專利名稱：使用硅鋁酸鹽富集海藻糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中海藻糖使用一種吸附劑富集。
海藻糖二糖(α-D-吡喃葡糖-α-D-吡喃葡苷)由彼此通過(guò)一個(gè)α，α-1，1-共價(jià)鍵連接的兩個(gè)葡糖分子組成。海藻糖，由于它在性能方面的重要性質(zhì)，在工業(yè)上越來(lái)越重要。一個(gè)重要的應(yīng)用領(lǐng)域是穩(wěn)定蛋白質(zhì)和多肽，例如酶和疫苗。海藻糖優(yōu)選用于食品工業(yè)。由于它低甜度和保持味道的性質(zhì)，海藻糖也被用作蔗糖替代物。此外，在冷凍和干燥過(guò)程中海藻糖具有穩(wěn)定作用。進(jìn)一步的應(yīng)用領(lǐng)域是化妝品領(lǐng)域。
海藻糖優(yōu)選通過(guò)酶法或使用合適的微生物發(fā)酵生產(chǎn)(Schiraldi，C.，etal.(2002).Trehalose ProductionExploiting Novel Approaches，Trend inBiotechnology，vol.20(10)，pages 420-425)。通常，海藻糖也作為用于發(fā)酵生產(chǎn)其它物質(zhì)的副產(chǎn)品而形成(Hull，S.R.，Gray，J.S.S.，et al.(1995).Trehalose as a Common Industrial Fermentation Byproduct.Carbohydrate Research，vol.266，pages 147-152)。在非化學(xué)合成的方法中，尤其在發(fā)酵情況下，形成含有高污染的溶液，如含有細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或其它糖。
因而海藻糖必須從這樣的高污染溶液中富集，并且根據(jù)使用目的，進(jìn)一步純化。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已知有多種富集和純化海藻糖的方法。
US 5,759,610描述了一種由微生物培養(yǎng)基中純化海藻糖的方法，包括步驟過(guò)濾和離心處理、使用活性炭處理、去離子作用、離子交換劑純化、濃縮形成糖漿產(chǎn)品，進(jìn)一步通過(guò)色譜柱技術(shù)純化，如離子交換色譜，活性碳色譜和硅膠色譜，也可以通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀，如乙醇、丙酮，并采用合適的膜過(guò)濾，酵母發(fā)酵處理或堿處理，目的是除去或分解任何殘留的糖類。為進(jìn)一步純化目的，如進(jìn)行冷凍結(jié)晶或噴霧干燥。未使用吸附劑吸附海藻糖。
JP 07000190(Tradashi，W.，et al.)描述了從釀酒廠發(fā)酵的固體殘留物中分離海藻糖。殘留物通過(guò)醇萃取和/或超聲波處理以從該殘留物中提取海藻糖。此外，通過(guò)熱處理抑制該殘留物中海藻糖酶的活性。其中通過(guò)離子交換柱和活性碳柱進(jìn)行純化。在這種方法中，海藻糖不被柱吸附。
US 5,441,644中描述了一種從發(fā)酵肉湯中純化海藻糖的方法。在這種方法中進(jìn)行超濾及使用活性碳脫色。其中，海藻糖不被活性碳吸附。
所述方法的缺點(diǎn)是各自使用吸附劑僅吸附不想要的雜質(zhì)，而非吸附海藻糖本身。由于萃取和純化步驟必須適應(yīng)不同的雜質(zhì)，因而是非常復(fù)雜的，難以應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模。尤其，用于從發(fā)酵肉湯中純化，其中海藻糖的干重含量通常低于15％(Schiraldi et al.，(2002)，Trehalose ProductionExploiting Novel Approaches.Trends In Biotechnology，vol.20(10)，page421)。
根據(jù)另一種方法，海藻糖作為發(fā)酵副產(chǎn)品通過(guò)連續(xù)的活性碳和Bio-Gel P-2色譜純化得到(Hull，S.R.，Gray，J.S.S.，et al.(1995).Trehaloseas a Common Industrial Fermentation Byproduct.CarbohydrateResearch，vol.266，pages 147-152)。然而，這種方法僅為一種檢測(cè)方法，不適合作為應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的方法。
除了上面描述的方法，US 5,441,644中還提到，現(xiàn)有技術(shù)中還有將海藻糖溶于乙腈溶液通過(guò)硅膠色譜柱的方法。然而，文件提到這種色譜方法不適于在工業(yè)規(guī)模上富集海藻糖或海藻糖純化。
Buttersack et al.(Specific Adsorption from Aqueous Phase on ApolarZeolites，Progress in Zeolite and Microporous Materials，vol.105，pp.1723-1730，1977)中描述了一定的單-和二糖與選擇的FAU，PEA和MFI沸石的結(jié)合。對(duì)于個(gè)別二糖，發(fā)現(xiàn)了差別很大的不同的吸附性。其中沒有對(duì)海藻糖進(jìn)行研究。
