專利名稱：嘌呤衍生物異構(gòu)體,其制備方法及含有它的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嘌呤衍生物異構(gòu)體，其制備方法，含有這些化合物的藥物組合物及用于治療人乙型肝炎病毒感染和/或并發(fā)感染的用途。
背景技術(shù)：
專利號為5206244的美國專利，描述了含有式(I)的化合物及其抗病毒特別是抗乙肝病毒的活性，公開號為1310999的中國專利申請，描述了含有低劑量式(I)化合物的藥物組合物。
式(I)化合物在室溫水溶液和中性生理緩沖溶液中的溶解度小于2.5毫克/毫升，屬于難溶性化合物。難溶性化合物由于溶解度低，通常會增加藥物制劑的難度，影響藥物活性化合物的快速釋放，及其它制劑或非口服制劑的制備，例如在固體口服制劑中。因此提高難溶性藥物的溶解度。對于更好發(fā)揮難溶性藥物藥效，擴(kuò)展難溶性藥物劑型，降低藥物制劑的成本具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找具有優(yōu)良水溶性和固體穩(wěn)定性的新結(jié)構(gòu)嘌呤衍生物異構(gòu)體及其鹽，以便于工業(yè)化大量、方便和有效的制備其口服制劑。
采用藥物分子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法對式(I)化合物進(jìn)行計(jì)算分析，發(fā)明人出乎意外的發(fā)現(xiàn)式(I)化合物在堿性條件下存在互變異構(gòu)，其互變異構(gòu)體為式(II)的化合物。
體現(xiàn)化合物穩(wěn)定性的熱晗(ΔH)計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，式(II)化合物比式(I)化合物在熱力學(xué)上穩(wěn)定12.53千焦·摩爾-1。計(jì)算實(shí)驗(yàn)還表明式(II)化合物酚羥基上氧的電荷密度為-0.60，氫的電荷密度為+0.43，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示式(II)化合物的酚羥基呈弱酸性，可以與適宜的堿性陽離子加成形成堿式鹽。
因此，本發(fā)明提供一類具有新結(jié)構(gòu)通式(III)的化合物
其中M+表示藥學(xué)上可接受的堿基陽離子，n為1或2；優(yōu)選的堿基陽離子為堿金屬陽離子、堿土金屬陽離子或銨和取代的銨陽離子；優(yōu)選的堿基陽離子為Na+，K+，NH4+或NH2R1R2+，R1或R2獨(dú)立地選自氫或含1-2個碳原子的低級烷基；根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的式(III)化合物為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉；或[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鉀。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明式(III)化合物也包括其適宜的藥學(xué)上可接受的溶劑化物和/或水合物。
進(jìn)一步講，現(xiàn)已出乎意料地發(fā)現(xiàn)式(III)化合物具有優(yōu)異的固體穩(wěn)定性，與式(I)的化合物相比，在同樣條件下具有顯著增強(qiáng)的溶解度，同時顯示出顯著的抗乙肝病毒活性。例如，在室溫水溶液和中性生理緩沖溶液中式(III)化合物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的溶解度大于152毫克/毫升，在同樣條件下式(I)化合物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-6H-嘌呤-6-酮的溶解度為2.4毫克/毫升，溶解度顯著提高60倍。式(III)化合物優(yōu)異的固體穩(wěn)定性和顯著提高的水溶解度，為該類化合物提供了良好可藥用特性，從而方便其大量而有效地制備各種口服制劑和/或其它制劑。
式(III)化合物是式(I)化合物異構(gòu)化為式(II)化合物所形成的堿加成的鹽，本發(fā)明涉及此鹽的所有形式，特別是式(II)化合物酚羥基上的酸性氫解離后與堿締合形成的堿加成鹽。
另外，本發(fā)明還提供了式(III)化合物和/或其藥物上可接受的溶劑化物和/或其水合物的制備方法。式(I)化合物可根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法制備(Bisacchi.，et al.Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters，Vol7，No2，pp127-132，1997)。式(I)化合物與陽離子M+源之間的反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行，例如，在溶劑中通常為C1-6低級烷醇溶劑如甲醇中進(jìn)行，于可提供生成所需化合物的適宜速率的任意溫度下，通常于室溫下，較適宜地以稍過量如1.1∶1～1.2∶1摩爾比但優(yōu)選用約等摩爾量的陽離子M+源的情況下將式(I)化合物與陽離子M+源反應(yīng)，然后結(jié)晶出所需的產(chǎn)物。式(III)化合物的藥學(xué)上可接受的溶劑化物和/或其水合物可以用通常的化學(xué)方法制備。
適宜的陽離子M+源是公知的在商業(yè)上可獲得的，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀，或者可以根據(jù)已知方法制備所需的陽離子M+源。
