專利名稱：用于診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病的結核分枝桿菌蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種結核分枝桿菌蛋白，以及該蛋白在依賴利福平結核分枝桿菌的臨床診斷和流行病學監(jiān)測等方面的應用，及其該蛋白作為藥物靶標在耐多藥結核病治療新藥開發(fā)的應用。
背景技術：
2000年全國第四次結核病流行病學抽樣調(diào)查結果顯示我國約有500萬結核病患者，五億結核病感染者，結核病疫情仍然很嚴重。WHO估計，當今世界約有2/3的結核病患者處于發(fā)生耐藥病例的危險之中。由于耐藥菌，特別是耐多藥菌的不斷產(chǎn)生和傳播，是當今結核病難以控制的關鍵。
依賴利福平結核分枝桿菌(以下簡稱依R菌)。依R菌是本發(fā)明第一發(fā)明人首次在臨床肺結核患者痰標本中，通過分枝桿菌羅氏培養(yǎng)的藥敏試驗結果菌落觀察發(fā)現(xiàn)和研究報道的，具有依賴利福平(R)抗結核藥物生長的特殊結核分枝桿菌。依R菌生物學特性主要表現(xiàn)為，在適宜的利福平濃度下其細菌生長旺盛，離開利福平生長不良或不能生長。如圖1所示，同時發(fā)現(xiàn)在有R和無R條件下兩種條件下生長細菌的蛋白質(zhì)表達不同，前者有標志性高表達蛋白，如圖4(c)所示。
大量研究表明依R菌在有R和無R條件下生長的細菌其形態(tài)、結構、染色性、毒力和蛋白質(zhì)表達等方面均有明顯差異。而且，依R菌中有74.4％～100％為耐多藥結核菌。依R菌肺結核具有病情重、耐多藥、化療效果差和預后不良的臨床特征，比一般的耐藥病例危害更大。依R菌產(chǎn)生與傳播給結核病的控制又提出新的難題。目前各地報道的依R菌在分枝桿菌培養(yǎng)陽性后的藥物敏感試驗中的發(fā)生率為6％～17％，這對于我國是一個結核病高發(fā)病率的國家，數(shù)值是驚人的。
目前，利福平是結核病初治化療組合方案中的主要殺菌藥，是初治結核病治療的必選藥物，其使用非常廣泛。依R菌感染所導致的結核病如果再使用利福平，不但化療將失敗，而且可使病情惡化，是難治性結核病的產(chǎn)生和化療失敗的重要原因之一。因此，臨床對依R菌結核病的早期診斷和有效治療的需求都十分迫切。現(xiàn)有常規(guī)方法從分枝桿菌的分離培養(yǎng)到藥物敏感實驗，至少需要2個月左右的時間才能觀察到致病菌是否存在藥物依賴現(xiàn)象，而且現(xiàn)有方法只能針對痰菌培養(yǎng)陽性的肺結核病人，對半數(shù)以上的痰菌陰性肺結核和肺外結核病患者來講，常規(guī)細菌學方法是根本無能為力的。因此，尋求一種快速簡便和有效的方法用于依R菌結核病的診斷非常急迫。
本發(fā)明通過大量研究發(fā)現(xiàn)，依R菌在試管內(nèi)適宜濃度利福平的誘導下可高表達量(占總細菌蛋白的30-50％)產(chǎn)生一種特定氨基酸序列的細菌蛋白。并通過大量臨床試驗證實，該特定氨基酸序列的細菌蛋白具有免疫活性功能，用于依R菌結核病的血清學快速診斷具有高度的特異性和良好的敏感性。
本發(fā)明的依R菌特定氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白，不僅是1種依R菌結核病的診斷蛋白，還可作為開發(fā)新的有效的耐多藥結核病治療的藥物靶標。因為，大量研究發(fā)現(xiàn)依R菌中有74.4％～100％都為耐多藥結核菌。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種具有依賴利福平(以下簡稱依R)生長的特異性的結核分枝桿菌、編碼結核分枝桿菌蛋白如序列2所示的核苷酸序列，以及誘導依R菌核苷酸序列表達的依R結核分枝桿菌蛋白的方法。本發(fā)明還包括所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的試劑盒及其在臨床診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病、耐多藥結核病及其流行病學監(jiān)測調(diào)查中的應用。
本發(fā)明涉及的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，其具有依賴利福平生長的特異性，其保藏號為CGMCC NO.1570，保藏時間2005年12月19日，參據(jù)的菌株號為1219。
本發(fā)明涉及的依賴利福平結核分枝桿菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量為43894道爾頓，pI值為5.25。
本發(fā)明涉及一種核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所指的依R菌結核分枝桿菌蛋白由序列2所示的核苷酸序列的核酸表達，所表達的蛋白的氨基酸序列如序列1所示。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白通過典型依R結核分枝桿菌誘導的方法如下1)分離鑒定篩選臨床典型依賴利福平結核分枝桿菌菌株(保藏號為CGMCC NO.1570，參據(jù)的菌株號為1219)2)在7H9液體培養(yǎng)基中，以利福平6～24μg/ml作為誘導濃度培養(yǎng)獲得富含序列2蛋白的依R菌株；3)或在L-J固體培養(yǎng)基中以利福平50～300μg/ml作為誘導濃度培養(yǎng)獲得富含序列2蛋白的依賴利福平結核分枝桿菌株；4)制備步驟2或3誘導后的依賴利福平結核分枝桿菌蛋白溶液；5)分離蛋白、回收、純化和復性即獲得依賴利福平結核分枝桿菌蛋白。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白也可以利用序列2所示的核苷酸序列，通過常規(guī)基因工程方法表達氨基酸序列如序列1所示的蛋白。
