專利名稱：Muc1粘蛋白的一個模擬表位肽及其編碼dna與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥和基因工程領(lǐng)域，特別是涉及MUC1粘蛋白的一個模擬表位肽及其編碼DNA與其在制備抗腫瘤疫苗和藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤疫苗是腫瘤生物學(xué)治療的一種手段，其研究已有近百年歷史。1991年Boon等首次成功分離了CTL特異性識別的人惡性黑色素瘤抗原MAGE-1，為腫瘤疫苗的研究創(chuàng)立了新的里程碑(Boon等，A gene encoding an antigen recognized bycytolytic T lymphocytes on a human melanoma.Science.1991 Dec13；254(5038)1643-7.)。腫瘤疫苗主要是通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答來打破機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫耐受而起作用。用作腫瘤疫苗的免疫原主要包括完整的自體或異源性腫瘤細(xì)胞、修飾的腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)抗原、合成糖鏈抗原、腫瘤抗原肽、腫瘤抗原刺激或轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞、抗獨(dú)特型抗體及其衍生物、重組病毒或細(xì)菌疫苗和核酸疫苗等。
目前有多個腫瘤相關(guān)抗原被用于腫瘤疫苗的制備。
MUC1粘蛋白(以下簡稱MUC1)是表達(dá)于細(xì)胞表面的一種高分子量(＞200kD)膜糖蛋白，具有兩個基本特征(1)糖鏈含量占全分子量的50％以上，多以∶型糖苷鍵與多肽骨架上的糖基化位點(diǎn)連接；(2)多肽骨架中含有20-125個由“HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA’共20個氨基酸殘基組成的連續(xù)重復(fù)序列(variablenumbers of tandem repeats，VNTRs)，所有O型糖基化位點(diǎn)均位于VNTRs中。研究表明，MUC1在多種上皮來源惡性腫瘤(乳腺、胰腺、卵巢、結(jié)腸、肺、胃、膀胱、腎臟、食管)中異常表達(dá)，主要表現(xiàn)在(1)表達(dá)量增高較正常可提高100倍以上；(2)表達(dá)部位改變在正常組織中表達(dá)于細(xì)胞近管腔或腺腔一側(cè)，即呈頂端表達(dá)(apical expression)，不與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸，而在腫瘤中，整個細(xì)胞表面均表達(dá)，因此，可與免疫系統(tǒng)接觸；(3)結(jié)構(gòu)異常主要由于糖基化不全，出現(xiàn)新的糖鏈及肽表位。
自80年代中期，F(xiàn)inn等發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)存在可特異識別腫瘤MUC1的CTL細(xì)胞以來(Finn等，Specific，major histocompatibility complex-unrestrictedrecognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Sep；86(18)7159-63.)，MUC1一直是腫瘤疫苗研究的一個熱點(diǎn)分子，用MUC1制備的腫瘤疫苗主要有多肽疫苗、DNA疫苗、樹突狀細(xì)胞疫苗、重組牛痘病毒疫苗、糖鏈疫苗等，有些疫苗的研究已進(jìn)入I/II/III期臨床。研究表明，MUC1糖鏈瘤苗在體內(nèi)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答；MUC1多肽疫苗雖然在動物模型中可誘導(dǎo)較強(qiáng)的CTL應(yīng)答，但在人體中卻主要以體液免疫應(yīng)答為主，且個別病例出現(xiàn)自身免疫現(xiàn)象。另外，腫瘤患者血循環(huán)中含有較高水平的MUC1蛋白，會對注入體內(nèi)的單抗或瘤苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體起封閉作用，從而大大降低了療效。