通式(III)化合物的結(jié)構(gòu)確證，可以通過核磁共振波譜，質(zhì)譜，紫外光譜和紅外光譜確定，特別是可以通過紅外光譜和質(zhì)譜予以明確指證。例如，紅外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，式(I)化合物嘌呤環(huán)上的6-酮基顯示出典型的羰基特征振動吸收峰1689.2cm-1，在式(III)化合物中該吸收峰則消失，圖1和圖2分別給出了式(I)和式(III)化合物中[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的紅外光譜圖。式(III)化合物中[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的質(zhì)譜出現(xiàn)典型的分子離子加鈉的質(zhì)譜峰MS m/e300.1{[M+Na]+，100}，式(III)化合物中[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鉀的質(zhì)譜出現(xiàn)典型的分子離子加鉀的質(zhì)譜峰MS m/e316.2{[M+K]+，100}，圖3和圖4分別為其質(zhì)譜圖。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證，在堿性條件下，式(I)的化合物可以異構(gòu)化為式(III)的化合物。


圖1為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-6H-嘌呤-6-酮的紅外光譜圖2為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的紅外光譜圖3為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的質(zhì)譜圖4為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鉀的質(zhì)譜根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明化合物的溶解度可以用標(biāo)準(zhǔn)的溶解度測定方法測定，例如，在室溫25±0.5攝氏度飽和水溶液中，式(III)化合物中鈉鹽的溶解度為152毫克/毫升，式(III)化合物中鉀鹽的溶解度為180毫克/毫升，在同樣條件下，式(I)化合物的溶解度為2.4毫克/毫升。因此，式(III)化合物與式(I)化合物相比在水溶液和中性生理緩沖溶液中具有顯著提高的溶解度，這一性質(zhì)為式(III)化合物的可藥用特性，如在制劑中的快速溶出而發(fā)揮藥效，或其可生物利用度，大量使用和有效制備式III化合物的口服制劑提供了優(yōu)勢。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明式(III)化合物具有良好的穩(wěn)定性且該穩(wěn)定性可以用常規(guī)的定量分析方法測定，例如式(III)化合物穩(wěn)定性可以用加速穩(wěn)定性試驗(yàn)來測定，如在40攝氏度，75％相對濕度；40攝氏度，92.5％相對濕度；及80攝氏度，測定式(III)化合物的穩(wěn)定性。分析可以用高效液相色譜，薄層色譜，差示掃描量熱法，熱解重量分析法和升溫下的等溫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，試驗(yàn)化合物的定量分析是在儲藏期之前，儲藏期之間和儲藏期之后取樣進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了用于治療乙型肝炎和/或并發(fā)感染的式(III)化合物和/或其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物。
本發(fā)明還涉及含有式(III)化合物和/或其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物和藥物上可接受的載體的藥物組合物。該藥物組合物可以經(jīng)多種途徑施用，例如口服片劑，膠囊，粉劑，口服液，注射劑和透皮制劑。根據(jù)常規(guī)的藥物上的慣例，藥學(xué)上可接受的載體包括稀釋劑、填充劑、崩解劑、潤濕劑、潤滑劑、著色劑、調(diào)味劑或其它常規(guī)添加劑。
典型的藥學(xué)上可接受的載體包括例如微晶纖維素、淀粉、交連聚維酮、聚維酮、聚乙烯吡硌烷酮、十二烷基磺酸鈉或硬脂酸鎂。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成單位劑型。此單位劑型通常含有0.001-50mg，優(yōu)選0.01-10mg，更優(yōu)選0.05-1mg的式(III)化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療人乙型肝炎病毒感染和/或并發(fā)感染藥物的方法，此方法包括給需要治療的乙型肝炎病毒感染和/或并發(fā)感染者施用治療有效劑量的式(III)化合物和/或其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物的藥物組合物，該組合物每日給藥一次，藥物組合物優(yōu)選含有0.1-1mg，更優(yōu)選0.5mg的式(III)化合物。本發(fā)明的藥物組合物可每日給藥一次用于治療成人患者的乙型肝炎病毒感染和/或并發(fā)感染。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但對本發(fā)明沒有任何限制作用。
