專利名稱：胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白－6介導(dǎo)的有活性胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅱ的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及蛋白質(zhì)或者多肽的制備，尤其涉及有藥物活性的蛋白質(zhì)或者多肽的制備。本發(fā)明也關(guān)于胰島素樣生長(zhǎng)因子-II的分子伴侶胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及蛋白質(zhì)或多肽與其分子伴侶的共表達(dá)，特別地，涉及控制其分子數(shù)目按照一定比例的共表達(dá)。本發(fā)明提供了一種制備具有活性的胰島素樣生長(zhǎng)因子-II的方法，包括構(gòu)建含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-II基因和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主，篩選出轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，共表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6；分離得到胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6復(fù)合體。本發(fā)明的方法和物質(zhì)可以避免這些物質(zhì)單獨(dú)使用所帶來(lái)的副作用，因此本發(fā)明也涉及制藥學(xué)、臨床藥物學(xué)、生物制品等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的不斷進(jìn)展，蛋白質(zhì)之間的相互作用越來(lái)越成為研究的重點(diǎn)。這不僅有科學(xué)研究意義，而且對(duì)于開(kāi)發(fā)新的生物制品藥物，或者避免某些已有的生物制品藥物的副作用有意義。
自從Anfinsen在1961年發(fā)現(xiàn)變性RNaseA分子在試管中能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象、恢復(fù)其生物學(xué)活性以來(lái)，人們一直認(rèn)為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，即某特定蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列包含了構(gòu)成其高級(jí)結(jié)構(gòu)的全部信息。然而，這個(gè)原則僅僅給出了蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)可能性，而折疊過(guò)程和折疊途徑卻仍然是個(gè)謎，參見(jiàn)朱玉賢，李毅，編著，現(xiàn)代分子生物學(xué)，高等教育出版社，1997年3月第1版，第352頁(yè)。
生長(zhǎng)因子(growth facter，GF)是是指一類具有激素樣性質(zhì)，能起促細(xì)胞分裂劑作用、刺激細(xì)胞分裂和繁殖的物質(zhì)。一些生長(zhǎng)因子作用于多種細(xì)胞，另一些作用于某一種類型的細(xì)胞。參見(jiàn)譚景瑩，董志偉主編，英漢生物化學(xué)及分子生物學(xué)詞典，科學(xué)出版社，2000年7月第1版，第416頁(yè)。關(guān)于生長(zhǎng)因子的定義尚未達(dá)成一致，但是它們?cè)诠δ苌鲜菍?dǎo)致細(xì)胞增殖效應(yīng)的因子。研究生長(zhǎng)因子的作用機(jī)制及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑，不僅對(duì)闡明細(xì)胞增殖、分化的分子生物學(xué)基礎(chǔ)有重要意義，而且對(duì)于研究腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制以及新的防治措施也有實(shí)用價(jià)值，因此受到高度重視，成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。由于某些生長(zhǎng)因子基因工程的成功表達(dá)，一些生長(zhǎng)因子目前已經(jīng)開(kāi)始在臨床中應(yīng)用。參見(jiàn)徐曉利，馬澗泉主編，醫(yī)學(xué)生物化學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1998年10月第1版，第1033頁(yè)到第1041頁(yè)。
胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)是體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子，又稱生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素(somatomedin)，包括IGF-I和IGF-II，對(duì)胚胎及出生后機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGF binding protein，IGFBP)家族包括六種對(duì)IGF具有高親和力的成員，命名為IGFBP-1～I(xiàn)GFBP-6，對(duì)IGF的活性有重要的調(diào)節(jié)作用。它們與IGF結(jié)合成大分子量的復(fù)合物，在血液循環(huán)中運(yùn)輸，既增加了IGF的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了半衰期，又限制了IGF自由通透血管進(jìn)入組織局部，避免了IGF促生長(zhǎng)活性的過(guò)度發(fā)揮。在組織局部IGFBPs以多種方式調(diào)節(jié)IGF的活性。
