專利名稱：用于控制生物膜的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制生物膜的化合物、組合物和方法，即，分裂生物膜、阻止生物膜的形成、加強生物膜或修改生物膜。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所使用的設(shè)備和篩選用于生物膜控制的試驗化合物的方法。
背景技術(shù)：
生物膜是微生物的粘性群落，所述微生物如生長在各種表面上的細菌、原始細菌、真菌、霉菌、藻類或原生動物或其混合物(參見Nature，第408卷，第284-286頁，2000年11月16日)。當微生物將自己安置在宿主表面并激活參與產(chǎn)生包括多糖的基質(zhì)的基因時，就會形成生物膜。該基質(zhì)可為生物膜細菌提供保護，使其免受生物殺滅劑的侵害。
被稱作密度感應(yīng)信號的分子幫助引發(fā)和協(xié)調(diào)形成生物膜的部分過程。細菌不斷地分泌低含量的信號，并通過其表面或內(nèi)部的受體感應(yīng)這些信號。當細菌足夠多使得該些信號的濃度達到臨界閾值時，該受體會引發(fā)行為變化。一旦該現(xiàn)象發(fā)生，細菌就會作出反應(yīng)，采取共同行為如形成生物膜，和在細菌為病原菌時使用毒性因子如毒素。細菌除了與其同類成員通信外，還進行類間通信，因此生物膜可包含不止一種細菌。
生物膜常常是不受歡迎的。例如，生物膜可通過覆蓋設(shè)備如冷卻系統(tǒng)或水產(chǎn)業(yè)設(shè)備而造成損害。生物膜還有害于健康。例如，許多在醫(yī)院獲得的傳染病與生物膜有關(guān)，其可污染植入體和導(dǎo)管。牙線是生物膜形成的主要候選場所。生物膜還可導(dǎo)致從囊腫性纖維化病人的肺部傳染病到齬齒病等多種疾病。
然而，生物膜也可以是有益的。例如，生物膜可用于用作生產(chǎn)藥品的生物反應(yīng)器中，生物膜還是污水和其它水處理系統(tǒng)的組分。
一種阻止或分解生物膜的方法是干擾密度感應(yīng)信號。已研制出一些化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)能干擾信號合成或同密度感應(yīng)信號受體結(jié)合而不會激活該受體。還研制出了能降解信號的酶。某些密度感應(yīng)信號典型具有酰化高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)系。據(jù)報道，WO 00/06177提供了用于識別自動誘導(dǎo)物合成反應(yīng)調(diào)節(jié)物的方法，該調(diào)節(jié)物能促進或抑制高絲氨酸內(nèi)酯的生成。據(jù)報道，WO00/32152提供了細菌發(fā)送信號因子4，5-二羥基-2，3-戊二酮，其中該因子幫助誘導(dǎo)發(fā)光基因的表達。
現(xiàn)需識別調(diào)節(jié)生物膜的形成和生長的試劑，以及用于檢測該形成和生長的方法和設(shè)備。本發(fā)明解決了這些問題，并提供調(diào)節(jié)該過程的氮雜環(huán)分子和用于檢測該調(diào)節(jié)的方法和設(shè)備。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于控制生物膜的化合物、組合物和方法?！翱刂啤鄙锬な侵阜至焉锬ず?或阻止生物膜的形成，加強生物膜的形成和/或生長，或修改生物膜。本發(fā)明還涉及用于確定化合物對生物膜的作用的測定和方法。本發(fā)明還提供了用于測試基質(zhì)表面生物膜控制的裝置。
所有引用文獻的相關(guān)部分均引入本文以供參考；任何文獻的引用并不是對其為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認可。
附圖概述

圖1為如測定參考實施例4中所描述的塑性試管基生物膜生長和檢測方法的側(cè)橫截面視圖。
圖2a為如測定參考實施例5所描述的生長室陣列基生物膜生長和檢測方法的一個實施方案的側(cè)橫截面視圖。
圖2b為如測定參考實施例6所描述的生長室陣列基生物膜生長和檢測方法的一個可選實施方案的側(cè)橫截面視圖。
圖3為如測定參考實施例5和6所描述的生長室陣列基生物膜生長和檢測方法的兩個蓋中之一的頂視圖。
圖4為如測定參考實施例5和6所描述的生長室陣列基生物膜生長和檢測方法的中間部件的頂視圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于控制基質(zhì)表面上生物膜的化合物和方法。本發(fā)明還提供了篩選試驗化合物在控制生物膜方面的活性的方法和用于檢測基質(zhì)表面上生物膜控制的裝置。“生物膜”是指微生物的粘性群落，這些微生物如能生長在各種基質(zhì)上的細菌、原始細菌、真菌、霉菌、藻類或原生動物。生物膜可包括一種或多種微生物。“基質(zhì)”是指任何生物膜可在其上形成或已經(jīng)形成表面?；|(zhì)包括但不限于硬的或軟的表面如聚合物、塑料、管形材料、陶瓷、金屬物、玻璃、羥基磷灰石、皮膚、骨或組織。
“控制生物膜”在本發(fā)明中是指分裂生物膜和/或阻止生物膜的形成，加強生物膜的形成和/或生長，或修改生物膜。本發(fā)明提供了用于控制生物膜的具有結(jié)構(gòu)A或結(jié)構(gòu)B的氮雜環(huán)化合物，或其組合、其鹽、或其立體異構(gòu)體?？刂苹|(zhì)上的生物膜的方法包括用具有如本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)A或結(jié)構(gòu)B的化合物接觸該基質(zhì)，接觸的時間充分長以控制基質(zhì)上的生物膜。
結(jié)構(gòu)A 對于用于控制生物膜的具有結(jié)構(gòu)A的化合物，n是1至4，R是H、烷基、?；蛲檠豸驶?。此外，當n是1時，R1和R2獨立地是H、C6-C20烷基或鏈烯基；其中當R是H時，R1和R2其中之一不是H。當n是2時，R1和R2獨立地是H、C4-C20烷基或鏈烯基；其中當R是H時，R1和R2其中之一不是H。當n是3時，R1和R2獨立地是H、C5-C20烷基或鏈烯基；其中當R是H時，R1和R2其中之一不是H。當n是4時，R1和R2獨立地是H、C1-C20烷基或C2-C20鏈烯基。
結(jié)構(gòu)B 對于用于控制生物膜的具有結(jié)構(gòu)B的化合物，n和m獨立地是1、2、3或4；X是C1-C20烷基或C2-C20鏈烯基；R1和R4獨立地是H、烷基、?；蛲檠豸驶襌2和R3獨立地是H或烷基；前提條件是當n和m是2時，X是C8-C20烷基或C8-C20鏈烯基。本發(fā)明者認識到本發(fā)明所提供的氮雜環(huán)化合物的鹽、立體異構(gòu)體或組合可用于控制生物膜。
本發(fā)明還提供了如下文所述的具有結(jié)構(gòu)A或結(jié)構(gòu)B的新化合物、或其鹽或其立體異構(gòu)體、或其組合物。本發(fā)明的實施方案提供了具有結(jié)構(gòu)A的化合物，當n是1時，R是H、烷基、?；蛲檠豸驶?；且R1和R2獨立地是H、C6-C20烷基或鏈烯基；且其中當R是H時，R1和R2其中之一不是H。這些化合物如本發(fā)明的合成實施例1至3中所示合成。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合成具有相關(guān)取代基的化合物。如實施例2中使用適當?shù)逆溝┗反鎛-癸胺可制備R1和R2獨立地是鏈烯基的化合物。如在實施例2中使用適當?shù)?-烷基-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸可制備R是烷基的化合物，Cromwell等人在J.Heterocyclic Chem.(1968)，5(2)，309-311中描述了該酸的合成。按類似于實施例9的方法讓適當?shù)?-氮雜環(huán)丁烷羧酸酰胺與酰基氯反應(yīng)可制備R是?；幕衔铩?br> 本發(fā)明的另一個實施方案提供了具有結(jié)構(gòu)A的新化合物，當n是3時，R是H、烷基、?；蛲檠豸驶?；且R1和R2獨立地是H、C5-C20烷基或鏈烯基；且其中當R是H時，R1和R2其中之一不是H。這些化合物如本發(fā)明的合成實施例7至9中所示合成。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合成具有相關(guān)取代基的化合物。如實施例7中使用適當?shù)逆溝┗反鎛-辛基胺可制備R1和R2獨立地是鏈烯基的化合物。如在實施例7中使用適當?shù)?-烷基-2-氮雜環(huán)己烷羧酸可制備R是烷基的化合物，如Hu等人在WO9943658中所描述，該酸可通過2-氮雜環(huán)己烷羧酸的還原烷化獲得。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了具有結(jié)構(gòu)A的新化合物，當n是4時，R是H、烷基、?；蛲檠豸驶?；且R1和R2獨立地是H、C5-C20烷基或鏈烯基。這些化合物如本發(fā)明的合成實施例10和11中所示合成。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合成具有相關(guān)取代基的化合物。按類似于實施例9的方法使適當?shù)?-氮雜環(huán)庚烷羧酸酰胺與?；确磻?yīng)可制備R是酰基的化合物。如在實施例10中使用適當?shù)?-烷基-2-氮雜環(huán)庚烷羧酸可制備R是烷基的化合物，該酸可通過2-氮雜環(huán)庚烷羧酸的還原烷化獲得。Seebach等人已經(jīng)描述了2-氮雜環(huán)庚烷羧酸的合成(Liebigs Ann.Chem.(1989)，(12)，1215-1232)。可根據(jù)實施例10中用氨替代n-辛基胺的方法或Cromwell等人在J.Heterocyclic Chem.(1971)，8(1)，19-24中所描述的方法制備R1和R2是H的化合物。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了具有結(jié)構(gòu)B的新化合物，其中n和m獨立地是1、2、3或4；X是C1-C20烷基或C2-C20鏈烯基；R1和R4獨立地是H、烷基、?；蛲檠豸驶?，且R2和R3獨立地是H或烷基；前提條件是當n和m是2時，X是C8-C20烷基或鏈烯基。這些化合物如本發(fā)明的合成實施例12和13中所示合成。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還知道如何根據(jù)實施例1至13制備n和m獨立地是1、2、3或4的化合物。