本發(fā)明涉及包含發(fā)明結核分枝桿菌蛋白的試劑盒。
本發(fā)明涉及一種新的結核病快速診斷方法，包含依R結核分枝桿菌株的發(fā)明結核分枝桿菌蛋白直接診斷，以及用血清學試驗來輔助診斷依R菌結核病和進行流行病學調(diào)查等。
本發(fā)明的依R結核分枝桿菌特定氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白，不僅是一種依R結核分枝桿菌結核病的診斷蛋白，還可作為開發(fā)新的有效的耐多藥結核病治療的藥物靶標。因為，大量研究發(fā)現(xiàn)依R結核分枝桿菌中有74.4％～100％都為耐多藥結核菌。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了一種編碼結核分枝桿菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，其編碼的結核分枝桿菌蛋白制備的方法，由該方法制備的包含序列1所示氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白，以及包含該發(fā)明蛋白的試劑盒。同時還公開了他們在依R菌結核病診斷和流行病學調(diào)查監(jiān)測中的應用。另外，本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白不僅是一種依R菌的診斷蛋白，還可作為開發(fā)新的有效的耐多藥結核病治療的藥物靶標。因為，大量研究發(fā)現(xiàn)依R菌中有74.4％～100％都為耐多藥結核菌。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白采用典型依R菌體外人工誘導編碼基因表達的方法，可以獲得高表達量的發(fā)明蛋白，如實施例2所敘述。該發(fā)明蛋白也通過基因工程的常規(guī)方法表達、回收和純化，還可以使用蛋白合成儀器系統(tǒng)直接合成。優(yōu)選采用人工誘導方法，因為該法簡單有效，成本低，重要的是獲得的蛋白具有良好的功能活性。同時，可以避免基因工程常規(guī)方法表達蛋白，在表達、回收和純化等過程可能引起的抗原丟失和產(chǎn)物功能活性的降低及不忠實性增強的可能。
本發(fā)明的一個實施方案涉及用上述方法制備的結核分枝桿菌蛋白組合的試劑盒。
本發(fā)明所公開的依R菌結核病血清免疫學診斷試劑盒，是指包括本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白組配的成套檢測試劑。該試劑盒用于依R菌結核病的快速輔助診斷，或用于依R菌結核病的流行病學調(diào)查和監(jiān)測。該試劑盒的檢測方式為單人份檢測板系統(tǒng)，其試劑盒包含20～50個已裝配好的密封檢測板。本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白已預先固定在檢測板中的膜上(可4～8℃干燥保存6月以上)。該試劑盒的其它組合檢測試劑還包括封閉液、膠體金標記的羊抗人IgG抗體和PBS洗滌液，以及陽性和陰性質(zhì)量控制血清等。該試劑盒在分離獲得臨床檢測樣品后，單樣品抗體檢測的時間只需數(shù)分鐘即可完成。開展此項目的臨床檢測不需要特殊的儀器設備。其方法簡單、快速、成本低，適于基層醫(yī)療單位推廣應用。
本試劑盒所能檢測的生物樣品可包括血清、腦脊液、尿掖和穿刺液等可能含有血清抗依R菌蛋白抗體的臨床樣本，優(yōu)先選用血清樣本。
上述依R菌結核病血清免疫學診斷試劑盒中所用到的包含本發(fā)明結核分枝桿菌蛋白的所有試劑或試劑盒都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白，也可直接經(jīng)過標記，如酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)等，通過相應的檢測儀器直接檢測更微量的特異性抗體。優(yōu)選的標記物是發(fā)光物質(zhì)，如異魯米諾、光澤精和魯米諾等，其敏感性、穩(wěn)定性和完全性更佳。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白，還可以通過基因工程和動物模型制備單克隆抗體，研制依R菌蛋白抗原的檢測系統(tǒng)和試劑盒，用于依R菌及其蛋白抗原的直接檢測，其檢測方法可采用各種標記的組織化學、免疫血清和流式細胞儀等，其檢測樣本可包括痰、組織和血清等各種臨床樣本和培養(yǎng)物。


附圖1為依R菌株單個菌落的生長對比圖；圖中的依R菌株由重慶市肺科醫(yī)院——重慶市結核基因診斷中心實驗室臨床分離，L-J培養(yǎng)基，采用濃度梯度法試驗獲得；圖中R100管內(nèi)為依R菌株在含R濃度為100μg/ml培養(yǎng)管中的生長情況，其菌落呈典型“菜花樣”生長，生長旺盛，易刮取。而對照管中反映的是依R菌株在無R條件下的生長情況，其菌落呈典型“荷包蛋樣”，且呈嵌入生長，不易刮取，表現(xiàn)為嚴重的生長不良狀態(tài)。