IGF-I是生長(zhǎng)激素GH的下游因子，直接介導(dǎo)GH活性的發(fā)揮，對(duì)出生后機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的促進(jìn)作用。所以重組IGF-I作為藥物具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。1987～2000年重組IGF-I作為藥物進(jìn)行了大量的臨床實(shí)驗(yàn)，用于多種疾病的治療，如Laronsyndrome(Laron氏侏儒癥候群)，脊髓側(cè)索硬化癥，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，腦白質(zhì)腎上腺營(yíng)養(yǎng)不良癥(ALD)，I型和II型糖尿病，胰島素阻抗綜合癥，骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)炎等。
但I(xiàn)GF-I單獨(dú)用藥會(huì)產(chǎn)生很多副反應(yīng)，如水腫、關(guān)節(jié)痛、頭痛、視網(wǎng)膜水腫、Bell’s麻痹等，最嚴(yán)重的是長(zhǎng)期用藥會(huì)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。(Jabri N，Schalch DS，SchwartzSL.1994 Adverse effects of recombinant human insulin-like growth factor Iin obese insulin-resistant type II diabetic patients.Diabetes.43369-374.Young SCJ，Smith-Banks A，Underwood LE，Clemmons DR.1992Effects ofrecombinant IGF-I and GH treatment upon serum IGF binding proteins incalorically restricted adults.J Clin Endocrinol Metab.75603-608.Kupfer SR，Underwood LE，Baxter RC，Clemmons DR.1993Enhancement of theanabolic effects of growth hormone and insulin-like growth factor-I by theuse of both agents simultaneously.J Clin Invest.91391-397.Clemmons DR，Smith-Banks A，Celniker AC，Underwood LE.1992Reversalof diet-induced catabolism by infusion of recombinant insulin-like growthfactor-I(IGF-I)in humans.J Clin Endocrinol Metab.75234-238.)近年的研究表明IGF-I和IGFBP-3聯(lián)合用藥可以有效的消除IGF-I單獨(dú)用藥時(shí)的副反應(yīng)。這是因?yàn)槁?lián)合用藥模擬了IGF的生理存在狀態(tài)，限制了IGF-I促生長(zhǎng)活性的隨意發(fā)揮，同時(shí)增加了IGF-I的穩(wěn)定性，降低了給藥濃度。(Sanders M，Moore J，Clemmons D，Sommer A，Adams S.Safety pharmacokinetics and biologic effectsof intravenous administration of rhIGFI/IGFBP-3to healthy subjects.Proceedings of the 79th Annual Meeting of The Endocrine Society，Minneapolis，MN，1997.Geusens R，Bouillion PB，Rosen DM，et al.Musculoskeletal effectsof recombinant human insulin-like growth factor-I(rhIGF-I)/IGF bindingprotein-3(IGFBP-3)in hip fracture patientsresults from a double-blind，placebocontrolled，phase II study.Proceedings of the Second Joint Meeting ofAmerican Society of Bone and Mineral Research-IBMS，San Francisco，CA，1998)。
IGF-II是胚胎期重要的生長(zhǎng)因子，出生后主要以自分泌和旁分泌的方式在組織局部發(fā)揮促生長(zhǎng)活性，對(duì)整個(gè)機(jī)體的生長(zhǎng)和代謝影響很小。所以重組人IGF-II在局部組織損傷的修復(fù)治療中有廣闊的臨床應(yīng)用前景，如各種軟組織損傷、骨折、腦缺血引起的腦組織損傷及神經(jīng)元的病變。
但是，在IGF-II的體外表達(dá)中，存在形成聚合體的問(wèn)題，使其活性喪失。而且有理由認(rèn)為IGF-II單獨(dú)作為藥物在體內(nèi)使用存在和IGF-I同樣的問(wèn)題，會(huì)產(chǎn)生多種副作用。因此，存在制備出具有生物學(xué)活性的IGF-II的需要，存在避免或者減弱IGF-II給藥所引起的副作用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于滿足上述這些具體需要，提供一種制備具有活性的IGF-II的方法。并且，在更廣泛的意義上，本發(fā)明利用分子生物學(xué)的進(jìn)展，提供一種在醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域具有價(jià)值的具有活性的蛋白質(zhì)或者多肽物質(zhì)的制備方法。