除非另具說明，“烷基”是指具有1至20個碳原子的完全飽和的一價烴基。所述烷基可是直鏈或支鏈的。優(yōu)選那些包含4、5或6至20個碳原子的烷基，尤其優(yōu)選包含4、6、8、10或12個碳原子?！磅；笔侵妇哂恤驶幕鶊F。“烷氧羰基”是指COOR，其中R是烷基?！版溝┗敝妇哂?至20個碳原子的不飽和一價烴基，其具有一個或多個雙鍵。鏈烯基可以是直鏈或支鏈的。優(yōu)選那些包含4至20個碳原子的鏈烯基，尤其優(yōu)選包含8、10或12個碳原子。
“獨立地”是指緊靠該術(shù)語前的兩個或多個基團相同或不同；即，從該術(shù)語后的名單中選取一個基團不會影響其它基團的選取。
根據(jù)本公開內(nèi)容，“其鹽”是如本發(fā)明所提供的氮雜環(huán)化合物的鹽，其有有機或無機酸如，例如，氯化物、溴化物、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、甲酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、抗壞血酸鹽，或是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它鹽。
通過分析和比較有試驗化合物處理下得到的生物膜的量和無試驗化合物處理下得到的生物膜的量，可以測定本發(fā)明所提供的氮雜環(huán)化合物對生物膜的控制。由處理所產(chǎn)生的生物膜的量的變化可來自于對生物膜的胞外多糖基質(zhì)的影響、或?qū)ι锬?nèi)的微生物的影響、或?qū)Π舛嗵腔w與微生物其間關(guān)系的影響。不受理論的約束，本發(fā)明者認為本發(fā)明的氮雜環(huán)分子可能在模仿、干擾或修改密度感應(yīng)分子在生物膜通信中的作用。本化合物還可通過例如減少毒素生產(chǎn)、降低毒性、干擾信號分子、或增加生物膜在例如生物反應(yīng)器中生成的酶的含量來修改生物膜。
“試驗化合物”是用于篩選其在控制生物膜方面的活性的候選化合物。本發(fā)明的實施例檢測了某些種類細菌中生物膜的分散和形成，這些種類的細菌與消費者和醫(yī)學(xué)環(huán)境相關(guān)，且廣泛代表了細菌細胞壁的類型。由于假單胞菌廣泛存在于在高濕度環(huán)境中形成的生物膜中，且其是有代表性的革蘭氏陰性細菌，本發(fā)明對該類細菌進行了檢測，如那些在淋浴器、馬桶、貯水池和下水道里邊或周圍的假單胞菌。由于表皮葡萄球菌通常位于人體皮膚上且其是有代表性的革蘭氏陽性細菌，本發(fā)明對該細菌進行了檢測。綠膿桿菌和表皮葡萄球菌都具有醫(yī)學(xué)重要性，是醫(yī)院獲得性傳染病中的條件性病原體和常見致病作用物，現(xiàn)認為這些生物體在生物膜狀態(tài)下的生長是重要的。此外，這三種生物代表著處理生物膜的難度范圍，其中綠膿桿菌是最難控制的。本發(fā)明所描述的篩選方法也適用于其它細菌和真菌，包括例如金黃色葡萄球菌、白色念珠菌或糠秕馬拉色菌。
本發(fā)明中生物膜生長的測量使用結(jié)晶紫作為定量的全體生物膜染色劑，其染色細胞和胞外多糖，以迅速識別控制綠膿桿菌、熒光桿菌和表皮葡萄球菌生物膜的活性化合物。根據(jù)類似的方法，生物膜的量化還可使用其它染色或測定，包括但不限于多糖染色、DNA染色、化學(xué)或生化測定、酶測定或物理方法。這些方法通常對包含在生物膜內(nèi)的細胞具有破壞性。
非破壞性的可選方法也可用于量化化合物在控制生物膜方面的活性程度。根據(jù)本公開內(nèi)容，可通過物理、化學(xué)或生物方法如刮削、超聲波降解法、在緩沖劑中攪拌(消化法)、同玻璃珠一塊搖動、化學(xué)制劑、酶或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法從生物膜上釋放出完整的細胞。然后運用下述方法測量所釋放的細胞的數(shù)目，所述方法如使用瓊脂板，使用具有或沒有熒光活性細胞分類的熒光或非熒光可存活細胞或全體細胞染色、光散射技術(shù)、圖像分析、酶測定或生化方法對經(jīng)典的生物學(xué)可存活細胞計數(shù)。根據(jù)本公開內(nèi)容可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，但預(yù)計目前可利用的最容易和最高性價比的方法是本發(fā)明所描述的結(jié)晶紫法。
本發(fā)明所公開的測定法測量化合物控制生物膜的程度，不考慮控制機制，從這種意義上說該測定法是“功能性的”。因此，該測定不管化合物在控制生物膜方面的活性如何，不會區(qū)別化合物對細菌生長是殺滅的、抑制的或是非抑制的。根據(jù)本公開內(nèi)容，附加測定將闡明這些活性化合物的活性機制，如最小抑制濃度測定、生長率測定、非特異細胞溶解測定、基于具體受體基因或蛋白的測定，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它測定。
本文所公開的本發(fā)明所使用的功能測定法的優(yōu)點是，使用該測定可發(fā)現(xiàn)具有任何生物膜控制機制的化合物，包括通過目前未知的機制進行作用的化合物。
本發(fā)明所公開的測定法尤其適用于對形成于硬表面的生物膜及其對例如各種清潔組合物的易感性的研究。根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯而易見的是，微小的改變就能使該方法適用于其它類型的表面如軟的、多孔的或不規(guī)則表面。
本發(fā)明還提供了方法，其用于增強具有生物膜分散活性的化合物對分散生物膜的量的作用。該方法包括用具有生物膜分散活性的化合物培養(yǎng)生物膜足夠長的時間以使該化合物分散生物膜，向該生物膜施加堿，培養(yǎng)生物膜足夠長的時間以增強該化合物的作用，和確定當前生物膜的量。同沒有堿相比，有堿增強了該化合物的作用。堿可以是任何堿，例如NaOH、KOH或NH4OH。同沒有加堿步驟的測定相比，在分散測定中使用堿可加強該測定的靈敏度。
在控制基質(zhì)上的生物的方法的實施方案中，該化合物具有結(jié)構(gòu)A，且n是1；當控制旨在增強生物膜的形成或增強現(xiàn)有生物膜時，R是烷氧羰基，R1是H，且R2是C10-C12烷基；和當控制旨在阻止生物膜的形成或分散現(xiàn)有生物膜時，R和R1是H，且R2是C6-C12烷基。
在控制基質(zhì)上的生物膜的方法的另一實施方案中，該化合物具有結(jié)構(gòu)A，且n是2；當控制旨在增強生物膜的形成或增強現(xiàn)有生物膜時，R是烷氧羰基或烷基，R1是H，且R2是C6-C12烷基；和當控制旨在阻止生物膜的形成或分散現(xiàn)有生物膜時，R和R1是H，且R2是C10-C12烷基。在另一實施方案中，R是H，R1是H，且R2是C10烷基。
在控制基質(zhì)上的生物膜的方法的另一實施方案中，該化合物具有結(jié)構(gòu)A，且n是3；可供選擇地，R是H或烷氧羰基，R1是H，且R2是C8烷基；當控制旨在增強生物膜的形成時，R是烷氧羰基、烷基或H，R1是H，且R2是C8烷基。
在控制基質(zhì)上的生物膜的方法的另一實施方案中，該化合物具有結(jié)構(gòu)A，且n是4。
在控制基質(zhì)上生物膜的方法的另一個實施方案中，該化合物具有結(jié)構(gòu)B，且n和m是1、3或4；可供選擇地，n和m是2，和優(yōu)選地，X是C12烷基，且R1、R2、R3和R4是H。當n和m是2，且當控制旨在增強生物膜的形成或增強現(xiàn)有生物膜時，X優(yōu)選是C12烷基，R2和R3優(yōu)選是H，和R1和R4優(yōu)選是烷氧羰基。當n和m是2，且當控制旨在增強生物膜的形成或增強現(xiàn)有生物膜時，優(yōu)選地，X是C12烷基，且R1-R4是H。
生物膜控制的應(yīng)用本發(fā)明提供了控制生物膜的方法和化合物。該方法包括用上述化合物接觸基質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用該化合物處理基質(zhì)，例如應(yīng)用到基質(zhì)上的化合物在基質(zhì)上留下殘余物。為了控制生物膜，組合物包括一種或多種占組合物重量的約0.001％至約99％、約0.01％至約50％，或例如約0.1％至約10％的化合物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，為了分裂生物膜和/或阻止其形成，在高度潮濕的環(huán)境中向基質(zhì)應(yīng)用上述化合物和/或組合物。該基質(zhì)可以是硬表面，包括浴室表面如淋浴器、馬桶或洗碗池、廚房表面如洗碗池或廢物處理器，或織物表面。可供選擇地，該化合物和/或組合物可用于處理高濕度設(shè)備如洗碗機、冰箱等的內(nèi)部?？晒┻x擇地，該基質(zhì)可以是另一個廚房表面和/或其它表面如海綿、切菜板(木質(zhì)或塑料的)或洗碗布。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物用于洗衣應(yīng)用中，例如，應(yīng)用于洗衣機槽和/或輥筒內(nèi)部。該化合物和/或組合物可應(yīng)用于織物。該化合物和/或組合物可減少惡臭、輔助洗滌和/或阻止霉菌在儲藏于潮濕環(huán)境中的織物如衣服、窗簾或其它織物上的生長。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于通過減少清潔劑和/或減少氯在如泳池、溫泉和/或熱浴盆中的使用來防止表面污垢。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于戶外基質(zhì)如墻板、屋頂材料、甲板和/或天井以阻止戶外霉菌和/或藻類的生長。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于植物和/或花瓶和/或魚缸中，例如通過減少清潔工作量并提供更長期持久的有益效果。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于易形成生物膜的汽車空調(diào)設(shè)備或其它空調(diào)設(shè)備，以阻止或處理生物膜的形成。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于防止家用水過濾系統(tǒng)(例如，過濾器、殼體和/或輸水管道)上生物膜的形成。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于防止地下室霉菌生物膜的形成。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用作抗感染藥，例如與另一種抗菌劑如抗生素一起使用。該化合物和/或組合物可用于治療病人與生物膜發(fā)展有關(guān)的疾病狀態(tài)，如細菌感染，用于囊腫性纖維化或HIV，或免疫缺失病人?？晒┻x擇地，該化合物和/或組合物可用于處理醫(yī)療或牙醫(yī)設(shè)備如導(dǎo)管、管道、鑲補工具等以防止或處理其上生物膜的形成。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于口腔護理應(yīng)用，如牙齒或假牙以控制牙斑和/或口臭。