實(shí)施例1穩(wěn)定性的熱晗(ΔH)實(shí)驗(yàn)采用高斯98程序(美國，Gaussian公司)，在神威新世紀(jì)-128P計(jì)算機(jī)上，用B3IYP/6-31G*基組在堿性條件下，對A和B兩個互變異構(gòu)體進(jìn)行全坐標(biāo)幾何構(gòu)型優(yōu)化，自洽場(SCF)梯度優(yōu)化收斂到小于0.001后，對標(biāo)志互變異構(gòu)體穩(wěn)定性的熱晗(ΔH)，互變異構(gòu)體關(guān)鍵原子上的電荷密度進(jìn)行分析，結(jié)果如下。
互變異構(gòu)體的晗變ΔH＝EB-EA＝-12.53千焦·摩爾-1，表明互變異構(gòu)體B比互變異構(gòu)體A在同樣條件下能量低12.53千焦·摩爾-1，互變異構(gòu)體A向互變異構(gòu)體B轉(zhuǎn)化會放出12.53千焦·摩爾-1的能量。
關(guān)鍵原子的電荷密度(圖中用“*”標(biāo)記的原子)


異構(gòu)體A

異構(gòu)體B實(shí)施例2[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉將2.77克(0.01mol)[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-6H-嘌呤-6-酮置于500ml圓底燒瓶中，加入150ml甲醇使固體溶解，過濾。向上述濾液加入等摩爾量的氫氧化鈉甲醇溶液(0.40克氫氧化鈉，0.01mol，溶解于25ml甲醇中)，攪拌，使溶液均勻，減壓旋去絕大部分甲醇，然后加入180ml丙酮，放置結(jié)晶，抽慮，用少量丙酮洗滌固體，40℃真空干燥，得標(biāo)題化合物2.73克，收率92％。IRνcm-1(KBr)3464.7，3383.2，3191.7，1616.8，1575.4，1527.6，1477.2，1412.7，1339.2，1015.8，610。1HNMR(400MHz，CD3OD)δppm7.58(s，1H)，5.45～5.41(t，1H)，5.21(s，1H)，4.78(s，1H)，4.38(d，1H)，3.86～3.78(m，2H)，3.33(s，1H)，2.67(br，1H)，2.43～2.36(m，1H)，2.22～2.09(m，1H)。13CNMR(400MHz，CD3OD)δppm169.15，161.47，151.67，151.31，136.37，119.18，111.13，73.16，64.78，57.29，54.81，47.86。MS m/e300.1{[M+Na]+，100}，278.1，268.1，252.1，199.0，176.0，160.0，146.0。
實(shí)施例3[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鉀將2.77克(0.01mol)[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-6H-嘌呤-6-酮置于500ml圓底燒瓶中，加入150ml甲醇使固體溶解，過濾。向上述濾液加入等摩爾量的氫氧化鉀甲醇溶液(0.56克氫氧化鉀，0.01mol，溶解于25ml甲醇中)，攪拌，使溶液均勻，減壓旋去絕大部分甲醇，然后加入180ml丙酮，放置結(jié)晶，抽慮，用少量丙酮洗滌固體，40℃真空干燥，得標(biāo)題化合物2.94克，收率93.2％。IRνcm-1(KBr)3463.5，3384.5，3191.6，1614.2，1573.6，1526.8，1479.2，1411.7，1340.3，1012.5，642。1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δppm7.41(s，1H)，5.79(br，2H)，5.35～5.33(t，2H)，5.08(s，1H)，4.57(s，1H)，4.25(s，1H)，3.59～3.56(t，2H)，2.53(s，1H)，2.29～2.23(m，1H)，2.09～1.99(m，1H)。13CNMR(600MHz，DMSO-d6)δppm155.14，149.43，148.70，116.64，60.00，58.49，52.44，48.90。MS m/e316.2[M+K]+，289.2，192.0(100)，70.0。
實(shí)施例4 -2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的穩(wěn)定性將化合物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉樣品放入60攝氏度烘箱，分別在第0，15，45天取樣進(jìn)行定量分析，檢測采用美國HP1100高效液相色譜儀，色譜柱為YMC-Pack ODS-A 3μ4.6×150mm，流動相為0.01M KH2PO4∶乙腈等于94.5∶5.5，流速1ml/min，檢測波長為254nm，所有樣品以面積歸一化法計(jì)算含量，檢測結(jié)果顯示，所有樣品含量均大于99％，降解產(chǎn)物沒有超過1％，樣品在加速實(shí)驗(yàn)下穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例5[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的吸濕穩(wěn)定性將化合物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉樣品分別放入恒溫40攝氏度，置有飽和KNO3溶液(相對濕度92.5％)和飽和NaCl溶液(相對濕度75％)的干燥器中，分別在第0，15，30天取樣，檢測采用美國HP1100高效液相色譜儀，色譜柱為YMC-Pack ODS-A 3μ4.6×150mm，流動相為0.01M