在一項(xiàng)進(jìn)一步的研究中，Buttersack et al.描述了二糖與不同的Y沸石和脫鋁Y沸石的結(jié)合(Buttersack et al.(1994).Adsorption of Glucose andFructose containing Disaccharides on different Faujasities.Studies InSurface Science and Catalysis，vol.84，pp.1363-1371)。他們強(qiáng)調(diào)在二糖研究中果糖自由基對(duì)于沸石吸附性的重要性。他們沒有對(duì)海藻糖進(jìn)行研究，海藻糖也沒有果糖自由基。
前面提到的吸附劑的缺點(diǎn)是，它們具有通用的吸附性，不能根據(jù)每一種方法單獨(dú)地作出調(diào)整。
因此，要求一種使用更好的吸附劑從溶液中富集海藻糖的方法，尤其要求吸附劑可以根據(jù)每一種方法進(jìn)行適應(yīng)調(diào)整。因而，本發(fā)明的目的是提供一種這樣的方法，尤其適用于色譜方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種方法，使從發(fā)酵肉湯中富集海藻糖成為可能，尤其是從生產(chǎn)賴氨酸的發(fā)酵肉湯中富集海藻糖。
我們發(fā)現(xiàn)由公知使用吸附劑從溶液中富集海藻糖的方法開始可以實(shí)現(xiàn)上述目的。本發(fā)明方法的特征在于吸附劑為硅鋁酸鹽。
與已有技術(shù)使用的吸附劑(如活性碳或離子交換劑)比較，硅鋁酸鹽，尤其是沸石，有利的是可以制備大量不同的變體，結(jié)果是吸附劑可以更好地適應(yīng)分離問(wèn)題。
海藻糖可以通過(guò)多種已知的方法生產(chǎn)。傳統(tǒng)地，海藻糖通過(guò)發(fā)酵方法生產(chǎn)，同時(shí)，酶解生產(chǎn)方法也已出現(xiàn)(Schiraldi，C.，et al.(2002)TrehaloseProductionExploiting Novel Approaches.Trends in Biotechnology，vol.20(10)，page 420-425)。微生物中，已發(fā)現(xiàn)3種主要的酶解路線用于海藻糖合成(1)在真菌類和酵母中的磷酸化酶體系，(2)在嗜溫細(xì)菌和嗜極(extremophilic)細(xì)菌中的糖基轉(zhuǎn)移酶-水解酶體系，(3)海藻糖合成酶催化的麥芽糖到海藻糖轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(例如見JP 09098779，KR 99029104)。
術(shù)語(yǔ)富集是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)富集尤其涉及與不想要的雜質(zhì)相比，增加海藻糖的比例。通常，海藻糖的比例相對(duì)于產(chǎn)品的干重計(jì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)富集也涉及海藻糖的純化。術(shù)語(yǔ)純化是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明內(nèi)容中，純化的目的尤其是得到一種海藻糖的純度，其中使海藻糖基本上不含其它物質(zhì)。尤其是，這意味著海藻糖以結(jié)晶形式存在。
富集或純化方法只有有滿意的產(chǎn)率才具有最好的經(jīng)濟(jì)效益。因此，本方法的進(jìn)一步目的是不僅獲得高富集而且獲得高產(chǎn)率。
關(guān)于溶液，對(duì)溶劑沒有特別的限制，如水或乙腈均可使用。優(yōu)選溶液是水溶液。
本發(fā)明意義上的吸附劑是固體或其它類似凝膠的物質(zhì)，在其表面上另一種物質(zhì)的吸收可以發(fā)生。此處術(shù)語(yǔ)“表面”也指三維基材的內(nèi)部表面，如一種三維結(jié)構(gòu)沸石的內(nèi)表面。
本發(fā)明中吸附劑的例子為硅膠，活性碳和硅鋁酸鹽。
硅鋁酸鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。術(shù)語(yǔ)硅鋁酸鹽含有，例如，酸活化的膨潤(rùn)土(精制用的白土)和沸石。酸活化的膨潤(rùn)土(精制用的白土)是其中蒙脫石(可膨脹的或粘土礦)通過(guò)酸處理被部分溶解，并因此具有高表面積和大微孔體積的膨潤(rùn)土。膨潤(rùn)土是通過(guò)風(fēng)化火山巖灰(石灰華)形成的粘土，并且由礦物蒙脫石和貝得石(綠土礦物組)組成。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中尤其優(yōu)選的硅鋁酸鹽是沸石。在本文中，那些不含鋁的沸石也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