附圖2為依R菌在R濃度為8μg/ml時培養(yǎng)瓶中的生長曲線；圖中反映依R菌株在有R情況下生長旺盛，生長曲線呈典型的拋物線型；附圖3為依R菌在無藥對照培養(yǎng)瓶中的生長曲線；圖中反映R菌株在無R情況下生長生長緩慢、代謝狀況低下，生長曲線平緩。
圖2和圖3顯示臨床肺結核患者痰標本中分離鑒定的依R菌，在7H9液體培養(yǎng)3D系統(tǒng)中不同條件下細菌的生長曲線。圖2顯示BacT/ALERT 3DSelect系統(tǒng)含R8μg/ml培養(yǎng)瓶中的生長曲線呈拋物線，其延滯期8.09天，初始反射率1750，最大反射率3429，最大反射率絕對值1679；圖3顯示無藥對照瓶的生長曲線呈平緩斜線，其延滯期17.09天，初始反射率1750，最大反射率2461最大反射率絕對值711。圖2和圖3顯示依R菌在有R和無R條件下的生長曲線差異明顯。
橫軸培養(yǎng)時間(天)縱軸反射率(細菌生長產(chǎn)生CO2，密閉培養(yǎng)瓶底乳膠感應器產(chǎn)生不可逆顏色改變導致系統(tǒng)監(jiān)測的反射率增加)生長曲線系統(tǒng)每10分鐘讀數(shù)一次監(jiān)測反射率，所建立的生長反應曲線(初始反射率1750)接種菌液濃度10-4μg/ml總培養(yǎng)時間40天(39.78)附圖4為誘導依R菌株的SDS-PAGE蛋白圖譜；圖中1.2.3(b)是以L-J培養(yǎng)基，在R濃度為100μg/ml時誘導的依R菌株高表達的本發(fā)明蛋白；相對于標準分子量43.000處，顯示出明顯的考馬斯亮蘭(電壓100V、電泳時間3.5小時)；M的右側(a)為電轉移于PVDV膜上的本發(fā)明蛋白；(c)是誘導與未誘導的依R菌蛋白的比較(電壓100V、電泳時間2.5小時)可明顯觀察出在R濃度為100μg/ml時誘導的依R菌株高表達的本發(fā)明蛋白。
附圖5為本發(fā)明蛋白帶總離子流質(zhì)譜圖(1)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、波峰為目標蛋白的N個肽段。
附圖6為本發(fā)明蛋白帶總離子流質(zhì)譜圖(2)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)；波峰為本發(fā)明蛋白的N個肽段。
附圖7為在圖5或圖6總離子流質(zhì)譜圖中的m/z 656.83肽段串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列解析圖(1)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、縱坐標上方為肽段氨基酸序列解析結果。
附圖8為在圖5或圖6總離子流質(zhì)譜圖中的m/z 656.83肽段串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列解析圖(2)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、縱坐標上方為肽段氨基酸序列解析結果。
附圖9為在圖5或圖6總離子流質(zhì)譜圖中的m/z 656.83肽段串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列解析圖(3)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、縱坐標上方為肽段氨基酸序列解析結果。
附圖10為在圖5或圖6總離子流質(zhì)譜圖中的m/z 656.83肽段串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列解析圖(4)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2毛細管液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-ESI-MS/MS，Q-TOF2)系統(tǒng)分析，其中橫坐橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、縱坐標上方為肽段氨基酸序列解析結果。
附圖11為在圖5或圖6總離子流質(zhì)譜圖中的m/z 656.83肽段串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸序列解析圖(5)，圖中質(zhì)譜圖采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS系統(tǒng)分析，其中橫坐標質(zhì)荷比(m/z)、縱坐標離子質(zhì)量百分比(100％)、縱坐標上方為肽段氨基酸序列解析結果。
附圖12為本發(fā)明蛋白肽段氨基酸序列檢索結果表。
圖13為Rv0341的編碼基因PCR擴增電泳圖；圖中顯示不同菌株的Rv0341編碼基因DNA擴增片段電泳結果。圖中M分子量標準、1H37Rv標準菌株、2耐R菌株、3依R菌株、4試劑空白對照。
