專利名稱：多肽微波固相合成法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
多肽微波固相合成法涉及的是一種微波輔助下的多肽固相合成方法，本發(fā)明屬有機化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般來講，多肽指由低于五十個氨基酸組成的化合物，它具有多種多樣的生物活性。人們發(fā)現(xiàn)存在于生物體的多肽有數(shù)萬種，并且發(fā)現(xiàn)所有的細胞都能合成多肽。同時，幾乎所有細胞也都受多肽調(diào)節(jié)，它涉及激素、神經(jīng)、細胞生長和生殖等各個領(lǐng)域。它們是溝通細胞間與器官間信息的重要化學(xué)信使，通過內(nèi)分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌乃至神經(jīng)分泌等作用方式行使其微妙的信息傳遞功能，從而使有機體組合成一系列高度嚴密的控制系統(tǒng)，調(diào)節(jié)生長、發(fā)育、繁殖、代謝和行為等生命過程，對于發(fā)育和新陳代謝的過程有著包括復(fù)雜調(diào)節(jié)和直接作用的多重生物功能。
多肽化學(xué)合成法可分為液相合成和固相合成法。液相合成法的反應(yīng)在液相中進行，由于每一步反應(yīng)后都需要將中間產(chǎn)物分離純化出來，因此工藝過于繁雜，操作實施比較困難。固相合成法采用不溶性載體鍵合的聚合物，只要簡單的反復(fù)過濾和洗滌，即可將可溶性的試劑和副產(chǎn)物分離出來。工藝簡單，是化學(xué)合成多肽的首選方法。目前，固相多肽合成中存在的主要問題一是由于固液之間的傳質(zhì)問題而使得反應(yīng)速度較慢，每個氨基酸的連接時間在兩個小時或以上，肽制備工藝時間長；二是由于氨基酸過量倍數(shù)高而增加了肽合成成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足之處，提供一種多肽微波固相合成法，在微波輔助下的固相多肽合成方法和傳統(tǒng)方法相比，大大縮短了反應(yīng)時間，減少了氨基酸的過量倍數(shù)，提高了產(chǎn)物的純度，最終降低了多肽的生產(chǎn)成本。
微波指波長1μm～1mm，頻率從300MHz～300GHz的超高頻電磁波。微波已被廣泛應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域。微波在化學(xué)中的應(yīng)用開辟了微波化學(xué)這一化學(xué)新領(lǐng)域，即微波直接與化學(xué)體系發(fā)生作用，從而促進各類化學(xué)反應(yīng)的進行。微波的作用原理目前主要存在兩種理論一是極性介質(zhì)在微波場作用下隨其高速旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生相當于“分子攪動”的運動，從而被均勻地加熱及混合，提高反應(yīng)速率。二是微波對化學(xué)反應(yīng)作用是非常復(fù)雜的，除了具有熱效應(yīng)外還存在一種不是由溫度引起的非熱效應(yīng)，它能改變反應(yīng)的動力學(xué)性質(zhì)，降低反應(yīng)的活化能，存在著某些特定的非熱效應(yīng)的影響。微波技術(shù)具有清潔、高效、耗能少、污染低等特點，已在無機化學(xué)、有機化學(xué)分析化學(xué)和環(huán)境化學(xué)等學(xué)科中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。
多肽微波固相合成法是采取以下方案實現(xiàn)本發(fā)明使用能吸收微波的溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)為介質(zhì)，將微波技術(shù)應(yīng)用在多肽合成中脫除氨基保護基、氨基酸縮合、多肽粗品的制備以及二硫鍵的形成四步反應(yīng)中，利用微波的特殊效應(yīng)，降低反應(yīng)的活化能，提高反應(yīng)速度。所用的微波頻率為2450赫茲，溫度和壓力可以在線控制，以維持恒定溫度為控制條件，微波的功率隨之變化。
多肽微波固相合成法為
氨基酸-樹脂復(fù)合物的制備稱量一份多肽合成樹脂，可以是羥基樹脂如王(wang)樹脂、氯樹脂如2-氯-三苯甲基氯樹脂和氨基樹脂如Rink Amide樹脂中的一種，放入帶過濾裝置的反應(yīng)器中，向其中加入二氯甲烷(DCM)，溶脹樹脂30～120min，然后抽掉二氯甲烷溶液。稱量羧基端氨基酸和縮合試劑——二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIC)和1-羥基苯丙三氮唑(HOBt)，放入可以密封的容器中，加入二甲基甲酰胺或四氫呋喃(THF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)，反應(yīng)30～150min。所述的氨基酸是側(cè)鏈官能團和氨基端均受到保護的保護氨基酸。所述的氨基酸和樹脂物質(zhì)的量的比為7～3∶1；氨基酸和縮合試劑物質(zhì)的量的比為1∶1～1.2。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉沉淀，將濾液加入到裝有樹脂的帶過濾裝置的反應(yīng)器中，同時加入二甲氨基吡啶(DMAP)，反應(yīng)4～20個小時。其中二甲氨基吡啶和樹脂物質(zhì)的量的比為0.1～0.5∶1。然后抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷依次洗滌樹脂三次。