沸石是廣泛分布的一組結(jié)晶性硅酸鹽，更精確的說(shuō)，是一種含水的堿金屬或堿土金屬硅鋁酸鹽，通式為M2/zO□Al2O3□xSiO2□yH2O，其中M＝單價(jià)或多價(jià)金屬(通常為一種堿金屬或堿土金屬陽(yáng)離子)H或NH4等，z＝陽(yáng)離子的化合價(jià)，x＝0.8～約12，y＝0～約8。SiO2相對(duì)于Al2O3的化學(xué)計(jì)量比例(模量)是沸石的一個(gè)重要參數(shù)。
沸石的晶格由SiO4和AlO4四方體構(gòu)建，通過(guò)氧橋鍵連接。這在空間產(chǎn)生相等孔穴結(jié)構(gòu)(吸附)的排列，有可進(jìn)入的通道或開孔，其中彼此之間尺寸相等。這種類型的晶格可作為分子篩，其容許相對(duì)于開孔具有較小截面的分子到達(dá)該晶格的孔穴，同時(shí)較大分子不能穿過(guò)。因而沸石也被稱為分子篩。靜電相互作用，氫鍵和其它分子內(nèi)力也在吸附上發(fā)揮作用。沸石的許多化學(xué)和物理性質(zhì)依賴于鋁的含量。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)沸石不僅涉及天然的，也包括合成沸石。
天然沸石通過(guò)火山玻璃或含有石灰華的沉積物水熱轉(zhuǎn)化形成。根據(jù)它們的晶格，天然沸石可以被分成纖維性沸石(如發(fā)光沸石，MOR)，葉狀沸石和立方體沸石(如八面沸石，F(xiàn)AU和鉀沸石，OFF)。通常將不同的沸石給予三個(gè)字母代碼(例如MOR，F(xiàn)AU，OFF)。
為了制備合成沸石，初始使用的原料為含有SiO2(如水玻璃，硅土填料，硅溶膠)和含有Al2O3(如氫氧化鋁，鋁酸鹽，高嶺土)的物質(zhì)，其與堿金屬氫氧化物(通常為NaOH)一起在超過(guò)50℃溫度下的水相中轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶沸石。
對(duì)用于工業(yè)吸收劑的合成沸石需可進(jìn)一步修飾。優(yōu)選的沸石孔尺寸至少為7。孔尺寸和沸石極性影響例如不同糖的重量分布，例如其帶來(lái)不同的色譜分離性質(zhì)。低鋁沸石普通為極性，并因此優(yōu)先吸附食糖。
如前所述，沸石可以適應(yīng)不同的分離問(wèn)題。最初的制備可影響孔的尺寸，并且極性可以通過(guò)減少鋁含量的后處理改變。
本發(fā)明優(yōu)選的沸石為FAU，BEA和OFF。在本發(fā)明中，不同的沸石各自有不同的優(yōu)點(diǎn)，性能見實(shí)施例1。尤其優(yōu)選OFF。
使用硅鋁酸鹽富集原則上可以采用兩種不同的方法進(jìn)行。硅鋁酸鹽或者吸收不要的雜質(zhì)以使溶液中主要為海藻糖，或者吸收海藻糖以使不想要的雜質(zhì)留在溶液中。在兩種情況下均優(yōu)選發(fā)生的吸附選擇性盡可能高。
作為吸附器，可以使用固定床，移動(dòng)床和流化床吸附器。吸附可以間歇進(jìn)行或連續(xù)進(jìn)行。
在海藻糖被硅鋁酸鹽吸附的具體實(shí)施方案中，有許多優(yōu)點(diǎn)。用于分離海藻糖所需的工藝步驟數(shù)通過(guò)選擇性富集海藻糖而減少(相比較以前分離海藻糖的方法，其中經(jīng)常有多種不想要的雜質(zhì)不得不通過(guò)一步一步地除去)。相比較分步除去雜質(zhì)，副產(chǎn)品/廢棄蒸汽的量降低。海藻糖由于選擇性吸附，甚至在用硅鋁酸鹽初步富集后，就以高純度形式存在。由于減少了工藝步驟及降低了副產(chǎn)品/廢棄蒸汽的量，產(chǎn)品生產(chǎn)成本降低。此外，相當(dāng)?shù)蜐舛鹊暮Ｔ逄峭ㄟ^(guò)選擇性吸附可以進(jìn)行成本合算地有效地富集。
因而，在本發(fā)明實(shí)施方案中優(yōu)選硅鋁酸鹽，尤其為沸石，相比較溶液中存在的不需要雜質(zhì)，對(duì)海藻糖進(jìn)行選擇性吸附、優(yōu)選進(jìn)行高選擇性結(jié)合。
在海藻糖吸附到硅鋁酸鹽后，下一步，海藻糖可以由硅鋁酸鹽上洗脫。例如，使用甲醇、乙醇、水、熱水(50-100℃)、熱甲醇(50-65℃)、熱乙醇(50-80℃)或其它合適的洗脫劑，如二氯甲烷、乙腈、NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)、DMSO(二甲亞砜)、短鏈酮或短鏈醚進(jìn)行洗脫。在本文中短鏈意思是鏈長(zhǎng)至多為C10，優(yōu)選至多為C6，更優(yōu)選至多為C4。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種富集海藻糖的方法，其中使用的吸附劑用于色譜分離中。在色譜方法中，海藻糖可以通過(guò)與存在溶液中的其它物質(zhì)間不同的流出時(shí)間行為得到分離。產(chǎn)生含有海藻糖的產(chǎn)品餾分。
本發(fā)明含義上的術(shù)語(yǔ)“色譜法”包括所有已知和合適的色譜分離方法，如固定床色譜、移動(dòng)床色譜和模擬移動(dòng)床色譜。色譜分離可以間歇進(jìn)行或連續(xù)進(jìn)行。連續(xù)色譜可以例如使用Continous Rotating AnnularChromatograph(CRAC)，True Moving-Bed Chromatograph(TMBC)和Simulated Moving-Bed Chromatograph(SMB)來(lái)進(jìn)行。