圖14顯示免疫印跡膠體金標記法血清抗體檢測結果，圖的左邊為典型依R菌肺結核患者血清抗依R菌Rv03411蛋白抗體陽性結果，圖右邊為正常人血清陰性結果。
具體實施例方式
實施例1依R菌的分離鑒定本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白采用典型依R菌體外人工誘導編碼基因表達的方法。依R菌的分離鑒定篩選采用的羅氏(L-J)分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定及絕對濃度間接法藥敏實驗均按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》要求進行[中國防癆協(xié)會.中國防癆雜志，1996，1828-31.1。也可以采用7H9液體3D培養(yǎng)系統(tǒng)，通過生長曲線等指標進行判斷。
依R菌篩選的判斷標準是具有在常規(guī)L-J絕對濃度間接法藥敏培養(yǎng)中，其細菌在R培養(yǎng)管(R250μg/ml或R50μg/ml)中菌落生長粗大旺盛，對照管中菌落細小、生長不良(呈L型生長)的菌種鑒定為結核分枝桿菌的一類細菌被判定為依R菌，如圖1所示。耐R菌則在含R管和對照管中細菌生長的旺盛程度(菌落外觀形態(tài))相同。7H9液體3D培養(yǎng)系統(tǒng)生長曲線的對比差異，也可作為判斷依據(jù)，如圖2和圖3所示。
研究將臨床篩選的典型依R菌株(保藏號CJMCC No1570，參據(jù)的菌株號為1219)，通過不同利福平濃度的梯度實驗篩選的其最佳藥物濃度，作為誘導該發(fā)明結核分枝桿菌蛋白的藥物濃度。其羅氏培養(yǎng)的最佳利福平藥物濃度為100μg/ml，7H9液體培養(yǎng)的最佳利福平藥物濃度為8μg/ml。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白采用3-4周培養(yǎng)的典型臨床依R菌株(菌種編號1219，CJMCC No1570)菌懸液(10-2mg/ml)，接種于含利福平終濃度為8μg/ml的7H9液體培養(yǎng)基或含100μg/ml的羅氏培養(yǎng)基35～37℃培養(yǎng)3-4周。獲得的高表達發(fā)明蛋白依R菌株，以常規(guī)分枝桿菌菌種保存方法-70℃凍存。
實施例2本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白的制備本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白的制備，采用實施例1準備的高表達發(fā)明蛋白依R菌株的培養(yǎng)菌液(或取菌落于PBS緩沖液)經(jīng)巴氏滅活后，離心去上清，并再用PBS緩沖液洗滌2次后，每2mg細菌沉淀物加1×加樣緩沖液(SDS加倍量)100μl和直徑200μm的玻璃珠2mg，然后于水浴超聲儀中超聲15min，沸水中10min，20℃14000轉/min離心8min，收集上清液備用。然后將其上清液樣品用紫外分光光度計定量蛋白濃度，電泳樣品的控制在1～2g/L之間。SDS-PAGE電泳條件為5％積層膠，10％分離膠，樣品15～20μl，電壓100V，電泳3～4h，電泳膠考瑪斯亮藍染色定位目標蛋白。如圖4右所示。
本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白的回收，采用直接定位切割以上SDS-PAGE膠中的目標蛋白，用常規(guī)方法進行回收、純化和復性。同時，也可采用常規(guī)電轉移技術直接轉印SDS-PAGE膠中的蛋白到PVDV膜上后，定位切割1條膜考瑪斯亮藍染色定位目標蛋白，如圖4左所示。然后定位切割膜上目標蛋白帶，用于分析或檢測。后者蛋白的丟失及其功能活性的影響較小，成本較低，可優(yōu)選采用。
實施例3本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白的氨基酸序列鑒定本發(fā)明蛋白氨基酸序列的鑒定采用Q-TOF2型LC-ESI-MS-MS儀器系統(tǒng)。由軍事醫(yī)學科學院國家生物醫(yī)學分析中心質(zhì)譜室提供服務。其基本方法是切割實施例2獲得的發(fā)明蛋白帶，經(jīng)回收純化后，先進行一次肽混合物質(zhì)譜分析，如圖5-6所示；再對其中5個肽段進行串聯(lián)質(zhì)譜(標簽序列)，解析出各肽段的氨基酸序列，如圖7-11所示；然后檢索比對，檢索結果如圖12所示。即本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白經(jīng)氨基酸序列鑒定為結核分枝桿菌H37Rv假設蛋白Rv0341，相對分子質(zhì)量43894，等電點(PI)5.25，得分183，氨基酸序列如序列2所示。
實施例3本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白編碼基因序列分析本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白編碼基因的擴增，是根據(jù)Genbank提供的序列資料，借助計算機輔助設計實施例2結果的結核分枝桿菌H37Rv假設蛋白Rv0341編碼基因(409360-410799序列)1440bp片段的擴增引物I(5’-CGATTACATCCTGAGCCTGTT-3’)和引物II(3’-GGTAGTCCGAAAAGGCCGTA-5’)。細菌DNA提取采用美國Promega公司DNA提取試劑盒(批號178886)，按其說明書方法提取實驗菌株DNA。PCR擴增體系按常規(guī)條件配制[10]，擴增條件為95℃5min后，以95℃1min、52℃1min和72℃2min循環(huán)35次，72℃延伸10min，4℃保存。
