專利名稱：一種對蝦白斑綜合癥病毒(wssv)膜蛋白及其抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三種對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)膜蛋白及其特異性多克隆抗體。更具體地說，本發(fā)明涉及三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的感染功能，而它們的特異性多克隆抗體則具有抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的能力。本發(fā)明還涉及三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體的應(yīng)用，以及所述膜蛋白VP68，VP281，VP466和它們的特異性多克隆抗體的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)，是一種短桿狀的、無包涵體的包膜病毒，該病毒感染力強，被感染的對蝦在一周內(nèi)死亡率高達90～100％，危害極大。它除了侵染絕大多數(shù)種類的對蝦之外，還可侵染多種蟹類、龍蝦類、端足類、水蠅類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍。
由于對蝦病毒病尚無法治療，因此目前只能從優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，阻斷病原的傳播，提高對蝦種質(zhì)，增強對蝦基礎(chǔ)免疫力等方面入手，以期實行對養(yǎng)殖對蝦病害的有效控制和預(yù)防。國內(nèi)外學(xué)者在這些方面做了大量的工作，也取得了一些成果。如利用滅活的弧菌疫苗，可有效地提高養(yǎng)成期及苗期日本對蝦的成活率(J ofAquatic Animal Health，1991，3151-2)；利用口服免疫增強劑(如β-1，3-葡聚糖和肽聚糖)可增強對蝦血細(xì)胞的吞噬活性及對細(xì)菌性感染的抵抗能力(Fish.Chimes.，1996，1641-42)；一些富含多糖、生物堿、有機酸等多種成分的天然物質(zhì)對對蝦有免疫刺激作用(海洋與湖沼，1995，2634-41)。但在現(xiàn)有的技術(shù)水平和養(yǎng)殖模式下這些方法都無法徹底解決問題。
病毒膜蛋白除了起維持病毒形態(tài)、保護病毒核酸的作用以外，另一個重要功能就是參與病毒與宿主的識別，協(xié)助病毒進入宿主細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466在病毒感染過程中的作用。即VP68，VP281，VP466直接參與病毒感染過程。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的方法，即應(yīng)用對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體來防止對蝦白斑綜合癥病毒感染養(yǎng)殖對蝦。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體的方法。
同時，本發(fā)明還包括病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其片段。較佳地，指那些能與病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體抗原通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物以生產(chǎn)抗體。病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466可以利用重組方法制備或利用合成儀合成。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。在本發(fā)明中，術(shù)語“VP68，VP281，VP466編碼序列”是指編碼具有VP68，VP281，VP466蛋白活性的多肽的核苷酸序列，由于密碼子的簡并性，所以與VP68，VP281，VP466位核苷酸同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出VP68，VP281，VP466的序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與VP68，VP281，VP466相同功能的蛋白的VP68，VP281，VP466序列的變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地10個以內(nèi)，最佳地5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“VP68，VP281，VP466蛋白多肽”指具有VP68，VP281，VP466蛋白活性的多肽。該術(shù)語還包括具有抗病毒功能的VP68，VP281，VP466蛋白的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括VP68，VP281，VP466蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本發(fā)明中，“純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少50％，較佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或濕重計)。純化可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC測量多肽的純度。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。
