專利名稱：一種抗人b細(xì)胞淋巴瘤的單鏈雙特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的基因工程抗體，特別是涉及靶向殺傷B淋巴瘤細(xì)胞的單鏈雙特異性抗體。
背景技術(shù)：
單鏈雙特異性抗體(single chain bispecific antibody，ScBsAb)為一種非天然的基因工程抗體形式，其兩個通過連接肽相連的抗原結(jié)合部位具有不同的特異性。因此，ScBsAb在化學(xué)結(jié)構(gòu)上雖然是雙價的，但就其結(jié)合抗原的功能而言卻是單價的。將腫瘤相關(guān)抗原的特異抗體與腫瘤殺傷細(xì)胞的表面觸發(fā)分子的特異抗體通過連接肽構(gòu)成的ScBsAb，可高效地將體內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞募集在腫瘤細(xì)胞周圍，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
CD20是一種非糖基化的III型跨膜蛋白，具高度的保守性。CD20僅在前B淋巴細(xì)胞、未成熟B淋巴細(xì)胞、成熟B淋巴細(xì)胞及激活的B淋巴細(xì)胞中表達(dá)，而在漿細(xì)胞、淋巴多能干細(xì)胞以及其它組織中均無表達(dá)。超過95％的B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)CD20，且沒有明顯的CD20內(nèi)吞或脫落現(xiàn)象，這些特征使得CD20成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶抗原。美國FDA批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的Retuximab(1997年12月)和Ibritumomal(2002年2月)即分別為針對CD20的人-鼠嵌合IgG1型抗體和同位素標(biāo)記的鼠源性IgG1型單克隆抗體。
效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞是人體免疫防護(hù)系統(tǒng)中最有力的“殺手”。T細(xì)胞的主要功能是識別并迅速地破壞那些已經(jīng)被病毒感染或遭受惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。T細(xì)胞的激活是其發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用的根本前提。T細(xì)胞的激活不是簡單的一步反應(yīng)，而是受一系列的細(xì)胞表面蛋白的控制，以此來保證T細(xì)胞只作用于特定的靶標(biāo)。這些表面蛋白包括一個能特異地識別靶細(xì)胞表面抗原與MHC I類分子復(fù)合物的T細(xì)胞受體、CD3信號復(fù)合物、共刺激分子和粘附分子。在它們的作用下，T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間形成一個免疫連接，靜態(tài)的T細(xì)胞被激活，從而發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞還可能通過“免疫逃避”策略來對付T細(xì)胞的殺傷作用，如降低腫瘤細(xì)胞表面MHC I類分子的表達(dá)，使之不能與表面抗原形成復(fù)合物，進(jìn)而不能被T細(xì)胞受體所識別。T細(xì)胞激活過程的復(fù)雜調(diào)控和腫瘤細(xì)胞的免疫逃避機制大大限制了T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞潛能的充分發(fā)揮。
BiTEs(bispecific T cell engagers)是以T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的單鏈雙特異性抗體。BiTEs和其它雙特異性抗體最大的不同點在于它的結(jié)構(gòu)，它采用單鏈抗體技術(shù)將兩個不同抗體的抗原結(jié)合部位通過連接肽連接在一起，其基本的形式為VL1-linker-VH1-linker-VH2-linker-VL2。這種結(jié)構(gòu)賦予BiTEs的兩個結(jié)合臂之間具有更好的柔韌性，可同時和T細(xì)胞及靶細(xì)胞表面的抗原分子結(jié)合，在T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間形成有效激活T細(xì)胞的毒性連接，介導(dǎo)靶細(xì)胞的裂解。
BiTEs作為一種基因工程單鏈雙特異性抗體，在充分挖掘了人體內(nèi)豐富的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng)的同時，克服了全抗體分子量大、穿透能力低的缺陷，在腫瘤的生物治療中有良好的臨床應(yīng)用前景。
抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體即是一種BiTEs形式的單鏈雙特異性抗體，它可以和T細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞表面的特異性抗原分子CD3、CD20發(fā)生特異性結(jié)合，為T細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞之間提供一個物理連接，有效地激活靜止的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，起到治療B細(xì)胞淋巴瘤的作用。
目前，有關(guān)于BiTEs形式的單鏈雙特異性抗體國內(nèi)外均有報道。其中，德國Micromet公司研制的針對B細(xì)胞表面CD19抗原的BiTEs(MT103)已獲準(zhǔn)進(jìn)入用于治療非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病的臨床試驗研究。針對CD20抗原的BiTEs，即抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種以CD20為靶標(biāo)的、具有靶向殺傷B細(xì)胞淋巴瘤功能的單鏈雙特異性抗體(抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體)。
本發(fā)明包括以下主要內(nèi)容本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體由抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體和抗人CD3單鏈抗體構(gòu)成，具體地說是通過3個鏈間連接肽將抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20抗體的輕鏈可變區(qū)(VLCD20)和重鏈可變區(qū)(VHCD20)以及抗人CD3抗體的輕鏈可變區(qū)(VLCD3)和重鏈可變區(qū)(VHCD3)連接而成。它能有效激活靜止的T淋巴細(xì)胞發(fā)揮特異殺傷人B細(xì)胞淋巴瘤的作用。
本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體采用(Gly4Ser)3為連接肽，其連接形式為VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20。