微波輻射脫除氨基保護基在上面洗滌得到的氨基酸-樹脂復(fù)合物中加入脫保護試劑——20～30％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后將置于微波反應(yīng)器中反應(yīng)，微波條件是溫度為20～70℃，反應(yīng)時間為3～10min。反應(yīng)完畢后，過濾抽掉溶液，用二甲基甲酰胺、甲醇(MeOH)、二氯甲烷洗滌樹脂。
微波輻射縮合氨基酸稱量下一個保護氨基酸和縮合試劑，放入可以密閉的容器中，加入溶劑溶解。其中所述的縮合試劑包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，苯并三氮唑-N，N，N′，N′，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)，卡特縮合劑BOP reagent，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)，二異丙基乙基胺(DIEA)，和它們的衍生物中的幾種。所述的氨基酸和樹脂物質(zhì)的量的比為4～2∶1；氨基酸和縮合試劑物質(zhì)的量的比為1∶1～1.2。所述的溶劑為二甲基甲酰胺、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃。然后將溶液加入到裝有脫除氨基保護基的氨基酸-樹脂復(fù)合物的反應(yīng)器中，置于微波反應(yīng)器中反應(yīng)，微波條件是溫度為20～70℃，反應(yīng)時間為3～10min。反應(yīng)完畢后，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗滌樹脂。
按照氨基酸從羧基端到氨基端的順序，更換氨基酸，重復(fù)微波輻射脫保護和微波輻射縮合氨基酸的反應(yīng)，合成所需的肽鏈。
多肽粗品的制備將上面得到的保護肽鏈-樹脂放入可以密閉的容器中，加入切割試劑，微波輻射下反應(yīng)。所述的切割試劑包括三氟乙酸(TFA)、重蒸水、三乙基硅烷(TES)、三異丙基硅烷(TIS)、苯酚、苯甲硫醚、苯甲醚、乙二硫醇(EDT)和二氯甲烷。它們之間的組合和相互比例可以為①三氟乙酸∶三異丙基硅烷(或三乙基硅烷)∶重蒸水＝95％∶2.5％∶2.5％(v/v)；②三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶苯甲醚∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；③三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶乙二硫醇∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；④三氟乙酸∶重蒸水＝95％∶5％(v/v)；⑤三氟乙酸∶二氯甲烷＝50％∶50％(v/v)。微波條件為溫度為30～60℃，反應(yīng)時間為10～20min。然后過濾掉樹脂，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸。向剩下的液體中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后離心，去除上清液，得到所需的多肽。
對于含有二硫鍵的多肽，采用5～30％二甲亞砜(DMSO)/水溶液為氧化劑，在微波輻射下合成二硫鍵，微波條件是溫度為20～60℃，反應(yīng)時間為5～30min。
所述的微波反應(yīng)器由美國CEM公司制造，型號為Mars5。該微波反應(yīng)器溫度和壓力可以在線控制，使得反應(yīng)結(jié)果具有很好的重復(fù)性和可靠性。
本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比有如下特點1.大大提高反應(yīng)的速率。常規(guī)固相多肽合成方法連接一個氨基酸一般需要時間兩個小時或者更長的時間，而在微波輻射下，連接一個氨基的時間不超過10min，反應(yīng)速率至少提高了11倍。因為微波輻射具有特殊的作用，可以降低反應(yīng)的活化能，從而加快反應(yīng)的進行。
2.在微波輻射下進行二硫鍵的合成，縮短了反應(yīng)的時間，提高了產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。