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于控制皮膚上生物膜的形成，例如，頭皮屑的控制(防止馬拉色菌生物膜在頭皮上形成)、用于手/皮膚殺菌劑(防止自然微生物區(qū)系的生長或恢復(fù))、用于除臭劑應(yīng)用或用于腳的護理(防止真菌生長如腳蘚，而不分裂自然微生物區(qū)系)。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于鞋護理應(yīng)用以控制在鞋表面形成細菌和/或真菌生物膜。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于防止中毒休克綜合癥或恢復(fù)失衡的微生物區(qū)系(例如，封閉在如尿布中的皮膚或陰道)。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于任何具有金屬、陶瓷、玻璃、復(fù)合物或聚合物部分的加工機械，尤其用于紙、食品、藥和化妝品加工應(yīng)用。該化合物和/或組合物可用于防止生物膜在金屬、陶瓷、玻璃、復(fù)合物或聚合物上的形成，以及防止真菌或細菌生物膜在紙制品中的生長。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用作食品和/或飲料防腐劑。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于普通使用的表面涂層以阻止生物污染(例如，漆或房屋、船只、織物、地毯、鞋等的涂層)。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于普通使用的被浸漬的材料(例如，塑料、木材、復(fù)合材料)或受控的傳輸系統(tǒng)。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于建筑應(yīng)用如材料保護(例如，木材、墻板、屋頂?shù)?和設(shè)備保護。在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于海洋和淡水生物污染保護(例如，在船只、碼頭、防波堤、浮標、繩索和軍事上的應(yīng)用)。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于生物處理應(yīng)用以促進在，例如廢水處理系統(tǒng)/工廠、生物矯正系統(tǒng)或生物處理系統(tǒng)(例如全細胞生物催化作用)中最佳生物膜的形成。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用如農(nóng)作物保護、農(nóng)作物營養(yǎng)(促進所需的生物膜)和處于農(nóng)歇期的污染保護(例如，溝渠、水泵等)。
在本發(fā)明的可選實施方案中，該化合物和/或組合物可用于水產(chǎn)業(yè)應(yīng)用如預(yù)防疾病和促進最佳的表皮生物膜。
藥物劑量、制劑和給藥對于藥物應(yīng)用，“治療有效量”是指本發(fā)明組合物在控制生物膜方面能達到特定醫(yī)療目標的濃度或量或含量，其中控制生物膜是指如減少生物膜的形成、分散生物膜或?qū)ι锬び卸拘?。具體的“治療有效量”將根據(jù)下列因素而變化特定治療情況、病人的身體狀況、所治療的哺乳動物的種類、治療的持續(xù)時間、并發(fā)治療(如果存在)的性質(zhì)、所采用的具體制劑和該化合物或其鹽的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的藥物方法可以任何適當?shù)膭┝渴┯?。所施用的劑量將根?jù)下列已知因素而變化特定化合物、鹽或組合的藥效特征、和其用藥方式和途徑；施用對象的年齡、健康或重量；癥狀的性質(zhì)和程度；藥物和患者的代謝特征；并發(fā)治療的種類；治療的頻率或想要達到的效果。有效劑量可根據(jù)動物模擬測試系統(tǒng)或體外測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線進行推斷。
劑量單元可包括稀釋劑、增補劑、載體、脂質(zhì)體等。該單元可以是固體或凝膠形式如丸劑、片劑和膠囊等，或是適于口服、直腸、局部、靜脈注射或非腸道給藥的液體形式或注射到治療處或治療處周圍。用于口服的制劑可包括無毒可藥用的惰性載體如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露糖醇、山梨醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精衍生物等。根據(jù)本發(fā)明的方法，藥物局部應(yīng)用包括油膏劑、霜膏、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴劑、氣霧劑或油。適于鼻部給藥的制劑可以液體形式給藥，例如鼻噴劑、鼻液滴或通過噴霧器進行氣霧劑給藥，包括活性成分的含水或油溶液。適于非腸道給藥的制劑包括與目標患者血液等壓的含水和不含水制劑；和含水和不含水的無菌懸浮液，該懸浮液可包括為使化合物定位靶血液組分或一個或多個靶器官而設(shè)計的懸浮系統(tǒng)。
藥物前體是指本發(fā)明所提供的化合物的形式，該化合物在其被轉(zhuǎn)化是所需的生物活性形態(tài)之前具有最小的治療活性。藥物前體是具有一種或多種功能團或共價結(jié)合的載體的化合物，其功能團或載體通過體內(nèi)代謝過程脫離該化合物以形成各自的生物活性化合物。藥物前體包括這樣的化合物，其中羥基或胺基團例如通過化學(xué)鍵結(jié)合到任何基團上，該基團在哺乳動物患者服用該化合物后會裂開以分別形成游離羥基或胺基團。藥物前體的實施例包括但不限于醇或胺官能團的乙酸酯、甲酸酯或苯甲酸酯衍生物、磷酸酯、二甲基甘氨酸酯、氨烷基芐基酯、氨烷基酯或羧基烷基酯的官能團。
代謝物是指本發(fā)明化合物的分解產(chǎn)物或末端產(chǎn)物，或該化合物通過代謝或生物轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生的鹽；例如，生物轉(zhuǎn)化為其共軛物或通過氧化、還原或水解而生物轉(zhuǎn)化為極性更大的分子?；衔锏拇x物或其鹽可以是更具生物活性的形態(tài)。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道本發(fā)明化合物的代謝物活性的測定，例如，檢測生物膜的分散或防止。
輔助成分本發(fā)明還提供包括一種或多種上述化合物和一種或多種輔助成分的組合物。例如，該組合物包含約0.0001％至約50％的上述化合物和余量的輔助成分。輔助成分的實施例包括但不限于抗生素、生物殺滅劑、助劑、漂白劑、漂白活化劑、漂白催化劑、載體、二價陽離子、酶、酶穩(wěn)定系統(tǒng)、螯合劑、熒光增白劑、去污聚合物、染料傳遞劑、分散劑、泡沫抑制劑、染料、著色劑、鹽填充劑、水溶助長劑、光催化劑、熒光劑、織物護理劑、包括水溶性表面活性劑的表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、抗收縮劑、防皺劑、其它抗菌劑、殺菌劑、殺真菌劑、色斑、銀器護理劑、防銹和/或防腐蝕劑、止泡劑、堿性來源、溶劑、加溶劑、載體、加工助劑、顏料、香料或pH控制劑。表面活性劑可以是非離子的、陰離子的、兩性的、兩性分子的、兩性離子的、陽離子的、半極性非離子的或其混合物。
本發(fā)明的組合物可包括溶劑或其混合物。根據(jù)本發(fā)明，適于摻入組合物的溶劑包括含水基或有機基溶劑。溶劑可包含水、鹽、鹽緩沖劑、葡萄糖、甘油、乙醇胺、醇、丙二醇衍生物如正丁氧基丙醇或正丁氧基丙氧基丙醇、2-(2-烷氧基乙氧基)乙醇、2-烷氧基乙氧基乙醇、或聚(亞烷基乙二醇)烷基醚，尤其是正丁氧基丙氧基丙醇、丁基CARBITOL，一乙醇胺(MEA)，二乙醇胺、三乙醇胺、芐基醇、甲醇、乙醇、異丙基醇、或二醇如2-乙基-1，3-己二醇和2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇或其混合物。此外，非鄰位C4-C8支鏈或直鏈亞烷基乙二醇，如己二醇、(4-甲基-2，4-戊二醇)、1，6-己二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇是本發(fā)明的溶劑實施方案。本發(fā)明使用的另一種低極性的非水溶劑是一-、二-、三-或四-C2-C3亞烷基乙二醇一C2-C6烷基醚。此類化合物的具體實施例包括二亞乙基乙二醇單丁基醚、四聚乙二醇單丁基醚、二丙二醇一乙基醚和二丙二醇單丁基醚。丁氧基丙氧基丙醇(BPP)也被看作一種溶劑?？捎糜诒景l(fā)明的另一種低極性的非水有機溶劑是低分子量的聚乙二醇(PEGs)。此類原料是那些分子量是至少約150的物質(zhì)。最優(yōu)選分子量約200至600的PEGs。本組合物中典型地使用的溶劑的含量按組合物重量計為約0％至約30％。
本發(fā)明所述的摻入組合物中的2-烷基鏈烷醇和溶劑的組合具有可接受的潤濕性能，且因此提供無條紋和蒸發(fā)的有益效果?！皾櫇瘛笔侵附M合物應(yīng)用到表面上，尤其是疏水表面上時會形成膜而不是單個的小滴，和/或干燥時不會在上述表面形成小滴。在干燥期間小滴的形成可導(dǎo)致在上述表面出現(xiàn)可見的殘余物(“條紋”)。對比之下，膜的干燥在干燥后的結(jié)果是減少或甚至防止可見殘余物(無條紋清潔有益效果)。此外，本發(fā)明所述的潤濕性導(dǎo)致上述組合物所施用的表面上形成一層均勻的組合物膜。
在本發(fā)明的可選實施方案中，可將上述化合物加入市售的組合物例如可從寶潔公司獲得的那些組合物中。
在本發(fā)明的可選實施方案中，上述化合物可用于配制化妝品或醫(yī)藥組合物。適于局部化妝品或醫(yī)藥組合物的輔助成分包括包含一種或多種選自下列成分的載體i)潤膚劑，ii)溶劑，iii)濕潤劑，iv)增稠劑，v)粉末，vi)香料，vii)蠟，viii)防腐劑，ix)表面活性劑，x)堿，以及其它上述輔助成分的補充或之外的成分?？删植渴┯糜谄つw的局部組合物可呈任何形式，包括溶液、油、霜膏、油膏劑、凝膠、洗劑、香波、免洗型或漂洗型頭發(fā)護理劑、奶劑、清劑劑、潤濕劑、噴劑、皮膚貼劑等。典型地，施用于受感染區(qū)域的組合物用量是每平方英寸約1至約1000毫克，優(yōu)選約1至約100毫克。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所選擇的化合物和組合物的目標用途，無需過度試驗即可選擇合適的輔助成分和數(shù)量以配制入上述組合物。
