離融合蛋白→60mmol/L鹽酸水解融合蛋白→DEAE-52柱層析分離→HPLC分離，用電噴霧質(zhì)譜法測得Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽相對分子質(zhì)量為3948Da。Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽無需復(fù)性，凍干后溶于PBS中，對正常雄性SD大鼠(160g-200g)皮下給藥14天，0.1，0.25，0.5mg/kg/day，小腸重量與對照組相比，有明顯體內(nèi)促腸生長的生物學(xué)活性。有可能用于改善短腸綜合癥，吸收障礙和吸收功能改變的胃腸疾病，放、化療病人的營養(yǎng)吸收狀況，增強(qiáng)病人體質(zhì)，促進(jìn)病人康復(fù)，具有很好的臨床應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
人胰高血糖素相關(guān)肽-2(或胰高血糖素樣肽-2，human Glucagon-like peptide-2，hGLP-2，)又稱為人腸生長激素，是由33個氨基酸構(gòu)成的多肽，主要是由腸分泌的(在小腸遠(yuǎn)端和鄰近結(jié)、直腸大量存在，回腸遠(yuǎn)端L細(xì)胞處濃度最高)，具有刺激腸生長的作用。臨床前研究已經(jīng)證實GLP-2的作用是通過GLP-2受體介導(dǎo)的，對各種胃腸疾病(主要表現(xiàn)為吸收障礙和吸收功能改變)具有作用專一性強(qiáng)，效果明顯，穩(wěn)定性高，治療面廣，有可能用于改善放、化療病人的營養(yǎng)吸收狀況，增強(qiáng)病人體質(zhì)，促進(jìn)病人康復(fù)。因而具有很好的臨床應(yīng)用前景。
國外有文獻(xiàn)報道改變GLP-2的氨基酸組成，能改變GLP-2的促腸生長活性，如由Gly取代N-端第2個氨基酸Ala，將2個Arg加到GLP-2的N-端或?qū)LP-2的C-端氨基化等[US05789379]。
哺乳動物細(xì)胞中的二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)是一種絲氨酸外肽酶，存在于脊椎動物的許多細(xì)胞和組織中，能從肽的氨基末端釋放二肽。其水解專一底物為NH2-X-Pro-(肽或蛋白質(zhì)鏈N端第2個氨基酸殘基為Pro)，是典型的X-脯氨酰-二肽氨肽酶，PPCE為水解-Pro-X-的內(nèi)肽酶，Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽應(yīng)歸為DPPIV及PPCE酶的推測底物，Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽可能是在體內(nèi)被DPPIV及PPCE酶切割生成高活性的h[Gly2]GLP-2(1-33)肽而發(fā)揮作用。GLP-1中含有的N末端X-Ala-可被DPPIV切掉，其體內(nèi)半衰期少于2min。而DPPIV外切-Ala-X-鍵的速度僅為外切-Pro-X-速度的1％～5％，PPCE內(nèi)切-Ala-X-鍵的速度僅為內(nèi)切-Pro-X-速度的0.1％～1％。因此，Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的N末端X-Pro-應(yīng)在2min內(nèi)被體內(nèi)的DPPIV及PPCE聯(lián)合切掉。
目前國外主要采用化學(xué)合成法制備短肽，成本仍較高，采用基因工程分泌表達(dá)Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2，尚沒有成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供新的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽及其制備方法，該方法可制備人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽。
本發(fā)明的另一個目的是提供相應(yīng)的編碼序列，載體和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽有顯著的體內(nèi)促腸生長的生物學(xué)活性。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽，它包含有在人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物1-35肽前的二肽酶IV及PPCE酶切位點，以及在N端2Ala被Gly取代，同時N端接加2個脯氨酸殘基。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)力要求6所述的質(zhì)粒載體及其轉(zhuǎn)化菌。
(b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)(1-35)肽。
(c)純化出Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽。
(d)利用體內(nèi)二肽酶IV酶切Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽，形成h[Gly2]GLP-2(1-33)肽。
在一優(yōu)選例中，在本發(fā)明的方法中，所述的步驟(b)包括通過溶菌，洗滌，乙醇沉淀等方法分離出Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽與門冬酰胺酶C末端組成的融合蛋白；用酸水解方法從所述融合蛋白中切下門冬酰胺酶C末端，形成Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽；在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(c)包括通過DEAE-52離子交換柱分離出Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(-135)肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(c)還包括HPLC分離和凍干。
在本發(fā)明的第二方面，Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽對正常雄性SD大鼠(160g-200g)皮下給藥14天，取小腸，用生理鹽水清洗，去除污物和過多液體，稱重。


圖1A為Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的融合表達(dá)質(zhì)粒PED-PPGLP-2的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
