專利名稱：：一種發(fā)酵法制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備15NL-色氨酸的方法。屬食品、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：15NL-色氨酸是L-色氨酸的氮同位素標(biāo)記化合物。它無毒、無放射性和半衰期，是一種優(yōu)良的示蹤劑。由于L-色氨酸是人體所必須的氨基酸之一，作為合成蛋白質(zhì)的基元，可合成具有重要生物活性的酶、激素等。因此，采用15NL-色氨酸作為示蹤劑，利用氨基酸的代謝，對揭開生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的理化過程，了解生物體的新陳代謝起到了關(guān)鍵性作用。在藥理研究過程中，可通過人或動物對15NL-色氨酸的代謝，研究其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)變、吸收、分布、排泄等。如通過對大鼠和兔子的代謝研究，發(fā)現(xiàn)色氨酸可代謝成犬尿氨酸、犬尿喹啉以及黃尿酸。在生物學(xué)上利用15NL-色氨酸及天然產(chǎn)物間的結(jié)構(gòu)相互關(guān)系，以15NL-色氨酸作為起始原料，通過分析產(chǎn)物的標(biāo)記物豐度，研究生物體內(nèi)天然產(chǎn)物在植物、動物以及微生物體內(nèi)的生物合成路線。如利用〔2-13C〕和〔α-15N〕色氨酸，驗(yàn)證了紫色桿菌素的生物合成中，中心環(huán)氮原子來源于色氨酸的右側(cè)，從而解決了合成中間體是來源于丙酮酸還是來源于吡咯烷酮上的氮原子這個(gè)無法解決的問題。目前，有關(guān)15NL～色氨酸合成的路線主要有化學(xué)合成法以及微生物酶法?；瘜W(xué)合成方面，R.FBorch等(范如霖.穩(wěn)定同位素標(biāo)記有機(jī)合成法，第一版，化學(xué)工業(yè)出版社，1986)將3-吲哚基丙酮酸和硝酸銨-15N溶于甲醇，向其中加入氰基硼氫化鈉，將該溶液調(diào)至pH＝7，25℃，攪拌36h，蒸除溶劑，使殘余物溶于水，轉(zhuǎn)入離子交換柱[Dowex-50(H+)，100ml]，順次用水和氫氧化銨淋洗，獲得無定形粉末狀15NL-色氨酸。酶法合成過程中，E.M.M.VandenBerg等(E.M.M.vandenBerg，A.U.Baldew，A.T.J.WdeGoedeetal.SynthesisofthreeisotopomersofL-tryptophanviaacombinationoforganicsynthesisandbiotechnology.Recl.Trav.Chim.Pays-Bas，1988，10773-81)首先以標(biāo)記的H15NO3、K13CN和13CH3CN為初始原料，合成了15N和13C雙標(biāo)記的豐度為99％的1-15N，2-13C-吲哚以及豐度為90％的1-15N，3-13C吲哚。同時(shí)，將攜帶色氨酸操縱子的質(zhì)粒pHP39，誘導(dǎo)進(jìn)E.coliK12的營養(yǎng)缺陷株KA539(EA2)，獲得高色氨酸合成酶活性的基因工程菌，以1％葡萄糖作為碳源，在37℃下培養(yǎng)。將獲得的菌體細(xì)胞加入到含有L-絲氨酸、標(biāo)記的吲哚、磷酸吡哆醛和硫酸銨的合成培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)24h，將標(biāo)記的吲哚轉(zhuǎn)化成同位素標(biāo)記的L-色氨酸。CliffordJ.Unkefer等(CliffordJ.Unkefer，SiegfriedN.Lodwig，LouisA.Silks，etal.StereoselectiveSynthesisofStableIsotope-LabeledL-α-AminoAcidsChemomicrobiologicalSynthesisofL-[β-13C]-，L-[2’-13C]-，andL-[1’～15N]Tryptophan.JournalofLabelledCompoundsandRadiopharmaceuticals，1991，XXIX(11)1247-1256)以鄰甲苯酰氯、15N-氨水為初始原料，合成了單標(biāo)記的〔1-15N〕-吲哚。同時(shí)，將帶有編碼大腸桿菌trpC+，B+，A+和氯霉素抗性標(biāo)記基因的質(zhì)粒pWS1誘導(dǎo)進(jìn)具有組氨酸營養(yǎng)缺陷的E.coliw3310Δ[tonBtrpBA17]，獲得了大腸桿菌的基因工程菌，以此作為出發(fā)菌株，以L-〔3-13C〕絲氨酸、〔1-15N〕-吲哚為前體物，在色氨酸酶作用下，合成L-〔1～15N〕色氨酸。上述合成方法中，化學(xué)合成法步驟繁瑣，副產(chǎn)物較多，同位素轉(zhuǎn)化率低，只有23％。