專利名稱：一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種活性多肽，特別是涉及一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽。
背景技術：
目前市場所流行的各種美容化妝品中，有些添加了各種皮膚生長因子類多肽或蛋白類物質，這些生長因子在體外細胞培養(yǎng)實驗中均可有效促進皮膚角質細胞的有絲分裂，添加于化妝品中，可使皮膚角質層更新?lián)Q代加快，從而形成新鮮、致密的角質層，以達到美容的目的。但皮膚角質層下是一層拒水的磷脂膜屏障，其功能是阻擋體內外水分的交換，所以，水溶性物質一般不能透過皮膚進入體內，使上述做法收效甚微，為了解決這個問題，目前化妝品中添加水溶性生長因子的方法是用表面活性劑(多為氮酮)將這些物質制備成油包水型細微顆粒，以相似相溶原理使其越過皮膚磷脂膜屏障，順利進入皮下組織，這種方法是一種有效的化學方法，但需以損傷皮膚為代價，并且所用表面活性劑對皮膚均有一定毒副作用，有些甚至會引起皮膚炎癥，產(chǎn)生不良效果。
基礎研究發(fā)現(xiàn)，有一類富含精氨酸和賴氨酸的多肽可以以非能量、非受體依賴方式自由出入細胞膜內外，并與濃度、溫度等環(huán)境因素無關，因此稱為穿膜肽，已經(jīng)有很多用穿膜肽將其它多肽或DNA等物質攜帶進入細胞內部的成功報道，但尚未見到用于化妝品的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽及其應用，其用穿膜肽與有促進角質細胞有絲分裂作用的功能肽融合，從而組成一種新的融合肽，可順利攜帶功能肽越過皮膚磷脂屏障，進入皮下組織，產(chǎn)生相應作用。
一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽，其序列為RKKRRQRRRASTTTNYT，其中R＝Arg＝arginine＝精氨酸，K＝Lys＝lysine＝賴氨酸，Q＝Gln＝glutamine＝谷酰胺，A＝Ala＝alanine＝丙氨酸，S＝Ser＝serine＝絲氨酸，T＝Thr＝threonine＝蘇氨酸，N＝Asn＝asparagine＝天冬酰胺，Y＝Tyr＝tyrosine＝酪氨酸。該活性多肽由穿膜肽和功能肽融合而成，穿膜肽位于其序列的前9個氨基酸，是愛滋病病毒(HIV)的轉錄活化因子---Tat蛋白的堿性區(qū)域片段多肽HIV-Tat49-57，RKKRRQRRR，在Tat蛋白中，其主要功能是介導Tat蛋白發(fā)生細胞內在化，即穿透細胞膜，將愛滋病病毒DNA導入感染細胞內，本發(fā)明用這條肽的穿膜作用將另一條功能多肽導入皮膚角質層細胞間質及細胞內部。
功能多肽位于其序列的后8個氨基酸，是愛滋病病毒(HIV)包膜糖蛋白gp120中的一段多肽類似物，ASTTTNYT，即T肽。T肽在0.1umol/L時就具有致角質細胞有絲分裂的作用。在T肽治療牛皮癬的臨床研究中，采用靜脈滴注或病灶部位局部注射的方法都取得了良好的效果，使用一周后，病人的牛皮癬病情則得到緩解，使用一個月，可使約50％的病人的牛皮癬消失。但這種給藥方法并不是最佳的，尤其對于皮膚病來說，應以皮膚給藥途徑最為理想。
一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽在制備用于治療牛皮癬的藥物中的應用。
一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽作為化妝品的應用。
本發(fā)明的活性多肽具備了自行穿透皮膚磷脂膜屏障和細胞膜的能力，進入皮膚細胞間質和細胞后，體內氨肽酶將開始水解穿膜肽，因穿膜肽富含精氨酸，其代謝產(chǎn)生的一氧化氮具有舒張血管之作用，可以改善皮膚血液循環(huán)，有利于皮膚健康。隨著穿膜肽被水解完畢，則釋放出功能肽，而功能肽則具有促角質細胞有絲分裂的作用。功能肽也會逐步被水解，其產(chǎn)物為氨基酸，不會對皮膚產(chǎn)生副作用。
本發(fā)明克服了功能肽不易通過皮膚磷脂屏障的缺點，順利進入到皮膚細胞間質中發(fā)揮其作用。用于牛皮癬的治療，可使其通過皮膚給藥途徑達到治療目的；用于化妝品，使產(chǎn)品具備了使皮膚角質層更新?lián)Q代加快的作用，形成新鮮的角質層均勻、致密、彈性良好，故可產(chǎn)生除皺美容的效果。
具體實施例方式
實施例1一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽，其序列為RKKRRQRRRASTTTNYT，可以用化學合成的方法獲得，采用固相多肽合成工藝，本發(fā)明采用工業(yè)多肽合成設備實施，選用Wang resin或2-Cl-resin，每批次用樹脂5克，催化劑HOBT/DCC和保護氨基酸用量按樹脂量的5倍使用。