本發(fā)明所提供的包括化合物的成套產(chǎn)品本發(fā)明還涉及成套產(chǎn)品，其包括本發(fā)明所述的化合物和/或組合物，和本發(fā)明所述化合物和/或組合物的使用說明，以及包含該化合物和/或組合物的的包裝，或與該化合物和/或組合物的銷售或使用相關(guān)的其它形式的廣告。該說明可以以消費者產(chǎn)品制造公司或供給公司典型采用的任何方式包括進該成套產(chǎn)品。實施例包括以附著在包裝該化合物和/或組合物的包裝物上的標簽來提供說明；附著在包裝物上或購買時與包裝物相隨的紙張說明；或廣告、示范、和/或可能與購買或使用該化合物和/或組合物相連的其它書面或口頭說明。
特別是該說明將包括該化合物和/或組合物的使用說明。該說明，例如，還可包括與應(yīng)用到基質(zhì)的化合物和/或組合物建議用量有關(guān)的信息。
生物膜小瓶裝置參照圖1，其是一次性生物膜生長裝置的橫斷面視圖，該裝置用于各種表面上的生物膜的生長和測試，其包括包含內(nèi)凸螺紋5的塑性小瓶6(其材料是聚乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或其它聚合物，但優(yōu)選聚丙烯)，螺帽部件7可插入其中。螺帽部件由模制的塑性頂部分1和凹螺紋部分3組成，該螺紋部分上安放著一個在螺帽部件7旋入小瓶6時能提供液體不滲透的密封O形環(huán)2(其材料是聚硅氧烷、合成或天然橡膠或其它合適材料)。螺帽部件7的中空部分植入一個圓片4，該圓片包括生物膜要在其上進行生長的表面，該表面包括但不限于聚合物、陶瓷、金屬、玻璃、復(fù)合物或天然材料表面如木材。圓片4通過摩擦力或使用注入螺帽部件中空部分的合適的生物相容的粘合劑(其不會抑制生物膜生長)進行固定，以使暴露的圓片表面與螺帽部件的螺紋部分3的末端齊平。該裝置的有用尺寸包括但不限于凹螺紋部分3的內(nèi)徑約8毫米，塑性小瓶6的內(nèi)徑約11毫米，和圓片4的直徑約8毫米。
參照圖1所示裝置，生物膜可生長在圓片4的表面上。這可通過下述操作實現(xiàn)將一定體積的植入了細菌或真菌的液體生長介質(zhì)放入小瓶4中，將安置了圓片4的螺帽部件7旋入小瓶6，然后將小瓶放在處于合適的受控溫度環(huán)境中的組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上。候選用于控制生物膜的試驗化合物加入液體生長介質(zhì)，加入的時間可在生物膜形成之前、之后或兩者。
生物膜生長室陣列用于檢測基質(zhì)表面生物膜控制的裝置是本發(fā)明的一個方面。該裝置包括第一主體，該主體具有用于支持無凸起的可移動基質(zhì)表面的平臺，生物膜生長在該基質(zhì)表面上；和適于同軸接受第一主體的第二主體，第二主體具有多個單體槽；其中當?shù)谝缓偷诙黧w裝配起來進行使用時，這些槽與第一主體的基質(zhì)表面保持液體密封流通。
參照圖2a，其是可重復(fù)使用的雙片生物膜生長室陣列(2P-GCA)的側(cè)橫截面視圖，圖2b是可重復(fù)使用的三片生物膜生長室陣列(3P-GCA)的側(cè)橫截面視圖。2P-GCA和3P-GCA能實現(xiàn)真實條件下生物膜在各種材料上的生長和檢測。本發(fā)明該些部分的圖解說明請參看附圖。給出圖2a、2b、3和4不是出于限制的目的，且根據(jù)本公開內(nèi)容，某些簡單的修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
參照圖2a所描述的本發(fā)明，2P-GCA包括蓋部件90和容器部件110，蓋部件設(shè)計成接受附著在生長表面30或是生長表面的一部分的各種材料，容器部件包含多個單體生長室(槽)，用于在表面30和該部件的單體槽80之間提供液體密封流通。通過使用螺栓40和螺母45以及插入定位釘孔20的定位釘(材料優(yōu)選是不銹鋼)來保持蓋部件90和容器部件110之間的連接，其中通過每個槽80使用單體O形環(huán)50(其材料是聚硅氧烷、合成或天然橡膠或其它合適材料)來保持液體密封流通。當本發(fā)明處于完全裝配構(gòu)型時，O形環(huán)80緊緊地連接溶劑部件110和表面30。
參照圖2a，蓋部件90由聚合物10的單個嵌段(如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯或其它聚合物)加工制成，包括尺寸是能接受表面30的淺凹100、定位釘孔20、容納表面固定螺釘130的孔和接受螺栓40的孔。根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，蓋部件嵌段可選擇由除聚合物之外的材料加工制成，如金屬、復(fù)合物、或其它材料、或在鑄造或模制方法中使用幾乎任何理想的材料預(yù)制。
參照圖3和圖4，其分別是蓋部件90和容器部件110的頂視圖。參照圖3，蓋部件嵌段10包含淺凹100，通過使用兩個表面固定螺釘130將表面30固定在其中。此外，還可看到包括兩個定位釘孔20，用于接受兩個幫助保持蓋部件90和容器部件110定位的定位釘。此外，還有四個孔用于接受四個保持2P-GCA 90和110兩個部分連接的螺栓40。參照圖4，可看見容器部件嵌段70中加工制成的相同的孔，其中容器部件嵌段70中的孔140和150分別用于配合蓋部件嵌段10中的孔120和20，以保持螺栓40與適合定位孔20的定位釘?shù)倪B續(xù)性。
參照圖2a，容器部件110也是由單個聚合物嵌段65(如聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯或其它聚合物)加工制成，包括尺寸是能接受表面30的淺凹160、定位釘孔20、容納表面固定螺釘130的孔和接受螺栓40的孔。根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，同蓋部件嵌段一樣，容器部件嵌段也可供選擇地由如上所述的除聚合物之外的材料加工制成。
參照圖4，本發(fā)明的容器部件110包含多個單體槽80，單體槽80在淺凹160中加工制成，而淺凹160又在容器部件嵌段中加工制成以接受從蓋部件90突出的表面30，兩者請參照圖2a和圖3。每個槽80用于模仿單體生長小瓶，如本發(fā)明提到的公開于圖1的小瓶6，且每個槽都包括直徑比槽大的0.5至5毫米深的額外淺凹，以為上述型號的O形環(huán)50提供容座(容器)。
參照圖2a和圖4，容器部件110包括由聚合物或其它材料制成的附加臂60，該臂用于附著在組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器或類似的旋轉(zhuǎn)設(shè)備上，其能平穩(wěn)地旋轉(zhuǎn)處于受控溫度環(huán)境中的完全裝配的、如本發(fā)明所述的公開于圖1中的生長室。該勻速旋轉(zhuǎn)能讓本發(fā)明表面30上的單體環(huán)形生物膜進行可再現(xiàn)的生長。
當使用時，并參照圖2a、圖3或圖4所示的本發(fā)明2P-GCA，單體生物膜陣列會生長在本發(fā)明表面30上。這可通過下述操作實現(xiàn)將O形環(huán)50放入其在容器部件110內(nèi)的容座中，向單體槽80加入相同或不同體積的相同或不同的液體生長介質(zhì)，向每個槽單獨或一起植入相同或不同的細菌或真菌，使用插入定位釘孔20/150的定位釘連接包含本發(fā)明已固定表面的蓋部件90，使用螺栓40和螺母45將蓋部件和容器部件固定在一起，然后將完全裝配的設(shè)備用附加臂60附著在一個組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上，或?qū)⒃撛O(shè)備本發(fā)明表面朝下地放在一個搖動培養(yǎng)器上，然后在合適的溫度下通過或不通過分別以旋轉(zhuǎn)或搖動進行培養(yǎng)。
另一個用于檢測基質(zhì)表面上生物膜控制的裝置是本發(fā)明的一個方面。該裝置包括第一和第三主體，每個主體具有用于支持無凸起的可移動基質(zhì)表面的平臺，該基質(zhì)表面用于生物膜在其上生長；和具有第一面和第二面的第二主體，第二主體以三明治定位的方式在第一面和第二面接受第一主體和第三主體，第二主體具有多個單體槽；其中當?shù)谝缓偷诙黧w裝配起來進行使用時，這些槽與第一主體的基質(zhì)表面保持液體密封流通。第二主體具有多個從第一面伸展到第二面的單體孔，這些孔的兩端形成槽開口，當裝配好該裝置進行使用時，這些孔與第一和第三主體的基質(zhì)表面保持液體密封流通。
參照圖2b，其是本發(fā)明在圖2a中公開的容器部件的可選擇實施方案。參照圖2b，結(jié)合參照圖3和圖4，可看見經(jīng)過修改的容器部件110，加工多個槽85使其貫穿整個嵌段70，增加淺凹160，O形環(huán)50及其容座，得到新的容器部件115。因此容器部件115被加工成接受兩個作是兩個同樣蓋部件90的一部分附著的同樣表面30。
除了容器部件被修改成接受兩個同樣蓋部件90之外，3P-GCA與2P-GCA在許多方面相同。稍微延長圖2a所描述的四個螺栓40以適應(yīng)完全裝配的三片部件的更大尺寸，得到四個如圖2b所描述的更長的螺栓55。這種3-片的實施方案的優(yōu)點是，在生物膜生長完成前必須更換生長介質(zhì)的情況下，只需要移動一個蓋，因此生長在另一個蓋上的生物膜完全不受干擾。此外，在不更換生長介質(zhì)生物膜就能生長的情況下，可形成和/或檢測兩倍多的生物膜。
在2P-GCA和3P-GCA的一個實施方案中，蓋部件90和容器部件110/115中的淺凹要加工制成使其尺寸能容納一塊如表面30的標準浴室瓷磚。這個設(shè)計的優(yōu)點是該瓷磚既可本身作為生物膜生長表面，又可作為本發(fā)明有關(guān)不同材料層的支撐物，不同材料包括但不限于聚合物、陶瓷、金屬、玻璃、復(fù)合物或天然表面如木材。所述層可用粘合劑、膠帶、摩擦力或其它方法附著到瓷磚上，且因此在完全裝配的本發(fā)明中可作為實際的生物膜生長表面。
在一個浴室瓷磚的實施方案中，參照圖2a、圖3和圖4，蓋部件90的加工嵌段10的有用尺寸包括但不限于嵌段尺寸是約156平方毫米，厚約25毫米，具有一個深約3毫米的約109平方毫米的淺凹100。該尺寸足夠用于容納一塊約108平方毫米的標準浴室瓷磚。容器部件110的嵌段65的有用尺寸包括但不限于嵌段尺寸是約156平方毫米，厚約41毫米，具有一個深約3毫米的約109平方毫米的淺凹160，24個深約35毫米直徑約8至12毫米的孔，且兩孔中心距約15至18毫米。
在一個浴室瓷磚的實施方案中，參照圖2b、圖3和圖4，有用尺寸包括上述相同尺寸，除了容器部件115厚約43毫米，在嵌段70的反面另加一個深約3毫米的約109平方毫米的淺凹160以容納第二個蓋部件90，并且槽孔85要貫穿整個嵌段。
當使用時，參照本發(fā)明圖2b、圖3和圖4所示的3P-GCA，一個單體生物膜陣列會生長在有關(guān)的兩個表面30上，其中這兩個表面各自可由相同的或不同的材料制成。這可用與上述2P-GCA發(fā)明相同的方法實現(xiàn)，除了在加入大量的液相生長介質(zhì)之前要用具有螺絲紋的螺栓65和四個螺母45將下方的蓋部件90固定好。