因此，制備新的基于MUC1分子的腫瘤疫苗，將有助于解決上述問題。模擬表位(mimotopes)肽疫苗就是其中的一種。模擬表位是指一級結(jié)構(gòu)完全不同的兩種物質(zhì)由于具有相同的空間構(gòu)象，能與同一抗體或T細(xì)胞表面受體的抗原結(jié)合區(qū)相結(jié)合。模擬表位能模擬各種天然抗原的抗原決定簇，目前常用的有多肽模擬蛋白表位和多肽模擬多糖或糖脂表位兩種。與天然的表位相比，理論上模擬表位具有如下優(yōu)勢①在天然表位未知的情況下也能獲得模擬表位用于預(yù)防和治療；②通過分子改造，能增強(qiáng)模擬表位與MHC分子的結(jié)合，更有利于T淋巴細(xì)胞的激活；③模擬表位一般為非自身蛋白，有望增強(qiáng)肌體對原表位的免疫應(yīng)答，或打破對原表位的免疫耐受狀態(tài)[13 14 15]。最近研究表明，用腫瘤抗原的模擬表位作為免疫原可在轉(zhuǎn)基因小鼠及人體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，且未發(fā)現(xiàn)自身免疫現(xiàn)象。
模擬表位的獲得有多種方法，其中基于噬菌體展示技術(shù)建立的噬菌體隨機(jī)肽庫是目前最常用的篩選模擬表位的技術(shù)之一。其基本思路是將化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸序列與噬菌體衣殼蛋白III或VIII基因進(jìn)行融合，使各種氨基酸排列的短肽表達(dá)于不同的噬菌體表面，構(gòu)建噬菌體隨機(jī)肽庫；通過生物淘洗(biopanning)篩選出能與抗體或淋巴細(xì)胞表面受體相結(jié)合的短肽配體，測序鑒定插入的編碼序列，獲得模擬表位的氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供MUC1粘蛋白的一個模擬表位肽及其編碼DNA。
本發(fā)明所提供的MUC1粘蛋白的模擬表位肽，名稱為M1，來源于M13噬菌體(PhageM13)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有誘導(dǎo)MUC1粘蛋白特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答作用的多肽。
序列表中的SEQ ID №1由12個氨基酸殘基組成。
本發(fā)明同時(shí)提供編碼本發(fā)明MUC1粘蛋白的模擬表位肽M1的DNA(M1)，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由36個堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明DNA的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的內(nèi)容。
擴(kuò)增M1中任一片段的引物對也為本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)上述MUC1粘蛋白的模擬表位肽的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述MUC1粘蛋白的模擬表位肽的方法，是將含有上述MUC1粘蛋白的模擬表位肽編碼DNA的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
所述宿主為任一可表達(dá)外源基因的原核或真核細(xì)胞。
所述原核細(xì)胞可為大腸肝菌，如E.coli BL21、E.coli M15、E.coli JM109或E.coliDH5α等。
所述真核細(xì)胞可為哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞等。包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。
用于構(gòu)建含有MUC1粘蛋白的模擬表位肽編碼DNA的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBluescript SK-、pTrx、pTrxFus、pQE-30、pCAT3系列、pβ-gal系列、pcDNA3.1(+/-)、pCMV系列、pCMVScript、pd2EGFP系列、pGL3系列、pIND(SP1)/V5-HisA、pTET-Splice、pVgRXR或pPIC系列等。
培養(yǎng)含有本發(fā)明的MUC1粘蛋白的模擬表位肽編碼DNA的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤疫苗和一種抗腫瘤藥物。
本發(fā)明所提供的抗腫瘤疫苗和抗腫瘤藥物，活性成分均為上述MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
需要的時(shí)候，在上述抗腫瘤藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以與抗生素、免疫刺激劑等進(jìn)行組合治療，并可通過選擇合適的抗原遞呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)、佐劑或細(xì)胞因子(如IL-2)聯(lián)合應(yīng)用來強(qiáng)化特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液等多種形式。
