專利名稱：一種從植物微量組織中提取rna病毒核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提純病毒核酸的方法，特別是一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法。
背景技術(shù)：
PCR和RT-PCR是DNA病毒和RNA病毒高靈敏度檢測的強有力工具。對植物病毒來說，RT-PCR方法與當(dāng)前的其它檢測技術(shù)相比，不管在檢測靈敏度、特異性還是花費時間方面都有了長足的進(jìn)步。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄了大量的病毒核酸序列，這對病毒特異的PCR引物設(shè)計提供了得天獨厚的優(yōu)勢。但是，組織核酸的提取在PCR和RT-PCR實驗過程中是耗時且花體力的一個步驟。況且，沒有一種方法可以適合所有組織核酸的提取，例如，經(jīng)典的Trizol提取方法就部分草本植物而言，可以獲得較為理想的結(jié)果，但是，就木本植物的葉組織而言，核酸提取的效率非常低；并且，在提取的核酸樣品中往往存在RT和PCR反應(yīng)的抑制因子，這樣往往導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陰性。因此，許多工作者在核酸提取方法上作了研究。
現(xiàn)有的病毒核酸提純方法主要有兩類其一是大量制備病毒顆粒，然后從病毒顆粒中將核酸與病毒蛋白(主要是外殼蛋白)分離，通過苯酚/氯仿抽提等方法去除蛋白質(zhì)，純化其中的核酸；這一方法需要大量的感染病毒的組織，微微需要10g～300g組織來制備純化病毒；同時，制備病毒粒子需要進(jìn)行超速離心等條件，制備時間長、條件要求高。
其二是從組織中提取總核酸(對于RNA病毒主要是總RNA)。由于寄主組織中總RNA制備物中主要是寄主的RNA，特別是核糖體RNA?？俁NA中病毒RNA的相對含量不到1％，因此對于基于病毒核酸制備的病毒檢測容易造成假陽性等不可預(yù)期的結(jié)果。同時，總RNA提取液，如市售的Trizol溶液中往往含有氯仿等多種對人體和環(huán)境有害的物質(zhì)，造成污染。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種成本低廉、操作簡便、僅需微量樣品就能進(jìn)行RNA病毒核酸分離的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步驟1)、將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05-0.2克/100μl的比例在預(yù)冷的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液中研磨至勻漿，所述病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液的pH值為5.0～9.0；2)、將上述勻漿轉(zhuǎn)移到0.2-1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱堿性緩沖溶液洗所述塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢后，離心后吸除殘液；3)、加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的一種改進(jìn)將所制備的病毒核酸直接用于RT-PCR或低溫方式保存；或先將病毒核酸稀釋至9～10倍的體積，并加入與稀釋后病毒核酸體積比為2/3～1倍的異丙醇或體積比為3～4倍的酒精，沉淀獲得純化濃縮的病毒核酸。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)中將勻漿轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，先將塑料離心管低速離心或者振蕩后，再室溫下靜止10～20分鐘。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟1)中，病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液的濃度為0.01～1.0mol/L；步驟2)中，每次使用100-200μl弱堿性緩沖溶液洗塑料離心管壁；步驟3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯處理的去離子水。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟1)中的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液是pH值為5.0～9.0的磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、或PBST溶液；步驟2)中的弱堿性緩沖溶液為PBST溶液。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟1)中的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液是pH7.2的PBST溶液。
作為本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的聚丙烯離心管、聚苯烯離心管、聚四氟離心管，特別選擇為0.5-1.5ml的不進(jìn)行硅烷化處理的聚丙烯離心管。
本發(fā)明的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，具有如下優(yōu)點1)、本發(fā)明方法操作簡便，可以不需要低溫冷凍離心機(jī)或超速離心機(jī)等儀器，提取時間為20～50分鐘；而常規(guī)方法需要多次使用低溫冷凍離心機(jī)或超速離心機(jī)，提取時間為1小時以上；2)、使用本發(fā)明之方法，提取核酸不使用氯仿和苯酚等有機(jī)溶劑，對環(huán)境和操作者友好；3)、本發(fā)明的最重要優(yōu)點是僅需微量組織即可提取，因此制備成本極低，有利于節(jié)省成本；4)、本發(fā)明的方法能對組織中可能同時攜帶的病毒和基因顆?？蛇M(jìn)行提取，用于檢測。
具體實施例方式