Rv0341蛋白編碼基因擴增片段的DNA序列分析，是將編碼基因進行分段DNA序列測序、交叉部分和兩端另設計引物重復測序，以重復一致的結果為準。測序使用的相關引物，除編碼基因擴增引物外，還有目標片段上游末端延伸測序引物(5’-GTATTGGGACGGGTCTGG-3’和3’-ATGAACCCGCCAGTGAC-5’)、中段290bp反向延伸引物(3’-GCTAGCCAGATCGGTGTC-5’)，以及目標片段下游末端延伸測序引物(5’-ACATTGGCGACGTCCTG-3’和3’-ATGAACCCGCCAGTGAC-5’)。PCR擴增產(chǎn)物的純化、DNA序列測定(相關引物設計合成)及結果的比對等均由上海基康生物技術有限公司提供服務。
用以上方法對從實施例1隨機抽取的依R菌株、耐R菌株和R敏感株各10株進行Rv0341編碼基因的PCR擴增，結果均獲得1440bp片段(圖13)。其片段經(jīng)分段測序、交叉及兩端部位重復測序結果均可重復后，再拼接并與NCBI上公共數(shù)據(jù)庫比對分析。結果不同臨床株的Rv0341編碼基因1440bp片段序列與基因庫結核分枝桿菌的相應序列完全相同，即未發(fā)現(xiàn)DNA的突變。其結果證實依R菌株的Rv0341蛋白高表達，不是其編碼基因DNA的突變所致，而是受控于利福平的濃度。
實施例4本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白用于依R菌的直接診斷的臨床試驗依R菌株臨床篩選和判斷標準具有在L-J絕對濃度間接法藥敏培養(yǎng)中，其細菌在利福平(R)培養(yǎng)管(R250μg/ml或R50μg/ml)中菌落生長粗大旺盛，對照管中菌落細小、生長不良(呈L型生長)的結核分枝桿菌，被判定為依R菌(圖1、2)。耐R菌則在含R管和對照管中細菌生長的旺盛程度(菌落外觀形態(tài))相同。
采用常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)技術對培養(yǎng)3-4周的結核分枝桿菌H37Rv標準株、R敏感株、耐R株和依R株的菌體蛋白掃描圖譜的比較分析的結果是不同菌株的蛋白圖譜條帶數(shù)和位置基本相似。其中84％(41/49)的依R菌株在含R管中菌體蛋白表達豐富，且在相對于標準物分子質(zhì)量43000的下端有一相同的高表達帶；經(jīng)全自動凝膠成像系統(tǒng)含量分析，該蛋白帶約占總菌體蛋白的30％～50％。86％(72/84)的非依R菌株(30株R敏感菌和54株耐R菌)和H37Rv標準菌株的含R管和對照管的蛋白圖譜相似，且無相應的高表達現(xiàn)象。依R菌等菌株的SDS-PAGE圖譜如圖14所示。其依R菌株的共同高表達蛋白帶為結核分枝桿菌H37Rv假設蛋白Rv0341，其氨基酸序列如序列2，鑒定方法如實施例3。
實驗結果顯示；利福平對依R菌Rv0341蛋白的表達有明顯上調(diào)作用(誘導作用)，其上調(diào)Rv0341蛋白與依R菌相關，可視為依R菌的相關蛋白或標志物。
實施例5本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白用于依R株結核病血清學診斷的臨床試驗[方法]采用免疫印跡膠體金標記法血清抗體檢測法。按實施例2制備本發(fā)明的結核分枝桿菌蛋白，固定于PVDV膜上。定位安裝于測試板的反應孔中，質(zhì)量檢測后，4～8℃干燥保存?zhèn)溆谩?br> 試劑盒組成包括測試板、封閉液、洗滌液、金標試劑及陽性和陰性質(zhì)控血清。
1.在測試板的反應孔中，加封閉液1滴，待其完全滲透于膜內(nèi)。
2.取新鮮的待測血清50μl于反應孔中心，待其完全滲透于膜內(nèi)。
3.加洗滌液3滴，待其完全滲透于膜內(nèi)。重復洗滌1次。
4.加金標試劑1滴，待其完全滲透于膜內(nèi)。
5.加洗滌液3滴，待其完全滲透于膜內(nèi)，肉眼觀察結果。
陽性在反應孔中的膜上出現(xiàn)紅色斑點條帶。如圖14左。
陰性在反應孔中的膜上沒有紅色斑點條帶或有條帶痕跡。如圖14右。
每個批次試劑盒配有陽、陰性質(zhì)控血清，用于監(jiān)測試劑盒質(zhì)量。陽、陰性質(zhì)控血清結果可靠時，方可用于臨床樣本的檢測。

從典型依R菌肺結核患者中成功獲得抗依R菌Rv0341蛋白的抗體陽性血清。30份正常人血清抗體檢測均為陰性。30份陰性血清和30份陽性血清的批內(nèi)平行重復實驗結果均相同。10份陰性血清的3次批間重復實驗結果均為陰性；10份陽性血清的3次批間重復實驗結果均為陽性，其陽性程度有一定的差異，以新培養(yǎng)菌株制備Rv0341蛋白帶膜的陽性程度較強。
327份血清源于重慶市肺科醫(yī)院——重慶市結核基因診斷中心實驗室血清庫。檢測結果見表1。
表1 327份血清抗體的檢測結果

