專利名稱：一種番茄rna病毒寄主因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種番茄RNA病毒寄主因子及其編碼基因與其在植物抗病毒育種上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番茄是一種重要的水果型蔬菜。在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中，容易受到各種病害的危害，其中以病毒性病害最為嚴(yán)重。目前報(bào)道的侵染番茄的病毒大多數(shù)是RNA病毒，其中最常見的RNA病毒有7種，即黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、煙草花葉病毒(Tabacco mosaic virus，TMV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)和番茄褪綠斑病毒(Tomatochlorotic spot virus，TCSV)。
由于病毒是嚴(yán)格的專性寄生物，至今還沒有嚴(yán)格選擇性的化學(xué)藥劑能有效地用于植物病毒病的防治。在生產(chǎn)實(shí)踐中主要以清除毒源和切斷病毒的傳播途徑、用化學(xué)藥劑殺死介體昆蟲和培育抗病新品種等預(yù)防性措施來控制病毒病的危害，其中以培育抗病新品種最為經(jīng)濟(jì)有效。然而，常規(guī)的抗病育種方法過程繁瑣，需要大量的人力物力，更重要的是抗病基因常與不良農(nóng)藝形狀基因連鎖，難以達(dá)到抗病優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)要求；另一方面，抗性基因資源的缺乏也限制了常規(guī)育種方面的應(yīng)用。植物基因工程在育種上的應(yīng)用為植物病毒病的防治開辟了新的途徑(Powell A.P.，N elson R.S.，HoffmanN.，et al.Delay of disease development in transgenic plants that express thetobacco mosaic virus coat protein gene.Science，1986，232738-743)。目前獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因植株的方法主要有兩種一是將來源于病毒自身的基因或基因的調(diào)控序列(如病毒的外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因及其片段、運(yùn)動(dòng)蛋白基因及其3’或5’端非編碼區(qū)、病毒反義RNA、核酶基因以及病毒衛(wèi)星RNA等)導(dǎo)入受體植物，從而獲得病毒起源的抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株(Lomonossoff G.P.，1995.Pathogen-derived Resistance to Plant Viruses，Annu.Rev.Phytopathol.，33323-343)，但是利用這種方法得到的抗病毒植株一般表現(xiàn)為垂直抗病性，而且，這一方法存在一定的潛在的危險(xiǎn)因素，即用于轉(zhuǎn)化植物的病毒序列有可能與田間存在的病毒發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的病毒；另一種方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)來獲得抗病毒植物(Goldbach R.，Bucher E.，and Prins M.2003.Resistancemechanisms to plant virusesan review.Virus Research.，92207-212)。
對(duì)病毒寄主因子基因的研究，為抗病毒基因工程提供了一條新的途徑。寄主因子(Host Factors)是指在病毒侵染過程(包括病毒入侵、病毒基因表達(dá)、病毒粒子裝配及釋放等)中寄主細(xì)胞提供給病毒的一切便利條件，也稱寄主蛋白(host proteins)或細(xì)胞蛋白(cellular proteins)。寄主細(xì)胞內(nèi)如果缺少這些寄主因子，病毒便不能復(fù)制或復(fù)制的效率大大降低(Ahlquist P.，Noueiry，A.O.，and Lee，W.M.，et al.，2003.Host Factor in Positive-Strand RNA Viruses Genome Replication.Journalof Virology，77(15)8181-8126.)。因此，通過抑制或沉默寄主細(xì)胞中支持病毒復(fù)制的基因，將有可能使其不支持病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和維持，從而獲得廣譜性的抗病毒植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種番茄RNA病毒寄主因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的番茄RNA病毒寄主因子，名稱為ToTOM1，來源于番茄屬番茄(Lycopersicon esculentum Miller)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有支持病毒復(fù)制作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由288個(gè)氨基酸殘基組成。包含多個(gè)高疏水性的區(qū)域，推測(cè)該蛋白是一種具有6-7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，與擬南芥AToTOM1基因在氨基酸水平上的同源性為74.9％。
編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
番茄RNA病毒寄主因子的編碼基因(ToTOM1)包括番茄RNA病毒寄主因子的cDNA基因和番茄RNA病毒寄主因子的基因組基因。其基因組基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由6727個(gè)堿基組成，具有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第1-158位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端的第838-928位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端的第1015-1067位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5′端的第1941-2033位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自5′端的第2109-2180位堿基為該基因組基因的第五個(gè)外顯子，自5′端的第3052-3131位堿基為該基因組基因的第六個(gè)外顯子，自5′端的第3236-3274位堿基為該基因組基因的第七個(gè)外顯子，自5′端的第3498-3561位堿基為該基因組基因的第八個(gè)外顯子，自5′端的第5842-5895位堿基為該基因組基因的第九個(gè)外顯子，自5′端的第6342-6419位堿基為該基因組基因的第十個(gè)外顯子，自5′端的第6497-6727位堿基為該基因組基因的第十一個(gè)外顯子，自5′端的第9-11位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5′端的第6587-6589位堿基為該基因組基因的終止密碼子TGA；自5′端的第159-837位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第929-1014位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第1068-1940位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第2032-2108位堿基為該基因組基因的第四個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第2181-3051位堿基為該基因組基因的第五個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3132-3235位堿基為該基因組基因的第六個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3273-3497位堿基為該基因組基因的第七個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3562-5841位堿基為該基因組基因的第八個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第5996-6341位堿基為該基因組基因的第九個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第6420-6496位堿基為該基因組基因的第十個(gè)內(nèi)含子。