本發(fā)明中的對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466及其特異性多克隆抗體是如此獲得的將編碼對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的多核苷酸序列分別克隆到質(zhì)粒載體pGEX4T-2中，轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中并誘導(dǎo)表達出對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白的融合蛋白VP68，VP281，VP466，用純化的融合蛋白VP68，VP281，VP466分別免疫小鼠，制備VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體，證明這些抗體具有抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的能力。在本發(fā)明被公布之前，沒有人證明病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466與感染過程密切相關(guān)，也沒有任何人公開過本申請中涉及的VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體具有抗病毒功能。本發(fā)明將可能為對蝦病害的防治提供新的途徑，促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。


附圖1VP281多克隆抗體的抗病毒作用。在注射病毒12，24，48，72小時后檢測對蝦體內(nèi)的病毒含量，由圖可見同時注射病毒與VP281多克隆抗體的對蝦，其體內(nèi)病毒的含量低于單純注射病毒的對蝦。
附圖2VP68，VP281，VP466多克隆抗體的抗病毒作用。由圖可見同時注射病毒與VP68，VP281，VP466多克隆抗體的對蝦，其14天的累計死亡率低于單純注射病毒的對蝦。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466在大腸桿菌中的表達1.病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466 cDNA的擴增分別將編碼病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA的開讀框的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的DNA插入片段。
2.病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的DNA的重組采用基因工程工具酶，將擴增的VP68，VP281，VP466的DNA片段分別連接到質(zhì)粒載體pGEX4T-2中。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取菌落，提取質(zhì)粒，用PCR、酶切和測序的方法鑒定的VP68，VP281，VP466DNA片段已分別正確插入了載體。
3.重組病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的表達、純化分別挑取含有病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的重組質(zhì)粒的單菌落于4ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培過夜。吸取1ml菌液于新的200ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培至OD600為0.6左右，加入IPTG至終濃度0.5mM，繼續(xù)搖培4hr。
離心菌液去上清，將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，超聲裂解，離心去沉淀，上清中的重組病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466用GST柱進行親和純化。
實施例2抗體制備將實施例1中獲得的純化的重組病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466分別用等體積的完全Freund’s佐劑乳化，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白對小鼠進行皮下注射。10天后用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣劑量的同樣抗原再注射進行加強免疫來免疫動物以產(chǎn)生抗體，每隔10天進行一次加強免疫，至少進行3次。分析所獲抗血清的滴度和特異性。
在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例3抗病毒實驗將施例2中獲得的多克隆抗體分別與對蝦白斑綜合癥病毒液混勻，在室溫下放置1小時，而后通過皮下肌肉各注射到2O只實驗對蝦體內(nèi)，每只對蝦注射106個病毒顆粒，觀察14天，統(tǒng)計對蝦在14天內(nèi)的累計死亡率，并與只注射生理鹽水或只注射對蝦白斑綜合癥病毒的對蝦比較，分析VP68，VP281，VP466多克隆抗體的抗病毒功能。其實驗結(jié)果見附圖1、附圖2。