實施例1、在半夏脫毒快繁的組織培養(yǎng)過程中，各取0.2g待檢的半夏愈傷組織，在100μl預(yù)冷的PBST溶液、研缽中研磨至勻漿；各取100μl勻漿液分別轉(zhuǎn)移到0.5ml規(guī)格的塑料離心管中，低速離心后再在室溫下靜止15分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；每次用100μl PBST溶液洗離心管，共洗3次，洗滌完畢后，再離心后吸除殘液。分別加入8μl DEPC處理的去離子水；其中1管升溫至80℃保持1分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
PBST溶液其配制方法為溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4和2ml of tween-20于800ml去離子水中，用HCl調(diào)整其pH至7.2，加入0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)，37℃放置2小時，高溫滅菌，冷卻后使用。
所制備的病毒核酸直接加入黃瓜花葉病毒(CMV)CP基因擴(kuò)增的RT-PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增獲得CMV CP基因的片段，進(jìn)一步進(jìn)行雜交檢測；確定是否有該病毒侵染；其中另1管升溫至80℃保持2分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸；所制備的病毒核酸直接加入芋花葉病毒(DsMV)3′末端基因擴(kuò)增的RT-PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增獲得DsMV部分基因組的片段，進(jìn)一步進(jìn)行雜交檢測；確定是否有DsMV的侵染。以同時侵染CMV和DsMV的半夏植株(葉片)作為對照，以通過DsMV和CMV的ELISA檢測方法確定為脫病毒的種苗作為陰性對照，用本方法從同一陽性植株中同時檢測出DsMV和CMV，但是陰性對照沒有檢測到以上2種病毒；通過脫病毒處理的預(yù)傷組織中33.7％的樣品中已經(jīng)脫除以上2種病毒。
實施例2、從黃瓜花葉病毒(CMV)系統(tǒng)侵染的番茄組織中制備CMV基因組RNA取0.1g系統(tǒng)侵染CMV的番茄組織，在預(yù)冷的磷酸緩沖液、研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml塑料離心管中，低速離心或者振蕩后再在室溫下靜止20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用150μl PBST溶液洗離心管3次，洗滌完畢后，再離心后吸除殘液；加入20μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持3分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
所制備的病毒核酸直接加入RT-PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增獲得CMV全長基因組RNA1、RNA2和RNA3的片段。
實施例3通過免疫捕捉方法從黃瓜花葉病毒(CMV)系統(tǒng)侵染的番茄組織中制備CMV基因組RNA取100μl用PBST或生理鹽水稀釋(1500倍)的CMV抗血清加入到1.0ml塑料離心管中，室溫下處理18分鐘，讓抗體充分吸附到離心管管壁上，然后倒去抗血清溶液，洗干；將-80℃保存的0.5g系統(tǒng)侵染CMV的番茄組織，在1000μl PBST溶液、研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml塑料離心管離心管中，低速離心或者振蕩后再在室溫下靜止15分鐘，使病毒粒子與吸附在管壁上的抗體充分結(jié)合；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，洗滌完畢后，再離心后吸除殘液；加入8μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持1分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
所制備的病毒核酸直接加入RT-PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增獲得CMV全長基因組RNA1、RNA2和RNA3的片段。
實施例4從馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒復(fù)合感染馬鈴薯植株中制備3種病毒核酸取0.1g同時感染馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和馬鈴薯M病毒的馬鈴薯葉組織(去中脈)于研缽中，加入200μl硼酸緩沖液充分研磨，然后取100μl提取物于DEPC處理的離心管中，24℃放置16分鐘；吸干提取物，用200μl DEPC處理的1×PBST溶液沖洗管壁2次；短暫離心之后，吸干殘留的PBST溶液，并加入10ul DEPC-H2O沖洗管壁，將離心管放置80℃變性2min，放置冰上3-10min；充分渦旋后，短暫離心，管底溶液即可作為RT-PCR的模板，同時獲得3條代表不同病毒核酸的條帶。
實施例5從煙草花葉病毒(TMV)侵染的煙草組織種制備TMV全長基因組RNA取0.05g系統(tǒng)侵染TMV的煙草組織，在PBST溶液和研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉(zhuǎn)移到0.5ml塑料離心管中，室溫下靜止10分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，離心后吸除殘液；加入8μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持3分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸；所制備的病毒核酸點樣到硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的TMV探針檢測，檢測到TMVRNA雜交信號。