其cDNA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №3由1282個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5′端第31-897位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
含有上述番茄RNA病毒寄主因子編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌以及擴(kuò)增番茄RNA病毒寄主因子編碼基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗病毒植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育抗病毒植物的方法，是將ToTOM1的反義基因片段或ToTOM1的RNA干擾表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因植株。
可按照植物基因工程領(lǐng)域中的常規(guī)方法，將ToTOM1的反義基因片段或ToTOM1的RNA干擾表達(dá)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法等。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可為茄科、十字花科或葫蘆科的植物。
本發(fā)明所提供的番茄RNA病毒寄主因子ToTOM1是一種RNA病毒在植物體內(nèi)存活的相關(guān)蛋白，通過轉(zhuǎn)反義基因片段或RNA干擾的方法沉默植物體內(nèi)的該蛋白的編碼基因可得到抗病毒的植物。轉(zhuǎn)基因植株的抗病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)ToTOM1反義RNA的轉(zhuǎn)基因番茄顯著抑制了CMV在番茄中的積累量，與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株相比，發(fā)病時(shí)間明顯推遲，癥狀也顯著減輕，此外，轉(zhuǎn)ToTOM1的RNA干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因番茄植株TMV的積累量也比對(duì)照非轉(zhuǎn)基因番茄顯著減少，表明番茄ToTOM1是CMV和TMV的一個(gè)寄主因子基因，通過抑制或沉默ToTOM1可獲得抗CMV和TMV的番茄品種。本發(fā)明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM1及其抑制該基因表達(dá)的方法，在抗病毒植物培育和育種中具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為ToTOM1的3’RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2為含ToTOM1的3’RACE產(chǎn)物的重組質(zhì)粒的BamH I和Xho I酶切鑒定圖譜圖3為ToTOM1的5’RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖4為含ToTOM1的5’RACE產(chǎn)物的重組質(zhì)粒的EcoR I酶切鑒定圖譜圖5為PCR擴(kuò)增的ToTOM1的基因組基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖6為含ToTOM1的基因組基因片段的重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖7為含ToTOM1基因片段的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜圖8為轉(zhuǎn)基因用植物表達(dá)載體pBI121圖9為PCR擴(kuò)增的ToTOM1基因組片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖10為外源片段在pUCm-T中連接方向的酶切鑒定圖譜圖11為ToTOM1的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIT1-2的酶切鑒定圖譜圖12為PCR擴(kuò)增的用于構(gòu)建RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒的ToTOM1 cDNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖13為重組質(zhì)粒pUCGAT1(-370)的酶切鑒定圖譜圖14為RNA干擾中間載體pUCGAToTOM1(RNAi-370)的酶切鑒定圖譜圖15為RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒pBIToTOM1(RNAi-370)的Pst I酶切鑒定圖譜圖16為轉(zhuǎn)化有反義ToTOM1的抗Kn番茄植株的PCR鑒定圖譜圖17為PCR鑒定轉(zhuǎn)化有反義ToTOM1的陽(yáng)性植株的Southern雜交檢測(cè)結(jié)果圖18為抗卡那霉素的表達(dá)RNA干擾片段的轉(zhuǎn)基因植株的35S、NOS、內(nèi)源ToTOM1基因和NPTII基因的PCR檢測(cè)結(jié)果圖19為PCR反應(yīng)陽(yáng)性的獨(dú)立RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交圖譜圖20為接種CMV 10天后非轉(zhuǎn)基因植株圖21為接種CMV 10天后反義RNA轉(zhuǎn)基因植株圖22為接種CMV 25天后非轉(zhuǎn)基因植株圖23為接種CMV 25天后表達(dá)反義RNA轉(zhuǎn)基因植株具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用番茄品種為購(gòu)自廣西農(nóng)科院的“超級(jí)大明星”。
實(shí)施例1、番茄寄主因子基因ToTOM1的全長(zhǎng)cDNA序列的克隆1、ToTOM1 3’端cDNA的克隆根據(jù)GenBank搜尋到的與擬南芥AtTOM1[gi9967414]具有一定同源性的番茄EST序列BE458681(528nt)[gi9502983]設(shè)計(jì)兩條正向引物擴(kuò)增ToTOM1 3’端的cDNA序列，引物序列如下Tomato Tom1-A5’CTCCCTTTGTGCTTCC-TATGGTCT 3’；Tomato Tom1-15’GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC 3’利用3’RACE System for Rapid Amplication of cDNA Ends試劑盒(Invitrogen公司，目錄號(hào)18373-027)合成ToTOM1 3’端的cDNA序列。提取番茄的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA，以此第一鏈cDNA為模板，在引物Tomato Tom1-A和上述試劑盒提供的引物AUAP5’GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’引導(dǎo)下，進(jìn)行第一次PCR，再以第一次PCR產(chǎn)物為模板，在引物Tomato Tom1-1和引物AUAP的引導(dǎo)下，進(jìn)行第二次PCR，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNA Ladder，泳道1為ToTOM1的3’RACE產(chǎn)物)，表明擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約1000bp的特異性條帶?；厥赵撎禺愋訮CR產(chǎn)物，將其與載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選后挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1為ToTOM1的3’RACE PCR片段，泳道2-5為含ToTOM1的3’RACE PCR片段的重組質(zhì)粒的BamH I和Xho I酶切產(chǎn)物)，表明克隆到的長(zhǎng)度約1000bp的ToTOM1的3’RACE PCR片段已正確插入到載體TOPO TA中，將該重組載體命名為pCToT1-3。對(duì)pCToT1-3進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明所插入的DNA片段長(zhǎng)度為1077bp，具有序列表中SEQ ID №3的自5’端第206-1282位的DNA序列，該DNA片段的3’端具有長(zhǎng)度為15個(gè)堿基的poly(A)尾。