從含有海藻糖的流出液中，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和合適的后續(xù)方法進(jìn)行進(jìn)一步的富集或純化。
例如，通過(guò)沉淀進(jìn)一步富集或純化海藻糖。在這一步，將希望得到的有價(jià)值材料或者雜質(zhì)沉淀出來(lái)。沉淀可以通過(guò)加入一種進(jìn)一步的溶劑、加鹽或變化溫度來(lái)起動(dòng)。最終的固體沉淀可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分離。
例如，可通過(guò)過(guò)濾分離固體，如加壓或真空過(guò)濾。也可使用濾餅過(guò)濾、深度過(guò)濾和交叉流過(guò)濾。優(yōu)選交叉流過(guò)濾。此處更優(yōu)選使用微過(guò)濾分離＞0.1μm的固體。
還可以采用沉積和/或離心分離固體?？梢允褂酶鞣N型號(hào)的儀器進(jìn)行離心，例如，管式和籃式離心機(jī)，尤其是推動(dòng)器，反向過(guò)濾離心機(jī)和盤式分離器。
可使用活性碳或離子交換劑(陰離子交換劑和/或陽(yáng)離子交換劑)進(jìn)行處理，作為進(jìn)一步富集或純化步驟。這種類型的方法可以由現(xiàn)有技術(shù)中得知(參見，如US 5,441,644，US 5,858,735和EP 0555540A1)。
進(jìn)一步的富集，尤其是純化，可使用微過(guò)濾和超濾(例如濾餅、深度和交叉流過(guò)濾)和反向滲透。這種情況下，微孔、均相、不對(duì)稱和電子荷電膜均可使用，其可通過(guò)公知的方法生產(chǎn)。通常膜的材料為纖維素酯、尼龍、聚氯乙烯、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸酯和陶瓷。
模的使用方式可以為，例如平面模、螺旋模、管簇和中空纖維模。此外，也可使用液體膜。海藻糖不僅可以被富集在進(jìn)料側(cè)并通過(guò)保留物移出，也可以在進(jìn)料側(cè)貧化并通過(guò)濾出物/滲透物移出。
為進(jìn)一步富集海藻糖，尤其是純化和最后加工，可使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。此處優(yōu)選的方法是結(jié)晶。結(jié)晶可以通過(guò)，例如冷凍、蒸發(fā)、真空結(jié)晶(絕熱冷卻)、反應(yīng)結(jié)晶和鹽析。例如可以在攪拌的和非攪拌的槽中、用直接接觸的方法、在蒸發(fā)結(jié)晶器、真空結(jié)晶器中間歇或連續(xù)地結(jié)晶，結(jié)晶器可以是例如，壓力循環(huán)結(jié)晶器(Swenson壓力循環(huán)結(jié)晶器)或流化床結(jié)晶器(Oslo型)。也可以分部結(jié)晶。
海藻糖的結(jié)晶通常是本領(lǐng)域人員人員熟悉的，并已有廣泛描述，包括從水溶液中結(jié)晶(參見US 5,441,644第4-5欄)。例如，結(jié)晶也可以通過(guò)預(yù)先的超濾實(shí)現(xiàn)。
一個(gè)特別典型的結(jié)晶海藻糖的方法是從合適的溶劑中冷卻結(jié)晶，溶劑為例如乙醇、甲醇、水、二氯乙烷、乙腈、NMP、DMSO、短鏈酮或短鏈醚。在本文中，短鏈指鏈長(zhǎng)至多為C10，優(yōu)選至多為C6，更優(yōu)選至多為C4。
另一個(gè)結(jié)晶的方法是沉淀結(jié)晶。在這種方法中，海藻糖存在于如水中，然后通過(guò)加入一種低溶解度的溶劑，如短鏈醇或短鏈酮，沉淀出來(lái)。在本文中，短鏈指鏈長(zhǎng)至多為C10，優(yōu)選至多為C6，更優(yōu)選至多為C4。
通過(guò)加入少量的海藻糖晶體可以加速結(jié)晶，海藻糖晶體作為晶種。
還存在其它的方法進(jìn)一步富集海藻糖；尤其對(duì)于純化和最后加工，其為干燥。有對(duì)流干燥的方法，例如用干燥箱、隧道式干燥器、帶形干燥器、盤式干燥器、噴射干燥器、流化床干燥器、充氣旋轉(zhuǎn)鼓干燥器的干燥方式和噴霧干燥方式。本發(fā)明優(yōu)選的方法是噴霧干燥。還可以利用接觸干燥，例如，葉片干燥器。同樣，熱輻射(紅外)和電介能(微波)也可以用于干燥。其它的方式還有真空干燥或凍干。也可以使用濃縮方式，也就是說(shuō)，干燥導(dǎo)致富集，但干燥至干不是必需的。
進(jìn)一步富集海藻糖的另一個(gè)方法，尤其是對(duì)于純化和最后加工，是納米過(guò)濾。在這種方法中，海藻糖全部或部分被保留在滯留側(cè)而富集。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯而易見的是，所述的進(jìn)一步富集步驟不僅可以在本發(fā)明的用硅鋁酸鹽處理之前進(jìn)行，也可以在其之后進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種從源自酶合成海藻糖的溶液中富集海藻糖的方法。酶法合成海藻糖是本領(lǐng)域人員公知的(例如參見Schiraldi，C.，et al.(2002)Trehalose ProductionExploiting NovelApproaches.Trends in Biotechnology，vol.20(10)，page 420-425和US5,919,668和EP 0990704A2)。
