專利名稱：一種r－藻紅蛋白的快速分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種R-藻紅蛋白的快速分離純化方法，屬于海洋紅藻分離純化技術領域。
背景技術：
為了研究蛋白質(zhì)等生物大分子的細胞定位、相互作用及其動態(tài)變化，研究人員急需新技術和新材料來實現(xiàn)對蛋白質(zhì)等生物大分子的“標識”、“閱讀”和“查詢”?，F(xiàn)在常用的熒光標記，由于熒光染料分子熒光特性的限制(熒光光譜較寬、量子產(chǎn)率低)，遠遠不能適用于高通量的生物大分子專一標識。
藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質(zhì)復合物，主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的熒光。在藍藻和紅藻中，由2-3種藻膽蛋白組成超分子結構藻膽體，形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻類光合作用的學者提出將藻膽蛋白作為熒光標記物，用于診斷試劑。由于其獨特的優(yōu)點，藻膽蛋白和藻膽蛋白標記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。
同常用的熒光標記物相比，藻膽蛋白具有下列優(yōu)點生產(chǎn)過程安全、無毒，光能吸收強，熒光產(chǎn)率高，超過90％，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以作雙色、三色和四色標記。所以，這類試劑的應用范圍不斷擴大。但是，由于價格昂貴，尚未應用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限于用細胞流式儀進行的診斷。
藻膽蛋白及其診斷試劑主要由美國生產(chǎn)，德國也有產(chǎn)品向我國推銷，英國和我國臺灣正在研制。最早研制產(chǎn)品的是美國分子探針公司(Molecular Probes，Inc.)，目前西格瑪(Sigma)公司共有6種藻膽蛋白產(chǎn)品，藻膽蛋白-Biotin/Avidin標記物12種，RPE-IgG或RPE-IgM12種，RPE單抗標記物3種。藻膽蛋白生產(chǎn)沿用已公開的實驗室方法。藻膽蛋白的種類包括異藻藍蛋白(APC)、藻藍蛋白(PC)、藻紅藍蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類，其中，藻藍蛋白和藻紅蛋白根據(jù)其光譜特性不同又分為CPC、RPC、CPE、b-PE、BPE和RPE(R-藻紅蛋白)。其中存在于海洋大型紅藻中的RPE是目前最常用的藻膽蛋白熒光探針。因為，RPE色素基團多，亮度大，斯托克位移大。我國沿海大型紅藻的資源非常豐富，其中有些是分離純化R-藻紅蛋白(RPE)的很好的材料。國際市場上決定購、銷關系的主要是價格因素。影響普及型診斷試劑的開發(fā)和應用的主要因素也是藻膽蛋白價格太高。因此，開發(fā)RPE的快速高效分離純化技術，實現(xiàn)高純度RPE的低成本大量制備，對于RPE在普及型診斷試劑的應用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種R-藻紅蛋白的快速分離純化方法。
本發(fā)明的R-藻紅蛋白的快速高效分離純化方法，步驟如下(1)原料為海洋紅藻，選自多管藻或三叉仙菜。
(2)R-藻紅蛋白的提取，采用凍溶和低離子強度溶漲的方法，使藻體解體溶解，藻紅蛋白釋放出來。
冷凍保存的紅藻藻體10～12g，按體積比1∶1加入0.02/L磷酸緩沖液(pH6.8～7.0)，20～25℃下，融化2～3h，紗布過濾，濾液在4℃下，8000rpm～10000rpm離心10min～15min，上清液即為R-藻紅蛋白的粗體液。
(3)R-藻紅蛋白的初步純化應用硫酸銨沉淀法，將R-藻紅蛋白的粗體液中的R-藻紅蛋白從溶液中沉淀出來，離心收集沉淀，再用20mM磷酸緩沖液(pH6.8～7.0)溶解并透析，除去硫酸銨。
(4)一步法制備高純度R-藻紅蛋白根據(jù)藻膽蛋白在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的特性，利用離子交換層析技術，用具有恒定的離子強度、pH梯度的緩沖液進行洗脫，一步法可以得到高純度的R-藻紅蛋白。
上述原料多管藻和三叉仙菜為海洋大型紅藻，是從沿海潮間帶采集，采集后用海水清洗，冷凍保藏。