在本發(fā)明2P-GCA和3P-GCA的實施方案中，可將控制生物膜的試驗化合物加入液相生長介質(zhì)中，加入的時間是在生物膜形成之前、之后或兩者。通過上述方法可實現(xiàn)這些化合物對生物膜形成和/或分散的作用的量化。使用之后，表面30可被除去和丟棄或清潔后重復(fù)使用，通過使用試管刷和通?？色@得的洗滌劑可容易地清潔槽80/85以重復(fù)使用。該方法尤其適于對在硬表面上形成的生物膜及其對例如各種清潔組合物的易感性的研究。
本發(fā)明所提供的生長室裝置是可重復(fù)使用的設(shè)備，其中可使用同一設(shè)備進行生物膜生長和測定。無需如Ceri等人的美國專利6,326,190和20010049975中的破壞突出物等物理干預(yù)或干擾生物膜。該設(shè)備最適于用水不滲透的硬表面作為基質(zhì)，但由于任何表面都可能作是基質(zhì)，所以該設(shè)備是多用途的。由于可使用機器可移動的蓋，所有加入或清除液體的步驟，包括量化的步驟可自動完成，所以該設(shè)備可容易地設(shè)置為自動操作。該設(shè)備可容易地升級為更高或更低的槽密度和/或更大或更小的槽。通過變化槽中液體的體積和旋轉(zhuǎn)器或搖動器的旋轉(zhuǎn)速度，可在較寬范圍內(nèi)調(diào)整通風(fēng)。
篩選用于基質(zhì)表面生物膜控制的試驗化合物的方法是本發(fā)明的一個方面，該方法包括獲得上述裝置、在基質(zhì)表面沒有試驗化合物可形成生物膜的條件下，在該裝置的槽中用試驗化合物培養(yǎng)生物膜形成的微生物，并比較有該試驗化合物和沒有該試驗化合物兩種情況下生物膜在基質(zhì)表面的形成。當有該試驗化合物情況下生物膜的形成少于沒有該試驗化合物的情況時，則說明該試驗化合物對生物膜在該基質(zhì)表面的形成有抑制活性，當有該試驗化合物情況下生物膜的形成多于沒有該試驗化合物的情況時，則說明該試驗化合物對生物膜在該基質(zhì)表面的形成有促進活性。
篩選用于分散基質(zhì)表面現(xiàn)有生物膜的試驗化合物的方法是本發(fā)明的一個方面，該方法包括獲得上述裝置，在一定條件下在該裝置的槽中培養(yǎng)生物膜形成的微生物以在基質(zhì)表面形成生物膜，用試驗化合物接觸基質(zhì)表面的該生物膜和比較有該試驗化合物和沒有試驗化合物兩種情況下基質(zhì)表面的生物膜的量。當有該試驗化合物情況下生物膜的量少于沒有該試驗化合物的情況時，則說明該試驗化合物對該基質(zhì)表面的生物膜的分散有活性。
除非另外指明，本文中所有量、份數(shù)、百分數(shù)和比例均以重量計。所有引用的美國專利均引入本文以供參考。
根據(jù)長期存在的專利法慣例，在本申請中，包括權(quán)力要求書中，術(shù)語“一”(a)和“一”(an)是指“一或更多”。
本發(fā)明所描述的化合物可通過常規(guī)的有機合成方法制備，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可在無過度試驗的情況下容易地獲得這些化合物。下文描述其具體實施例。
實施例下述實施例舉例說明本發(fā)明，但并不旨在限制或定義本發(fā)明的范圍。
本文使用了各種縮寫。下面表1所示是可能用到的縮寫和其定義。
表1-縮寫
化合物合成實施例實施例1-N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸(1)
將(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(1.00g，9.89mmol)溶解于12mL的1∶1的二惡烷∶水中。加入三乙胺(2.1mL，14.84mmol)，緊接著加入BOC-ON(2.68g，10.9mmol)。攪拌該混合物6.75小時，然后倒入水(50mL)中并用醚萃取(7次，每次50mL)。冰浴冷卻該水溶液并用冰冷的1N HCl溶液將pH調(diào)至約2.5。所得溶液用二氯甲烷萃取(3次，每次50mL)。用MgSO4干燥該組合的有機萃取物，在真空中過濾和濃縮以得到油產(chǎn)物。向該油產(chǎn)物中加入己烷(100mL)并將混合物放入冷箱中過夜。輕輕倒出己烷，然后將該產(chǎn)物(1)在真空中干燥以獲得白色固體。ISMSMH+202.2實施例2-N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸正癸基酰胺(285) 將N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸(1)(90mg；0.447mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正癸胺(72mg；0.470mmol)，N，N-二異丙基乙胺(116mg；0.895mmol)和PyBOP(244mg；0.470mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)4天，然后在減壓下濃縮。該粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(己烷中10％→60％的乙酸乙酯)進行提純以獲得期望的產(chǎn)品(285)。ISMSMH+341.4用類似方法，以正己胺、正辛基胺和正十二烷基胺替代正癸胺分別制備化合物283、284和286。
實施例3-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸正癸基酰胺(289) 將N-(叔丁氧羰基)-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸正癸基酰胺(285)(160mg；0.470mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(2mL)并在室溫下攪拌該溶液2小時。在真空中將該溶液在40C下進行濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(20mL)中然后倒入飽和碳酸氫鈉溶液。用飽和碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9。搖動該混合物使各層分離。用二氯甲烷萃取水層(3次，每次5mL)。用水沖洗該組合的有機萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮以獲得期望的固體產(chǎn)物(289)。ISMSMH+241.2以類似方法分別用化合物283、284和286制備287、288和290。
實施例4-N-(乙?；?-DL-脯氨酸正癸基酰胺(7) 將N-(乙?；?-DL-脯氨酸(Sigma Chemical Company，St.Louis，MI)(100mg；0.64mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正己胺(77mg；0.76mmol)、N，N-二異丙基乙胺(181mg；1.40mmol)和PyBOP(397mg；0.76mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)18小時，然后在減壓下濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(己烷中80％→100％的乙酸乙酯，緊接著己烷中50％→100％的丙酮)進行提純以獲得期望的產(chǎn)物(7)。
ISMSMH+241.4
用類似方法，以正辛胺和正癸胺替代正己胺分別制備化合物8和9。
實施例5-N-(叔-丁氧羰基)-L-脯氨酸正癸基酰胺(12) 將N-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(137mg；0.64mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入正癸胺(120mg；0.76mmol)，N，N-二異丙基乙胺(181mg；1.40mmol)和PyBOP(397mg；0.76mmol)。在室溫下攪拌42小時，然后在減壓下濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(己烷中20％→70％的乙酸乙酯)進行提純以獲得期望的油產(chǎn)物(12)。ISMSMH+355.2用類似方法，以正己胺、正辛基胺、正丁胺和正十二烷基胺替代正癸胺分別制備化合物10、11、155和160。
用類似于制備化合物10、11、12、155和160的方法，以N-(叔-丁氧羰基)-D-脯氨酸替代N-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸制備化合物153、154、158、152和159。
實施例6-L-脯氨酸正癸基酰胺(32)
將N-(叔-丁氧羰基)-L-脯氨酸正癸基酰胺(12)(120mg；0.339mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(2mL)并在室溫下攪拌該溶液2.5小時。在真空中將該溶液在40℃下進行濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(20mL)中并倒入飽和碳酸氫鈉溶液。用飽和碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9。搖動該混合物使各層分離。用二氯甲烷萃取水層(3次，每次5mL)。用水沖洗該組合的有機萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮以獲得期望的油產(chǎn)物(80mg)。ISMSMH+254.8用類似于制備化合物10、11、155和160的方法分別制備化合物30、31、165和168。
用類似于制備化合物153、154、158、152和159的方法分別制備化合物163、164、166、162和167。
實施例7-(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸正辛基酰胺(22)。
將(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸(Aldrich ChemicalCompany，Milwaukee，WI)(1.00g；4.36mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(20mL)中。依次加入正辛基胺(0.620g；4.80mmol)，N，N-二異丙基乙胺(1.24g；9.60mmol)和PyBOP(2.50g；4.80mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)25小時，然后在減壓下濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(己烷中20％→40％的乙酸乙酯)進行提純以獲得期望的油產(chǎn)物(22)。ISMSMH+341.2