在一個(gè)實(shí)施方案中溶液是發(fā)酵肉湯。
本發(fā)明含義中，發(fā)酵肉湯是在真核和原核細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的，尤其是微生物(例如細(xì)菌、酵母或其它真菌類)。
在合成海藻糖中優(yōu)選的微生物為酵母菌(Saccharomyces spec.)，尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；芽孢桿菌(Bacillus Spec.)；念珠菌(Candida spec.)，尤其是發(fā)酵念珠菌(Candida fermentii)；大腸桿菌(Escherichia coli)；棒桿菌(Corynebacterium spec.)，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidofirum)(例如ATCC 13870)，百合棒桿菌(Corynebacterium lilium)(例如ATCC 15990)和棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melaseccola)(例如ATCC 17965)；假單胞桿菌(Pseudomonas spec.)；諾卡氏菌(Nocardia spec.)；短桿菌(Brevibacterium spec.)，尤其是Brevibacterium lactofermentum(例如ATCC 13869)，Brevibacterium fiavum(例如ATCC 14067)和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatium)(例如ATCC 21642)；節(jié)桿菌(Arthrobacter spec.)，尤其是Arthrobacter sulfureis(例如ATCC 15170)，Arthrobacter citoreus(例如ATCC 11624)；曲霉菌(Aspergillus spec.)；鏈霉菌(Streptomyces spec.)；微桿菌(Microbacterium spec.)，尤其是Microbacterium ammoniaphylum(例如ATCC 15354)；畢赤酵母(Pichiaspec.)和絲擔(dān)子菌(Filobasidium spec.)，尤其是Filobasidium fioriforme。
其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的微生物，例如參見Miyazaki，J.-I.，et al.(1996).，Trehalose acumulation by a basidiomycotinous yeast，F(xiàn)ilobasidium fioriforme.Journal of Fermentation and Bioengineering，vol.81(4)，pages 315-319。
通過(guò)突變或遺傳修飾衍生的這些菌株的變異體，或其具有增加海藻糖合成能力的變異體，也可以用于本發(fā)明中。
微生物也可以通過(guò)添加合適的抗生素進(jìn)行培養(yǎng)，例如添加一種β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素誘導(dǎo)合成海藻糖。
在這種情形中，發(fā)酵肉湯首先不僅含有細(xì)胞，而且還有培養(yǎng)基。根據(jù)發(fā)酵類型，主要部分的海藻糖可以在細(xì)胞內(nèi)部堆積。這種情況下，有利的是是消化使用的細(xì)胞，并且使用合適的方法萃取海藻糖。合適的方法例如超聲處理、清潔劑處理、堿溶解和/或醇萃取或三氯乙酸萃取(JP 07 000190，US 5,441,644)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在發(fā)酵肉湯中通常有相當(dāng)量的固體應(yīng)優(yōu)選地首先被分離除去。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“固體”也包括細(xì)胞和細(xì)胞組成物，如核酸和蛋白質(zhì)。為分離這些固體，尤其是細(xì)胞組成物，有利的是首先聚積它們?？捎酶鞣N合適的方法來(lái)進(jìn)行，然而在此種情況下應(yīng)盡可能避免海藻糖分解(例如水解)。合適的方法包括，如堿處理，例如Ca(OH)2處理，或熱處理。這種情況下，有利的是使可能存在的海藻糖活性的酶也同時(shí)失活。
固體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法除去。相關(guān)方法前面已經(jīng)提到。
本方法也適合從溶液中富集海藻糖，尤其是發(fā)酵肉湯，其中海藻糖以低濃度存在，尤其是低于15重量％，根據(jù)發(fā)酵肉湯的干重測(cè)定。