圖1B為含Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的融合基因的融合表達(dá)及在誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物占全菌蛋白的百分含量隨時間變化的情況.泳道1-6為PED-PPGLP-2/BL21在乳糖誘導(dǎo)0h，2h，4h，6h，8h，10h，后的融合蛋白表達(dá)情況，泳道7為溶菌酶蛋白對照。
圖1C為PED-PPGLP-2融合表達(dá)質(zhì)粒的DNA測序圖譜。
圖2融合蛋白加工及目的肽純化圖譜。
其中圖2A為含Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的融合蛋白的純化圖譜。泳道1為溶菌酶蛋白對照；泳道2為胰島素蛋白對照；泳道3為PED-PPGLP-2/BL21在乳糖誘導(dǎo)4h后的融合蛋白表達(dá)；泳道4為酸水解前的融合蛋白；泳道5為融合蛋白在60mmol/L鹽酸水解后的水解液。
圖2B目的肽Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的純化圖譜。泳道1為中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)和胰島素蛋白對照；泳道2及3為Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽。
圖3質(zhì)譜法(ESI-MS)測定分子量。Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的ESI-MS圖譜。
圖4生物活性測定圖(促腸生長法)。用體內(nèi)生物活性測定法進(jìn)行促腸生長活性的研究。SD大鼠(160g-200g)，隨機(jī)分成4組，6只/組，1組為PBS對照組；另3組為Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)給藥組，劑量分別為0.1，0.25，0.5mg/kg/day，1天2次(上午8:00和下午6:00)，腹部皮下注射給藥14天，晚上禁食，第二天處死，取小腸，用生理鹽水清洗，去除污物和過多液體，稱重。示Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的劑量活力關(guān)系。圖5生物活性測定，示促小腸絨毛生長。其中圖5A為PBS對照組，圖5B為，0.5mg/kg/dayPro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的給藥組，腹部皮下注射給藥14天。
實施例材料(1)菌株與質(zhì)粒宿主菌E.coli BL21(DE3)LysS是基因工程常用工其菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實驗室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司。
質(zhì)粒pED由本實驗室構(gòu)建并保存。PED是本實驗室劉景晶，陳正蘭構(gòu)建的適合于短肽高效表達(dá)與加工的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒系將消去了唯一酸水解位點的L-天門冬酰胺酶C末端127肽基因以及一組多克隆位點引入質(zhì)粒PET28a的NcoI和BamHI位點之間構(gòu)建而成。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細(xì)菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品；(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
方法分子生物學(xué)操作方法。
質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達(dá)量的測定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進(jìn)行。
實施例1Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)多肽基因的設(shè)計、合成和克隆按照大腸桿菌的密碼子及設(shè)計要求將N端位置2的丙氨酸(2Ala)殘基被Gly取代同時N端延伸2個脯氨酸的人胰高血糖素相關(guān)肽-2的35個氨基酸序列轉(zhuǎn)化成核甘酸序列，其結(jié)構(gòu)框架見圖2。在其5’端增設(shè)BamH I酶切位點，3’端增設(shè)終止密碼子TAA和HindIII酶切位點，在計算機(jī)輔助分析后，確定基因全長124bp，分為53、54、53堿基的三個寡核苷酸片段，同時，為用PCR方法初篩陽性克隆，設(shè)計了下游引物M4。
合成4條序列如下M1(5’GCGGG GAT CCG CCG CAC GGT GAC GGT TCT TTC TCT GAC GAA ATG AAC ACC ATC 3’，含BamH I酶切位點)M2(5’GAC GAA ATG AAC ACC ATC CTG GAC AAC CTG GCT GCT CGT GAC TTC ATC AAC TGG 3’)M3(5’GGCCAAGC TTAATC AGT GAT TTT GGT CTG GAT CAG CCA GTT GAT GAA GTC ACG 3’，含HindIII酶切位點)M4(5’GGCCAAGC TTAATC AGT GAT TTT GGT CTG 3’，含HindIII酶切位點)由上海博亞生物技術(shù)有限公司于Beckman oligo-1000DNA合成儀上合成。PCR反應(yīng)在GTC-2型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。其中M1、M2、M3按10∶1∶10濃度比例混合，于94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30個循環(huán)。1.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，將目的片段用凝膠回收試劑盒回收后保存于-20℃。
經(jīng)凝膠回收的PCR目的片段和克隆質(zhì)粒pUC18經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，于T4DNA連接酶反應(yīng)體系中16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布到含100μg/ml Amp、40μg/ml X-gal和0.1mmol/L ITPG的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落，抽提純化重組克隆質(zhì)粒pUCGLP-2。各取與Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2的基因上、下游核苷酸序列分別互補(bǔ)的兩條特異引物M1、M4，各100pmol/L，以純化的重組質(zhì)粒分別作模板在10μl體系中進(jìn)行PCR，初篩陽性克隆，再將陽性克隆在大連寶生物工程公司ABI 377 DNA自動測序儀上進(jìn)行測序。