按類似方法用(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸(AldrichChemical Company，Milwaukee，WI)替代(R)-(+)-1-(叔-丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸制備化合物19。
實施例8-(R)-(+)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸正辛基酰胺(23) 將(R)-(+)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸正辛基酰胺(8)(1.00g；2.94mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(40mL)中。加入三氟乙酸(20mL)并在室溫下攪拌該溶液7小時。在真空中將該溶液在40C下進行濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(200mL)中并倒入飽和碳酸氫鈉溶液。用飽和碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9。搖動該混合物使各層分離。用二氯甲烷萃取水層(3次，每次50mL)。用水沖洗該組合的有機萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮以獲得期望的固體產(chǎn)物(23)。ISMSMH+240.8用類似于制備化合物19的方法制備化合物20。
實施例9-1-辛?；?(R)-(+)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸正辛基酰胺(28) 將(R)-(+)-2-氮雜環(huán)己烷羧酸正辛基酰胺(23)(100mg；0.416mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(3mL)中。加入三乙基胺(63mg；0.624mmol)并冰浴冷卻該溶液。用注射器滴加辛酰氯(74mg；0.458mmol)。攪拌該溶液15分鐘，然后讓其升溫至室溫。再次攪拌4.5小時后，將該溶液倒入飽和碳酸氫鈉溶液并用二氯甲烷(20mL)萃取。用水沖洗該二氯甲烷萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(在己烷中0％→40％的乙酸乙酯)進行提純以獲得期望的油產(chǎn)物(28)。ISMSMH+367.4用類似于制備化合物20和23的方法，以乙酰氯替代辛酰氯分別制備化合物21和24。
實施例10-(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)庚烷羧酸正辛基酰胺(2) 將(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)庚烷羧酸(如TetrahedronLetters(1994)，35(2)，237-240中描述的方法制備)(1.00g；4.11mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(20mL)中。依次加入正辛基胺(0.584g；4.52mmol)、N，N-二異丙基乙胺(1.17g；9.04mmol)和PyBOP(2.35g；4.52mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)24小時，然后在減壓下濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法進行提純以獲得期望的產(chǎn)物(2)。
實施例11-(S)-(-)-2-氮雜環(huán)庚烷羧酸正辛基酰胺(3)
將(S)-(-)-1-(叔丁氧羰基)-2-氮雜環(huán)庚烷羧酸正辛基酰胺(2)(1.00g；2.82mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(40mL)中。加入三氟乙酸(20mL)并在室溫下攪拌該溶液7小時。在真空中將該溶液在40C下進行濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(200mL)中并倒入飽和碳酸氫鈉溶液。用飽和碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9。搖動該混合物使各層分離。用二氯甲烷萃取水層(3次，每次50mL)。用水沖洗該組合的有機萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮以獲得期望的產(chǎn)物(3)。
實施例12-N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷雙酰胺(225) 將N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)(161mg；0.749mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(3mL)中。依次加入1，12-二氨基十二烷(75mg；0.374mmol)、N，N-二異丙基乙胺(155mg；1.20mmol)和PyBOP(409mg；0.786mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)7小時，然后在減壓下濃縮。該殘余物經(jīng)過硅膠色譜法使用梯度洗脫(己烷中20％→50％的乙酸乙酯)進行提純以獲得期望的產(chǎn)物(225)。ISMSMH+595.6
實施例13-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷雙酰胺(226) 將N-(叔丁氧羰基)-D-脯氨酸1，12-二氨基十二烷雙酰胺(225)(190mg；0.319mmol)在室溫下溶解于二氯甲烷(4mL)中。加入三氟乙酸(1mL)并在室溫下攪拌該溶液1.75小時。在真空中將該溶液在40C下進行濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(20mL)中并倒入飽和碳酸氫鈉溶液。用飽和碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9。搖動該混合物使各層分離。用二氯甲烷萃取水層(3次，每次50mL)。用水沖洗該組合的有機萃取物，用MgSO4干燥，在真空中過濾和濃縮以獲得期望的固體產(chǎn)物(226)。ISMSMH+395.4測定參考實施例主要的高生產(chǎn)量小板篩選法本發(fā)明所描述的高生產(chǎn)量篩選法是基于細菌附著到96槽小板并在其上形成生物膜的能力，和它們能被如結(jié)晶紫(CV)這樣染色生物膜而不染色塑性材料的染料染色的能力。該小板的的材料是聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)或其它材料。緊接著對染料進行乙醇萃取，并用小板讀數(shù)器進行分光光度法量化。
已經(jīng)詳細描述了用于數(shù)種細菌的多個版本的這種篩子(參見，例如Cowan，M.M.和Fletcher，M.，1987，J.Microbiol.Methods 7241-249；Shea，C.，和Williamson，J.C.，1990，Biotechniques 8610-611；O’Toole，G.A.，和Kolter，R.，1998，Mol.Microbiol.28449-461；Loo，C.Y.等人，2000，J.Bacteriol.1821374-1382)；幾乎可使用任何細菌。通過選擇理想的染料和生長介質(zhì)，還可對該篩子進行修改以用真菌如酵母菌用于類似用途。
本發(fā)明涉及改進的篩子，該篩子易于使用、迅速且可促進自動操作。這些篩子可用于發(fā)現(xiàn)抑制或增強生物膜形成的化合物，或還可用于發(fā)現(xiàn)引發(fā)生物膜分散的化合物。該篩選法還可用于確定存在于生物膜中的細菌對殺菌劑或其它抗菌劑的易感性。
參考實施例1-生物膜防止篩，其用于篩選抑制生物膜形成的化合物。
用綠膿桿菌菌株P(guān)AO1(生長于R2A介質(zhì)中(Handbook ofMicrobiological Media；CRC Press，1997年，第二版，R.M.Atlas編著)，經(jīng)過改性以濾掉Mg2+但包括0.3-0.5％果糖(pH 7.0)和3μM硫酸亞鐵銨)、熒光桿菌菌株ATCC 13525(生長于R2A中，經(jīng)過改性以濾掉Mg2+但包括0.3-0.5％丙酮酸鈉(pH 7.0))、表皮葡萄球菌菌株ATCC 35984(生長于TSB的稀釋液中(Handbook of Microbiological Media；CRC出版社，1997年，第二版，R.M.Atlas編著)追加1％果糖(pH 7.0)和3μM硫酸亞鐵銨)制備3mL的隔夜培養(yǎng)物。任選地向每種生長介質(zhì)中添加HEPES(pH 7.3)以得到10mM的最終濃度。
向每槽包含100μl相應(yīng)的上述生長介質(zhì)的96槽圓底PS、PVC或PP(優(yōu)選PP或PVC)小板中加入待檢測的化合物(溶解于DMSO中)并進行混合，以得到250-500μM的最終濃度。這些小板還可用于在相同的相應(yīng)生長介質(zhì)中制備該化合物的相繼稀釋液，以獲得包含，例如160μM和32μM最終濃度的相同配套化合物。在稀釋液系列槽中包括對照槽，其僅僅包含DMSO。從這3ml隔夜培養(yǎng)物中，向三套稀釋液板中的每個板每槽植入在適當培養(yǎng)物的相同液體生長介質(zhì)中的5μl 1∶1稀釋液。在濕度受控環(huán)境中，在300C下(對于綠膿桿菌或熒光桿菌)或370C下(對于表皮葡萄球菌)，以每分鐘200轉(zhuǎn)的速度搖動密封板進行培養(yǎng)。
用CV對有生物膜附著在小板表面的槽以下列方法進行染色從每個槽中除去液體緊接著用每槽150μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次且最后每槽加入100μl PBS，或不沖洗就直接加入細菌培養(yǎng)物染色劑。向每槽100μlPBS或細菌培養(yǎng)物中加入25μl 1％CV溶液(在~10％乙醇中)。在室溫下培養(yǎng)45分鐘后，從板中除去染料溶液。通過注入去離子水流并翻轉(zhuǎn)該板4至5次輕輕沖洗或使用自動吸移管管理器，立刻除去殘余染料。將沖洗過的板在室溫下晾干0.5至2小時。通過向每槽加入150μL 95％乙醇萃取緊附的染料，緊接著有力地混合10至15秒并在室溫下無搖動培養(yǎng)45分鐘。隨后，將稀釋(在乙醇中)的或未稀釋的CV萃取物的樣本轉(zhuǎn)移至平底聚苯乙烯微滴定濃度板，并用小板讀數(shù)器在586nm下測量吸光率。比較包含化合物的槽的讀數(shù)與僅僅包含DMSO的對照槽的讀數(shù)平均值。測量復(fù)制的樣本，并記錄復(fù)制槽數(shù)據(jù)值的平均值。