上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為0.5-2mg MUC1粘蛋白的模擬表位肽/kg體重/day，療程為10-20天。
本發(fā)明通過MUC1單抗篩選噬菌體隨機(jī)肽庫獲得的模擬表位肽M1，可作為活性成份制備成疫苗或藥物用于體內(nèi)，誘導(dǎo)出針對MUC1的細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答，抑制或清除表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明也可以與其它藥物聯(lián)合使用，預(yù)防和治療多種腫瘤疾病。本發(fā)明在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為濃度為100、200、400、800μg/mL M1肽分別與Ma695單克隆抗體混合后和乳腺癌細(xì)胞MCF7的競爭性抑制檢測結(jié)果。
圖2為流式細(xì)胞儀檢測免疫小鼠血清與MUC1+腫瘤細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖3為ELISPOT技術(shù)檢測免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中M1肽特異性T細(xì)胞比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖4為以BST739、BST739-MUC1為靶細(xì)胞、效靶比為50∶1、100∶1時(shí)的靶細(xì)胞溶破率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖5為腫瘤預(yù)防模型各組腫瘤大小比較結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有測序工作均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。
實(shí)施例1、MUC1粘蛋白的模擬表位肽M1的獲得噬菌體隨機(jī)12肽庫(Ph.D.-12)購自New England Biolabs公司。
一、Ph.D.-12肽庫的生物淘洗(Biopanning)選擇可識別腫瘤MUC1糖肽表位的Ma695單克隆抗體(購自北京中杉生物技術(shù)有限公司)作為靶分子對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行篩選，得到MUC1的模擬表位肽M1，具體方法如下第一輪篩選用包被液(0.1M NaHCO3，pH8.6)將Ma695單克隆抗體的濃度調(diào)為約10μg/mL，每孔加入100μL上述抗體液包被酶標(biāo)板，在4℃、濕盒中放置12-24小時(shí)；棄掉包被液，用力拍掉殘留液，每孔加滿封閉液(0.1M NaHCO3(pH8.6)，1％BSA)，4℃放置1小時(shí)，棄掉封閉液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20(V/V))快速洗6次.每次拍掉殘留液，不要使孔干燥；用100μL TBST稀釋10μL(4×1010pfu)噬菌體庫液，加入孔中，室溫輕搖60min；棄掉未結(jié)合的噬菌體液，拍掉殘留液；用TBST洗10次，每次6min，并用吸管上下劇烈吹打；加入100μL洗脫液(0.2M Glycine-HCl，pH2.2，1mg/ml BSA)，室溫孵育8min，將洗脫液移到1.5mL離心管中，立即加入30μL中和液(1M Tris-HCl，pH9.1)，混勻；取經(jīng)10-1，10-2，10-3，10-4梯度稀釋的洗脫液各10μL測滴度。剩余洗脫液進(jìn)行擴(kuò)增，方法同上。
第二-四輪篩選方法同第一輪，加入2×1011pfu擴(kuò)增噬菌體，TBST中Tween-20的濃度提高到0.5％(V/V)。
二、噬菌斑的擴(kuò)增取經(jīng)培養(yǎng)12-24小時(shí)的大腸桿菌XL1-blue，按1∶100的比例用LB稀釋(含10μg/mL Tet(Sigma))，每個試管中加入1mL經(jīng)稀釋的菌液，用槍頭挑取單個第四輪擴(kuò)增后測定滴度后的藍(lán)斑，接種于上述含10μg/mL Tet的LB培養(yǎng)基中，37℃ 260rpm培養(yǎng)4.5h；培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液4℃ 10000rpm離心30sec，取上清重復(fù)離心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至終濃度為50％后于-20℃保存。