用M1、M4作為特異引物，以測序正確的純化的pUCGLP-2為模板，PCR反應(yīng)條件94℃，30s；54℃，60s；72℃，90s；共30個循環(huán)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于1.8％Argarose上電泳檢測并回收目的片段。所得PCR目的片段經(jīng)BamH I和HindIII雙酶消化后，插入pED的相應(yīng)酶切位點，并保持原有閱讀框架。轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)LysS感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性重組表達(dá)菌PED-PPGLP-2/BL21。經(jīng)PCR初篩重組表達(dá)質(zhì)粒pED-PPGLP-2(見圖1A)后進(jìn)行測序。DNA序列分析也與預(yù)期的相符(基因測序結(jié)果見圖1C)。
實施例2Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)多肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)重組表達(dá)菌PED-PPGLP-2/BL21在液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩過夜，以2％接種量轉(zhuǎn)接于玉米漿發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4h，加終濃度5mmol/l乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，4h后收集發(fā)酵菌體。留樣進(jìn)行15％SDS-PAGE分析和薄層掃描。在分子量約17700Da處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖1B)，與融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2理論推算值一致。融合蛋白在誘導(dǎo)后8小時達(dá)到穩(wěn)定的最大表達(dá)量，Densitometric analysis分析顯示融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的40％以上，并且在胞內(nèi)形成了包涵體。
實施例3融合蛋白分離純化誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在破壁液(pH8.0磷酸緩沖鹽，0.02％溶菌酶)，菌體裂解后得到包涵體，包涵體經(jīng)洗滌，尿素溶解及乙醇分級沉淀后獲得較純的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(圖2A)。
實施例4融合蛋白酸切割條件的研究將乙醇沉淀獲得的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成為溶液，分別于45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示低于55℃切割融合蛋白，可以獲得較為清晰的目的肽條帶。將融合蛋白按照6％比例分別用30mmol/L、60mmol/L，120mmol/L，180mmol/L，240mmol/L HCl等不同濃度HCl配置成為溶液，于50℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示用60mmol/L HCl切割融合蛋白，可以獲得較為清晰和較多的目的肽條帶。用60mmol/LHCl將融合蛋白分別配置成為1％，2％，4％，6％，8％(w/v)的溶液，于50℃切割48h，Tricin-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示對6％或8％的融合蛋白溶液進(jìn)行酸切割，可以獲得較為清晰的目的肽條帶。將融合蛋白按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成為溶液，于50℃分別切割0h，24h，36h，48h，72h，96h，Tricin-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示將融合蛋白酸切割48h至72h，可以獲得較清晰和較多的目的肽條帶，因48h和72h獲得的目的肽條帶相差不大，為保證目的肽不被破壞，故選用48h。用優(yōu)化的酸切割工藝(融合蛋白按照6％比例，用60mmol/LHCl配置成為溶液，于50℃切割48h(圖2A)。
實施例5Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的分離純化將含Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2的酸水解液調(diào)節(jié)至與平衡緩沖液基本一致的pH值，稀釋至原水解液體積的10倍左右，流動上樣于用0.02mol/L乙酸銨平衡好的0.02mol/L DEAE-52離子交換柱，將0.02mol/L乙酸銨對0.25mol/L乙酸銨進(jìn)行梯度洗脫，收集樣品峰，凍干；HPLC分離純化獲得人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽(C18柱，室溫，樣品用0.1％三氟乙酸溶解，溶媒A0.1％三氟乙酸水溶液，B99％乙睛/0.1％三氟乙酸，，乙睛梯度30％60％洗脫45min，流速0.7ml/min，檢測波長215nm，HPLC樣品真空干燥)(圖2B)。
實施例6質(zhì)譜分析由上海吉爾公司完成。
方法為電噴霧質(zhì)譜。
測得重組制備的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的相對分子質(zhì)量為3948Da(圖3)，與理論推算值一致。