保護氨基酸的保護方案分Fmoc和Boc法兩種在Boc法中氨基酸的α--氨基用Boc(叔丁基氧羰?；?基團進行保護封閉，該基團對弱酸敏感，可以用50％的三氟乙酸將其脫除，側鏈活性基團如氨基、巰基、羥基、羧基、胍基等可以用對甲苯磺?；?Tos)、叔丁基(tBU)、苯甲氧基(Bzl)、硝基(NO2)等進行保護，這些保護基團可用氫化催化方法脫除，每連接一個氨基酸，用三氟乙酸將α-氨基的保護基團脫除使氨基游離出來，可與第二個氨基酸的羧基進行縮合，重復脫保護，縮合可使肽鏈逐步延長，最后用HF或三氟甲基磺酸可將第一個氨基酸的羧基與樹脂之間的連接鍵切斷，同時也切除了所有側鏈保護基團，使活性多肽裸露出來獲得粗肽，用HPLC可對粗肽進行純化獲得純肽；在Fmoc法中，氨基酸的α-氨基用Fmoc基團保護，此基團與氨基之間的連接鍵對堿敏感而對酸穩(wěn)定，可用哌啶切斷，側鏈活性基團用對酸敏感而對堿穩(wěn)定的基團進行保護，如(Trt，Boc，2-Cl-Z，tBu等)，每連接一個氨基酸，用哌啶除去α-氨基的Fmoc保護基團，使氨基游離出來，可與第二個氨基酸的羧基進行縮合，重復脫保護，縮合可使肽鏈逐步延長，最后用三氟乙酸∶酚∶乙基二硫醇∶苯甲硫醚∶水＝82.5∶0.75∶2.5∶2.5∶5混合切割試劑，每克樹脂用15毫升切割試劑，可將第一個氨基酸的羧基與樹脂之間的連接鍵切斷，同時也切除了所有側鏈保護基團，使活性多肽裸露出來獲得粗肽，用HPLC可對粗肽進行純化獲得純肽。
實施例2本發(fā)明可以用基因重組的方法獲得，按常規(guī)DNA合成方法制備本發(fā)明對應的基因序列，將這個多肽的基因序列克隆到載體質粒中，再將質粒輸送到大腸桿菌中，從而構建一個基因工程菌，對該基因工程菌進行人工培養(yǎng)，可以生產(chǎn)出富含該活性多肽的包涵體，用鹽酸胍或尿素溶解包涵體，用HPLC進行相關純化處理，可得到純的活性多肽，用做美容產(chǎn)品或牛皮癬治療產(chǎn)品的原料。
本發(fā)明在常規(guī)角質細胞培養(yǎng)對照實驗中，在0.1umol/L時，可以使細胞周期縮短25-35％。
應用示例應用示例1按重量百分比，用甘油30±10％、水30±10％、薄荷油5±1％、冰片5±1％、凡士林30±10％、苯甲酸鈉0.01％以及本發(fā)明的活性多肽1±0.5mmol，按上述配比調制成粘稠狀油質液體，可涂抹于皮膚表面的牛皮癬病灶部位，用于治療牛皮癬。
應用示例2按重量百分比，用聚乙烯醇20±5％、甘油25±5％、水25±10％、透明質酸鈉30±10％、苯甲酸鈉0.01％以及本發(fā)明的活性多肽1±0.5mmol按上述配比調制成一種晶瑩透明的液體，成為一種高級美容化妝品，具有增加皮膚彈性，促進皮膚角質更新，消除皮膚皺褶，使皮膚鮮艷的美容作用。
應用示例3在上述應用示例2的基礎上，添加氨基酸、維生素、乙酸乙酯(或各種天然油質香精)適量，生產(chǎn)各種營養(yǎng)性美容化妝品。
序列表<110>陜西九州科技股份有限公司<120>一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽及其應用<160>1<210>1<211>17<212>PRT<213>人工序列<400>1Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ser Thr Thr Thr Asn Tyr15 10 15Thr
權利要求
1.一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的活性多肽，其序列為RKKRRQRRRASTTTNYT。
2.權利要求1所述的多肽在制備用于治療牛皮癬的藥物中的應用。
3.權利要求1所述的多肽作為化妝品的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有促進角質細胞有絲分裂作用的的活性多肽及其應用，其序列為RKKRRQRRRAS TTTNYT，該活性多肽由穿膜肽和功能肽融合而成，本發(fā)明克服了功能肽不易通過皮膚磷脂屏障的缺點，通過穿膜肽的作用順利進入到皮膚細胞間質中發(fā)揮其作用，并可進一步穿透細胞膜，進入細胞內部，從而促進皮膚角質細胞的有絲分裂。本發(fā)明在制備用于治療牛皮癬的藥物中的應用，可使其通過皮膚給藥途徑達到治療目的；本發(fā)明作為化妝品的應用，使產(chǎn)品具備了使皮膚角質層更新?lián)Q代加快的作用，形成新鮮的角質層均勻、致密、彈性良好，故可產(chǎn)生除皺美容的效果。
文檔編號C07K7/00GK1687117SQ20051004188
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權日2005年4月1日
發(fā)明者趙金禮 申請人:陜西九州科技股份有限公司