三、用ELISA法對獲得的噬菌體克隆進(jìn)行分析將Ma695單克隆抗體用包被液稀釋成10μg/mL，包被雙條可拆酶標(biāo)板，每孔100μL，平行作兩孔，4℃靜置12-24小時(shí)；棄掉包被液，每孔加滿封閉液，37℃封閉1h；用TBST(含0.5％Tween-20，下同)洗6次，取步驟二經(jīng)擴(kuò)增后的噬菌體克隆，每個取50μL+150μL TBST，混勻，加入板孔中，同時(shí)取2μL原庫+200μL TBST作為對照，RT輕搖1h；用TBST洗8次，每孔加入用封閉液(含1mg/mL BSA)按1∶5000比例稀釋的HRP/AntiM13單抗(amercham pharmacia biotech)100μL，室溫輕搖1h，TBST洗8次；每孔加入100μL TMB顯色液，37℃下顯色10-15min，再加入50μL 2MH2SO4終止顯色，測定OD450值，結(jié)果如表1所示，挑選與對照比值大于2的噬菌體克隆提取ssDNA進(jìn)行測序和分析。
表1 噬菌體克隆的ELISA分析結(jié)果

四、M1的獲得選取結(jié)合活性最強(qiáng)的噬菌體克隆進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果推導(dǎo)出與Ma695抗體結(jié)合的肽表位序列，共獲得5種各含12個氨基酸的肽表位，將其中一個命名為M1，M1具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列，序列表中SEQ ID №1由12個氨基酸殘基組成，編碼M1的DNA具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸，序列表中的SEQID №2由36個堿基組成。選擇M1用下述方法作進(jìn)一步研究。
實(shí)施例2、M1肽、Ma695與MCF7的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)將濃度為100、200、400、800μg/mL M1肽分別與經(jīng)稀釋濃度為0/25μg/mL的Ma695單克隆抗體混合，冰上放置5min，再與乳腺癌細(xì)胞MCF7(ATCC)混合，冰上放置45min，再以2％PBA洗滌兩次，加入1∶100稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的第二抗體，避光、冰上放置45min；以PBS洗滌兩次后，用預(yù)冷的PBS 200μl重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測，熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果如圖1所示(縱坐標(biāo)為陽性細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度)，表明M1肽競爭性抑制Ma695與MCF7細(xì)胞的結(jié)合，抑制效應(yīng)具有劑量依賴性，當(dāng)細(xì)胞數(shù)為2×105個、Ma695濃度為0.25μg/mL、M1肽濃度分別為100、200、400、800μg/mL時(shí)，陽性細(xì)胞百分比分別為92.7％、87.7％、86.7％和82.5％，相對熒光強(qiáng)度分別為3.85、3.20、3.20、2.80。根據(jù)相對熒光強(qiáng)度變化情況，按公式計(jì)算抑制率抑制率＝(抑制前熒光強(qiáng)度-抑制后熒光強(qiáng)度)/抑制前熒光強(qiáng)度×100％。抑制率分別為11％、26％、26％和34％，表明M1肽能競爭性抑制Ma695抗體與原表位的結(jié)合，是真正的模擬表位。
實(shí)施例3、流式細(xì)胞儀檢測免疫小鼠血清與MUC1+腫瘤細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)1、用負(fù)載M1肽的樹突狀細(xì)胞(DC)免疫小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)T739小鼠斷頸處死，無菌取脾，磨碎，過200目不銹鋼濾網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液；裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌3次后，按2×106/ml的細(xì)胞密度加入塑料培養(yǎng)皿，4小時(shí)后棄懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加入DC專用培養(yǎng)基及細(xì)胞因子(IL-41000U/mL，GM-CSF 1000U/mL)，隔日半量換液；第六天收集懸浮和疏松貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)皿中，加入LPS(1μg/mL)刺激DC成熟。
收集成熟DC，按10μg/mL的濃度加入M1肽或TAT-M1，37℃、5％CO2濃度和飽和濕度下培養(yǎng)1小時(shí)，其間間斷搖動數(shù)次。洗滌兩次后，根據(jù)成熟DC純度，以PBS調(diào)整至DC密度為2×106個/mL。4～8周齡雌性T739隨機(jī)分為四組，每組2-4只，尾靜脈注射0.1mL成熟DC懸液(2×105/鼠)，或空DC，或相應(yīng)體積的PBS。每周免疫一次，共三次；TAT-M1肽只免疫一次。