2、ToTOM1 5’端cDNA的克隆根據(jù)GenBank搜尋到的與擬南芥ATOM1具有一定同源性的番茄EST序列BE458681(528nt)[gi9502983]設(shè)計(jì)兩條正向引物擴(kuò)增ToTOM1 5’端的cDNA序列，引物序列如下Tomato Tom1-25’CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’；
Tomato Tom1-B5’TCCTGAGCTTATCTGTTGGTAAACTCCTAGCCT-3’利用SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒(Clontech公司，目錄號(hào)K1881-1)合成ToTOM1 5’端的cDNA序列。提取番茄的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA，以此第一鏈cDNA為模板，在引物Tomato Tom1-2和上述試劑盒提供的引物UPM5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’的引導(dǎo)下進(jìn)行第一次PCR，再以第一次PCR產(chǎn)物(稀釋100倍)為模板，在引物Tomato Tom1-B和引物NUP5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’的引導(dǎo)下進(jìn)行第二次PCR，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道M為100bp DNA Ladder Plus泳道1為ToTOM1的5’RACE產(chǎn)物)，表明擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約500bp的特異性條帶。回收該特異性PCR產(chǎn)物，將其與載體TOPO TA連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選后挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖4所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1為ToTOM1的5’RACEPCR片段，ToTOM1的3’RACE PCR片段，泳道2-5為含ToTOM1的5’RACE PCR片段的重組質(zhì)粒的EcoR I酶切產(chǎn)物)，表明克隆到的長(zhǎng)度約500bp的目的片段已正確插入到載體TOPO TA中，將該重組載體命名為pCToT1-5。對(duì)pCToT1-5進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明所插入的DNA片段長(zhǎng)度為448bp，具有序列表中SEQ ID №3的自5’端第1-448位的DNA序列。
3、ToTOM1全長(zhǎng)cDNA的獲得對(duì)步驟1和步驟2獲得的5’RACE PCR片段和3’RACE PCR片段進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果表明兩片段具有一段長(zhǎng)度為243nt的重疊區(qū)，此重疊區(qū)在步驟2獲得的5’RACE PCR片段的5’端的第279位堿基處有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Mun I的酶切位點(diǎn)，在載體pCToT1-3和pCToT1-5的序列上有一個(gè)限制性內(nèi)切酶Xha I的酶切位點(diǎn)。利用Mun I和Xba I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將3’RACE和5’RACE的cDNA連接起來，得到ToTOM1的全長(zhǎng)cDNA。對(duì)該全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該序列具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中SEQ ID №3由1282個(gè)核苷酸組成，3’端具有長(zhǎng)度為15個(gè)堿基的poly(A)尾。用Vector NTI軟件對(duì)ToTOM1全長(zhǎng)的cDNA序列進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果表明其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第31-897位堿基，其5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為30個(gè)堿基，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為385個(gè)堿基，編碼序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列，將ToTOM1與擬南芥AtTOM1編碼的氨基酸殘基序列進(jìn)行同源性比較，ToTOM1與擬南芥AtTOM1在氨基酸水平上的同源性為74.9％。用Kyte & Doolittle的方法(Kyte & Doolittle，A simple method for displaying the hydropathiccharacter of a protein，J Mol Biol，157(1)105-132)對(duì)ToTOM1編碼的蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果表明ToTOM1編碼的蛋白質(zhì)具有高疏水性的區(qū)域，推斷該蛋白是一種具有6-7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。
實(shí)施例2、番茄ToTOM1基因組片段的克隆根據(jù)已獲得的番茄ToTOM1的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼區(qū)的自5’端第23-45位堿基序列和自5’端第1035-1012位堿基序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ToTOM1的基因組序列，引物序列如下ToTOM 1-D5’-GAGCTGAAATGGCTAGGTTGCCG-3’；ToTOM 1-E5’-CGTTGAATCTTTGCCTTTCCGCAG-3’以番茄的總DNA為模板，在引物ToTOM1-D和引物ToTOM1-E的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1為PCR擴(kuò)增的ToTOM1的基因組片段)，表明擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約6.7kb的特異性條帶。回收該特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，將其克隆到載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)中，對(duì)其進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(泳道1為CKpCR2.1-TOPO，泳道1-6為含有ToTOM1基因組片段的重組質(zhì)粒)，然后用限制性內(nèi)切酶Sac I和Xba I進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖7所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1為含有ToTOM1基因組基因片段的重組質(zhì)粒的Sac I和Xba I酶切產(chǎn)物)，表明克隆到的長(zhǎng)度約6.7kb的目的片段已正確插入到載體pCR2.1 TOPO中，將含有該目的片段的重組質(zhì)粒命名為pT1DE-9。