微生物酶法是利用微生物合成的色氨酸合成酶，將L-色氨酸的前體物吲哚及L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為L-色氨酸。此法雖然簡便，但在吲哚合成過程中，同樣存在步驟繁瑣，副產(chǎn)物較多的問題，同位素原料總的轉(zhuǎn)化率在22％左右。由于同位素原料價(jià)格昂貴，低的轉(zhuǎn)化率使生產(chǎn)成本提高，不宜大量生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵法制備15NL-色氨酸的方法，以15N鄰氨基苯甲酸作為前體物，利用微生物發(fā)酵的方法制備15NL-色氨酸。在簡化工藝，提高同位素的轉(zhuǎn)化率的同時(shí)提高15NL-色氨酸產(chǎn)品的產(chǎn)量、純度和同位素豐度。本發(fā)明采用15N鄰氨基苯甲酸作為前體物，15N硫酸銨作為氮源，葡萄糖為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵合成、分離純化制備15NL-色氨酸產(chǎn)品。具體步驟過程如下(1)菌株預(yù)處理將酵母或大腸桿菌在活化培養(yǎng)基中活化20-30小時(shí)。將活化的菌體鋪到含有5-50mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3天，用生理鹽水洗下菌體，將得到的菌懸液再鋪到含有5-50mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3天，將這一過程反復(fù)至少5次。用pH6.8的磷酸緩沖液將菌體洗下，以0.1-20mg/ml的量加入硫酸二乙酯，在30℃反應(yīng)20-30min，加水稀釋到使誘變反應(yīng)停止，然后經(jīng)紫外線照射30-180s，將照射后的液體涂布在含有4mg/ml的5-甲基-DL-色氨酸和質(zhì)量含量為0.2％鄰氨基苯甲酸的活化固體培養(yǎng)基上，待菌體長出后，挑取單個(gè)菌落經(jīng)發(fā)酵，得到預(yù)處理好的菌株?；罨囵B(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為1-6％葡萄糖，0.2-1％牛肉膏，0.5-3％蛋白胨，0.02-0.1％的硫酸鎂，0.05-0.3％的磷酸氫二鉀，其余為水?；罨腆w培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為1-2％瓊脂，1-6％葡萄糖，0.2-1％牛肉膏，0.5-3％蛋白胨，0.02-0.1％的硫酸鎂，0.05-0.3％的磷酸氫二鉀，其余為水。(2)發(fā)酵合成將步驟(1)預(yù)處理獲得的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)15-24h，將得到的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵合成，直到15NL-色氨酸產(chǎn)量不再下降為止，發(fā)酵合成期間，從24h后開始添加15N鄰氨基苯甲酸的乙醇水溶液、15N硫酸銨水溶液、葡萄糖水溶液，使發(fā)酵液中添加的15N鄰氨基苯甲酸達(dá)到0.1-5g/l，15N硫酸銨達(dá)到0.5-5g/l、葡萄糖達(dá)到10-100g/l。種子培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖1-6％，硫酸銨0.5-2％，玉米漿0.5-3％，磷酸氫二鉀0.05-0.3％，硫酸鎂0.02-0.1％，碳酸鈣1-3％，其余為水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8。發(fā)酵培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖3-11％，15N硫酸銨0.5-5％，磷酸氫二鉀0.05-0.3％，硫酸鎂0.02-0.1％，鄰氨基苯甲酸0.1-5％，碳酸鈣1-5％，其余為水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8。(3)分離純化步驟(2)的發(fā)酵液經(jīng)離心分離，用草酸調(diào)節(jié)上清液pH為2-5，經(jīng)陽離子樹脂吸附、氨水洗脫，將獲得的洗脫液蒸發(fā)脫氨濃縮至干，加入溶劑萃取脫色，得到15NL-色氨酸粗產(chǎn)品，再經(jīng)大孔樹脂脫色、冷凍干燥得到15NL-色氨酸。本發(fā)明的方法實(shí)質(zhì)上是，利用物理以及化學(xué)誘變和苯菌靈、5-甲基色氨酸、鄰氨基苯甲酸處理的酵母或大腸桿菌，將同位素原料為15N鄰氨基苯甲酸以及15N硫酸銨通過發(fā)酵合成制得15NL-色氨酸產(chǎn)品。