第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備活性蛋白質(zhì)或者多肽的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備活性蛋白質(zhì)或者多肽的方法。該方法包括將目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽的編碼序列重組進(jìn)表達(dá)載體中，在合適的宿主中表達(dá)出重組蛋白或者重組多肽，檢測(cè)重組蛋白或者重組多肽的生物學(xué)活性。如果檢測(cè)到重組多肽或者重組蛋白質(zhì)具有較低或者沒(méi)有生物活性，則本方法進(jìn)一步包括尋找這一現(xiàn)象的原因，包括進(jìn)一步研究該重組多肽或者重組蛋白質(zhì)的構(gòu)象，確定是否分子伴侶在該多肽或者蛋白質(zhì)的折疊中起作用。利用分子伴侶或者編碼分子伴侶的基因獲得有生物活性的重組多肽或者重組蛋白質(zhì)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備活性蛋白質(zhì)或者多肽的方法。該方法包括將目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽的編碼序列和其分子伴侶的編碼序列重組到一個(gè)表達(dá)載體中，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，在合適的宿主中共表達(dá)出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽以及分子伴侶，純化出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽和分子伴侶的復(fù)合物。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備活性蛋白質(zhì)或者多肽的方法。該方法包括將目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽的編碼序列和其分子伴侶的編碼序列分別重組進(jìn)表達(dá)載體中，用這兩種載體共轉(zhuǎn)化合適的宿主，誘導(dǎo)這些分子的共表達(dá)，純化出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽與分子伴侶的復(fù)合物。
在更進(jìn)一步的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備活性蛋白質(zhì)或者多肽的方法。該方法包括將目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽的編碼序列和其分子伴侶的編碼序列重組進(jìn)一個(gè)表達(dá)載體中，其中該載體中含有可以與宿主基因組進(jìn)行同源重組的序列；用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽的編碼序列和其分子伴侶的編碼序列整合到宿主基因組中；共表達(dá)出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽以及分子伴侶，純化出目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)多肽和分子伴侶的復(fù)合物。
具體的，本發(fā)明所述共表達(dá)載體中的所述多肽的基因序列編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和所述伴侶分子的基因序列編碼IGFBP-6。
所述復(fù)合物含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和IGFBP-6，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子-II是正確折疊的。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了分子伴侶或者與其相關(guān)分子及其片段在制備有活性多肽或者蛋白質(zhì)中的用途。
多肽鏈?zhǔn)蔷€狀合成的，必須折疊以獲得正確的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)或者多肽的折疊是重要的。在體內(nèi)，很多新合成的蛋白質(zhì)或者多肽不能自發(fā)地折疊成它們的天然構(gòu)象(自組裝，self-assembly)，可能是由于折疊過(guò)程要求能量上不利的中間態(tài)的過(guò)渡或由于同時(shí)存在幾種可能的穩(wěn)定折疊途徑，只有一種可以達(dá)到天然態(tài)。在這種情況下，正確的折疊由被稱為分子伴侶(molecular chaperones)的分子來(lái)指導(dǎo)，它們可以結(jié)合在天然態(tài)包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部而在變性態(tài)暴露在蛋白質(zhì)外的殘基(暴露于溶劑的疏水殘基)來(lái)識(shí)別變性態(tài)。正確的折疊反映了分子伴侶-底物結(jié)合與釋放的一個(gè)周期。參見(jiàn)，R·M·特懷曼，著；陳淳，徐沁等譯，高級(jí)分子生物學(xué)要義，科學(xué)出版社，2001，第270頁(yè)到第271頁(yè)。
因此，分子伴侶的編碼基因或者其片段可以與該分子伴侶所指導(dǎo)的多肽或者蛋白質(zhì)的編碼基因重組進(jìn)行共表達(dá)，產(chǎn)生有活性多肽或者蛋白質(zhì)。