序列表一、VP68的信息1、VP68的核酸序列(1)序列特征(A)長度776bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA1 ATGTCTGATA TGACCAGAAA CATCATCGTC GGCTTGGCCG TTGTCGTCAT CGCATTGAGC61 ATGGTCGCTT TCATGCTTTC TGTTACTCCT GCACTTACCG GATTCCTCCT AGGTTTGGGT121 GTATCAGCAC TAGGAGTTAC ACTCTTTGGA TGTCCCACTA TGAAATCTCC AGGGGGAGGA181 AATGCTACAA TCAACCCCGT GGCA2、VP68的蛋白序列(1)序列特征(A)長度68aa(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)三級(2)分子類型多肽1 MSDMTRNIIV GLAVVVIALS MVAFMLSVTP ALTGFLLGLG VSALGVTLFG CPTMKSPGGG61 NATINPVA二、VP281的信息1、VP281的核酸序列(1)序列特征(A)長度846bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA1 CTGGCGGTAA ACTTGGATAA TGTTCTTGTG AATATCAACA ACAAGGATGA AGATCTTACA61 AAACTCGTAT CCGAGGCAAT AAAGCGGCGA GCTAAAACTG TATTTGACAC TAAAAATCAA121 GCAGGGTTTG ACATGAGACG TCAAGTTGAA GCTGCATTAT ATGAAGCAAT ATCCAAAAAG181 AAAGAAAAGG CCATAAAGGC ATTCGATGAG CTCATACAAG AAAGAGGTGA TGAAATTACA241 CCTTTGACTA CAATGCAGTA TGAAGAGTGG GTAAACCGTA CAATAACTCC CTCATTGACG301 ACTGAAAATT TATTAGGTGA TGTTGAGCAC GCCGATTTTT TACTGGACCG AATGACACCC361 GTAAGCGAGG AAGATATTGA AGGTTTCGCT GCTTCTACTT TTAAGGAGGT ATCAGATTCA
421 AAAACTGCAA CAGTCATAGT TAAGGCAGAT TGTGAAACGG GGGATATCGA TGAAGTGTAT481 AATCTTGCAC CATCATTCGG CGTCACTCAA GAAATTAAAA TATATAGGTC AAACAATTCC541 TCGGAATTGG ATAATGTCGC AGATTCTTTC CATATTTATA AAATTTCTGC AACAGATAGC601 GACAGTGGCA ATACTAAAAA ATTGTTGTAT GGGTTAAGGA ATAAAAAAGC AGGTTATACG661 TGTTTGTGTA GAATTTTTGC AGAAATTGAA TCAGATGGGA TTATGGCCAA TACAAATATC721 GGTGTCGCTG AAAACAACAG AGATGAAATT GATGAAAACG AAGAAGGTAA ATATGGTTTT781 TTAATACCCA AACAACCAGC TGGTGCAAAA TTGATCATCT ACTTCTTTTT AAATTGTTGG841 ACGTAA2、VP281的蛋白序列(1)序列特征(A)長度281aa(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)三級(2)分子類型多肽1 MAVNLDNVLV NINNKDEDLT KLVSEAIKRR AKTVFDTKNQ AGFDMRRQVE AALYEAISKK61 KEKAIKAFDE LIQERGDEIT PLTTMQYEEW VNRTITPSLT TENLLGDVEH ADFLLDRMTP121 VSEEDIEGFA ASTFKEVSDS KTATVIVKAD CETGDIDEVY NLAPSFGVTQ EIKIYRSNNS181 SELDNVADSF HIYKISATDS DSGNTKKLLY GLRNKKAGYT CLCRIFAEIE SDGIMANTNI241 GVAENNRDEI DENEEGKYGF LIPKQPAGAK LIIYFFLNCW T三、VP466的信息1、VP466的核酸序列(1)序列特征(A)長度1401bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA1 ATGTCTGCAT CTTTAATATT GGACGAATAC CTCAAGAAGA CTGCTTCAGC CGTTCTGGAT61 GTAGCTGACT CATTTGAGAA AATCAAGGGA GAAATCCAAT CACCTGAGGA GGCTGCGGCT121 CTTTCTGTTG CTCTCTATGG AGCACCTCCA AAACCTTCAG CTTCGGCTGT GGCCTCTATC181 ATCACTGGAG AAAGAACATC TTTAAACGAC AAATATCTAT CGGATAATGT CCTATTGAAA241 ATGTCTGTTG CTCGCGTTGG ACAAGAAAAT AATCGCAAGA GAGCCGACCA GGCAGCTGAT301 GAAATTAGAA CCATCATGGA AGATATTACA GGGAGTTTGT CCGGTGCGTA CAGGCAATAT361 AGCCCGCTCG AGGAAGAAAA TAAGGTGCAT ATAGGCATCA TGAATAACAA AACGCCTAGC421 ATTGTTTGTG GATATTATAC AATGGACACA TCTATTTCTT CCGAACCTCT TTCTCTAACA481 GATTTTCAAA ACCCCACTGT CATTGCCAAT GTGACTAAGC GGATGGAGAG CATTTTTTCA541 AAGGTCGACT CTGCTAGGTC TACAAGATTC GACGCTTTTG TTAATGGTGT TGCGAATAAT601 ATGGATATAA AGTCATCAAT AGATTGGGCA AATATGGTAG AAAATGTGAT CAAATTACCA661 GATTCTACAC CTAACCCTTG TTCAGTTGAC ACTATTGTGT CCAGAGACGC AAGTGTAGTT