對(duì)pT1DE-9進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明ToTOM1的基因組基因具有序列表中SEQ ID№2的多核苷酸序列，該序列由6727個(gè)堿基組成，將其與ToTOM1的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明ToTOM1的基因組基因具有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第1-158位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端的第838-928位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端的第1015-1067位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5′端的第1941-2033位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自5′端的第2109-2180位堿基為該基因組基因的第五個(gè)外顯子，自5′端的第3052-3131位堿基為該基因組基因的第六個(gè)外顯子，自5′端的第3236-3274位堿基為該基因組基因的第七個(gè)外顯子，自5′端的第3498-3561位堿基為該基因組基因的第八個(gè)外顯子，自5′端的第5842-5895位堿基為該基因組基因的第九個(gè)外顯子，自5′端的第6342-6419位堿基為該基因組基因的第十個(gè)外顯子，自5′端的第6497-6727位堿基為該基因組基因的第十一個(gè)外顯子，自5′端的第9-11位堿基為該基因組基因的起始密碼子ATG，自5′端的第6587-6589位堿基為該基因組基因的終止密碼子TGA；自5′端的第159-837位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第929-1014位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第1068-1940位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第2032-2108位堿基為該基因組基因的第四個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第2181-3051位堿基為該基因組基因的第五個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3132-3235位堿基為該基因組基因的第六個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3273-3497位堿基為該基因組基因的第七個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第3562-5841位堿基為該基因組基因的第八個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第5996-6341位堿基為該基因組基因的第九個(gè)內(nèi)含子，自5′端的第6420-6496位堿基為該基因組基因的第十個(gè)內(nèi)含子。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得一、植物表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例中所用的二元表達(dá)載體為pBI121(Clontech)，其物理圖譜如圖8所示，具有T-DNA整合的必需序列，以卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因，從多克隆位點(diǎn)插入的外源基因由CaMV 35S啟動(dòng)子控制。
1、含有ToTOM1基因組基因反義片段的植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例2克隆的番茄ToTOM1的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Tomato Tom1-1(5’-GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC-3’)和Tomato Tom1-2(5’-CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’)。以番茄的總DNA為模板，在引物Tomato Tom1-1和引物Tomato Tom1-2的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖9所示(泳道M為1Kb DNA Marker，泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，表明擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約2.6kb的特異性條帶?；厥赵撎禺愋詳U(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行兩端測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該DNA片段為ToTOM1的一段核苷酸片段。將回收的ToTOM1的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到載體pUCm-T(上海生工)中，并用限制性內(nèi)切酶Kpn I進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖10所示(泳道M為1Kb DNA Marker，泳道1為回收片段與pUCm-T的正向連接產(chǎn)物，泳道2為回收片段與pUCm-T的反向連接產(chǎn)物的Kpn I酶切產(chǎn)物，泳道3為回收片段與pUCm-T的正向連接產(chǎn)物的Kpn I酶切產(chǎn)物)，表明該基因片段分別以正向與反向的形式連接到載體pUCm-T中，將其中反向連接的重組質(zhì)粒命名為pUT1-2。將已克隆在pUT1-2中的ToTOM1片段用限制性內(nèi)切酶EcoR V和Xba I切下，經(jīng)凝膠電泳后回收該DNA片段，將其連接到經(jīng)Sma I和XbaI雙酶切的載體pBI121上，得到ToTOM1的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIT1-2，對(duì)其用限制性內(nèi)切酶HindIII進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖11所示(泳道M為1kb DNA Marker，泳道1為未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒pBIT1-2，泳道2為pBIT1-2的HindIII酶切產(chǎn)物)，表明ToTOM1的DNA片段已正確連接到載體pBI121中，獲得了構(gòu)建正確的ToTOM1的植物表達(dá)載體。
2、番茄ToTOM1的RNAi干擾表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)番茄ToTOM1的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)兩條引物，引物序列如下ToTOM1-RNAi-2F(879-899)CCTCAGATCTGCACAATACCACCCAAT(劃線部分堿基為Bgl II識(shí)別位點(diǎn))；ToTOM1-RNAi-2R(1258-1227)CCTCACTAGTAAAGGAGATCCAGAACATC(劃線部分堿基為Spe I識(shí)別位點(diǎn))以含有番茄ToTOM1全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒為模板，在引物ToTOM1-RNAi-2F(879-899)和引物ToTOM1-RNAi-2R(1258-1227)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端分別含有限制性內(nèi)切酶Bgl II和Spe I識(shí)別位點(diǎn)的ToTOM1的cDNA片段，命名為TT1，該DNA片段的1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖12所示(泳道M為GeneRuler 100bp DNAladder，泳道1為TT1)，表明擴(kuò)增到了370bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致?；厥赵撈?