應(yīng)用分子伴侶與目標(biāo)多肽或者蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，制備具有生物活性的目標(biāo)多肽或者蛋白質(zhì)是在本發(fā)明之內(nèi)。也可以表征為應(yīng)用分子伴侶或者正確折疊的多肽或者蛋白質(zhì)。
具體地，本發(fā)明提出IGFBP-6作為伴侶分子在制備有活性的胰島素樣生長(zhǎng)因子-II中的應(yīng)用。
第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了在上述方法中所形成的共表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、共表達(dá)產(chǎn)物等。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，含有編碼IGF-IT的核酸和編碼IGFBP-6的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，是采用IGF-II的cDNA和IGFBP-6的cDNA構(gòu)建表達(dá)載體。
本發(fā)明提供了一種含有上述表達(dá)載體的細(xì)胞，比如酵母細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種由IGF-II和IGFBP-6兩種多肽組成的復(fù)合物，是通過(guò)培養(yǎng)上述含有表達(dá)載體的細(xì)胞，比如酵母細(xì)胞；從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收得到。


圖1是質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2是pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)酶切鑒定結(jié)果。圖中，1BamHI+BglII雙酶切(7.9Kb，4.0Kb，2.4Kb)；2λ/HindIII。
圖3顯示共表達(dá)對(duì)IGF-II產(chǎn)量的影響(誘導(dǎo)24hr)。圖中，M低分子量蛋白質(zhì)marker；1IGFBP-6單表達(dá)上清；2IGF-II和IGFBP-6共表達(dá)上清；3IGF-II單表達(dá)上清。
圖4顯示共表達(dá)對(duì)IGF-II結(jié)構(gòu)的影響。圖中，1IGF-II單表達(dá)上清，還原加樣buffer；2IGF-II單表達(dá)上清，非還原加樣buffer；3IGF-II共表達(dá)上清，還原加樣buffer；4IGF-II共表達(dá)上清，非還原加樣buffer。
圖5顯示共表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果。圖中，M低分子量蛋白maker；1共表達(dá)上清；2離子交換層析洗脫液；3疏水交換層析洗脫液。
圖6顯示IGFBP-6二硫鍵折疊。圖中，1IGFBP-6溶于還原加樣buffer；2IGFBP-6溶于非還原加樣buffer。
圖7顯示胰島素家族三種多肽氨基酸序列的比較。圖中，方框所標(biāo)為高度同源的序列。IGF-I和proinsulin序列中陰影加粗處為進(jìn)行突變的位點(diǎn)，突變后聚合體消失。箭頭所指處為IGF-II中相應(yīng)的帶電荷氨基酸，是引起分子間相互作用的潛在位點(diǎn)。
圖8IGF-II分子二硫鍵的折疊。
圖9ABglII線性化載體后的同源重組。圖9BSalI線性化載體后的同源重組。
具體實(shí)施例方式
1.定義和說(shuō)明蛋白質(zhì)或者多肽必須折疊成它的天然構(gòu)象(native conformation)。天然構(gòu)象是其具有生物活性的構(gòu)象。
在本發(fā)明中，蛋白質(zhì)或者多肽是指由一系列氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的分子。術(shù)語(yǔ)，“蛋白質(zhì)”和“多肽”，在本發(fā)明中不予以區(qū)分，將它們?cè)诒景l(fā)明中替換使用。
在本發(fā)明中，“蛋白質(zhì)或者多肽的折疊”，是指新合成的(或者變性的)多肽鏈構(gòu)象的整體轉(zhuǎn)變成獨(dú)特三維構(gòu)象的天然蛋白質(zhì)或者多肽的過(guò)程。
在本發(fā)明中，“分子伴侶”是指指導(dǎo)多肽鏈正確折疊的物質(zhì)。
IGF-II是胰島素樣生長(zhǎng)因子-II的縮寫(xiě)，它是一種單鏈多肽，含有三個(gè)二硫鍵，由67個(gè)氨基酸殘基組成。
IGFBP-6是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(簡(jiǎn)稱IGFBP)的一種，為單鏈多肽，由213個(gè)氨基酸殘基組成。
由于重組IGF-II被認(rèn)為在局部組織損傷的修復(fù)治療中有廣闊的臨床應(yīng)用前景，所以一直以來(lái)在尋求制備有活性的重組IGF-II的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人此前也進(jìn)行了酵母體系分泌表達(dá)IGF-II的工作，參見(jiàn)李旌軍，黃秉仁，人胰島素樣生長(zhǎng)因子II在甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母P.pastoris中的表達(dá)分泌和性質(zhì)研究，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，1999，15(6)893-898。但是，重組表達(dá)的IGF-I常常形成沒(méi)有活性的聚合體，本發(fā)明人的酵母體系分泌表達(dá)IGF-II也得到的是沒(méi)有活性的IGF-II。因此，本發(fā)明人期望得到有活性的重組IGF-II。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為IGF-II作為藥物在體內(nèi)使用存在和IGF-I同樣的問(wèn)題，比如會(huì)產(chǎn)生多種副作用。