2、DC+PBS免疫小鼠方法同1，用PBS替換M1肽。
3、PBS免疫小鼠方法同2，不加DC。
4、流式細(xì)胞儀檢測免疫小鼠血清與MUC1+腫瘤細(xì)胞(指細(xì)胞表面表達(dá)有MUC1的腫瘤細(xì)胞)的結(jié)合情況取步驟1-3免疫小鼠的眼球收集血清，三種血清分別按1∶20比例稀釋后與不表達(dá)MUC1的小鼠來源膀胱癌細(xì)胞BST739(MUC1-小鼠來源膀胱癌細(xì)胞BST739(蔣鋒，周性明，張忠林等.可移植性小鼠膀胱移行細(xì)胞癌模型的建立[J].中華泌尿外科雜志，1993，14(2)184-186))、乳腺癌細(xì)胞MCF7(MUC1+乳腺癌細(xì)胞MCF7，ATCC)和前列腺癌細(xì)胞PC-3(MUC1+前列腺癌細(xì)胞PC-3，ATCC)以及BST739-MUC1(在BST739細(xì)胞中轉(zhuǎn)入人MUC1全長cDNA(GenBankJ05582)，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)MUC1)結(jié)合，對照為正常小鼠血清，用流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞數(shù)和相對熒光強(qiáng)度(異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記)。結(jié)果如圖2所示(縱坐標(biāo)為陽性細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。1為負(fù)載M1肽的DC免疫后的小鼠血清；2為DC+PBS免疫后的小鼠血清。A為MUC1-小鼠來源膀胱癌細(xì)胞BST739，B為MUC1+乳腺癌細(xì)胞MCF7，C為MUC1+前列腺癌細(xì)胞PC-3，D為BST739-MUC1，負(fù)載M1肽的成熟DC免疫T739小鼠后，小鼠血清能與MUC1+乳腺癌細(xì)胞MCF7、MUC1+PC-3和BST739-MUC1結(jié)合，但不與MUC1-BST739結(jié)合；用DC+PBS免疫獲得的小鼠血清與來源于人的MUC1+MCF7和MUC1+PC-3部分結(jié)合(陽性率分別為26％和13.5％)，但不與同系小鼠來源的MUC1-小鼠來源膀胱癌細(xì)胞BST739和BST739-MUC1結(jié)合；以PBS免疫后的小鼠血清不與上述任何一種細(xì)胞結(jié)合。
實(shí)施例4、ELISPOT技術(shù)檢測免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中M1肽特異性T細(xì)胞比例用與實(shí)施例3相同的方法得到負(fù)載M1肽的成熟DC，并將其免疫T739小鼠，以DC+PBS免疫的小鼠為對照(與實(shí)施例3相同)；用同樣方法將TAT-M1肽(化學(xué)合成，HPLC純化)免疫T739小鼠。用ELISPOT技術(shù)檢測免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中M1肽特異性T細(xì)胞比例(所用ELISPOT檢測試劑盒購自荷蘭U-Cytech公司)用50μL稀釋好的包被抗體包被96孔板，添加PBS至100μL，用粘紙封口防止蒸發(fā)，4℃孵育12-24小時(shí)，棄上清，PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗5-10次，每次1分鐘，每次洗滌后在吸水紙上反復(fù)拍干。200μL封閉液(含1％BSA的PBS)封閉每孔，37℃孵育1h或4℃孵育12-24小時(shí)。棄上清，勿洗。每孔加入100μL制備的單層細(xì)胞懸液(抗原刺激5×104個細(xì)胞/孔)。蓋上蓋子，37℃、5％CO2濃度和飽和濕度下孵育5h，期間保持孵箱震動，防止影響斑點(diǎn)形成。棄上清，每孔加入200μL冰冷的去離子水，冰上放置10min，PBST洗10次，拍干。棄上清，每孔加入100μL經(jīng)稀釋的生物素檢測抗體，37℃孵育1h或4℃孵育12-24小時(shí)。棄上清，PBST洗5-10次，拍干。每孔加入50μL經(jīng)稀釋的抗生物素抗體(GABA)，37℃孵育1h。棄上清，PBST洗5-10次，拍干(孔內(nèi)不要?dú)埩粝匆?。每孔加入30μL新鮮配制的顯色劑(冰上加)，室溫、暗處放置，孵育15-30min。顯微鏡下觀察斑點(diǎn)形成情況，當(dāng)斑點(diǎn)清晰可見時(shí)，自來水沖洗終止反應(yīng)。室溫干燥96孔板，ELISPOT斑點(diǎn)成像分析儀(BIOSYS產(chǎn)品)計(jì)數(shù)每孔斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判斷陽性斑點(diǎn)直徑中央密度較高、向周圍逐漸彌散；每次實(shí)驗(yàn)中，與陰性對照組相比，斑點(diǎn)數(shù)增加2倍以上認(rèn)為有意義。