上述步驟(3)R-藻紅蛋白的初步純化具體操作為向上述步驟(2)得到的R-藻紅蛋白的粗體液中加入固體硫酸銨，至濃度為55～60％(w/v)，放置4～5h，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm離心10min～15min，收集沉淀部分。將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH6.8～7.0)中，然后對20mM的磷酸緩沖液(pH6.8～7.0)進行透析。收集透析液。
上述沉淀與磷酸緩沖液的比例沒有嚴格限定，只要沉淀能夠完全溶解即可。
上述步驟(4)一步法制備高純度R-藻紅蛋白的具體操作如下取步驟(3)的透析液1～2ml，上DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，該離子交換色譜柱是經(jīng)20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)預先平衡的，規(guī)格為0.6×10cm，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，)洗脫，最后用20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0，含0.05mol/L NaCl)各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為60～70mL/h，洗脫曲線見圖1，檢測波長280，根據(jù)洗脫曲線收集蛋白峰5的紅色液體，得到純化的R-藻紅蛋白(圖2)。
經(jīng)吸收光譜檢測，得到的純化R-藻紅蛋白A565/A280達到了5.6。一般認為，A565/A280達到4.5以上，就認為R-藻紅蛋白已經(jīng)純化，因此，該一步法離子交換層析得到的R-藻紅蛋白是高純化的。同時，A620/A280和A650/A280的比值＜0.001，而C-藻籃蛋白(CPC)和異藻籃蛋白(APC)的最大吸收峰分別位于620nm和650nm，說明分離純化的RPE沒有CPC的和APC的污染。Native-PAGE電泳檢測，只有一個條帶，進一步表明分離純化的RPE沒有其它蛋白的污染。
本發(fā)明的優(yōu)良效果在于，以海洋紅藻為材料，應用經(jīng)凍溶和低離子強度溶漲快速提取R-藻紅蛋白(RPE)，然后經(jīng)硫酸銨沉淀進行初步純化，最后根據(jù)R-藻紅蛋白(RPE)在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析技術，用恒定的離子強度、pH梯度的緩沖液進行洗脫，一步法可以得到高純度的R-藻紅蛋白(RPE)。本方法省去了傳統(tǒng)的應用分子篩層析結合離子強度洗脫的離子交換層析的復雜分離純化程序，克服了難于規(guī)模化快速制備的難題，操作簡便，省時省力，對設備要求簡單，得率高，容易大量制備并且大大降低了RPE的制備成本，從而為將RPE應用于超靈敏的生物醫(yī)學檢測奠定了基礎，具有很好的應用前景和經(jīng)濟效益。


圖1是實施例1多管藻RPE離子交換層析洗脫曲線(檢測波長280)，峰5為R-藻紅蛋白。
圖2是圖1的峰5中分離純化的R-藻紅蛋白的吸收光譜(實線)和熒光發(fā)射光譜(虛線)。吸收峰分別為498nm、545nm、565nm。用498nm激發(fā)，熒光發(fā)射峰位于578nm，與標準熒光發(fā)射峰相同。
圖3是實施例1分離純化的多管藻R-藻紅蛋白的Native-PAGE電泳圖譜。
具體實施方式
實施例1R-藻紅蛋白的快速高效分離純化方法，步驟如下(1)原料為多管藻。從沿海潮間帶采集，采集后用海水清洗，冷凍保藏。
(2)R-藻紅蛋白的提取，冷凍保存的多管藻藻體10g，按體積比1∶1加入0.02/L磷酸緩沖液(pH6.98)，24℃下，融化2h，紗布過濾，濾液在4℃下，10000rpm離心12min，上清液即為R-藻紅蛋白的粗體液。
(3)R-藻紅蛋白的初步純化向上述步驟(2)得到的R-藻紅蛋白的粗體液中加入固體硫酸銨，至濃度為58％(w/v)，放置4h，然后在4℃下，10000rpm離心12min，收集沉淀部分。將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH6.98)中，然后對20mM的磷酸緩沖液(pH6.98)進行透析。收集透析液。
(4)一步法制備高純度R-藻紅蛋白取步驟(3)的透析液2ml，上DEAE SepharoseFast Flow離子交換色譜柱，該離子交換色譜柱是經(jīng)20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)預先平衡的，規(guī)格為0.6×10cm，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，)洗脫，最后用20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0，含0.05mol/L NaCl)各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為60～70mL/h，洗脫曲線見圖1，收集蛋白峰5的紅色液體，得到純化的R-藻紅蛋白。