研究表明IGFBP-6是IGF-II特異的高親和力結(jié)合蛋白(它對(duì)IGF-II的親和力是對(duì)IGF-I的約100倍)，如果IGFBP-6能與IGF-II共同給藥將提高IGF-II的臨床藥用價(jià)值。因此，本發(fā)明人期望得到IGF-II與IGFBP-6的復(fù)合物。
基于以上需要，對(duì)在酵母體系中分泌表達(dá)IGF-II進(jìn)行了進(jìn)一步研究。在對(duì)IGF-II的晶體結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)分泌表達(dá)的IGF-II形成了沒(méi)有活性的聚合體，進(jìn)一步的分析揭示這種聚合體是由于IGF-II分子間形成了二硫鍵。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道胰島素和IGF-I在體外表達(dá)時(shí)也存在形成聚合體的問(wèn)題。其機(jī)理是由于胰島素和IGF-I分子中的帶電荷氨基酸相互吸引，干擾了正在折疊的分子形成二硫鍵，導(dǎo)致沒(méi)有配對(duì)的半胱氨酸形成分子間二硫鍵，引發(fā)聚合體。IGF-II的氨基酸組成與IGF-I和胰島素有高度的同源性，也在相應(yīng)的區(qū)域存在帶電荷氨基酸，所以本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為IGF-II也是基于相同的機(jī)理形成聚合體。而且本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了聚合體中IGF-II分子間確實(shí)形成了二硫鍵。
由于IGF分子在體內(nèi)是與IGFBP結(jié)合成復(fù)合物的形式在血液循環(huán)中運(yùn)輸?shù)?，而且IGFBP對(duì)IGF的生物活性也有重要的調(diào)節(jié)作用，兩者的關(guān)系非常密切。所以，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為IGFBP-6很可能對(duì)IGF-II的翻譯加工過(guò)程也有調(diào)節(jié)作用。
基于以上兩點(diǎn)，本發(fā)明人進(jìn)行了IGF-II與IGFBP-6在酵母中共分泌表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明1、IGFBP-6能幫助IGF-II形成正確的二硫鍵，并大大提高了IGF-II分泌表達(dá)的效率，具有分子伴侶的作用。2、兩者成功實(shí)現(xiàn)了共分泌表達(dá)，并建立了分離純化結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物的工藝流程，為下一步作為重組藥物的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
而且兩者共表達(dá)與聯(lián)合給藥具有明顯的優(yōu)點(diǎn)1.簡(jiǎn)化了重組藥物生產(chǎn)及純化的過(guò)程，2.得到的IGF-II具有正確的結(jié)構(gòu)和活性，3.確保IGF-II都是以結(jié)合狀態(tài)存在，避免了游離IGF-II隨意發(fā)揮其促增殖活性。
2.實(shí)驗(yàn)與IGFBP家族其他成員相比，IGFBP-6對(duì)IGF-II具有特異的高親和力，這意味著IGFBP-6和IGF-II有著特殊的關(guān)系，IGFBP-6可以特異地抑制IGF-II促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，而對(duì)IGF-I活性的影響甚微。IGFBP-6在體內(nèi)多種組織廣泛分布，這對(duì)IGF-II的存在和活性有什么更深的意義，是本發(fā)明的發(fā)明人所關(guān)心的問(wèn)題。本發(fā)明的發(fā)明人在以前的針對(duì)IGF-II的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在Pp酵母中表達(dá)的IGF-II，由于二硫鍵不能正確配對(duì)導(dǎo)致分子間形成二硫鍵，使大部分IGF-II都以高度聚合體的形式存在。選用低拷貝的轉(zhuǎn)化子降低表達(dá)量、高通氧條件下的發(fā)酵表達(dá)以及各種表達(dá)條件的優(yōu)化都不能解決這一問(wèn)題。這提示IGF-II的正確折疊可能需要分子伴侶的幫助才能完成?；贗GFBP-6與IGF-II的密切關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IGFBP-6在IGF-II翻譯、折疊過(guò)程中發(fā)揮的作用。
實(shí)驗(yàn)材料1.pA0815-2IGF-II表達(dá)載體以及Mut+表型的GS115/pA0815-2IGF-II菌株是以前構(gòu)建的，參見(jiàn)李旌軍，黃秉仁，人胰島素樣生長(zhǎng)因子II在甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母P.pastoris中的表達(dá)分泌和性質(zhì)研究[J]，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，1999，15(6)893-898。
2.HRP顯色底物6mg二氨基聯(lián)苯胺溶解于10ml 10mM Tris·Cl(pH 7.6)，Whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾后，加入10μl過(guò)氧化氫。使用前新鮮配制。
3.Tricine-SDS-PAGE用試劑49.5％丙烯酰胺48.02g丙烯酰胺，1.48g N，N’-二甲叉丙烯酰胺，以50ml溫?zé)岬娜ルx子水溶解，加水定容至100ml，Whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾除雜質(zhì)，室溫避光保存。