檢測結(jié)果如圖3所示(圖中A，A1，A2，A3為M1肽實(shí)驗(yàn)組同一樣品的平行4孔；B，B1，B2，B3為空DC對照組同一樣品的平行4孔)，測定脾臟細(xì)胞分泌γ-干擾素的M1特異性活化T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，測定結(jié)果如表1所示(n為該組的小鼠數(shù)量)，體外不經(jīng)抗原刺激，每105個脾細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)為52±8.5(也可表示為52±8.5/105脾細(xì)胞)；體外經(jīng)10μg/mL M1肽刺激40h后，斑點(diǎn)數(shù)明顯增加，達(dá)112.5±16.2/105脾細(xì)胞，表明脾臟細(xì)胞中，M1肽特異性活化的T淋巴細(xì)胞的比例為0.11％；DC+PBS免疫后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外經(jīng)或不經(jīng)M1肽刺激，斑點(diǎn)均少于10/105脾細(xì)胞，與PBC免疫者類似。
表2 ELISPOT檢測脾臟細(xì)胞分泌γ-干擾素的M1特異性活化T淋巴細(xì)胞

結(jié)果以每105個脾細(xì)胞形成的陽性斑點(diǎn)數(shù)表示。表中所列為3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。DC為小鼠尾靜脈內(nèi)注射。
實(shí)施例5、體外細(xì)胞毒活性檢測用非放射性乳酸脫氫酶法進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性檢測，其中，靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的制備方法如下1、靶細(xì)胞的制備將BST739和BST739-MUC1細(xì)胞消化后記數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，96孔板每孔中加入上述細(xì)胞懸液50μL，每組設(shè)4個復(fù)孔。
2、效應(yīng)細(xì)胞的制備用與實(shí)施例4相同的方法制備脾臟淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞以含3％人AB血清的完全1640培養(yǎng)基調(diào)整為不同的細(xì)胞密度(降低血清濃度可減少培養(yǎng)基背景)。按效靶比為1∶1、10∶1、50∶1、100∶1在各靶細(xì)胞的孔中加入50μL上述系列稀釋密度的效應(yīng)細(xì)胞，總體積為100μL。
小鼠以負(fù)載M1肽的成熟DC免疫三次后(方法同前述)，以DC+PBS免疫組為對照，檢測脾淋巴細(xì)胞CTL效應(yīng)(系列1靶細(xì)胞為BST739-MUC1；系列2靶細(xì)胞為BST739)，結(jié)果如圖4所示。效靶比為50∶1和100∶1時(shí)，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對BST739-MUC1細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒效應(yīng)，但靶細(xì)胞溶破率不超過30％；效靶比低于50∶1無明顯溶破效應(yīng)。以DC+PBS免疫或靶細(xì)胞為BST739時(shí)均無CTL效應(yīng)。CTL是以BST739-MUC1為靶細(xì)胞、效靶比為50∶1時(shí)的靶細(xì)胞溶破率。
實(shí)施例6、腫瘤預(yù)防模型中觀察M1肽誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)T739小鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別以DC+M1肽、DC+TAT-M1肽和DC+PBS進(jìn)行免疫(方法同前述)，最后一次免疫后一周，在相同的淋巴結(jié)引流區(qū)域皮下接種BST739-MUC1細(xì)胞2×105個/只；第8天觀察成瘤率16天去眼球取血并處死，仔細(xì)剝離腫瘤，稱重。將腫瘤與皮膚粘連緊密者連同粘連皮膚一同取下。標(biāo)本以4％福爾馬林固定，常規(guī)病理切片。血清-20℃保存，用于檢測M1肽特異性抗體。每組隨機(jī)選擇一只小鼠，在無菌條件下取脾臟制成單細(xì)胞懸液，測定預(yù)防模型中腫瘤大小，并進(jìn)行ELISA、ELISPOT和細(xì)胞毒活性檢測。其中，ELISA法檢測時(shí)，將血清按1∶100稀釋，測定450nm處吸光度值，所用的二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(購自北京中杉生物技術(shù)有限公司)，顯色底物為TMB(SIGMA)。預(yù)防模型中腫瘤大小比對結(jié)果如圖5所示(1為DC+PBS免疫組，2為DC+TAT-M1肽免疫組，3為DC+M1肽免疫組)，具體數(shù)值如表2所示(n為該項(xiàng)檢查的小鼠數(shù)量)，其余各項(xiàng)免疫學(xué)檢測結(jié)果也如表2所示，檢測結(jié)果表明M1肽孵育的DC免疫小鼠后可誘發(fā)M1特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并可在體內(nèi)外對表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷作用。