3.降低合成的成本。在常規(guī)方法中，氨基酸和縮合試劑與樹脂的比例一般為5～3∶1，也即是氨基酸和縮合試劑的過量倍數(shù)為4～2倍，而氨基酸和縮合試劑占合成成本的80％以上，是固相多肽合成成本高居不下的主要原因。而在微波輻射下，可將氨基酸和縮合試劑的過量倍數(shù)降低到1倍，這就大大降低了多肽的合成成本。
4.縮短多肽的合成周期，提高合成的效率。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下實例作進一步舉例說明，這些實例不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制。
實施例1 胸腺五肽的微波法制備(1)稱量王樹脂(0.93mmol/g)3克(2.79mmol)，置于反應(yīng)器中，加入二氯甲烷15mL溶脹樹脂120分鐘，抽掉二氯甲烷溶液。稱量19.53mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH(保護酪氨酸)，加入10mL四氫呋喃溶解，然后再加入19.53mmol二異丙基碳二亞胺和19.53mmol 1-羥基苯并三氮唑，反應(yīng)150min。反應(yīng)結(jié)束后，過濾去沉淀，將濾液加入到樹脂中，同時加入1.395mmol二甲氨基吡啶，反應(yīng)20個小時。反應(yīng)中各物料物質(zhì)的量之比為Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶樹脂＝7∶1；Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶縮合試劑＝1∶1；二甲氨基吡啶∶樹脂＝0.5∶1。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺15mL各洗滌樹脂三次。真空干燥樹脂，測得Fmoc-Tyr(tBu)-OH和樹脂的連接效率是85％。
(2)微波輔助脫除芴甲氧羰基(Fmoc)保護基將酪氨酸-王樹脂置于反應(yīng)管中，然后加入10mL 30％哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反應(yīng)在微波反應(yīng)器中進行。微波條件為溫度為70℃，反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺20mL各洗滌樹脂三次。
(3)微波輔助縮合反應(yīng)1)縮合Fmoc-Val-OH。稱量Fmoc-Val-OH，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和1-羥基苯并三氮唑各9.487mmol，用10mL N-甲基吡咯烷酮溶解。然后加入到樹脂中，同時加入9.487mmol的二異丙基乙基胺(Fmoc-Val-OH∶縮合試劑＝1∶1；Fmoc-Val-OH∶樹脂＝4∶1)，微波輻射下反應(yīng)。微波條件為溫度為70℃，反應(yīng)時間為10min。然后抽掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺20mL各洗滌樹脂三次。
2)肽鏈的延長。按照胸腺五肽中氨基酸從羧基端到氨基端的順序(Tyr-Val-Asp-Lys-Arg)，氨基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Val-OH相同，重復(fù)縮合和脫保護兩步反應(yīng)，合成胸腺五肽。
(4)胸腺五肽粗品的制備稱量合成的胸腺五肽-樹脂40mg左右，置于可以密封的容器中，加入0.125mL重蒸水、0.125mL三乙基硅烷以及4.75mL三氟乙酸(重蒸水∶三乙基硅烷∶三氟乙酸＝2.5％∶2.5％∶95％，v/v)，微波輻射下反應(yīng)10min，溫度為30℃。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉樹脂，用10mL二氯甲烷洗滌樹脂三次，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸和其他有機溶劑。在剩余的液體中加入適量冰的無水乙醚析出胸腺五肽，然后離心得到胸腺五肽粗品。
(5)胸腺五肽的分析將離心后得到的白色沉淀溶于5mL重蒸水中，經(jīng)過0.22μ的膜過濾，然后加入重蒸水稀釋10倍，以胸腺五肽對照品作標樣，用高效液相色譜(HPLC)分析胸腺五肽的純度和產(chǎn)率。液相條件為流動相為0.1％三氟乙酸水溶液和甲醇，比例為85％∶15％；流速為1mL/min；波長為275nm。測得純度為96.5％，計算得到產(chǎn)率為92.4％。
實施例2 氨基酸和縮合試劑過量一倍下胸腺五肽的微波法合成(1)稱量王樹脂(0.93mmol/g)1克(0.93mmol)，置于反應(yīng)器中，加入二氯甲烷10mL溶脹樹脂90分鐘，抽掉二氯甲烷溶液。稱量3.4875mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH，加入10mL二甲基甲酰胺溶解，然后再加入4.185mmol二異丙基碳二亞胺和4.185mmol 1-羥基苯并三氮唑，反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，過濾去沉淀，將濾液加入到樹脂中，同時加入0.465mmol二甲氨基吡啶，反應(yīng)4個小時。反應(yīng)中各物料物質(zhì)的量之比為氨基酸∶樹脂＝3∶1；Fmoc-Tyr(tBu)-OH∶縮合試劑＝1∶1.2；二甲氨基吡啶∶樹脂＝0.1∶1。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺10mL各洗滌樹脂三次。真空干燥樹脂，測得Fmoc-Tyr(tBu)-OH和樹脂的連接效率是95％。