凝膠buffer3mol/L Tris·Cl(pH8.45)，0.3％SDS。將36.3g Tris和0.3gSDS溶于80ml去離子水中，用HCl調(diào)pH至8.45，加水至100ml。
80％甘油80ml甘油，加水至100ml，充分混勻。
1×陰極電泳buffer0.1mol/L Tris·Cl(pH8.25)，0.1mol/L Tricine，0.1％SDS。將1.21g Tris、1.79g Tricine及0.1g SDS溶于80ml去離子水中，用HCl調(diào)pH至8.25，加水定容至100ml。
1×陽(yáng)極電泳buffer0.2mol/L Tris·Cl(pH8.9)。將2.42g Tris溶于80ml離水中，用HCl調(diào)pH至8.9，加水定容至100ml。
10％APS將1g過(guò)硫酸胺溶于10ml去離子水中，4℃短期保存。
TEMED少量分裝，4℃避光保存。
4×非還原加樣buffer0.2mol/L Tris·Cl(pH6.8)，8％SDS，0.4％溴酚藍(lán)，40％甘油。
4.蛋白質(zhì)層析用試劑bufferA0.05mol/L醋酸鈉buffer，62mmol/L氯化鈉，1mmol/L EDTA調(diào)節(jié)pH至5.0bufferB0.05mol/L醋酸鈉buffer，1mol/L硫酸銨，1mmol/L EDTA調(diào)節(jié)pH至5.0實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果實(shí)施例一.共表達(dá)載體pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)的構(gòu)建利用已有的表達(dá)載體pA0815-2IGF-II和pA0815-2IGFBP-6構(gòu)建共表達(dá)載體pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)，方法如圖1所示，BglII和BamHI雙酶切pA0815-2IGFBP-6，得到兩拷貝的IGFBP-6表達(dá)單元，回收片段后，與經(jīng)過(guò)BamH I線性化及CIP去磷酸化處理的表達(dá)載體pA0815-2IGF-II進(jìn)行連接。挑取氨芐青霉素抗性陽(yáng)性的克隆，制備質(zhì)粒，根據(jù)質(zhì)粒大小鑒定插入了目的片段的陽(yáng)性克隆，再利用BglII和BamHI雙酶切鑒定和篩選出兩拷貝IGFBP-6表達(dá)單元按正確方向連入的重組表達(dá)載體pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)。制備質(zhì)粒，SalI使之線性化后，轉(zhuǎn)化Pp菌株GS115。
克隆入表達(dá)載體中的IGFBP-6的cDNA序列 AGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGCTAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGACGGTGCCCAGGCTGCGGGCAAGGGGTGCAGGCGGGTTGTCCAGGGGGCTGCGTGGAGGAGGAGGATGGGGGGTCGCCAGCCGAGGGCTGCGCGGAAGCTGAGGGCTGTCTCAGGAGGGAGGGGCAGGAGTGCGGGGTCTACACCCCTAACTGCGCCCCAGGACTGCAGTGCCATCCGCCCAAGGACGACGAGGCGCCTTTGCGGGCGCTGCTGCTCGGCCGAGGCCGCTGCCTTCCGGCCCGCGCGCCTGCTGTTGCAGAGGAGAATCCTAAGGAGAGTAAACCCCAAGCAGGCACTGCCCGCCCACAGGATGTGAACCGCAGAGACCAACAGAGGAATCCAGGCACCTCTACCACGCCCTCCCAGCCCAATTCTGCGGGTGTCCAAGACACTGAGATGGGCCCATGCCGTAGACATCTGGACTCAGTGCTGCAG
CAACTCCAGACTGAGGTCTACCGAGGGGCTCAAACACTCTACGTGCCCAATTGTGACCATCGAGGCTTCTACCGGAAGCGGCAGTGCCGCTCCTCCCAGGGGCAGCGCCGAGGTCCCTGCTGGTGTGTGGATCGGATGGGCAAGTCCCTGCCAGGGTCTCCAGATGGCAATGGAAGCTCCTCCTGCCCCACTGGGAGTAGCGGC框內(nèi)部分為Kozak序列；劃線部分為α-factor信號(hào)肽的編碼序列.共255bp，編碼85個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，用于引導(dǎo)IGFBP-6分泌表達(dá)；其他部分為IGFBP-6的編碼序列，639bp編碼213個(gè)氨基酸的IGFBP-6。
克隆入表達(dá)載體中的IGF-II的cDNA序列 AGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGCTAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGAGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAG框內(nèi)部分為Kozak序列；劃線部分為α-factor信號(hào)肽的編碼序列，共255bp，編碼85個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，用于引導(dǎo)IGF-II的分泌表達(dá)；其他部分為IGF-II的編碼序列，201bp，編碼67個(gè)氨基酸的IGF-II。