表2顯示了這種生物膜防止篩的效果，其中使用本文所述化合物進行實驗，采用的生物膜是參考實施例1中指明的三種細菌的生物膜。通過比較在每種化合物存在的情況下形成的生物膜和DMSO對照組，即每組4個樣本，根據(jù)生物膜減少的平均百分比來表達數(shù)據(jù)。使用所述的三種化合物濃度進行測定。正數(shù)表示化合物防止生物膜形成，而負數(shù)表示化合物增強生物膜形成(變化百分比系數(shù)是≤10％)。該表清楚地表明了特定化合物對一種或多種細菌生物膜的防止效力。
表2-1表2
表2-2表2(續(xù))
表2-3表2(續(xù))
表2-4表2(續(xù))
表2-5表2(續(xù))
表2-6表2(續(xù))
表2-7表2(續(xù))
表2-8表2(續(xù))
表2-9表2(續(xù))
表2-10表2(續(xù))
參考實施例2-生物膜分散篩，其用于篩選引發(fā)或促進已形成的生物膜分散的化合物。
如參考實施例1中，制備隔夜培養(yǎng)物并分配100μL的生長介質(zhì)，但在如參考實施例1中指明的條件下進行細菌培養(yǎng)和生長之前，既不加化合物也不加DMSO。
待生物膜在槽中生長后，除去每個槽中的液體，緊接著每槽用150μL PBS沖洗一次，然后除去槽中液體?；衔锏南♂屢杭瓤稍趩为毜男“逯杏脜⒖紝嵤├?所描述的相同方法(但每槽用100-150μL PBS，而不是生長介質(zhì))制備，緊接著將其加入到包含已經(jīng)長成的生物膜的經(jīng)過沖洗的槽中，也可將化合物直接加入到將要加入到槽中的100-150μL PBS中。然后如參考實施例1中所描述的，小板在20-250C下、不搖動或以每分鐘200轉(zhuǎn)的速度搖動進行培養(yǎng)0.5至24小時，緊接著用CV染色。任選地，在染色和測量之前，可另外用150μL PBS沖洗一遍板，緊接著加入1-100mM氫氧化鈉溶液并在20-250C下培養(yǎng)15至60分鐘。然后如參考實施例1中所描述完成CV染色和測量。在使用難以移動脫除的細菌生物膜時，這種任選的的二次處理可松動生物膜和改進分散篩對化合物作用的敏感性。
參考實施例3-改進的生物膜分散篩，其用于篩選引發(fā)或促進已形成的生物膜分散的化合物特此公開對參考實施例2中公開的方法進行修改后的方法，其大大改進了分散篩的敏感性和再現(xiàn)性。這種方法部分地基于這樣的觀察結(jié)果，即缺乏營養(yǎng)的生物膜例如那些如參考實施例2中用PBS中的化合物處理過的那些有著固有的不穩(wěn)定性，因此在生物膜分散測定中往往產(chǎn)生更多的虛假正面結(jié)果。在本文所描述的修改后的方法中，化合物在有新鮮液相生長介質(zhì)的情況下加入，以使得到的生物膜繼續(xù)生長，除非試驗化合物觸發(fā)生物膜的分散。
按上述方法制備隔夜培養(yǎng)物，并將100μL適當?shù)囊合嗌L介質(zhì)分配到兩個相同的96槽小板，在這種方式下，使每種細菌配備兩個相同的小板以進行測定。在細菌培養(yǎng)之前既不加化合物也不加DMSO，并允許兩個相同板中的細菌在如參考實施例1中指明的條件下生長24小時。
在槽中待測的生物膜生長后，從兩個小板中挑選一個，將其有生物膜附著的槽用CV進行染色，根據(jù)參考實施例1所描述的方法測量數(shù)量，并平均整個板各個槽的數(shù)據(jù)，得到一個生長控制值t0。每對小板中剩下的一個用DMSO中的化合物或只用DMSO進行處理作為對照槽首先，除去槽中的槽懸浮液，然后加入新鮮的100μL適當?shù)南嗤合嗌L介質(zhì)，緊接著直接加入并混合化合物DMSO溶液以得到390μM的最終化合物濃度。在與參考實施例1相同的條件下，將包含化合物的小板再連續(xù)培養(yǎng)22至26個小時。然后除去槽懸浮液，每槽加入溶于PBS中的100μL 0mM NaOH(表皮葡萄球菌)，20mM NaOH(熒光桿菌)或30mMNaOH(綠膿桿菌)溶液，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。因為試驗測定表明堿對采用表皮葡萄球菌菌種的實驗沒有增強作用，因此不向表皮葡萄球菌懸浮液中加入NaOH。隨后每槽用150μL PBS沖洗三次，緊接著除去最后的液體，按參考實施例1所描述用CV染色和測量數(shù)量。每個包含化合物的槽的數(shù)據(jù)構(gòu)成一個化合物值R，并且平均只包含DMSO的對照槽的數(shù)據(jù)以生成第二控制值t24。對照兩個控制值，每個被檢測的化合物對生物膜分散的作用通過下式進行計算 表3顯示了這種生物膜分散篩的效果，其中實驗使用本文所述化合物進行，采用的生物膜是如參考實施例1中指明的三種細菌的生物膜。對照兩個控制值，每組4個樣本，根據(jù)在每種化合物存在的情況下形成的生物膜減少的平均百分比來表達數(shù)據(jù)。按上述方法進行測定，使用的化合物濃度是390μM。正數(shù)表示化合物對現(xiàn)有生物膜的分散(減少)，而負數(shù)表示化合物對現(xiàn)有生物膜的增強(促進生長)(變化百分比系數(shù)是≤15％)。該表清楚地表明了特定化合物對一種或多種細菌的現(xiàn)有生物膜的分散效力。
表3-1表3
表3-2表3(續(xù))
表3-3表3(續(xù))
表3-4表3(續(xù))
表3-5表3(續(xù))
表3-6表3(續(xù))
用于生長在各種硬表面上的生物膜的鑒別模型為了檢測控制生物膜的化合物的效力，如應(yīng)用如參考實施例1中公開的那些化合物，已經(jīng)開發(fā)出用于在任何硬表面上生長的模型生物膜的量化方法。該方法還可用于確定存在于生物膜中的細菌對殺菌劑或其它抗菌劑的易感性，和用于確定引發(fā)生物膜分解的化合物的效力，如應(yīng)用如參考實施例2中公開的那些化合物。此前已經(jīng)描述了生長和檢測所定義的表面上生物膜的方法(參見，例如，美國專利6,051,423；5,605,836；6,326,190；2001/0049975；WO0077162；和歐洲專利1038972)，但是，這些方法不能應(yīng)用到許多不同的表面，不適用于高生產(chǎn)量模式，或者不易于量化操作，或有其它限制其廣泛應(yīng)用的方面。
本發(fā)明涉及這樣的方法，其可應(yīng)用于幾乎任何細菌在幾乎任何表面(包括聚合物、陶瓷、金屬、玻璃、復(fù)合物和天然表面如木材)上的生物膜生長，是定量的、可再現(xiàn)的，且適于高生產(chǎn)量的模式。通過選擇理想的染料和生長介質(zhì)，還可對本發(fā)明的方法進行修改以用于類似用途，如真菌如酵母菌。此外，本發(fā)明的方法可以使用許多取自生物膜的天然微生物接種體，這些生物膜存在于現(xiàn)實生活設(shè)施或自然環(huán)境中，如浴室瓷磚表面、馬桶表面、皮膚表面、水管、牙齒或醫(yī)療水管、土壤樣本等。
參考實施例4-基于在單體塑性小瓶中生長的生物膜生長和檢測方法對帶有內(nèi)螺紋帽和O形環(huán)的2ml聚丙烯低溫貯藏小瓶(Corning#2027)進行修改，向帽的空腔插入8毫米的圓片，該圓片可是浴室瓷磚、浴室隔間丙烯酸塑料或馬桶陶瓷?；蛘咄ㄟ^讓圓片的直徑稍大于塑性帽，或者通過提前在帽的空腔中應(yīng)用標準的聚硅氧烷粘合劑來使圓片固定在與帽的內(nèi)部頂端齊平的位置。完美結(jié)果是如圖1所描述的均勻表面，生物膜可在其上生長。
向修改的小瓶中注入0.5至1mL用果糖或丙酮酸鹽補充物改性的R2A介質(zhì)(如參考實施例1中所描述)，并用5至10μL的綠膿桿菌菌株ATCC 10145或熒光桿菌菌株ATCC 13525隔夜培養(yǎng)物進行培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的小瓶在20-250C下，在設(shè)定轉(zhuǎn)速是每分鐘1至3轉(zhuǎn)的組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上放置24小時。任選地，然后用新鮮介質(zhì)替換原來的1mL液體介質(zhì)，且再持續(xù)培養(yǎng)24小時；按此順序重復(fù)更換介質(zhì)和持續(xù)生長1至3次以得到所需厚度的生物膜。
生長之后，丟棄小瓶的底部并換之以包含200μL 1％CV溶液(在~10％乙醇中)的新鮮小瓶底部。然后重新用帽蓋上小瓶，重新將其放置在組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上，并在上述環(huán)境中培養(yǎng)約15至75分鐘以使生物膜染色。將小瓶帽移去并輕輕地將其浸入4份分開的去離子水中以除去非緊附的CV染料，緊接著除去帽表面多余的水。然后通過將帽旋入包含0.5至1.0mL 1％脫氧膽酸鈉在95％乙醇中的溶液(且可供選擇地4至6個直徑是1至3mm的玻璃珠以輔助除去染料)的新鮮小瓶底部，并劇烈搖動1至5分鐘。隨后，如參考實施例1中所描述的，將未稀釋的或稀釋(在乙醇中)的CV萃取的樣本轉(zhuǎn)移至平底聚苯乙烯微滴定濃度板，并用小板讀數(shù)器在586nm下測量吸光率。
表4顯示了重復(fù)的小瓶測定的結(jié)果，該測定使用由浴室標準白瓷磚制作的8毫米圓片，生長和量化的條件如上述熒光桿菌所指明的，生物膜生長24小時后更換一次液體生長介質(zhì)，共生長48小時。所報告的數(shù)據(jù)是在586nm下測量200μL萃取的染料溶液所得的光密度，一式六份。對照小瓶不用細菌進行培養(yǎng)，但跟培養(yǎng)的小瓶進行一樣的處理，且在CV量化步驟中空白數(shù)據(jù)代表只包含緩沖劑的微滴定濃度板槽。較小的數(shù)字表示較少的生物膜生長。該表表示，相對于對照組，這種方法能產(chǎn)生具有良好信噪比的可再現(xiàn)數(shù)據(jù)。
表4
參考實施例5-基于2-片生長室陣列的生物膜生長和檢測方法如圖2a、3和4所示，加工一個聚丙烯嵌段以產(chǎn)生一個24個單體圓柱體槽的陣列，這24個槽基本上模仿如參考實施例4中所描述的低溫貯藏小瓶底部(“嵌段底部”)。加工每個槽，以在槽的頂端是O形環(huán)或墊圈提供容座，且槽間距設(shè)計成與標準的96-槽小板的槽間距匹配，以便能用多路吸移管管理器進行液體操作。如圖2a、3和4所示，加工單獨的聚丙烯嵌段以提供凹槽蓋(“嵌段帽”)，用于容納108×108毫米的表面(如浴室瓷磚、陶瓷、塑料、玻璃)。嵌段底部包含用于定位嵌段帽和底部的金屬釘，而嵌段帽包含為容納來自嵌段底部的釘而鉆的孔。嵌段帽還包含一套螺釘以將表面夾緊到凹陷的支持平臺上。此外，嵌段底部包含一個改裝臂以將其安裝到組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器的機動化部分。將該表面附著到嵌段帽，然后將嵌段帽與底部定位好，以使表面接觸到O形環(huán)或墊圈，其對表面提供密封作用。在嵌段帽和底部都加工出螺紋孔以容納螺釘，該螺釘用于將嵌段帽和底部牢固地夾在一起以在O形環(huán)上提供充分的壓力來產(chǎn)生密封效果。這樣，如參考實施例3所描述，該整個部件裝配系統(tǒng)精確地模仿出24槽小瓶-帽部件裝配系統(tǒng)。任選地，可容易地修改嵌段設(shè)計以適應(yīng)其它較大規(guī)模的格式(如48或96槽)。