(2)微波輔助脫除Fmoc保護基將酪氨酸-王樹脂置于反應(yīng)管中，然后加入20mL 25％哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反應(yīng)在微波反應(yīng)器中進行。微波條件為溫度40℃，反應(yīng)時間6min。反應(yīng)結(jié)束后，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺10mL各洗滌樹脂三次。
(3)微波輔助縮合反應(yīng)1)縮合Fmoc-Val-OH。稱量Fmoc-Val-OH 1.767mmol，苯并三氮唑-N，N，N’，N’，-四甲基脲六氟磷酸酯和1-羥基苯并三氮唑各1.945mmol，用10mL二甲基甲酰胺溶解。然后加入到樹脂中，同時加入1.945mmol的二異丙基乙基胺(Fmoc-Val-OH∶縮合試劑＝1∶1.1；Fmoc-Val-OH∶樹脂＝2∶1)，微波輻射下反應(yīng)。微波條件為溫度30℃，反應(yīng)時間5min。然后抽掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺10mL各洗滌樹脂三次。
2)肽鏈的延長。按照胸腺五肽中氨基酸從羧基端到氨基端的順序，氨基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Val-OH相同，重復(fù)縮合和脫保護兩步反應(yīng)，合成胸腺五肽。
(4)胸腺五肽粗品的制備稱量合成的胸腺五肽-樹脂40mg左右，置于可以密封的容器中，加入0.125mL重蒸水、0.125mL三異丙基硅烷以及4.75mL三氟乙酸(重蒸水∶三異丙基硅烷∶三氟乙酸＝2.5％∶2.5％∶95％，v/v)，微波輻射下反應(yīng)20min，溫度為60℃。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉樹脂，用10mL二氯甲烷洗滌樹脂三次，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸和其他有機溶劑。在剩余的液體中加入適量冰的無水乙醚析出胸腺五肽，然后離心得到胸腺五肽粗品。
(5)胸腺五肽的分析將離心后得到的白色沉淀溶于5mL重蒸水中，經(jīng)過0.22μ的膜過濾，然后加入重蒸水稀釋10倍，以胸腺五肽對照品作標樣，用高效液相色譜(HPLC)分析胸腺五肽的純度和產(chǎn)率。液相條件為流動相為0.1％水溶液和甲醇，比例為85％∶15％；流速為1mL/min；波長為275nm。測得純度為91％，計算得到產(chǎn)率為88.7％。
胸腺五肽的鑒定ESI-MS質(zhì)譜測定為目標產(chǎn)物M+1＝680.4，和理論分子量一致。
核磁共振結(jié)果為1H NMR(500MHz，D2O)δ6.67～6.98(m，4H，ArH)，3.34～4.48(m，5H，CH)，2.46～3.05(m，8H，Argδ-，Lysε-，Aspβ-，Tyrβ-，CH2)，1.30～1.58(m，11H，Argβ-，γ-，Lysα-，β-，γ-，Valβ-，CH2)，0.69～0.72(m，6H，CH3)。結(jié)果和文獻報道一致。
實施例3 微波輔助固相合成奧曲肽(1)稱量Rink Amide樹脂(0.4mmol/g)1g(0.4mmol)，置于反應(yīng)器中，加入二氯甲烷5mL溶脹樹脂30分鐘，抽掉二氯甲烷溶液。稱量1.6mmol Fmoc-L-蘇氨醇與對羧基苯甲醛形成的雙縮醛，加入8mL N-甲基吡咯烷酮溶解，然后再加入1.76mmol二環(huán)己基碳二亞胺和1.76mmol 1-羥基苯并三氮唑，反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，過濾去沉淀，將濾液加入到樹脂中，同時加入0.08mmol二甲氨基吡啶，反應(yīng)4個小時。反應(yīng)中各物料物質(zhì)的量之比為氨基酸∶樹脂＝4∶1；蘇氨醇縮醛∶縮合試劑＝1∶1.1；二甲氨基吡啶∶樹脂＝0.2∶1。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺10mL各洗滌樹脂三次。真空干燥樹脂，測得蘇氨醇縮醛和樹脂的連接效率是75％。
(2)微波輔助脫除Fmoc保護基將蘇氨醇-DHP樹脂置于固相肽反應(yīng)管中，然后加入8mL 20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反應(yīng)在微波反應(yīng)器中進行。微波條件為溫度20℃，反應(yīng)時間3min。反應(yīng)結(jié)束后，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺8mL各洗滌樹脂三次。