實施例7Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)多肽的體內(nèi)生物學(xué)活性研究用體內(nèi)生物活性測定法進(jìn)行促腸生長活性的研究。正常雄性SD大鼠(160g-200g)，隨機(jī)分成4組，6只/組，1組為PBS對照組；另3組為Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)給藥組，劑量分別為0.1，0.25，0.5mg/kg/day，1天2次(上午8:00和下午6:00)，腹部皮下注射給藥14天，晚上禁食，第二天處死，取小腸，用生理鹽水清洗，去除污物和過多液體，稱重。結(jié)果顯示給藥組的小腸重量與PBS對照相比，顯示有明顯體內(nèi)促腸生長的生物學(xué)活性并有劑量相關(guān)性(圖4)。同時與PBS對照組(圖5A)相比，0.5mg/kg/day劑量組顯著促進(jìn)小腸絨毛生長(圖5B)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)力要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>中國藥科大學(xué)<120>人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物<130>ppglp-2<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>105<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Artificial Sequence<220>
<221>CDS<222>(1)..(105)<400>1ccg ccg cac ggt gac ggt tct ttc tct gac gaa atg aac acc atc ctg48Pro Pro His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu1 5 10 15gac aac ctg gct gct cgt gac ttc atc aac tgg ctg atc cag acc aaa96Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys20 25 30atc act gat105Ile Thr Asp35<210>2<211>35<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Synthetic Construct<400>2Pro Pro His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu1 5 10 15Asp Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys20 25 30Ile Thr Asp3權(quán)利要求
1.一種人胰高血糖素相關(guān)肽-2(hGLP-2)類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)即Pro-Pro-h[Gly.sup.2]GLP-2(1-35)。其特征在于該類似物相對分子質(zhì)量3948Da，由Gly取代N端位置2的丙氨酸(Ala)殘基，同時N端接加2個脯氨酸(Pro)殘基，N端包含二肽酶IV及PPCE酶切位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1和2所述的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的生物活性，其特征在于人胰高血糖素相關(guān)肽-2(1-33)的N端2Ala被Gly取代，同時N端接加2個脯氨酸殘基形成的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物依然能保持顯著生物活性，促進(jìn)增加腸重量，增加腸絨毛高度。
4.一種設(shè)計合成的多核苷酸，其特征在于它包含一核苷酸序列，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列。該核苷酸序列編碼權(quán)利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物。
5.一種載體，其特征在于它含有權(quán)力要求4所述的核苷酸序列及重組方法將由PCR方法生成的L-天冬酰胺酶C末端127個氨基酸的DNA片斷與人工和PCR方法合成的Asp-Pro-Pro-h[Gly2]h GLP-2的基因序列融合，構(gòu)成新的融合蛋白基因。將該基因插入到pED載體T7啟動子的下游。這個重組的融合表達(dá)質(zhì)粒稱pED-PPGLP-2。pED-PPGLP-2包括了一個融合伙伴和Asp-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2的基因。
6.一種基因工程菌，其特征在于它含有權(quán)力要求5所述的載體。
7.包括權(quán)利要求5所述的該類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的重組方法，其特征在于該融合蛋白使用L-天冬氨酸C末端127個氨基酸殘基作為融合伙伴，在融合伙伴基因與活性多肽基因之間以天冬-脯肽鍵連接，這種連接對酸敏感。
8.一種人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)力要求6所述的宿主細(xì)胞。(b)通過溶菌，洗滌，乙醇沉淀等方法，從培養(yǎng)物中分離出Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)與門冬酰胺酶C末端組成的融合蛋白AnsB-C-Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2；用酸水解方法從所述融合蛋白中切下門冬酰胺酶C末端，形成權(quán)利要求2所示氨基酸序列的人胰高血糖素相關(guān)肽-2類似物Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。(c)通過DEAE-52離子交換柱和HPLC分離出Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)。(d)利用體內(nèi)二肽酶IV酶切Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)肽，形成h[Gly2]GLP-2(1-33)。
9.如權(quán)力要求8所述的方法，其特征在于所述的步驟(d)是在Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)進(jìn)入體內(nèi)后，通過體內(nèi)豐富的體內(nèi)二肽酶IV及PPCE酶迅速酶切掉Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2(1-35)N端的Pro-Pro-，形成h[Gly2]GLP-2(1-33)。這對于研制抗二肽酶IV水解的長效激素是有益的。
全文摘要
本發(fā)明是人胰高血糖素相關(guān)肽－2類似物Pro－Pro－h(huán)[Gly
文檔編號C07K19/00GK1861635SQ20051003926
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者劉景晶, 李泰明, 吳潔 申請人:中國藥科大學(xué)