檢測結果顯示本發(fā)明結核分枝桿菌蛋白建立的免疫印跡膠體金標記血清抗體檢測法，有較好的批內(nèi)批間重復性，其方法比較穩(wěn)定。該法在正常人組、耐R菌肺結核組、R敏感菌肺結核組和非結核肺部疾病組的特異性分別為100％(30/30)、93.5％(29/30)、83.3％(30/36)和97.6％(40/41)，平均為93.5％(129/138)。在依R菌肺結核R治療組中的敏感性為86.7％(26/30)。近期未使用R治療組的12例依R菌肺結核患者的血清抗體僅檢測到3例陽性(25.0％)，其結果基本與體外實驗相符。即依R菌在沒有R的條件下生長不良，目標蛋白不能進行有效表達，抗依R菌蛋白抗體在體內(nèi)維持的時間，取決于被誘導的依R菌蛋白的量和在體內(nèi)維持的時間。在培養(yǎng)陰性結核組中，獲得了19.7％(29/147)陽性率，其中復難治病例13例，初治16例(包括頸淋巴結核2例、腹膜結核2例和血播性結核1例)，且29例患者均使用含R的治療方案，其中已經(jīng)治療3-6月，而療效不佳的6例，病情加重的3例，臨床和實驗結果均提示這些患者可能為依R菌結核病。另外，6例抗體陽性的R敏感肺結核病例的體內(nèi)是否同時存在依R菌的問題值得證實(已知研究和臨床結果均提示同一病例體內(nèi)的結核分枝桿菌存在不均一性，即可能同時存在不同耐藥情況的菌株)，其病例的臨床療效和細菌學資料的追蹤研究正在進行。
綜上所述，用包含本發(fā)明所指的蛋白的試劑盒在臨床診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病時，不但有較好的重復性、特異性和敏感性，還能夠使檢測系統(tǒng)操作簡單快速，不需要特殊的儀器和條件，利于推廣應用。制備方法中，采用在常規(guī)培養(yǎng)基中加入特定濃度的利福平培養(yǎng)依R菌，無不需特殊設備的情況下，低成本的誘導依R菌產(chǎn)生本發(fā)明蛋白。在目前臨床結核病治療方案廣泛使用利福平的情況下，采用包含本發(fā)明蛋白的試劑盒可作為血清學快速篩檢方法輔助診斷依R菌結核病，特別是對大部分在體外不能獲得細菌學指標的菌陰結核病的診斷來說，更有臨床應用價值。
序列表<110>重慶市肺科醫(yī)院<120>用于診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病的結核分枝桿菌蛋白<130>Hypothetical protein RV0341[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]<160>4<210>1<211>479<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述誘導的<400>1Met Thr Ser Leu Ile Asp Tyr Ile Leu Ser Leu Phe Arg Ser Glu Asp Ala Ala Arg Ser1 5 10 15 20Phe Val Ala Ala Pro Gly Arg Ala Met Thr Ser Ala Gly Leu Ile Asp Ile Ala Pro His25 30 35 40Gln Ile Ser Ser Val Ala Ala Asn Val Val Pro Gly Leu Asn Leu Gly Ala Gly Asp Pro45 50 55 60Met Ser Gly Leu Arg Gln Ala Val Ala Ala Arg His Gly Phe Ala Gln Asp Val Ala Asn65 70 75 80Val Gly Pro Phe Gly Asp Ala Gly Ala Gly Val Ala Ser Val Ile Thr Thr Asp Val Gly85 90 95 100Ala Gly Leu Ala Ser Gly Leu Gly Ala Gly Phe Leu Gly Gln Gly Gly Leu Ala Leu Ala105 110 115 120Ala Ser Ser Gly Gly Phe Gly Gly Gln Val Gly Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu Gly Phe125 130 135 140Thr Ala Val Ile Glu Ala Glu Val Gly Ala Gln Val Gly Ala Gly Leu Gly Ile Gly Thr145 150 155 160Gly Leu Gly Ala Gln Ala Gly Met Gly Phe Gly Gly Gly Val Gly Leu Gly Leu Gly Gly
165 170 175 180Gln Ala Gly Gly Val Ile Gly Gly Ser Ala Ala Gly Ala Ile Gly Ala Gly Val Gly Gly185 190 195 200Arg Leu Gly Gly Asn Gly Gln Ile Gly Val Ala Gly Gln Gly Ala Val Gly Ala Gly Val205 210 215 220Gly Ala Gly Val Gly Gly Gln Ala Gly Ile Ala Ser Gln Ile Gly Val Ser Ala Gly Gly225 230 235 240Gly Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Gly Leu Thr Gly Val Ser Ser