通常，海藻糖的濃度根據(jù)發(fā)酵肉湯的干重測(cè)量為3-8重量％。在分離其它有價(jià)值的產(chǎn)品(如賴氨酸)后，海藻糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以增加到10-20重量％，根據(jù)剩余發(fā)酵肉湯的干重測(cè)定。如果在初始階段也對(duì)作為不溶組分的生物量進(jìn)行分離，則海藻糖的濃度達(dá)到20-40重量％，根據(jù)發(fā)酵肉湯的干重測(cè)定。
因而，本發(fā)明的另一種實(shí)施方案也是一種從發(fā)酵肉湯中富集海藻糖的方法，其中海藻糖的濃度至少低于15重量％，根據(jù)發(fā)酵肉湯的干重測(cè)定。
在許多發(fā)酵中，有多種有價(jià)值產(chǎn)品產(chǎn)生。經(jīng)常地，海藻糖也作為另一種有價(jià)值的產(chǎn)品同時(shí)產(chǎn)生。問(wèn)題是，用于發(fā)酵產(chǎn)生的物質(zhì)的富集或純化方法，要特定適合每一個(gè)有價(jià)值產(chǎn)品本身(例如在氨基酸或有機(jī)酸的情況下是通過(guò)離子交換色譜純化)。在富集第一價(jià)值產(chǎn)品后，其它價(jià)值產(chǎn)品，如海藻糖，實(shí)際上存在于阻礙富集其它有價(jià)值產(chǎn)品的環(huán)境中(例如從離子交換材料上洗脫氨基酸后的高離子濃度)。這在海藻糖中尤其是一個(gè)問(wèn)題，由于海藻糖不具備適合簡(jiǎn)單富集的特別化學(xué)性質(zhì)(例如在水溶液中低溶解性或電荷)。因此，海藻糖常常與發(fā)酵的廢物流一起被丟棄。
因此本發(fā)明的另一個(gè)目的是從發(fā)酵肉湯中提取海藻糖作為進(jìn)一步有價(jià)值的產(chǎn)品，其中第一有價(jià)值產(chǎn)品已經(jīng)被或提前或隨后提取。
本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案涉及一種從發(fā)酵肉湯中富集進(jìn)一步有價(jià)值產(chǎn)品海藻糖的方法，從中已經(jīng)或得到了至少一種第一有價(jià)值產(chǎn)品，該方法包括分離固體和使用吸附劑富集海藻糖的步驟，其中吸附劑是硅鋁酸鹽。
本方法的不同之處在于，其特別能容忍存在海藻糖的溶液的性能。因而，當(dāng)海藻糖存在于通常阻礙其富集的環(huán)境中時(shí)，本發(fā)明的方法也可以使用。
不同的是，本發(fā)明對(duì)存在海藻糖的溶液的處理特別溫和，使得其它有價(jià)值的產(chǎn)品即使在富集海藻糖之后也可以獲得。
因而，海藻糖可以在得到第一有價(jià)值產(chǎn)品之前、之后或同時(shí)間得到。
在本發(fā)明的含義之內(nèi)，有價(jià)值的產(chǎn)品包括例如有機(jī)酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸，核苷和核苷酸、脂質(zhì)和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、維生素和輔助因子，儲(chǔ)藏物質(zhì)，例如PHA(聚羥基烷酸酯)或PHB(聚羥基丁酸酯)，和蛋白質(zhì)與多肽(例如酶)。
本發(fā)明中優(yōu)選的第一有價(jià)值產(chǎn)品為氨基酸賴氨酸。
此外，在本說(shuō)明書或?qū)嵤├忻枋龅姆椒ㄖ斜景l(fā)明涉及使用硅鋁酸鹽，尤其是沸石。
在示例性的實(shí)施方案中，描述了適合從發(fā)酵肉湯中純化海藻糖的方法，其中另一種有價(jià)值的產(chǎn)品已預(yù)先得到。
附圖和實(shí)施例用于更進(jìn)一步詳細(xì)解釋本發(fā)明。


如下圖1顯示沸石對(duì)于蔗糖(sac)和麥芽糖(malt)相對(duì)于海藻糖(tre)的選擇性。
圖2顯示選擇的沸石孔尺寸對(duì)于蔗糖(sac)和麥芽糖(malt)相對(duì)于海藻糖(tre)的選擇性。
孔尺寸的測(cè)量用空間填充的原子中心球體來(lái)表示原子的范德華體積，如MSI Program Materials Studio定義的，球的半徑與范德華半徑一致。在沸石孔中施用0.9的膨脹系數(shù)到該原子的范德華半徑之上，并且一個(gè)氦原子隨后放入孔的中心。氦的范德華半徑膨脹系數(shù)用手最優(yōu)化，直到氦原子的膨脹空間填充體積接觸到沸石孔的空間填充體積。氦的膨脹系數(shù)用作孔(孔尺寸)的膨脹系數(shù)。
圖3顯示對(duì)碳?xì)浠衔锵鄬?duì)于選擇的沸石的孔尺寸的選擇性。
實(shí)施例1為了定量比較在各種沸石中糖的擴(kuò)散性，進(jìn)行了理論計(jì)算。這樣，沿?cái)U(kuò)散坐標(biāo)上進(jìn)行傳統(tǒng)的動(dòng)態(tài)分子模擬。擴(kuò)散坐標(biāo)通過(guò)應(yīng)用于沿最大孔或最寬通道的軸向上的小驅(qū)動(dòng)力測(cè)定。這模擬了一種濃度梯度的效果。