表3 預(yù)防模型中腫瘤大小及免疫學(xué)檢查指標(biāo)結(jié)果

注經(jīng)ELISA法檢測，正常小鼠血清OD450nm處吸光度值為0.009，ELISPOT法檢測結(jié)果以每105個脾臟淋巴細(xì)胞形成的陽性斑點(diǎn)數(shù)表示；CTL是以BST739-MUC1為靶細(xì)胞、效靶比為50∶1時(shí)的靶細(xì)胞溶破率。
序列表<160>2<210>1<211>12<212>PRT<213>M13噬菌體(Phage M13)<400>1Lys His Tyr Asp Pro Phe His His Arg Met Pro Gln1 5 10<210>2<211>36<212>DNA<213>M13噬菌體(Phage M13)<400>2aagcattatg atccgtttca tcatcggatg ccgcag 3權(quán)利要求
1.一種MUC1粘蛋白的模擬表位肽，是具有下述氨基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有誘導(dǎo)產(chǎn)生MUC1粘蛋白特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答作用的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUC1粘蛋白的模擬表位肽，其特征在于所述模擬表位肽具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA，其特征在于所述DNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA，其特征在于所述DNA具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述DNA的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
7.一種表達(dá)權(quán)利要求1或2所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽的方法，是將含有所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽DNA的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
8.一種抗腫瘤疫苗，它的活性成分為權(quán)利要求1或2所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗腫瘤疫苗，其特征在于其活性成分為權(quán)利要求2所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
10.一種抗腫瘤藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1或2所述MUC1粘蛋白的模擬表位肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了MUC1粘蛋白的一個模擬表位肽及其編碼DNA與應(yīng)用。其目的是提供MUC1粘蛋白的一個模擬表位肽及其編碼DNA與其在制備抗腫瘤疫苗和藥物中的應(yīng)用。它是具有下述氨基酸殘基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有誘導(dǎo)產(chǎn)生MUC1粘蛋白特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答作用的多肽。其編碼DNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明可作為活性成份制備成疫苗或藥物，起到抑制或清除表達(dá)MUC1的腫瘤細(xì)胞的作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/435GK1699418SQ20051007761
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者張立新, 潘進(jìn)勇, 王祥衛(wèi), 路浩軍, 李春海 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院