在后附序列表中，序列SEQ ID NO1表示IGF-II的編碼序列；序列SEQ ID NO2表示IGFBP-6的編碼序列；序列SEQ ID NO3表示α-factor信號(hào)肽的編碼序列。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BglII和BamHI雙酶切pA0815-2IGFBP-6，可以得到大小約為4.4Kb、頭→尾正確連接的兩拷貝IGFBP-6表達(dá)單元，這一片段5’端為BglII粘性末端，3’端為BamHI的粘性末端。由于BglII和BamHI是同尾酶，在與經(jīng)過(guò)BamH I線性化及CIP去磷酸化處理的表達(dá)載體pA0815-2IGF-II進(jìn)行連接時(shí)，會(huì)以兩種方向連入。利用BglII和BamHI雙酶切可以鑒定出按5’→3’正確轉(zhuǎn)錄方向連入的重組克隆。正確方向的克隆中，載體上的BamHI末端與片段上的BglII末端連接后將不能再被兩種酶切割，BglII和BamHI雙酶切鑒定時(shí)將產(chǎn)生7.9Kb的頭→尾連接的表達(dá)單元的片段(參見(jiàn)圖2)。由于載體大小的限制，只能構(gòu)建兩拷貝的共表達(dá)載體。在兩拷貝的共表達(dá)載體pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)中，IGF-II和IGFBP-6以相等的拷貝數(shù)存在，每一個(gè)表達(dá)單元具有獨(dú)立的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，獨(dú)立的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，這樣可以確保IGF-II和IGFBP-6以相等的分子數(shù)存在于表達(dá)上清中。以SalI復(fù)載體線性化后轉(zhuǎn)化酵母菌，利用HIS4位點(diǎn)重組，可以保證所有的插入片段全部整合入酵母基因組中，進(jìn)一步保證了IGF-II和IGFBP-6以等分子數(shù)進(jìn)行表達(dá)。
實(shí)施例二.貼膜法篩選陽(yáng)性共表達(dá)轉(zhuǎn)化子將MD板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子按順序接種至新的MD板上，一塊9cm直徑的平板可以接種約30～40個(gè)克隆。28～30℃培養(yǎng)3～4天，克隆的直徑可以達(dá)到約2～3mm。用一張直徑6cm的圓形無(wú)菌的醋酸纖維素膜貼至平板上，使菌落黏附于醋酸纖維素膜上。在一個(gè)新鮮準(zhǔn)備的BMMY板上，放置一張同樣大小的無(wú)菌硝酸纖維素膜，將醋酸纖維素膜帶有菌落的一面向上平貼于硝酸纖維素膜上，使兩張膜重疊在一起，盡量排除兩層膜以及平板之間的氣泡。28～30℃誘導(dǎo)表達(dá)24hr，取出硝酸纖維素膜進(jìn)行抗體的雜交。每次實(shí)驗(yàn)需同時(shí)制備兩張完全一樣的膜，進(jìn)行兩種抗體的雜交。吸附有分泌蛋白的硝酸纖維素膜封閉后，分別與羊抗IGF-II的多克隆抗體和羊抗IGFBP-6的多克隆抗體雜交，PBS-T洗膜后再將兩張膜背靠背同時(shí)與HRP標(biāo)記的二抗雜交，TBS-T洗膜后，加入HRP顯色底物，顯色后將膜晾干，避光保存。
貼膜法篩選共表達(dá)IGF-II和IGFBP-6的陽(yáng)性克隆，一次實(shí)驗(yàn)可以完成30～40個(gè)克隆的篩選，是一種高效率的初步篩選方法。與兩種抗體都有雜交信號(hào)的克隆共有8株，其中信號(hào)最強(qiáng)的有兩株，另外6株信號(hào)較弱。將兩株雜交信號(hào)強(qiáng)的克隆進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)從MD板上挑取菌株，分別于10ml BMG培養(yǎng)基中28～30℃震蕩培養(yǎng)至OD600≈10。室溫離心收集菌體，重懸于10mlBMMY中，28～30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每24h追加甲醇100μl，在誘導(dǎo)后72hr收獲菌體，離心收集上清，進(jìn)一步分析IGF-II和IGFBP-6的表達(dá)情況。500μl培養(yǎng)上清TCA沉淀濃縮后，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分離。銀染結(jié)果表明表達(dá)上清中分別存在7.4KD、18KD和30KD的三條主帶(參見(jiàn)圖3中2道)，分子量分別與在Pp酵母中單獨(dú)表達(dá)時(shí)的IGF-II、IGFBP-6的降解片段及IGFBP-6全長(zhǎng)一致。經(jīng)Western blot鑒定，7.4KD的帶與抗IGF-II多克隆抗體有雜交信號(hào)，18KD和30KD的帶與抗IGFBP-6多克隆抗體有特異的雜交信號(hào)，說(shuō)明這兩株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子確實(shí)共表達(dá)了IGF-II和IGFBP-6。選定其中的一株進(jìn)行下一步的分離純化及性質(zhì)的研究。
實(shí)施例三、搖瓶表達(dá)SalI線性化的pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)轉(zhuǎn)化GS115后，載體上的HIS4基因與酵母染色體上的his4基因發(fā)生同源重組，整合入酵母染色體，不影響酵母的AOX1啟動(dòng)子對(duì)甲醇的利用，所得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子應(yīng)全部是Mut+表型。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)放大體積培養(yǎng)。刮取MD平板上的陽(yáng)性克隆，接種于25ml YPD液體培養(yǎng)基，28～30℃，200～230rpm振蕩培養(yǎng)20h后，將適量菌液轉(zhuǎn)接于100ml BMG中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，使OD600≈10，室溫離心1500×g，收集菌體，重懸于500ml BMMY，1％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72hr后，4℃，8000×g離心收集上清，4℃短期保存，如需長(zhǎng)期保存，分裝成小份后-20℃凍存。