，將其用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Spe I雙酶切后克隆到經(jīng)同樣酶雙酶切的RNA干擾載體pUCGA(構(gòu)建方法以馬鈴薯總DNA為模板，在引物GA-F5’-AGGGAGCTCCTCGAGACTAGTAGATCTGGTACGGACCGTACTACTCTATTCG-3’(劃線部分堿基依次為限制性內(nèi)切酶Sac I、Xho I、Spe I和Bgl II的識(shí)別位點(diǎn))和引物GA-R5’-AGGGGATCCCTATATAATTTAAGTGGAAAAAAAGGTTAAC-3’(劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到馬鈴薯GA20氧化酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子片段(199bp)，對(duì)該片段用Sac I和BamH I酶切，與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pUC18(TaKaRa公司)連接，將獲得的重組載體命名為pUCGA)上，得到含有該回收片段的重組載體，命名為pUCGAT1(-370)，對(duì)該重組載體用限制性內(nèi)切酶Pst I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖13(泳道M為GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1為pUCGA的Pst I酶切產(chǎn)物，泳道2為pUCGAT1(-370)的Pst I酶切產(chǎn)物)所示，表明該回收DNA片段已正確連接入載體pUCGA中。用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamHI對(duì)pUCGAT1(-370)進(jìn)行雙酶切后，再與經(jīng)Bgl II和Spe I雙酶切的TT1連接，得到ToTOM1的重組RNA干擾中間質(zhì)粒，命名為pUCGAToTOM1(RNAi-370)。對(duì)該重組RNA干擾中間載體用限制性內(nèi)切酶Pst I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖14所示(泳道M為GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1為pUCGAT1(-370)的Pst I酶切產(chǎn)物，泳道2為pUCGAToTOM1(RNAi-370)的PstI酶切產(chǎn)物)。將連有ToTOM1的RNA干擾片段TT1的RNA干擾質(zhì)粒pUCGAToTOM1(RNAi-370)用限制性內(nèi)切酶Sal I酶切后補(bǔ)平，再用限制性內(nèi)切酶Spe I進(jìn)行酶切，經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳后回收長(zhǎng)度約900bp的小片段，將回收片段連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR V和Xba I雙酶切的載體pBI121上，得到番茄ToTOM1的RNAi干擾植物表達(dá)質(zhì)粒，命名為pBI121ToTOM1(RNAi-370)，將其用限制性內(nèi)切酶Pst I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖15所示(泳道M1為GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道M2為GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道1為pBI121的Pst I酶切產(chǎn)物，泳道2為pBIToTOM1(RNAi-370)的Pst I酶切產(chǎn)物)，表明獲得了構(gòu)建正確的番茄ToTOM1的RNAi干擾植物表達(dá)質(zhì)粒。
二、番茄的遺傳轉(zhuǎn)化1、三親結(jié)合將植物表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2導(dǎo)入農(nóng)桿菌分別將含植物表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的大腸桿菌與含有輔助質(zhì)粒pRK2073的大腸桿菌和農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行三親本結(jié)合(Rogers S.G.，Horsch R.B.，and Fraley R.T.1986.Gene transfer in plantproduction of transformed plants using Ti-plasmidvectors.Methods Enzymol.，118627-640)，在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素的LA平板進(jìn)行篩選，得到含有植物表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。
2、番茄的遺傳轉(zhuǎn)化1)用含表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的農(nóng)桿菌EHA105感染外植體將步驟1獲得的含植物表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的農(nóng)桿菌在含50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素的YEB平板上劃線，置于28℃恒溫中培養(yǎng)約24h，長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落接種于含相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床(200轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)約24h至OD600為04-0.6，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm離心10min，棄上清液，將收集的菌體用MS培養(yǎng)液清洗一次并重新懸浮，稀釋50倍后用于番茄的轉(zhuǎn)化。參考JavierPozueta-Romero等人的方法(Pozueta-romero，J.，Houlnè，G.， ，L.，et al.2001.Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants forAgrobactereium-mediated transformation.Plant cell，Tissue and organ culture.，67173-180)制備Flamingo Bill外植體，具體方法為將番茄的種子一個(gè)個(gè)地分開，用蒸餾水洗3次，然后用80％乙醇浸泡并不停地?cái)噭?dòng)2分鐘，另加4-6滴100％的Tween-80，倒去乙醇溶液，再用無菌水洗滌2-3次加入有效氯為1％的NaClO溶液和4-6滴100％Tween-80在攪拌器上攪動(dòng)15分鐘，把NaClO溶液倒去，用無菌水洗2次，再重復(fù)二次，直至番茄種子的顏色由褐色變?yōu)榻瘘S色，用無菌水沖洗6-10次，在無菌濾紙上晾干。晾干后把種子接入裝有1/2MS培養(yǎng)基(含1.5％的蔗糖)的培養(yǎng)瓶中，在25-28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，再把培養(yǎng)瓶放在超凈臺(tái)中，打開蓋子，并補(bǔ)充培養(yǎng)瓶中的水分，使無菌苗在開放的環(huán)境下培養(yǎng)15個(gè)小時(shí)，然后將培養(yǎng)的無菌苗的一側(cè)子葉從葉柄基部連同頂芽及周圍分生組織全部切去，只留一側(cè)子葉，另外將無菌苗的大一部分根系切去只保留長(zhǎng)度為2-3cm的胚根作為外植體。
將外植體放入活化的含表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的農(nóng)桿菌EHA105的MS液體培養(yǎng)基中(另加終濃度為100μmol/L的乙酰丁香酮)，不停地?fù)u動(dòng)10分鐘，取出后用無菌水沖洗兩次，然后一根根地放入倒有MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基(在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加玉米素0.15mg/L和吲哚乙酸0.05mg/L)的15cm直徑的大培養(yǎng)皿中，封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