本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體中，抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體具有如序列表SEQ ID No.1所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體中，抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體具有如序列表SEQ ID No.2所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體中，抗人CD3單鏈抗體具有如序列表SEQ ID No.3所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列，本發(fā)明的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體中，抗人CD3單鏈抗體具有如序列表SEQ ID No.4所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，本發(fā)明與現(xiàn)有針對CD20抗原的其他形式的抗體相比有以下優(yōu)點①抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體中的兩個抗原結(jié)合臂之間具有更好的柔韌性，這種柔韌性有利于促進(jìn)CD3復(fù)合體和腫瘤靶標(biāo)的連接以及最后在T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間形成毒性連接，從而有效地激活靜止的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。②抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體分子量較小、對腫瘤組織的穿透能力較強。③CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)較簡單，便于采用生物工程技術(shù)手段所進(jìn)行大量制備。
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為表達(dá)質(zhì)粒pcDNA5/FRT-amiCD3/antiCD20的物理圖。
圖2為采用活細(xì)胞間接免疫熒光檢測法在熒光顯微鏡下觀察到的Ramous細(xì)胞(2A)和Jurkat細(xì)胞(2B)。
圖3為抗CD3/抗CD20單雙特異性鏈抗體介導(dǎo)下，由Jurkat細(xì)胞和Ramous細(xì)胞形成的玫瑰花環(huán)。
圖4為抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體介導(dǎo)下的人外周血淋巴細(xì)胞對人B淋巴瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
具體實施例方式
實施例1一.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體核苷酸序列的設(shè)計和合成根據(jù)VLCD3、VHCD3、VLCD20、VHCD20的氨基酸序列和VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20的連接形式，參照哺乳動物細(xì)胞常用密碼子確定抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的核苷酸序列。為了便于蛋白的純化，在序列的3’端引入組氨酸標(biāo)簽、NotI酶切位點，并在組氨酸標(biāo)簽前加入凝血酶酶切位點，以便在最終除去組氨酸標(biāo)簽；在序列的5’端加上Nhe I酶切位點、KOZAK序列和前導(dǎo)序列。
設(shè)計合成多個約60bp的寡核苷酸片段，每相鄰的兩個片段有約20bp的堿基互補，通過重疊延伸PCR(SOE PCR)得到了全長為1640bp的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體全基因序列。擴(kuò)增全基因所用引物為上游引物5’-CTAGCTAGCG CCGCCAGCC-3’。下游引物5’-GTTTTCCTTT TGCGGCCGCC TA-3’。
抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體全基因序列示意圖如下-----KOZAK序列-前導(dǎo)序列-VLCD3-(G4S)3-VHCD3-(G4S)3-VHCD20-(G4S)3-VLCD20-凝血酶切位點-(His)6-----。
二.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體表達(dá)載體的構(gòu)建將抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的全基因用Nhe I和Not I雙酶切后，用T4連接酶將其連接到經(jīng)Nhe I和Not I酶切處理的真核定點表達(dá)載體pcDNA5/FRT(購自美國Invitrogen公司)中，獲得抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的表達(dá)載體pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20(圖1)。用pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆經(jīng)菌落進(jìn)行酶切鑒定和測序分析。
三.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)采用脂質(zhì)體法將測序正確的pcDNA5/FRT-antiCD3/antiCD20表達(dá)質(zhì)粒與表達(dá)重組酶Flp的pOG44質(zhì)粒(購自美國Invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染Flp-InTMCHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞(購自美國Invitrogen公司)，并用濃度為500μg/ml的Hgromycm B(購自美國Invitrogen公司)篩選陽性克隆。采用直接競爭ELISA檢測抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的表達(dá)。
四.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的純化在轉(zhuǎn)瓶和攪拌瓶中用無血清培養(yǎng)基放大培養(yǎng)篩選到的陽性克隆細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入終濃度為5mM的咪唑及1mM的CaCl2，以1ml/min的流速通過Ni-NTA層析柱(GE Helthcare公司)，先用含0.5M NaCl的PBS洗脫雜蛋白，再用咪唑濃度分別為20mM至500mM的PBS對目的蛋白進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。