本發(fā)明的方法合成工藝簡單，產(chǎn)量較高，與有機(jī)合成法以及酶法比較，N同位素替代容易、15N轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50％，產(chǎn)品的純度可以達(dá)到99％，同位素豐度大于98％，適合大規(guī)模生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)菌株預(yù)處理將原始的假絲酵母Canadidautilis189在活化培養(yǎng)基中活化24小時(shí)?；罨囵B(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為5％葡萄糖，1％牛肉膏，1％蛋白胨，0.08％的硫酸鎂以及0.1％的磷酸氫二鉀，其余為水。將活化的菌體鋪到含有25mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中(除含有1.5％瓊脂以外，其它成分與活化培養(yǎng)基相同)，30℃培養(yǎng)2天。用無菌生理鹽水將平板上的菌體洗下，取少量菌懸液鋪到含有25mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2天，反復(fù)5次。用pH6.8的磷酸緩沖液將含有苯菌靈平板上的菌體洗下稀釋到20ml，加入5mg/ml的硫酸二乙酯，在搖床中30℃、220r/min反應(yīng)20min后，稀釋到10-4。然后經(jīng)紫外線照射40s。將照射后液體涂布到含有4mg/ml5-甲基-DL-色氨酸和0.2％鄰氨基苯甲酸的固體培養(yǎng)基的平板上。待菌體長出后，挑取單個(gè)菌落，接種到固體斜面上。經(jīng)發(fā)酵，篩選出高產(chǎn)的出發(fā)菌株。(2)發(fā)酵合成將預(yù)處理獲得的高產(chǎn)菌株接種到種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖3％，硫酸銨0.5％，玉米漿2％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.05％，碳酸鈣1.5％，其余為水，用氫氧化鈉調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)18h。將10％種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖11％，硫酸銨0.5％，磷酸氫二鉀0.10％，硫酸鎂0.1％，鄰氨基苯甲酸0.15％，碳酸鈣2％，其余為水，用氫氧化鈉調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)140h，發(fā)酵期間從24h開始，每隔12h流加一次。流加物為50％的15N鄰氨基苯甲酸乙醇水溶液、硫酸銨水溶液以及葡萄糖水溶液。使發(fā)酵液中添加的15N鄰氨基苯甲酸達(dá)到2.1g/l，15N硫酸銨達(dá)到4.1g/l、葡萄糖達(dá)到30g/l。(3)分離純化發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液用草酸調(diào)pH為2.5，經(jīng)732陽離子樹脂柱、2％氨水洗脫獲得的洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)脫氨濃縮至干，加入丙酮萃取色素，過濾，得色氨酸粗產(chǎn)品。將色氨酸粗產(chǎn)品用水溶解，調(diào)pH為4，經(jīng)D3520大孔樹脂柱脫色，流速為1倍柱體積/h。將脫色液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，采用70℃60％熱乙醇溶液溶解，冷卻，放置冰箱冷藏過夜，過濾，冷凍干燥得2.12g(11發(fā)酵液)15NL-色氨酸成品，純度和同位素豐度大于98％。實(shí)施例2(1)菌株預(yù)處理將原始的漢遜酵母Hanscula.jaudinic21393在活化培養(yǎng)基中活化20小時(shí)?；罨囵B(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為3％葡萄糖，0.5％牛肉膏，2％蛋白胨，0.05％的硫酸鎂以及0.15％的磷酸氫二鉀，其余為水。將活化的菌體鋪到含有15mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中(除含有2％瓊脂以外，其它成分與活化培養(yǎng)基相同)，30℃培養(yǎng)3天。用無菌生理鹽水將平板上的菌體洗下，取少量菌懸液鋪到含有15mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3天，反復(fù)8次。用pH6.8的磷酸緩沖液將含有苯菌靈平板上的菌體洗下稀釋到20ml，加入10mg/ml的硫酸二乙酯，在搖床中30℃、220r/min培養(yǎng)25min后，稀釋到10-2。然后在磁力攪拌下，紫外線照射60s，將照射后液體涂布到含有4mg/ml5-甲基-DL-色氨酸和0.2％鄰氨基苯甲酸的固體培養(yǎng)基的平板上。待菌體長出后，挑取單個(gè)菌落，接種到固體斜面上。