2)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)2天后，將含表達(dá)質(zhì)粒pBIT1-2的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化后的外植體轉(zhuǎn)接入分化篩選培養(yǎng)基中(在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了ZT 0.15mg/L，IAA 0.05mg/L，Km 50mg/L和Cef 200mg/L)，繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3個(gè)星期，培養(yǎng)條件為25-28℃，15小時(shí)光照，9小時(shí)黑暗。
3)轉(zhuǎn)基因植株的生根、煉苗及移栽將在分化篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)正常的植株(長(zhǎng)到高度約2-3cm)從愈傷組織上切下，插入生根培養(yǎng)基中(在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了Km 50mg/L，Cef 150mg/L，NAA 0.2mg/L)，25-28℃，15小時(shí)光照，9小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)直至生根。待再生苗的根系長(zhǎng)約3cm時(shí)將培養(yǎng)瓶的蓋子打開并補(bǔ)充水分，在25-28℃，光照條件為15小時(shí)/天下，放置3-4天，然后將植株慢慢地拔出，洗凈根部所帶的瓊脂，移植到土壤中，保持土壤的濕度，并將溫度控制在25-30℃。
用上述同樣方法將番茄ToTOM1的RNAi干擾表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化番茄植株。
三、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定1、反義RNA轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定共獲得19株卡那霉素(Kn)抗性反義RNA轉(zhuǎn)基因植株。在盆栽前對(duì)小苗進(jìn)行外源基因的PCR檢測(cè)，具體方法為取抗Kn的轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片，用CTAB法提取番茄植株葉片的總DNA，并以此為模板，在引物Tomato-ToTOM1-1和根據(jù)35S啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)的一條引物序列5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖16所示(泳道M為lambda/HindIII+EcoRI，泳道1-19為用轉(zhuǎn)化有反義ToTOM1的不同轉(zhuǎn)基因植株的總DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道20為陽(yáng)性對(duì)照，以質(zhì)粒pBIT1-2為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，表明19株中有12株轉(zhuǎn)基因植物中能擴(kuò)增出大小約為3300bp的外源目的基因片段。將PCR鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄植株命名為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12，編號(hào)分別對(duì)應(yīng)圖16中的泳道1、2、3、4、7、8、9、10、13、14、17和19。
將PCR鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行盆栽，4個(gè)星期后提取其總DNA，用Sal I酶切后經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離，通過向下毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移到雜交膜上，與P32標(biāo)記的以Tomato-ToTOM1-1以及35S啟動(dòng)子上的一條引物5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’獲得的PCR片段進(jìn)行Sonthern雜交，結(jié)果如17所示(泳道M為1kb DNA marker，泳道CK為非轉(zhuǎn)基因植株，泳道T1-T12為不同的轉(zhuǎn)基因株系)，表明除了出現(xiàn)內(nèi)源ToTOM1的雜交帶外(圖中箭頭所示)，還有外源ToTOM1的雜交帶，所有PCR檢測(cè)陽(yáng)性的植株均有外源ToTOM1片段的插入。由Sal I酶切片段顯示的大小差異判斷，一半以上的轉(zhuǎn)基因植株的外源基因片段插入到染色體的不同位點(diǎn)，即屬于不同的轉(zhuǎn)基因株系。部分植株的插入片段大小相近(如T1、T3)，不易判斷，還需用其它酶切后再進(jìn)行雜交分析才能確定。不過，番茄的染色體堿基數(shù)目巨大，外源基因插入到同一位置的可能性極小，所以，所得到的轉(zhuǎn)基因植株有可能均是不同的株系。圖17還顯示出大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株是單拷貝的，但有3株是雙拷貝的(T4、T9、T10)。
2、RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株的鑒定共獲得93株抗卡那霉素的RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株。盆栽前作初步的PCR檢測(cè)，在引物Kam-R5’-GATCTGGATCGTTTCGCATG-3’和引物Kam-F5’-AAGGCGATAGAAGGCGATGC-3’的引導(dǎo)下擴(kuò)增NPTII，在引物NOS-F5’-TGCTACCHAHCTCHAATTTC-3’和NOS-R5‘-ACGACGGCCAGTGAATTCCC-3’的引導(dǎo)下擴(kuò)增NOS，在引物35S-F5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’和ToTOM1-RNAi-2F(的引導(dǎo)下擴(kuò)增35S，在引物TA-TOM1-15’-GGGTACCCGAGTATGGCTGGACAAC-3’和TA-TOM1-25’-CCACCATATAGCAGAAAGCCCAAGG-3’的引導(dǎo)下擴(kuò)增ToTOM1，其中63株抗性植株的NPTII、NOS、35S和內(nèi)源ToTOM1基因檢測(cè)為陽(yáng)性，部分檢測(cè)結(jié)果如圖18所示(泳道M為GeneRuler 100bp DNA ladder，泳道1-5為抗性植株的35S檢測(cè)(泳道1-5依次為MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道6-10為NOS檢測(cè)(泳道6-10依次為MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道11-15為內(nèi)源ToTOM1檢測(cè)(泳道11-15依次為MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)，泳道16-20為NPTII基因檢測(cè)(泳道16-20依次為MLC-ToTOM1-RNAi-370-11，-49，-71，-79，-80)。將陽(yáng)性植株進(jìn)行盆栽。一個(gè)月后用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在32株中僅有3株(MLC-TOTOM1-RNAi370-71，-79和-80)仍有陽(yáng)性信號(hào)。提取這3株呈陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，用EcoR I完全酶切后經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離，通過向下毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移到雜交膜上，與P32標(biāo)記的RNA干擾TT1片段進(jìn)行Sonthern雜交，結(jié)果如圖19所示(泳道M為GeneRuler 1kb DNAladder，泳道ck(-)為非轉(zhuǎn)基因番茄的EcoR I酶切產(chǎn)物，ck(+)為pBITOTOM1RNAi-370的EcoR I酶切產(chǎn)物，泳道1為MLC-TOTOM1-RNAi370-80，泳道2為MLC-TOTOM1-RNAi370-79，泳道3為MLC-TOTOM1-RNAi370-71)，表明除了4.2kb的內(nèi)源雜交帶外，所有的轉(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)一條大小不同的第二條雜交帶，證明RNA干擾片段已整合到番茄基因組上。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株的抗病性檢測(cè)一、反義RNA轉(zhuǎn)基因植株的抗病性實(shí)驗(yàn)采用摩擦接種法，用黃瓜花葉病毒(CMV)對(duì)實(shí)施例3獲得所有5-6葉期轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行摩擦接種，以相同生長(zhǎng)期的非轉(zhuǎn)基因番茄為對(duì)照。