實施例6從侵染菜豆黃花葉病毒(BYMV)的美人蕉葉組織中制備病毒基因組RNA取0.05g感染BYMV的美人蕉葉組織，在PBST溶液和研缽中研磨至勻漿；取100μl勻漿液轉(zhuǎn)移到0.5ml塑料離心管中，室溫下靜止10分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；分別用100μl PBST溶液洗離心管3次，離心后吸除殘液；加入15μl DEPC處理的去離子水；升溫至80℃保持2分鐘，使病毒粒子解離，釋放核酸。
通過RT-PCR方法從制備的病毒核酸樣品中檢測到該病毒。
對照實施例1從200g煙草葉組織中提取黃瓜花葉病毒(CMV)，進(jìn)而提取該病毒的基因組核酸取200g系統(tǒng)侵染CMV的煙草葉組織，加入200ml的PB緩沖液，勻漿3min，加入40ml氯仿，繼續(xù)勻漿2min，離心取上清，加入總體積6％的PEG6000，4℃攪拌4h，離心棄上清，沉淀懸浮于PB緩沖液，取上清，超速離心，沉淀懸浮于0.2M PB緩沖液。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明提純獲得的CMV濃度含量很低。取200ul病毒粗體液提取病毒的總核酸，經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，沒有檢測到病毒核酸的條帶。
對照實施例2利用商品化TRizol試劑提取美人蕉葉組織的總RNA取0.1美人蕉葉組織，經(jīng)液氮研磨后，加入1ml Trizol充分研磨，之后加入0.2ml氯仿混勻，12000rpm離心5min，取上清，加入等體積的異丙醇沉淀，最后，用50ul DEPC H2O溶解沉淀。取5ul核酸樣品進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖膠電泳檢測。結(jié)果，多次采用這一方法提取的核酸產(chǎn)率極低，有的次數(shù)無法檢測到核酸條帶。
以上實驗證明使用本發(fā)明的方法能實現(xiàn)從微量組織中提取病毒核酸的目的，而現(xiàn)有方法則不行。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是依次包括以下步驟1)、將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05-0.2克/100μl的比例在預(yù)冷的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液中研磨至勻漿，所述病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液的pH值為5.0～9.0；2)、將上述勻漿轉(zhuǎn)移到0.2-1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱堿性緩沖溶液洗所述塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢后，離心后吸除殘液；3)、加入焦碳酸二乙酯處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是將所制備的病毒核酸直接用于RT-PCR或低溫方式保存；或先將病毒核酸稀釋至9～10倍的體積，并加入與稀釋后病毒核酸體積比為2/3～1倍的異丙醇或體積比為3～4倍的酒精，沉淀獲得純化濃縮的病毒核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，其特征是步驟2)中，將所述勻漿轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，先將塑料離心管低速離心或者振蕩后，再室溫下靜止10～20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是步驟1)中，所述病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液的濃度為0.01～1.0mol/L；步驟2)中，每次使用100-200μl弱堿性緩沖溶液洗塑料離心管壁；步驟3)中，加入8μl～20μl的焦碳酸二乙酯處理的去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步驟1)中的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液是pH值為5.0～9.0的磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、或PBST溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步驟2)中的弱堿性緩沖溶液為PBST溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步驟1)中的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液是pH7.2的PBST溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的聚丙烯離心管、聚苯烯離心管、聚四氟離心管。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的從植物微量組織中提取病毒核酸的方法，其特征是所述步驟2)中的塑料離心管為0.5-1.5ml的不進(jìn)行硅烷化處理的聚丙烯離心管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從植物微量組織中提取RNA病毒核酸的方法，依次包括以下步驟1)將被病毒侵染的植物寄主組織，按照0.05－0.2克/100μl的比例在預(yù)冷的病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液中研磨至勻漿，病毒粒子保護(hù)性緩沖溶液的pH值為5.0～9.0；2)將上述勻漿轉(zhuǎn)移到0.2－1.5ml的塑料離心管中，室溫下靜止10～20分鐘，使病毒粒子吸附在管壁上；倒去溶液；用弱堿性緩沖溶液洗塑料離心管壁2～4次，洗滌完畢后，離心后吸除殘液；3)加入焦碳酸二乙酯處理的去離子水，升溫至70℃～100℃，保溫1～3分鐘，使病毒粒子解離，釋放出病毒核酸。本發(fā)明的方法，僅需微量樣品就能進(jìn)行RNA病毒核酸分離，因此成本低廉、操作簡便。
文檔編號C07H21/02GK1763063SQ20051006093
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者陳集雙, 杜志游, 竺錫武, 王鐠, 陳紹寧 申請人:浙江理工大學(xué)