向嵌段底部的槽中注入0.5至1mL如考實施例1所描述的介質(zhì)，并用5至10μL參考實施例1所描述的細菌菌株的隔夜培養(yǎng)物進行培養(yǎng)。然后將嵌段底部和包含標準尺寸白色浴室瓷磚的頂部定位并夾在一起，然后將該部件裝配系統(tǒng)在適當溫度下放在旋轉(zhuǎn)速度設(shè)定在每分鐘1至3轉(zhuǎn)的組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上或放進搖動培養(yǎng)器中，持續(xù)24小時。任選地，然后用新鮮介質(zhì)替換原來的1mL液體介質(zhì)，且培養(yǎng)再持續(xù)24小時；按此順序重復(fù)更換介質(zhì)和持續(xù)生長1至3次以得到所需厚度的生物膜。
生長之后，移開嵌段底部并用200μL 1％CV溶液(在~10％乙醇中)更換原來的液體。然后重新裝配好嵌段系統(tǒng)，重新將其放置在組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上，并在上述環(huán)境中培養(yǎng)約15至75分鐘以使生物膜染色。拆開嵌段系統(tǒng)各部分，在溫和的去離子水流下沖洗包含瓷磚表面的嵌段帽，直至除去所有可見的非緊附染料。任選地，可使用試管刷和常見的洗滌劑除去任何吸附在嵌段底部槽壁的多余染料；這有助于減少由于有時會發(fā)生的非具體染色而出現(xiàn)的任何背景。作為更快的可選擇的方法，可只需用一個新的或預(yù)先清潔過的嵌段底部更換該染色的嵌段底部。然后向每個槽滴入0.5至1.0mL 1％脫氧膽酸鈉在95％乙醇中的溶液(且可供選擇地4至6個直徑是1至3mm的玻璃珠以輔助除去染料)，以萃取瓷磚表面的緊附染料，重新裝配好嵌段帽和底部，然后或者重新將其放置在組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上，緊接著在上述環(huán)境中培養(yǎng)約0.5至2小時，或任選地，劇烈搖動1至5分鐘。隨后，如參考實施例1所描述，將吸取的未稀釋的或稀釋的(在乙醇中)CV萃取物樣本從解開的嵌段轉(zhuǎn)移至平底聚苯乙烯微滴定濃度板，并用小板讀數(shù)器測量吸光率，然后同對照組加以比較。
使用后，移去并丟棄表面，槽80/85很容易能用試管刷和常見的洗滌劑制劑清潔后供再次使用。
根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，描述檢測防止生物膜形成的化合物的本生長和檢測方法可容易地應(yīng)用于篩選引發(fā)生物膜分散的化合物，其操作是首先讓生物膜在沒有這些化合物的條件下生長，然后測量加入這些化合物之后的效果。
表5顯示了使用所述方法收集的數(shù)據(jù)，熒光桿菌生物膜在標準浴室無光澤白瓷磚上連續(xù)生長72小時，包括兩次更換液體生長介質(zhì)。使用了聚丙烯嵌段帽和底部。所報告的數(shù)據(jù)是在586nm下測量200μL萃取的染料溶液所得的光密度，共16組培養(yǎng)槽和8組對照槽。對照槽(第5和6列)沒有用細菌培養(yǎng)，但跟培養(yǎng)槽(第1至4列)進行一樣的處理。較小的數(shù)字表示較少的生物膜生長。
表5
*無可獲得數(shù)據(jù)表6顯示了類似的光密度數(shù)據(jù)，也是使用所述方法收集的，但采用的是表皮葡萄球菌生物膜在標準浴室有光澤白瓷磚上生長72小時，包括兩次更換液體生長介質(zhì)。使用了聚丙烯嵌段帽和底部。所報告的數(shù)據(jù)是光密度測量結(jié)果，共20組培養(yǎng)槽(第1至5列)和4組對照槽(第6列)。較小的數(shù)字表示較少的生物膜生長。
表6
*無可獲得數(shù)據(jù)表5和表6一起清楚地證明了上述檢測方法實現(xiàn)了多種細菌的可再生生物膜生長，并且適于檢測生物膜控制化合物的效力。
參考實施例6-基于3-片生長室陣列的生物膜生長和檢測方法除槽孔鉆至完全貫穿嵌段外，如圖2b、3和4所示，加工聚丙烯或TEFLON嵌段以產(chǎn)生24個單體圓柱體槽的陣列，如參考實施例5所示。制作兩個與上述及圖2b、3和4所示的蓋部件(嵌段帽)相同的蓋部件。
除了當更換嵌段底部槽中的液體生長介質(zhì)時，只需移去一個蓋部件外，3P-GCA的使用與參考實施例5所述的2P-GCA相同。這種設(shè)計的優(yōu)點是，如果研究的是敏感的生物膜，在整個方法中它們完全不會受到干擾。如果研究的生物膜是對干擾不敏感的，那么3P-GCA的另一個優(yōu)點是其每個蓋部件90的兩個表面30都可用于生長生物膜，特別是為了生物膜的生長將3P-GCA安放在組織培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)器上，以使液體生長介質(zhì)能接觸兩個表面30。
根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，通過最優(yōu)化生長介質(zhì)組合物和體積、通風(fēng)(旋轉(zhuǎn)速率)、溫度、介質(zhì)更換、接種體大小、以及其它化學(xué)、物理和生物參數(shù)，2P-GCA和3P-GCA都是充分多用的，能生長和檢測在任何表面上任何細菌或真菌的生物膜。
表7顯示了使用上述3P-GCA方法檢測的化合物，采用的是表皮葡萄球菌生物膜在標準浴室無光澤白瓷磚上生長72小時，包括兩次更換液體生長介質(zhì)。使用了聚丙烯嵌段組件。所報告的數(shù)據(jù)是光密度測量結(jié)果，每種檢測的化合物有3組培養(yǎng)槽，包括3個培養(yǎng)的和3個未培養(yǎng)的槽組，相對應(yīng)的是第1列(化合物32)、第2列(化合物168)、第3列(化合物226)、第4列(培養(yǎng)的對照槽)和第5列(未培養(yǎng)的對照槽)。較小的數(shù)字表示較少的生物膜生長。
表7
從數(shù)據(jù)可看出，化合物32和226明顯地具有強大的生物膜阻止活性，而化合物168在該種檢測方法中具有更加溫和的效果，同參考實施例1和2所描述的方法相比，這種方法更實際但生產(chǎn)量較小。
根據(jù)本公開內(nèi)容，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，描述檢測阻止生物膜形成的化合物的本生長和檢測方法可容易地應(yīng)用于篩選引發(fā)生物膜分散的化合物，其操作如下首先讓生物膜在沒有這些化合物的條件下生長，然后測量加入這些化合物之后的效果。
雖然已經(jīng)舉例說明和描述了本發(fā)明的特定實施方案，根據(jù)本公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明精神和范圍的條件下，可以對其進行各種改變或變化。因此在附加的權(quán)利要求書中將覆蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化或改變。
權(quán)利要求
1.裝置，所述裝置用于檢測基質(zhì)表面生物膜控制，并包括第一主體，所述第一主體具有支持無凸起的可移動基質(zhì)表面的平臺，所述基質(zhì)表面用于生長生物膜；和第二主體，所述第二主體適于同軸接受所述第一主體，所述第二主體具有多個單體槽；其中當所述第一和第二主體裝配起來并使用時，這些槽與所述第一主體的基質(zhì)表面保持液體密封流通。
2.裝置，所述裝置用于檢測基質(zhì)表面生物膜控制并包括第一和第三主體，每個主體具有支持無凸起的可移動基質(zhì)表面的平臺，所述基質(zhì)表面用于生長生物膜；和第二主體，其具有第一面和第二面，所述第二主體以三明治對齊的方式在所述第一面和第二面接受所述第一主體和第三主體，所述第二主體具有多個從所述第一面伸展到所述第二面的單體孔，這些孔的兩端形成槽開口，當裝配好所述裝置進行使用時，這些孔與所述第一和第三主體的基質(zhì)表面保持液體密封流通。
3.篩選用于基質(zhì)表面生物膜控制的試驗化合物的方法，所述方法包括獲得如權(quán)利要求2所述的裝置；在容許沒有試驗化合物在基質(zhì)表面形成生物膜的條件下，在所述裝置的槽中用試驗化合物培養(yǎng)生物膜形成的微生物；比較有所述試驗化合物和沒有所述試驗化合物兩種情況下生物膜在所述基質(zhì)表面的形成，其中當有所述試驗化合物情況下生物膜的形成少于沒有所述試驗化合物的情況時，則說明所述試驗化合物對生物膜在所述基質(zhì)表面的形成有抑制活性，和其中當有所述試驗化合物情況下生物膜的形成多于沒有所述試驗化合物的情況時，則說明所述試驗化合物對生物膜在所述基質(zhì)表面的形成有促進活性。
4.篩選用于分散基質(zhì)表面現(xiàn)有生物膜的試驗化合物的方法，所述方法包括獲得如權(quán)利要求2所述的裝置；在所述裝置的槽中培養(yǎng)生物膜形成的微生物以在所述基質(zhì)表面形成生物膜；用試驗化合物接觸所述基質(zhì)表面的生物膜；比較有所述試驗化合物和沒有試驗化合物兩種情況下所述基質(zhì)表面的生物膜的量，其中當有所述試驗化合物情況下生物膜的量少于沒有所述試驗化合物的情況時，則說明所述試驗化合物對所述基質(zhì)表面的生物膜的分散有活性。
5.用于增強具有生物膜分散活性的化合物對分散的生物膜的量的作用的方法，所述方法包括用具有生物膜分散活性的化合物培養(yǎng)生物膜足夠長的時間以使所述化合物分散生物膜；向所述生物膜添加堿；培養(yǎng)生物膜足夠長的時間以增強所述化合物的作用；和確定當前生物膜的量；其中同沒有堿相比，堿的存在增強了所述化合物的作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于控制生物膜的氮雜環(huán)化合物、組合物和方法，即，分裂生物膜、阻止生物膜的形成、加強生物膜或修改生物膜。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所使用的設(shè)備和篩選用于生物膜控制的試驗化合物的方法。
文檔編號C07D205/04GK1699545SQ20051007657
公開日2005年11月23日 申請日期2002年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月27日
發(fā)明者C·R·德根哈德特, R·A·格瑞林, C·A·迪勒, C·S·坦斯基 申請人:寶潔公司