1、癥狀表現(xiàn)接種CMV 10天后，非轉(zhuǎn)基因的番茄實(shí)生苗對(duì)照開始出現(xiàn)花葉癥狀，新長(zhǎng)出的葉片明顯失綠(圖20)，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)正常(圖21)；二十五天時(shí)，對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株的癥狀已非常嚴(yán)重，新長(zhǎng)出的葉片幾乎完全失綠，而且新葉畸形(圖22)。此時(shí)的轉(zhuǎn)基因植株雖然也表現(xiàn)癥狀，但比對(duì)照要明顯減輕，葉片僅有些褪綠(圖23)。
2、轉(zhuǎn)基因番茄植株內(nèi)病毒相對(duì)量的測(cè)定以莧色藜為枯斑寄主，用生物定量法測(cè)定轉(zhuǎn)基因番茄植株內(nèi)病毒相對(duì)含量。接種二十天后，取番茄植株的部分新葉(約0.5g)磨成勻漿，分別接種到枯斑寄主植物莧色藜的葉片，每個(gè)處理接2張葉片，設(shè)2個(gè)重復(fù)，五天后統(tǒng)計(jì)枯斑的數(shù)目并進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果如表1所示，表明以轉(zhuǎn)基因番茄為接種源，在莧色藜上形成的枯斑數(shù)均顯著低于對(duì)照實(shí)生番茄植株。其中轉(zhuǎn)基因植株T9形成的枯斑數(shù)(34.5個(gè)/葉)僅為對(duì)照(119個(gè)/葉)的29％。不同的轉(zhuǎn)基因株系在莧色藜上形成的枯斑的數(shù)量有明顯的差異，如T1植株的枯斑數(shù)(68.5個(gè)/葉)比T9植株(34.5個(gè)/葉)高出近1倍。枯斑試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)反義ToTOM1番茄的CMV濃度要明顯低于非轉(zhuǎn)基因番茄。
表1 轉(zhuǎn)反義ToTOM1基因番茄在枯斑寄主莧色藜上的生物定量

二、表達(dá)RNA干擾片段轉(zhuǎn)基因植株的抗病性實(shí)驗(yàn)采用摩擦接種法，用煙草花葉病毒(TMV)對(duì)實(shí)施例3獲得的3株RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株(5-6葉期)進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，以處于相同生長(zhǎng)期的的非轉(zhuǎn)基因番茄為對(duì)照，觀察并記錄結(jié)果，結(jié)果表明接種10天后，非轉(zhuǎn)基因番茄苗呈現(xiàn)斑駁癥狀，而轉(zhuǎn)基因植株無任何癥狀表現(xiàn)。接種70天后，非轉(zhuǎn)基因植株仍表現(xiàn)為斑駁癥狀，轉(zhuǎn)基因植株仍無任何癥狀表現(xiàn)。75天后，稱取轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的新生葉(倒數(shù)第三張新生葉)0.1g，用DAS-ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的病毒含量，具體方法為樣品加1ml包被緩沖液(0.015 M Na2CO3，0.035 M NaHCO3，pH9.6)磨成勻漿，稀釋1000倍后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，表明所有的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)TMV的濃度均明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。
表2 表達(dá)ToTOM1 RNA干擾片段轉(zhuǎn)基因植株的TMV的DAS-ELISA定量

序列表<160>3<210>1<211>288<212>PRT<213>番茄屬番茄(Lycopersicon esculentum Miller)<400>1Met Ala Arg Leu Pro Leu Gly Ser Ser Pro Ile Asp Ile Ala Gly Pro1 5 10 15Val Thr Asn Trp Trp Asp His Val Asn Glu Ser Val Gln Trp Gln Asp20 25 30Gly Ile Phe Tyr Ser Leu Cys Ala Ser Tyr Gly Leu Val Ser Ala Val35 40 45Ala Leu Ile Gln Leu Ile Arg Ile Asp Leu Arg Val Pro Glu Tyr Gly50 55 60Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe His Leu Met Asn Phe Val Val Asn Gly65 70 75 80Val Arg Ala Ile Val Phe Gly Phe His Lys His Val Phe Leu Leu His85 90 95Tyr Lys Val Leu Thr Leu Ala Ile Leu Asp Leu Pro Gly Leu Leu Phe100 105 110Phe Ser Thr Phe Thr Leu Leu Val Leu Phe Trp Ala Glu Ile Tyr His115 120 125Gln Ala Arg Ser Leu Pro Thr Asp Lys Leu Arg Ile Ser Tyr Ile Ala130 135 140Ile Asn Gly Ala Ile Tyr Phe Ile Gln Ala Cys Ile Trp Val Tyr Leu145 150 155 160Trp Ile Asn Asp Asn Ser Thr Val Glu Phe Ile Gly Lys Ile Phe Met165 170 175
Ala Val Val Ser Val Ile Ala Ala Leu Gly Phe Leu Leu Tyr Gly Gly180 185 190Arg Leu Phe Leu Met Leu Arg Arg Phe Pro Ile Glu Sar Lys Gly Arg195 200 205Arg Lys Lys Leu His Glu Val Gly Ser Val Thr Ala Ile Cys Phe Thr210 215 220Cys Phe Leu Ile Arg Cys Phe Val Val Val Leu Ser Ala Phe Asp Ser225 230 235 240Asp Ala Ser Leu Asp Val Leu Asp His Pro Val Leu Asn Leu Ile Tyr245 250 255Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser Ala Leu Val Leu Tyr Ile Leu260 265 270Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Val Ser Ala Gln Tyr His Pro Ile Ser275 280 285<210>2<211>6727<212>DNA<213>番茄屬番茄(Lycopersicon esculentum Miller)<400>2gagctgaaat ggctaggttg ccgcttgggt cgtcgccgat tgacatcgcc ggtccggtga 60ccaactggtg ggaccacgtc aacgaatccg ttcagtggca agatgggatt ttctactccc120tttgtgcttc ctatggtctt gtttcagcag ttgccctagt aagtttctct ttctcttcca180ttctcttttt ctgctctgta gatatgtaaa gattggtttt ttctttcctt tttgtgaatt240tcacgatcaa agtagagttt gggagctgaa atgccggaat tgatgttaga tgatttatat300tttcaactcc tactaatttg atgttgagat gcagttgata gaattgcagt gtctagttca360tgtataaagt caagtacttg ctgttagttg tttttttttt cgtaacttct gttaaaaatg420gaaaatcttg gttggtcaac tgtaggaatg aaataatgga gtagggaatc agacgagaat480gtttgattac caagtgcaat ttaggggttt ccattaagac aaattacggt atattttgtg540cttttttatg tcgctaataa aagtttggag cagtggactg actggttaat catacttctg600gtaggttcgg ttagatggtt agtatttggg agtactcctt ttgtgtgtgc ttgtgaagct660