經(jīng)發(fā)酵，篩選出高產(chǎn)的出發(fā)菌株。(2)發(fā)酵合成將預(yù)處理獲得的高產(chǎn)菌株接種到種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖5％，硫酸銨1％，玉米漿1％，磷酸氫二鉀0.15％，硫酸鎂0.1％，碳酸鈣2.5％，其余為水，用氫氧化鈉調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)24h。將種子液按照10％接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖7％，15N硫酸銨2％，磷酸氫二鉀0.15％，硫酸鎂0.05％，鄰氨基苯甲酸0.05％，碳酸鈣2％，其余為水。用氫氧化鈉調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)144h，發(fā)酵期間從36h開始，每隔6h流加一次。流加物為50％的15N鄰氨基苯甲酸乙醇水溶液、硫酸銨水溶液以及葡萄糖水溶液。使發(fā)酵液中添加的15N鄰氨基苯甲酸達(dá)到1.2g/l，15N硫酸銨達(dá)到1g/l、葡萄糖達(dá)到70g/l。(3)分離純化發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液用草酸調(diào)pH為3.5，經(jīng)003×7型陽離子樹脂柱吸附，5％氨水洗脫獲得的洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)脫氨濃縮至干，加入乙醚萃取色素，過濾，得色氨酸粗產(chǎn)品。將色氨酸粗產(chǎn)品用水溶解，調(diào)pH為7，經(jīng)D301R大孔樹脂柱脫色，流速為1倍柱體積/h。將脫色液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，采用70℃60％熱乙醇溶液溶解，冷卻，放置冰箱冷藏過夜，過濾，冷凍干燥得1.85g(11發(fā)酵液)15NL-色氨酸成品，純度和同位素豐度大于98％。實(shí)施例3(1)菌株預(yù)處理將原始的大腸桿菌AGX1775，在活化培養(yǎng)基中活化30小時(shí)?；罨囵B(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為6％葡萄糖，1％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.05％的硫酸鎂以及0.2％的磷酸氫二鉀，其余為水。將活化的菌體鋪到含有5mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中(除含有1％瓊脂以外，其它成分與活化培養(yǎng)基相同)，30℃培養(yǎng)3天。用無菌生理鹽水將平板上的菌體洗下，取少量菌懸液鋪到含有5mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3天，反復(fù)10次。用pH6.8的磷酸緩沖液將含有苯菌靈平板上的菌體洗下稀釋到20ml，加入1mg/ml的硫酸二乙酯，在搖床中30℃、220r/min培養(yǎng)30min后，稀釋到10-5。然后經(jīng)紫外線照射90s。將照射后液體涂布到含有4mg/ml5-甲基-DL-色氨酸和0.2％鄰氨基苯甲酸的固體培養(yǎng)基的平板上。待菌體長出后，挑取單個(gè)菌落，接種到固體斜面上。經(jīng)發(fā)酵，篩選出高產(chǎn)的出發(fā)菌株。(2)發(fā)酵合成將預(yù)處理獲得的高產(chǎn)菌株接種到種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖4％，硫酸銨0.5％，玉米漿2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，碳酸鈣1.5％，其余為水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)20h。將10％種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖3％，硫酸銨2％，磷酸氫二鉀0.15％，硫酸鎂0.05％，鄰氨基苯甲酸0.05％，碳酸鈣2％，其余為水，用氫氧化鈉調(diào)pH為6.8。30℃，150r/min搖床培養(yǎng)120h，發(fā)酵期間從24h開始，每隔4h流加一次。流加物為50％的15N鄰氨基苯甲酸乙醇水溶液、硫酸銨水溶液以及葡萄糖水溶液。使發(fā)酵液中添加的15N鄰氨基苯甲酸達(dá)到2.38g/l，15N硫酸銨達(dá)到1.4g/l、葡萄糖達(dá)到10g/l(3)分離純化發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液用草酸調(diào)pH為4.0，經(jīng)IR120型陽離子樹脂柱吸附，2％氨水洗脫。