研究首先做的是該模擬是否定性地得到正確結(jié)果。為了這樣的目的，計(jì)算麥芽糖和蔗糖在FAU和BEA中的擴(kuò)散時(shí)間，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較。根據(jù)計(jì)算，通過(guò)FAU時(shí)，麥芽糖的擴(kuò)散明顯較海藻糖和蔗糖慢(見表1)。這與麥芽糖較蔗糖具有明顯較低吸附能力的試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。
對(duì)于BEA，在使用的時(shí)間刻度內(nèi)，計(jì)算的結(jié)果是，蔗糖沒有通過(guò)沸石遷移(見表2)。這種結(jié)果(不吸附)是實(shí)驗(yàn)測(cè)量的其它1-2Fru二糖的一般特性。從BEA和FAU的結(jié)果來(lái)看，得到的結(jié)論是，對(duì)于FAU和BEA中麥芽糖和蔗糖的相對(duì)“溶解性”，該計(jì)算定性地得到正確預(yù)測(cè)。
首先排列了一系列用于分離海藻糖、麥芽糖和蔗糖的合適沸石的候選物質(zhì)(見表1)。
表1

使用這些沸石對(duì)所有3種糖進(jìn)行動(dòng)態(tài)分子模擬。在這種方法中，關(guān)于通過(guò)相應(yīng)通道擴(kuò)散的糖的相對(duì)選擇性，可以被計(jì)算得出。
動(dòng)態(tài)分子力場(chǎng)模擬在微正則系綜、298K下操作。分子通過(guò)靜電力驅(qū)使，通過(guò)沸石結(jié)構(gòu)中的孔的相對(duì)時(shí)間被測(cè)定。靜電力通過(guò)帶電氦原子固定在分子孔的相對(duì)側(cè)面的方法來(lái)形成，分子被每一個(gè)原子上的相應(yīng)相反電荷均一地帶電。例如，當(dāng)氦原子具有電荷為+1.5q時(shí)，最接近氦原子的海藻糖的5個(gè)原子，每一個(gè)設(shè)定電荷為-0.3q。系統(tǒng)上其它保留的原子為非荷電。表1中的選擇性根據(jù)下列公式計(jì)算選擇性＝t海藻糖/t食糖，此處當(dāng)t食糖＞8000ps，t食糖＝8000ps，計(jì)算的食糖擴(kuò)散時(shí)間被列在表2中。
表2

圖1中的曲線代表選擇性。從圖1中可以清楚看出，每一種沸石有不同從糖混合物中分離出海藻糖的能力。最通用的是不含鋁的OFF(鉀沸石)，相對(duì)于其它兩種糖，明顯的優(yōu)選海藻糖。FAU和BEA同樣地顯示對(duì)海藻糖相對(duì)高的選擇性，同時(shí)對(duì)蔗糖和麥芽糖一定的選擇性。
實(shí)施例2氫氧化鈣沉淀，離心，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖1L賴氨酸發(fā)酵肉湯，在賴氨酸已經(jīng)被離子交換劑分離除去后，加入250g固體氫氧化鈣混合。懸浮液攪拌4小時(shí)后，3000g懸浮液被實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)離心10min。結(jié)果，從深褐色的發(fā)酵肉湯中得到800mL黃色的上清液，該上清液含有初始使用的8g海藻糖中的7.6g。加入400g的活性碳粉末，進(jìn)一步純化此上清液。在室溫保溫12小時(shí)后，活性碳被過(guò)濾分離出去。得到650mL的淡黃色濾液，其中總共含有6.3g海藻糖。最后，凍干濾液。9.7g殘留物中含有海藻糖64.9重量％。
實(shí)施例3氫氧化鈣沉淀，過(guò)濾，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖相比較實(shí)施例2，在氫氧化鈣沉淀后，形成的固體通過(guò)過(guò)濾分離。產(chǎn)生730mL的黃色濾液。進(jìn)一步的工藝操作與實(shí)施例2類似，結(jié)果得到8.7g干的殘留物，海藻糖含量為66.2重量％。
實(shí)施例4通過(guò)熱誘導(dǎo)沉淀，交叉過(guò)濾，活性碳處理，干燥殘留物，富集海藻糖實(shí)施例5氫氧化鈣沉淀，活性碳處理后離心，干燥殘留物，富集海藻糖1L賴氨酸發(fā)酵肉湯，在賴氨酸被離子交換劑分離后(海藻糖含量11g/L)，加入250g固體氫氧化鈣混合。懸浮液攪拌4小時(shí)后，3000g懸浮液被實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)離心10min。20g活性碳加入到所獲得的800mL深褐色上清液中，并且混合物在室溫保溫19小時(shí)?；钚蕴急贿^(guò)濾分離出去。濾液含8.9g海藻糖。真空濃縮，得到72.6g黑褐色粘稠殘留物，海藻糖含量為10.4重量％。
實(shí)施例6活性碳吸附、甲醇解吸富集海藻糖100mL含有海藻糖的發(fā)酵肉湯(含量9.76g/L)與10g活性碳(CPG12x40)一起在室溫下振搖16小時(shí)。在混合物通過(guò)短頸抽吸過(guò)濾器過(guò)濾后，活性碳與100mL甲醇在室溫下振搖60小時(shí)。再次過(guò)濾后，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干。1.1g褐色殘留物含有300mg海藻糖(27重量％)。