KH2PO4∶乙腈等于94.5∶5.5，流速1ml/min，檢測波長為254nm，所有樣品以面積歸一化法計(jì)算含量，檢測結(jié)果顯示，所有樣品含量均大于99％，降解產(chǎn)物沒有超過1％，樣品在高濕條件下穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例6[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉的生物活性乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2)的2.2.15細(xì)胞系(美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心)，細(xì)胞培養(yǎng)液含10％胎牛血清，3％L-谷氨酰胺，380μg/ml的G418，50U/ml的卡那霉素，放射性同位素32P dCTP(比活度111TBq/nmol)購自亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司，探針標(biāo)記引物試劑盒購自Promerga公司，酶標(biāo)儀為BIO-RAO3550型。將HepG22.2.15細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)版，每孔1ml培養(yǎng)液接種10萬個細(xì)胞，于37攝氏度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24小時，藥物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉用細(xì)胞培養(yǎng)液溶解，梯度稀釋到20nM，10nM，5nM，1nM和0.5nM，每濃度3孔，設(shè)3孔無藥物細(xì)胞對照組，于37攝氏度，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每4天更換原濃度藥液，第8天時收獲培養(yǎng)基中的細(xì)胞上清液，按分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法提取其HBV DNA，各樣品斑點(diǎn)雜交，放射自顯影，測定每個雜交點(diǎn)的值，計(jì)算抑制率，根據(jù)抑制率曲線計(jì)算出半數(shù)有效劑量EC50值約為3nM。表明藥物[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉可顯著抑制HBV DNA的復(fù)制。
權(quán)利要求
1.式(III)化合物，其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物， 其中M+表示藥學(xué)上可接受的堿基陽離子，n為1或2。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中堿基陽離子M+為堿金屬陽離子、堿土金屬陽離子或銨或取代的銨陽離子。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中堿基陽離子M+為Na+，K+，NH4+或NH2R1R2+，R1或R2獨(dú)立地選自氫或含1-2個碳原子的低級烷基。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中式III化合物為為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鈉，其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物。
5.權(quán)利要求3的化合物，其中式III化合物為為[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-嘌呤-6-酚鉀包括其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物。
6.含有權(quán)利要求1-5任一要求的式(III)化合物，其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物及藥用載體的藥物組合物。
7.一種制備權(quán)利要求1-5任一化合物的方法，該方法包括以甲醇為溶劑，在室溫下，以等摩爾量的適當(dāng)?shù)膲A為M+堿基陽離子源與[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氫-9-[4-羥基-3-(羥甲基)-2-亞甲基環(huán)戊基]-6H-嘌呤-6-酮反應(yīng)，然后結(jié)晶出式III化合物，如果需要，將所得到式III化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌幱萌軇┗锘蛩衔铩?br> 8.權(quán)利要求7的方法，其中堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
9.制備權(quán)利要求1-5任一化合物作為其活性成分的藥物組合物的方法，該方法包括將有效量的活性成分與藥用載體相混合。
10.權(quán)利要求1-5任一要求的化合物在制備用于治療人乙型肝炎病毒感染和/或并發(fā)感染藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(III)新的嘌呤衍生物異構(gòu)體，包括其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物，其中M
文檔編號C07D473/18GK1699364SQ200510073399
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者李志兵 申請人:北京市典范科技有限責(zé)任公司