721 AAAACAGCAG TTAATGATAT ATACGCTTCT GTTGGAAAAT CTTATTGTCG TCCTGCAACA781 CAGCTAACCT TTATGAGCGA GATTGAAAAA CTGCGAAAGG CTGCAGTTGT ATGTTTTGAG841 GCACTCATGT CCGATACTAG GGAGAGGGCA TTCGTAGAGT TCCTATTTTA CGTTAGCTTT901 AAGGAAGATG CATCAAATAC CAATTCAAAA TTGTTTGTTC AGAATAAGCT ATCTTCCATG961 TCTGGAAACC CCAGACAGCC CATAAAATTG GTACGCCGTT CTGCTGAGGA AACACTATTC1021 GGGCTCTGTT TCATGTTTAA GGTAATGCCT CCAGAATTCA TGAACTGTAT ATTTAACTTC1081 CCTACCATTC CCCATTCAAC ACAATACCAT GGTCTATATG GTACATGTTT AACCCCTCTA1141 CTTAGAAAAT ACGGTTCTTC ATTCGAAAAG TCCTGGGCTC ATTTTGAGGA AATTTTAAGC1201 GAAAGAGCCA ATGCAGTGAA AAAATTTGGT GTAAACGATA CGAGGATAGA TTGTCTAGAT1261 GCAGTAGCAA ATCTCACCGG ACCTGTGTAT GTTCTCATTT TAGATCTTGT ACGTACTCTA1321 AGTGCGCAGA GATCGTGTTC AACTAAATTT CTCCGTGAAA TTAAGGAAAA CTATCTTTTG1381 TGGAATAGGT TTGTGTCATA A2、VP466的蛋白序列(1)序列特征(A)長度466aa(B)類型多肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)三級(2)分子類型多肽1 MSASLILDEY LKKTASAVLD VADSFEKIKG EIQSPEEAAA LSVALYGAPP KPSASAVASI61 ITGERTSLND KYLSDNVLLK MSVARVGQEN NRKRADQAAD EIRTIMEDIT GSLSGAYRQY121 SPLEEENKVH IGIMNNKTPS IVCGYYTMDT SISSEPLSLT DFQNPTVIAN VTKRMESIFS181 KVDSARSTRF DAFVNGVANN MDIKSSIDWA NMVENVIKLP DSTPNPCSVD TIVSRDASVV241 KTAVNDIYAS VGKSYCRPAT QLTFMSEIEK LRKAAVVCFE ALMSDTRERA FVEFLFYVSF301 KEDASNTNSK LFVQNKLSSM SGNPRQPIKL VRRSAEETLF GLCFMFKVMP PEFMNCIFNF361 PTIPHSTQYH GLYGTCLTPL LRKYGSSFEK SWAHFEEILS ERAKAVKKFG VNDTRIDCLD421 AVANLTGPVY VLILDLVRTL SAQRSCSTKF LREIKENYLL WNRFVS
權(quán)利要求
1.一種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白，該膜蛋白與對蝦白斑綜合癥病毒感染對蝦的過程相關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白，其特征在于編碼具有VP68蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少與VP68的核苷酸同源性70％的簡并序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白，其特征在于編碼具有VP281蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少與VP281的核苷酸同源性70％的簡并序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白，其特征在于編碼具有VP466蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少與VP466的核苷酸同源性70％的簡并序列。
5.一種抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的方法，其特征在于應(yīng)用對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體來防止對蝦白斑綜合癥病毒感染養(yǎng)殖對蝦。
6.一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體的方法。
7.一種能與權(quán)利要求2所述的對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68特異性結(jié)合的抗體。
8.一種能與權(quán)利要求3所述的對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP281特異性結(jié)合的抗體。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP466特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466，它們具有感染功能，而它們的特異性多克隆抗體則具有抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的能力。本發(fā)明還涉及三種對蝦白斑綜合癥病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特異性多克隆抗體的應(yīng)用，以及所述膜蛋白VP68，VP281，VP466和它們的特異性多克隆抗體的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K16/08GK1831009SQ200510053350
公開日2006年9月13日 申請日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月9日
發(fā)明者章曉波, 吳文林, 王磊 申請人:國家海洋局第三海洋研究所