實(shí)施例7活性碳吸附、乙醇解吸、冷凍結(jié)晶富集海藻糖300mL海藻糖溶液(含量9.25g/L)與20g活性碳一起在室溫下振搖18小時(shí)?；旌衔锿ㄟ^(guò)短頸抽吸過(guò)濾器過(guò)濾后，活性碳與300mL乙醇混合并攪拌回流15小時(shí)。熱過(guò)濾活性碳，濾液冷凍至0-5℃，結(jié)晶出海藻糖。混合物抽濾后，得到1.3g淺灰色海藻糖結(jié)晶。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干，得到0.1g無(wú)色海藻糖晶體。
過(guò)濾之后，該活性炭與300mLMeOH在室溫下振搖16小時(shí)，過(guò)濾和濾出之后，該濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，結(jié)果進(jìn)一步得到0.5g基本上白色的海藻糖晶體。
實(shí)施例8硅膠吸附、甲醇解吸富集海藻糖100mL含有海藻糖的發(fā)酵肉湯(含量14g/L)與10g硅膠(MR3482)一起在室溫下振搖19小時(shí)?；旌衔锿ㄟ^(guò)玻璃抽濾瓶抽濾后，硅膠與100mL甲醇在室溫下振搖16小時(shí)。再次過(guò)濾后，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干。1.5g褐色殘留物含有110mg海藻糖(7重量％)。
權(quán)利要求
1.一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中富集通過(guò)使用一種吸附劑進(jìn)行，其中包括使用硅鋁酸鹽作為吸附劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的硅鋁酸鹽是沸石。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中海藻糖被硅鋁酸鹽吸附。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中沸石選自FAU、BEA、DON、EMT、CFI、MOR、MAZ和OFF。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中在色譜法中使用吸附劑。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中溶液源自酶法海藻糖合成。
7.一種由發(fā)酵肉湯中富集海藻糖的方法，包括分離固體和使用吸附劑富集海藻糖的步驟，其中使用硅鋁酸鹽作為吸附劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中硅鋁酸鹽是一種沸石。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中除海藻糖外，至少還有另一種有價(jià)值的產(chǎn)品從發(fā)酵肉湯中分離出。
10.如權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的方法，其中發(fā)酵肉湯源自至少一種選自下組的微生物發(fā)酵酵母菌(Saccharomyces spec.)，念珠菌(Candidaspec.)，大腸桿菌(Escherichia coli)；棒桿菌(Corynebacterium spec.)，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，假單胞桿菌(Pseudomonasspec.)，諾卡氏菌(Nocardia spec.)，短桿菌(Brevibacterium spec.)，節(jié)桿菌(Arthrobacter spec.)，鏈霉菌(Streptomyces spec.)；微桿菌(Microbacterium spec.)，曲霉菌(Aspergillus spec.)，芽孢桿菌(BacillusSpec.)，畢赤酵母(Pichia spec.)和絲擔(dān)子菌(Filobasidium spec.)。
11.如權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的方法，其中海藻糖以低于15％重量的濃度存在于發(fā)酵肉湯中，以發(fā)酵肉湯的干重測(cè)定。
12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法包括至少一個(gè)選自活性碳處理、超濾和離子交換劑處理的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從溶液中富集海藻糖的方法，其中富集使用一種吸附劑進(jìn)行，吸附劑為硅鋁酸鹽。優(yōu)選的硅鋁酸鹽為沸石。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由發(fā)酵肉湯中富集和純化海藻糖的方法，特別是作為發(fā)酵生產(chǎn)其它有價(jià)值產(chǎn)品的關(guān)聯(lián)產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07H3/00GK1696139SQ20051006562
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者M·博伊, M·蓬佩尤斯, D·克萊因, M·弗爾克特, J·R·布朗 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司