所獲得的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入乙酸乙酯萃取色素，過濾，得色氨酸粗產(chǎn)品。將色氨酸粗產(chǎn)品用水溶解，調(diào)pH為6，經(jīng)DIAIONHP2MG大孔樹脂柱脫色，流速為1倍柱體積/h。將脫色液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，采用70℃60％熱乙醇溶液溶解，冷卻，放置冰箱冷藏過夜，過濾，冷凍干燥得2g(11發(fā)酵液)15NL-色氨酸成品，純度和同位素豐度大于98％。權(quán)利要求1.一種發(fā)酵法制備15NL-色氨酸的方法，采用15N鄰氨基苯甲酸作為前體物，15N-硫酸銨作為氮源，葡萄糖為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵合成、分離純化制備，具體的步驟和方法為(1)菌株預(yù)處理將酵母或大腸桿菌在活化培養(yǎng)基中活化20-30小時(shí)；將活化的菌體鋪到含有5-50mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3天，用生理鹽水洗下菌體，將得到的菌懸液再鋪到含有5-50mg/l苯菌靈的活化固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3天，將這一過程反復(fù)至少5次；用pH6.8的磷酸緩沖液將菌體洗下，以0.1-20mg/ml的量加入硫酸二乙酯，在30℃反應(yīng)20-30min，加水稀釋到使誘變反應(yīng)停止，然后經(jīng)紫外線照射30-180s，將照射后的液體涂布在含有4mg/ml的5-甲基-DL-色氨酸和質(zhì)量含量為0.2％鄰氨基苯甲酸的活化固體培養(yǎng)基上，待菌體長出后，挑取單個(gè)菌落經(jīng)發(fā)酵，得到預(yù)處理好的菌株；(2)發(fā)酵合成將步驟(1)預(yù)處理獲得的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)15-24h，將得到的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵合成，直到15NL-色氨酸產(chǎn)量不再下降為止，發(fā)酵合成期間，從24h后開始添加15N鄰氨基苯甲酸的乙醇水溶液、15N硫酸銨水溶液、葡萄糖水溶液，使發(fā)酵液中添加的15N鄰氨基苯甲酸達(dá)到0.1-5g/l，15N硫酸銨達(dá)到0.5-5g/l、葡萄糖達(dá)到10-100g/l；(3)分離純化步驟(2)的發(fā)酵液經(jīng)離心分離，用草酸調(diào)節(jié)上清液pH為2-5，經(jīng)陽離子樹脂吸附、氨水洗脫，將獲得的洗脫液蒸發(fā)脫氨濃縮至干，加入溶劑萃取脫色，得到15NL-色氨酸粗產(chǎn)品，再經(jīng)大孔樹脂脫色、冷凍干燥得到15NL-色氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是活化培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為1-6％葡萄糖，0.2-1％牛肉膏，0.5-3％蛋白胨，0.02-0.1％的硫酸鎂，0.05-0.3％的磷酸氫二鉀，其余為水。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是活化固體培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為1-2％瓊脂，1-6％葡萄糖，0.2-1％牛肉膏，0.5-3％蛋白胨，0.02-0.1％的硫酸鎂，0.05-0.3％的磷酸氫二鉀，其余為水。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是種子培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖1-6％，硫酸銨0.5-2％，玉米漿0.5-3％，磷酸氫二鉀0.05-0.3％，硫酸鎂0.02-0.1％，碳酸鈣1-3％，其余為水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基的組份和質(zhì)量百分含量為葡萄糖3-11％，15N硫酸銨0.5-5％，磷酸氫二鉀0.05-0.3％，硫酸鎂0.02-0.1％，鄰氨基苯甲酸0.1-5％，碳酸鈣1-5％，其余為水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8。全文摘要本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備文檔編號C07B59/00GK1896260SQ20051008384公開日2007年1月17日申請日期2005年7月14日優(yōu)先權(quán)日2005年7月14日發(fā)明者袁其朋,劉占峰,汪文川申請人:北京化工大學(xué)