實施例2.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的生物活性鑒定一.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體的抗原結(jié)合活性將一定濃度的純化抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體分別與1×106Ramous細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞(均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)4℃共同孵育1h，3000r/min 4℃離心3min，PBS洗3次。加入50μl 1∶500稀釋的Anti-His(C-term)-FITC抗體(購自美國Invitrogen公司)，4℃避光作用1h，3000r/min 4℃離心3min，PBS洗4次，熒光顯微鏡下觀察并照相。在熒光顯微鏡下，Ramous細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞均顯現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖2)，且主要分布在細(xì)胞膜周圍，表明抗CD3/抗CD20雙特異性單鏈抗體具有特異結(jié)合CD3或CD20抗原的能力。
將一定濃度的純化抗體與1×106Ramous細(xì)胞混合，4℃孵育4h后，500r/min離心3min，棄上清，PBS洗細(xì)胞3次。加入1×107Jurkat細(xì)胞，混勻，4℃孵育4h后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到玫瑰花環(huán)的形成(圖3)。表明抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體具有同時結(jié)合CD3和CD20抗原的雙特異性，可有效介導(dǎo)Jurkat細(xì)胞和Ramous細(xì)胞的結(jié)合。
二.抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體對人淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞的殺傷活性將人B細(xì)胞淋巴瘤Ramous細(xì)胞(靶細(xì)胞)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl(約1×104個細(xì)胞)，先按每孔1μg/ml的作用濃度加入純化的抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體，再按不同的效靶比加入新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)，37℃、5％CO2培養(yǎng)24h，每孔加入25μl MTT，37℃、5％CO2培養(yǎng)4h后倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入100μl酸性SDS(0.1N HCl、1％SDS)，37℃、5％CO2孵育4h用酶標(biāo)儀測OD570值。按如下公式計算腫瘤細(xì)胞殺傷率腫瘤細(xì)胞殺傷率(％)＝(ODE+T-ODE)/(1-ODT)×100％在抗體濃度為1μg/ml的作用條件下，抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體對人B細(xì)胞淋巴瘤Ramous細(xì)胞的殺傷活性隨效靶比的升高而增加。當(dāng)效靶比為10∶1時，抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體對人B細(xì)胞淋巴瘤Ramous細(xì)胞的殺傷率高達(dá)87.3％(圖4)。實驗結(jié)果表明抗CD3/抗CD20單鏈雙特異性抗體能高效地介導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞殺傷人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的特定實施例已經(jīng)對本發(fā)明的內(nèi)容做了詳盡的說明。對本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，特別是對若干部件的等同替換，都構(gòu)成對本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120>一種抗人B細(xì)胞淋巴瘤的單鏈雙特異性抗體<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>121<212>PRT<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala115 120<210>2<211>121<212>PRT<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>2Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile20 25 30His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Tyr Lys Leu Glu Ile Lys100 105
<210>3<211>120<212>PRT<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>3Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>106<212>PRT<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)
<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 10權(quán)利要求
1.一種抗人B細(xì)胞淋巴瘤的單鏈雙特異性抗體，其特征在于它是由抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體和抗人CD3單鏈抗體連接而成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈雙特異性抗體，其特征在于單鏈抗體可變區(qū)的連接肽為(Gly4Ser)3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈雙特異性抗體，其特征在于單鏈抗體可變區(qū)的連接形式為VLCD3-(Gly4Ser)3-VHCD3-(Gly4Ser)3-VHCD20-(Gly4Ser)3-VLCD20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的單鏈雙特異性抗體，其特征在于抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體具有序列表SEQ ID No.1所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的單鏈雙特異性抗體，其特征在于抗人B細(xì)胞淋巴瘤CD20單鏈抗體具有序列表SEQ ID No.2所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的單鏈雙特異性抗體，其特征在于抗人CD3單鏈抗體具有序列表SEQ ID No.3所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項所述的單鏈雙特異性抗體，抗人CD3單鏈抗體具有序列表SEQ ID No.4所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人B細(xì)胞淋巴瘤的單鏈雙特異性抗體。用3個鏈間連接肽(Gly
文檔編號C07K16/00GK1683409SQ20051005123
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月2日
發(fā)明者陳昭烈, 于蕊, 李世崇, 吳本傳, 劉紅, 葉玲玲, 劉興茂, 王啟偉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所