上述純化的R-藻紅蛋白吸收光譜見圖2，吸收峰分別為498nm、545nm、565nm，A565/A280達到5.6，表明已經(jīng)高度純化。用498nm激發(fā)，熒光發(fā)射峰位于578nm，與標準熒光發(fā)射峰相同。上述純化的R-藻紅蛋白Native-PAGE電泳圖譜見圖3，只有一個條帶，進一步說明分離純化的R-藻紅蛋白沒有其它蛋白的污染。
實施例2如實施例1所述，所不同的是(1)原料為三叉仙菜，從沿海潮間帶采集，用海水清洗，冷凍保藏。
(2)取冷藏的三叉仙菜12g，按體積比1∶1加入0.02/L磷酸緩沖液(pH6.8)，22℃下，融化3h，紗布過濾，濾液在4℃下，8000rpm離心15min，上清液即為R-藻紅蛋白的粗體液。
(3)向上述步驟(2)得到的R-藻紅蛋白的粗體液中加入固體硫酸銨，至濃度為55％(w/v)，放置5h，然后在4℃下，11000rpm離心10min，收集沉淀部分。將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH6.8)中，然后對20mM的磷酸緩沖液(pH6.8)進行透析。收集透析液。
(4)同實施例1。
權利要求
1.R-藻紅蛋白的快速高效分離純化方法，步驟如下(1)原料為海洋紅藻，選自多管藻或三叉仙菜；(2)R-藻紅蛋白的提取，冷凍保存的紅藻藻體10～12g，按體積比1∶1加入0.02/L磷酸緩沖液pH6.8～7.0，20～25℃下，融化2～3h，紗布過濾，濾液在4℃下，8000rpm～10000rpm離心10min～15min，上清液即為R-藻紅蛋白的粗體液；(3)R-藻紅蛋白的初步純化應用硫酸銨沉淀法，將R-藻紅蛋白的粗體液中的R-藻紅蛋白從溶液中沉淀出來，向上述步驟(2)得到的R-藻紅蛋白的粗體液中加入固體硫酸銨，離心收集沉淀，再用20mM磷酸緩沖液pH6.8～7.0溶解并透析，除去硫酸銨；(4)一步法制備高純度R-藻紅蛋白利用離子交換層析技術，用具有恒定的離子強度、pH梯度的緩沖液進行洗脫，得到高純度的R-藻紅蛋白。
2.如權利要求1所述的R-藻紅蛋白的快速高效分離純化方法，其特征在于，步驟(3)中加入固體硫酸銨至濃度為55～60％w/v，放置4～5h，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm離心10min～15min，收集沉淀部分。
3.如權利要求1所述的R-藻紅蛋白的快速高效分離純化方法，其特征在于，步驟(4)離子交換層析技術是取步驟(3)的透析液1～2ml，上DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，該離子交換色譜柱是經(jīng)20mmol/L醋酸緩沖液預先平衡的，規(guī)格為0.6×10cm，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液pH5.6洗脫，最后用20mmol/L醋酸緩沖液pH5.6和20mmol/L醋酸緩沖液pH4.0各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為60～70mL/h，根據(jù)檢測波長280的洗脫曲線，收集蛋白峰5的紅色液體，得到純化的R-藻紅蛋白。
全文摘要
一種R－藻紅蛋白的快速分離純化方法，屬于海洋紅藻分離純化技術領域。本發(fā)明以海洋紅藻為材料，應用經(jīng)凍溶和低離子強度溶漲快速提取R－藻紅蛋白，然后經(jīng)硫酸銨沉淀進行初步純化，最后根據(jù)R－藻紅蛋白在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析技術，用恒定的離子強度、pH梯度的緩沖液進行洗脫，一步法可以得到高純度的R－藻紅蛋白。本方法省去了傳統(tǒng)的應用分子篩層析結合離子強度洗脫的離子交換層析的復雜分離純化程序，克服了難于規(guī)?；焖僦苽涞碾y題，操作簡便，得率高，容易大量制備并且大大降低了RPE的制備成本，從而為將RPE應用于超靈敏的生物醫(yī)學檢測奠定了基礎。
文檔編號C07K1/00GK1680435SQ200510042028
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月17日 優(yōu)先權日2005年1月17日
發(fā)明者張玉忠, 劉魯寧, 陳秀蘭, 周百成 申請人:山東大學