Asn Ala Val Leu245 250 255 260Ala Ser Asn Ala Ser Gly Gln Ala Gly Leu Ile Ala Ser Glylu Gly Ala Ala Leu Asn Gly265 270 275 280Ala Ala Met Pro His Leu Ser Gly Pro Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Gln Ala Gly285 290 295 300Ala Ala Gly Gly Ala Gly Leu Gly Phe Gly Ala Val Gly His Pro Thr Pro Gln Pro Ala305 310 315 320Ala Leu Gly Ala Ala Gly Val Val Ala Lys Thr Glu Ala Ala Ala Gly Val Val Gly Gly325 330 335 340Val Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly Val Gly Gly Ala His Gly Asp Ile Leu Gly His Glu345 350 355 360Gly Ala Ala Leu Gly Ser Val Asp Thr Val Asn Ala Gly Val Thr Pro Val Glu His Gly365 370 375 380Leu Val Leu Pro Ser Gly Pro Leu Ile His Gly Gly Thr Gly Gly Tyr Gly Gly Met Asn385 390 395 400Pro Pro Val Thr Asp Ala Pro Ala Pro Gln Val Pro Ala Arg Ala Gln Pro Met Thr Thr405 410 415 420Ala Ala Glu His Thr Pro Ala Val Thr Gln Pro Gln His Thr Pro Val Glu Pro Pro Val425 430 435 440His Asp Lys Pro Pro Ser His Ser Val Glu Asp Val Gly His Glu Pro Pro Val Thr His445 450 455 460Thr Pro Pro Ala Pro Ile Glu Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Gly Leu Pro Gly Phe465 470 475 479<210>2<211>1440<212>DNA
<213>結核病的結核分枝桿菌H37Rv[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]<220>
<400>1409360 a tgacctcgct tatcgattac409381 atcctgagcc tgttccgcag cgaagacgcc gcccggtcgt tcgttgccgc tccgggacgg409441 gccatgacca gtgccgggct gatcgatatc gcgccgcacc aaatctcatc ggtggcggcc409501 aatgtggtgc cgggtctgaa tctgggtgcc ggcgacccca tgagcggatt gcggcaggcc409561 gtcgccgctc ggcatggctt tgcgcaggac gtcgccaatg tcggcttcgc cggtgacgcg409621 ggcgcggggg tggcaagcgt catcacgacc gatgtcggtg cgggcctggc tagcggactg409681 ggtgctgggt tcctgggtca gggtggcctg gctctcgccg cgtcaagcgg tggtttcggc409741 ggtcaggtcg gcttggctgc ccaggtcggt ctgggtttta ctgccgtgat tgaggccgag409801 gtcggcgctc aggttggtgc tgggttaggt attgggacgg gtctgggtgc tcaggccggt409861 atgggctttg gcggcggggt tggcctgggt ctgggtggtc aggccggcgg tgtgatcggt409921 gggagcgcgg ccggggctat cggtgccggc gtcggcggtc gcctaggcgg caatggccag409981 atcggagttg ccggccaggg tgccgttggc gctggtgtcg gcgctggtgt cggcggccag410041 gcgggcatcg ctagccagat cggtgtctca gccggtggtg ggctcggcgg cgtcggcaat410101 gtcagcggcc tgaccggggt cagcagcaac gcagtgttgg cttccaacgc aagcggccag410161 gcggggttga tcgccagtga aggcgctgcc ttgaacggcg ctgctatgcc tcatctgtcg410221 ggcccgttag ccggtgtcgg tgtgggtggt caggccggcg ccgctggcgg