tatgaccttt tccaataagt agataagttt cattgaaggg tgttttttca tactttgatt 720aatatgtgtt tcagatacag tatttaccta atactgcatg tgtagagaac tgttttcctc 780gtggtgcttg cttagtcgca ggacttttgg ttgagtctat gagttaacta tgtgcagatt 840caattaatac gaattgattt gagggtaccc gagtatggct ggacaacaca aaaggtgttc 900catctgatga actttgttgt aaatggaggt aaagcggact cagactaaac aaaccgtcca 960gctctttttc ttaatctgga attttgtttt aaatgcaaat cttttgtttt tcagttcgtg1020caattgtctt tggatttcac aaacatgttt ttctgctcca ttataaggta atattctttc1080ttaaaagtaa cttttcaatt gtcaatattt tttcttaatt atgttcagtt tgttttcaat1140agaacgcgac aatatatgca aacctgaata tattgccttt gttcttatca gccatttaac1200ttttccccaa ataatggttc ttttcctata gtgcgtcaac ttacatagga actatcaaaa1260atcaaaatta ggtcagaact gtacctagaa aatttatcac ctgatgggac cattttcaag1320gcaagtgcat gcatgttact tttgctgatt ggagctgtag gctttcttat atctttgaca1380ctcttaactt tgagcttaat ttgacatttt agattcctta ccttctaatt tatttattcg1440gaaggtcatc ctgctctctt acagctagta caatccaata gcagttcagc aatccttgtt1500tgttaatgtg tgagctaatt ggattgaaag cacattagta tatacattct gtctttcaga1560ttccagtttg aagcttatca cctagttact catcttttac ttgccctaaa attttggttt1620gactgtgatg ggccgatgac attgttcaag tgcttagttc ctctgcagcc agcaacaccg1680tagtgttacc atgtcaatcc tttagctttg actatcattt tattgagatg aattttctgt1740tagcaataac gaatctactg aaagcacctc ccctttacga cttccgtgat ctctttcctt1800catttgggtg ggctactaat ggccccgtcc ctttttagcc cgataactta agaagtagaa1860ataattaaca tgcccacaac tgcctcttaa actgctgcct aattgttaac ctgatgttag1920atttgcttca cgataaccag gtgctgactc tggcaatatt ggacctacca gggctccttt1980tcttttcaac attcacactc cttgttctat tttgggctga gatatatccc caggcaagtg2040aagttatagc atcttgcagg caaactgtaa atctattgat tctaaccctt gcatttatgt2100aatggcaggc taggagttta ccaacagata agctcaggat ttcttatatt gccattaatg2160gtgccatata cttcattcag gtttgctaca aatgtatccc ctgctcatac gctattggac2220atcatggttg ttcatatgga aatataatcg atcaagtatt attacttatt tttattttgt2280ctctagtaat atgtgaattc ctttaagatt cttttacgcc agtcaaaccc atctactttt2340gggttctatt tgataacccc ttgtattttg gtggtgacag gggtggatta gtgtagaagt2400tatgggttca actgaaaaag ggttcctgga acccaacatt agctcaaacc ctgtatatat2460gttaaaaatt ttgtaaacaa gtaaacataa tagattttga acccactaaa tcaatcgggt2520tgtggtagaa tttctgagac acataaagtt cgaatcctgg agccgcctca ttgatctgtg2580ggcatatgtg tgcttctcaa tatgtggaat tctgagatat tcttctttct caaaatgtta2640
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1.一種番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有支持病毒復(fù)制作用的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的番茄RNA病毒寄主因子的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于其基因組基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于其cDNA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求2或3或4所述編碼基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求2或3或4所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求2或3或4所述編碼基因的宿主菌。
8.一種培育抗病毒植物的方法，是將ToTOM1的反義基因片段或ToTOM1的RNA干擾表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的植物宿主為茄科、十字花科或葫蘆花科的植物。
10.權(quán)利要求2或3或4所述編碼基因在培育抗病毒植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種番茄RNA病毒寄主因子及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一種番茄RNA病毒寄主因子及其編碼基因與其在植物抗病毒育種上的應(yīng)用。該番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有支持病毒復(fù)制作用的蛋白質(zhì)。通過轉(zhuǎn)反義基因片段或RNA干擾的方法沉默植物體內(nèi)的該蛋白的編碼基因可得到抗病毒的植物。本發(fā)明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM1及其抑制該基因表達(dá)的方法，在抗病毒植物培育和育種中具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1709908SQ20051007665
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日
發(fā)明者陳保善, 程海榮, 蒙姣榮, 劉遙測(cè), 林海燕 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)