(3)微波輔助縮合反應(yīng)1)縮合Fmoc-Cys(trt)-OH。稱量Fmoc-Cys(trt)-OH 0.9mmol，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯和N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑各1.08mmol，用4mL四氫呋喃溶解，然后加入1)中得到的樹脂中，同時加入1.08mmol的二異丙基乙基胺(Fmoc-Cys(trt)-OH∶縮合試劑＝1∶1.2，F(xiàn)moc-Cys(trt)-OH∶樹脂＝3∶1)，微波輻射下反應(yīng)。微波條件為溫度20℃，反應(yīng)時間3min。然后抽掉反應(yīng)液，加入二氯甲烷，甲醇，和二甲基甲酰胺20mL各洗滌樹脂三次。
2)肽鏈的延長。按照奧曲肽中氨基酸從羧基端到氨基端的順序(Thr-ol-Cys-Thr-Lys-D-Trp-Phe-Cys-D-Phe)，氨基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Cys(trt)-OH相同，重復(fù)縮和脫保護兩步反應(yīng)，合成奧曲肽。
(4)還原型奧曲肽粗品的制備及分析稱量合成的奧曲肽-樹脂200mg左右，置于可以密封的容器中，8mL三氟乙酸、0.5mL重蒸水、0.5mL苯酚以及0.25mL乙二硫醇、0.25mL苯甲硫醚(三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶乙二硫醇∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％，v/v)，微波輻射下反應(yīng)15min，溫度為40℃。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉樹脂，用10mL二氯甲烷洗滌樹脂三次，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸和其它有機溶劑。在剩余的液體中加入適量冰的無水乙醚析出奧曲肽，然后離心得到奧曲肽粗品。
將離心后得到的白色沉淀溶于5mL重蒸水中，經(jīng)過0.22μ的膜過濾，然后加入重蒸水稀釋10倍，以奧曲肽對照品作標樣，用高效液相色譜(HPLC)分析奧曲肽的純度和產(chǎn)率。液相條件為流動相為1‰的三氟乙酸/水溶液和甲醇，比例為85％∶15％；流速為1mL/min；波長為280nm。測得純度為91.6％，計算得到產(chǎn)率為85.5％。ESI-MS m/z1021.1[M+]，實際相對分子質(zhì)量為1021.1。
(5)氧化型奧曲肽的制備及分析取凍干后的還原型奧曲肽50mg，加入10mL 5％的DMSO/水溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)，微波反應(yīng)條件為溫度30℃，反應(yīng)時間5min。用高效液相色譜分析反應(yīng)的結(jié)果，氧化型奧曲肽的產(chǎn)率達到90.8％。ESI-MS m/z1019.5[M+]，實際相對分子質(zhì)量為1019.2。
權(quán)利要求
1.一種多肽微波固相合成法，其特征在于微波固相合成法為(1)氨基酸-樹脂復(fù)合物的制備稱量一份多肽合成樹脂，放入帶過濾裝置的反應(yīng)器中，向其中加入二氯甲烷，溶脹樹脂30～120min，然后抽掉二氯甲烷溶液，稱量羧基端氨基酸和縮合試劑——二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯丙三氮唑，放入可以密封的容器中，加入二甲基甲酰胺或四氫呋喃，反應(yīng)30～150min，所述的氨基酸和樹脂物質(zhì)的量的比為7～3∶1；氨基酸和縮合試劑物質(zhì)的量的比為1∶1～1.2，反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉沉淀，將濾液加入到裝有樹脂的帶過濾裝置的反應(yīng)器中，同時加入二甲氨基吡啶，反應(yīng)3～20個小時，其中二甲氨基吡啶和樹脂物質(zhì)的量的比為0.5～0.1∶1，然后抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷依次洗滌樹脂三次；(2)微波輻射脫除氨基保護基在上面洗滌得到的氨基酸-樹脂復(fù)合物中加入脫保護試劑——20～30％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后將置于微波反應(yīng)器中反應(yīng)，微波條件是溫度為20～70℃，反應(yīng)時間為3～10min，反應(yīng)完畢后，過濾抽掉溶液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗滌樹脂；(3)微波輻射縮合氨基酸稱量下一個保護氨基酸和縮合試劑，放入可以密閉的容器中，加入溶劑溶解，所述的氨基酸和樹脂物質(zhì)的量的比為4～2∶1；氨基酸