cgccgggttg410281 ggcttcggag cggtcgggca cccgactcct cagccggcgg ccctgggcgc ggctggcgtg410341 gtggccaaga ccgaggcggc tgctggagtg gttggcgggg tcggcggggc aaccgcggcc410401 ggggtcggcg gggcacacgg cgacatcctg ggccacgagg gagccgcact gggcagtgtc410461 gacacggtca acgccggtgt cacgcccgtc gagcatggct tggtcctgcc cagtggcccc410521 ctgatccacg gcggtaccgg cggctatggc ggcatgaacc cgccagtgac cgatgcgccg410581 gcaccgcaag ttccggcgcg ggcccagccg atgaccacgg cggccgagca cacgccggcg410641 gttacccaac cgcagcacac gccggtcgag ccgccggtcc acgataagcc gccgagccat410701 tcggtgtttg acgtcggtca cgagccgccg gtgacgcaca cgccgccggc gcccatcgaa410761 ctgccgtcgt acggcctttt cggactaccc gggttctga 410799<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述上游引物<400>3CGATTACATCCTGAGCCTGTT<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述下游引物<400>3GGTAGTCCGAAAAGGCCGTA
權利要求
1.一種結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，其具有依賴利福平生長的特異性，其保藏號為CGMCC NO.1570，保藏時間2005年12月19日，參據(jù)的菌株號為1219。
2.一種依賴利福平結核分枝桿菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量為43894道爾頓，pI值為5.25。
3.一種核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。
4.一種依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的合成方法，其特征是采用人工誘導依賴利福平結核分枝桿菌的方法，獲得高表達濃度的所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白；方法如下1)分離鑒定篩選臨床典型依賴利福平結核分枝桿菌菌株(保藏號為CGMCC NO.1570，參據(jù)的菌株號為1219)；2)在7H9液體培養(yǎng)基中，以利福平6～24μg/ml作為誘導濃度培養(yǎng)獲得富含序列2蛋白的依R菌株；3)或在L-J固體培養(yǎng)基中以利福平50～300μg/ml作為誘導濃度培養(yǎng)獲得富含序列2蛋白的依賴利福平結核分枝桿菌株；4)制備步驟2或3誘導后的依賴利福平結核分枝桿菌蛋白溶液；5)分離蛋白、回收、純化和復性即獲得依賴利福平結核分枝桿菌蛋白。
5.包含權利要求2或4所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的組合物。
6.包含權利要求2或4所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的試劑盒。
7.權利要求6的試劑盒在臨床診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病、耐多藥結核病及其流行病學監(jiān)測調(diào)查中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有依賴利福平生長的特異性結核分枝桿菌(其保藏號為CGMCC NO.1570)。還涉及依賴利福平結核分枝桿菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量為43894道爾頓，pI值為5.25。還涉及一種核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及采用人工誘導依賴利福平結核分枝桿菌，獲得高表達濃度的所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的方法。涉及包含所述依賴利福平結核分枝桿菌蛋白的組合物、試劑盒以及所述試劑盒在臨床診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病、耐多藥結核病及其流行病學監(jiān)測調(diào)查中的應用。
文檔編號C07K14/35GK1821384SQ20051005748
公開日2006年8月23日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權日2005年12月31日
發(fā)明者鐘敏, 王易偉, 婁樂山, 鐘明 申請人:重慶市肺科醫(yī)院