和縮合試劑物質(zhì)的量的比為1∶1～1.2，所述的溶劑為二甲基甲酰胺、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋喃，然后將溶液加入到裝有脫除氨基保護基的氨基酸-樹脂復(fù)合物的反應(yīng)器中，置于微波反應(yīng)器中反應(yīng)，微波條件是溫度為20～70℃，反應(yīng)時間為3～10min，反應(yīng)完畢后，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗滌樹脂；(4)按照氨基酸從羧基端到氨基端的順序，更換氨基酸，重復(fù)微波輻射脫保護和微波輻射縮合氨基酸的反應(yīng)，合成所需的多肽；(5)多肽粗品的制備將上面得到的保護肽-樹脂放入可以密閉的容器中，加入切割試劑，微波輻射下反應(yīng)，微波條件為溫度30～60℃，反應(yīng)時間為10～20min，然后過濾掉樹脂，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，向剩下的液體中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后離心，去除上清液，得到所需的多肽粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽微波固相合成法，其特征在于對于含有二硫鍵的多肽，采用5～30％二甲亞砜/水溶液為氧化劑，在微波輻射下合成二硫鍵，微波條件是溫度為20～60℃，反應(yīng)時間為5～30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽微波固相合成法，其特征在于多肽合成樹脂采用羥基樹脂、氯樹脂和氨基樹脂中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽微波固相合成法，其特征在于所述的氨基酸是側(cè)鏈官能團和氨基端均受到保護的保護氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽微波固相合成法，其特征在于合成法(3)中所述的縮合試劑包括二環(huán)己基碳二亞胺，二異丙基碳二亞胺，1-羥基苯并三氮唑，苯并三氮唑-N，N，N′，N′，-四甲基脲六氟磷酸酯，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯，N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑，卡特縮合劑BOPreagent，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，二異丙基乙基胺，和它們的衍生物中的幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽微波固相合成法，其特征在于合成法(5)中所述的所述的切割試劑包括三氟乙酸、重蒸水、三乙基硅烷、三異丙基硅烷、苯酚、苯甲硫醚、苯甲醚、乙二硫醇和二氯甲烷，它們之間的組合和相互比例可以為①三氟乙酸∶三異丙基硅烷或三乙基硅烷∶重蒸水＝95％∶2.5％∶2.5％(v/v)；②三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶苯甲醚∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；③三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶乙二硫醇∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；④三氟乙酸∶重蒸水＝95％∶5％(v/v)；⑤三氟乙酸∶二氯甲烷＝50％∶50％(v/v)。
全文摘要
多肽微波固相合成法涉及的是一種微波輔助下的多肽固相合成方法。多肽微波固相合成法為(1)氨基酸－樹脂復(fù)合物的制備加入二氯甲烷溶脹多肽合成樹脂；在羧基端氨基酸和縮合試劑中加入溶劑，反應(yīng)結(jié)束后過濾，將濾液加入樹脂中，同時加入二甲氨基吡啶反應(yīng)。(2)微波輻射脫除氨基保護基在氨基酸－樹脂復(fù)合物中加入脫保護試劑，微波輻射下反應(yīng)。(3)微波輻射縮合氨基酸溶解下一個氨基酸和縮合試劑，加入到氨基酸－樹脂復(fù)合物中，微波輻射下反應(yīng)。(4)更換氨基酸，重復(fù)(2)和(3)合成所需的多肽。(5)多肽粗品的制備在合成的肽鏈中加入切割試劑，微波輻射。反應(yīng)結(jié)束后過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，向余液中加入冰乙醚，析出多肽粗品。
文檔編號C07K1/00GK1699404SQ20051004003
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月17日
發(fā)明者沈樹寶, 王衛(wèi)國, 李佩華, 應(yīng)漢杰, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學(xué)