共表達(dá)產(chǎn)物中IGF-II結(jié)構(gòu)的鑒定和表達(dá)產(chǎn)量的分析Mut+表型的GS115/pA0815-2IGF-II、GS115/pA0815-2(IGF-II-IGFBP-6)及GS115/pA0815-2IGFBP-6菌株按相同的搖瓶培養(yǎng)條件放大體積誘導(dǎo)。誘導(dǎo)前菌液的OD600值均約為10，使菌的狀態(tài)保持一致。誘導(dǎo)24hr時(shí)收集菌液，取等量的表達(dá)上清TCA沉淀濃縮后，Tricine-SDS-PAGE分離，銀染鑒定表達(dá)上清中蛋白的含量。結(jié)果如圖3所示共表達(dá)菌株誘導(dǎo)24hr時(shí)，已有相當(dāng)含量的IGF-II分泌；而單表達(dá)IGF-II的菌株，誘導(dǎo)24hr時(shí)，IGF-II的表達(dá)卻很低。說(shuō)明IGFBP-6顯著提高了IGF-II的翻譯加工的效率。共表達(dá)對(duì)IGFBP-6的表達(dá)量卻沒(méi)有明顯的影響，IGFBP-6依然被降解成18KD的片段，說(shuō)明IGF-II與IGFBP-6的結(jié)合并沒(méi)有使酶切位點(diǎn)受到保護(hù)。
誘導(dǎo)72hr后，IGF-II的表達(dá)量逐漸積累增加。取IGF-II單獨(dú)表達(dá)上清和共表達(dá)上清，TCA沉淀濃縮，每種樣品分別用1×還原加樣buffer(含β-巰基乙醇)和1×非還原加樣buffer(不含β-巰基乙醇)溶解，Tricine-SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后與羊抗人IGF-II多克隆抗體進(jìn)行雜交。結(jié)果如圖4所示IGF-II單表達(dá)上清中，β-巰基乙醇可以打開(kāi)分子間的二硫鍵，使樣品中的IGF-II完全成為7.4KD的單體，非還原條件下IGF-II則以多種聚合體的形式存在，未見(jiàn)單體IGF-II條帶，說(shuō)明二硫鍵是聚合體形成的原因。共表達(dá)的樣品則不受β-巰基乙醇的影響，還原和非還原的變性條件下，都以7.4KD的單體IGF-II為主要形式存在。所以共表達(dá)時(shí)，IGFBP-6具有分子伴侶的功能，幫助IGF-II實(shí)現(xiàn)了二硫鍵的正確折疊，防止了聚合體的形成。
實(shí)施例四、復(fù)合物的制備1.凝膠的配制

2.電泳灌制好凝膠后，分別將陰極電泳buffer和陽(yáng)極電泳buffer加入電泳槽的上槽和下槽中，將電泳槽封好，避免陰極buffer和陽(yáng)極buffer的混合，恒壓100V電泳約3hr。
3.共表達(dá)產(chǎn)物的分離純化表達(dá)上清經(jīng)4℃，8000×g離心10min后，收集上清。經(jīng)0.22μm混合纖維素膜過(guò)濾后，用于層析。層析用所有試劑都需經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除雜質(zhì)，防止層析介質(zhì)的堵塞。
表達(dá)上清采用FPLC系統(tǒng)的陽(yáng)離子交換層析和疏水交換層析進(jìn)行兩步純化。陽(yáng)離子交換層析柱為自裝柱Amersham Bioscience公司的層析介質(zhì)SP Sepharose Fast Flow裝入XK26/20柱，柱體積50ml。疏水交換層析柱為自裝柱Amersham Bioscience公司的層析介質(zhì)Phenyl Sepharose Fast Flow裝入XK26/20柱，柱體積10ml。層析緩沖液見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料部分。
表達(dá)上清用10倍體積的bufferA稀釋，調(diào)節(jié)pH至5.0后，以5ml/min上樣于經(jīng)250ml bufferA平衡的SP Sepharose Fast Flow，用bufferA將上樣峰洗至基線后，用bufferB以5ml/min洗脫，收集洗脫液。陽(yáng)離子交換層析的洗脫液以2ml/min上樣于經(jīng)100ml bufferB平衡的HiTrap Octyl Fast Flow，用bufferB將上樣峰洗至基線后，用bufferA以2ml/min流速一步洗脫。Tricine-SDS-PAGE鑒定洗脫液。
共表達(dá)產(chǎn)物的層析性質(zhì)的分析在疏水交換層析過(guò)程中，共表達(dá)樣品表現(xiàn)出與單獨(dú)表達(dá)的IGF-II和IGFBP-6不同的疏水性質(zhì)。在1mol/L硫酸銨的上樣條件下，單獨(dú)表達(dá)的IGF-II樣品和IGFBP-6樣品都能夠與較弱的疏水介質(zhì)辛烷基瓊脂糖(octyl sepharose)結(jié)合，在不含硫酸銨的bufferA洗脫條件下可以有效洗脫。相同的上樣條件下，共表達(dá)樣品則不能與辛烷基瓊脂糖有效結(jié)合，需使用具有更強(qiáng)的疏水性的苯基瓊脂糖介質(zhì)(phenylsepharose)才能有效結(jié)合，不含硫酸銨的bufferA可以有效洗脫。而單獨(dú)表達(dá)的IGF-II樣品和IGFBP-6樣品與苯基瓊脂糖介質(zhì)強(qiáng)有力的結(jié)合則必須使用20％～70％乙醇的極端洗脫條件，才能將其洗脫。這說(shuō)明共表達(dá)的過(guò)程中IGF-II折疊形成了正確的結(jié)構(gòu)，能夠與IGFBP-6結(jié)合形成復(fù)合物，占據(jù)了蛋白表面的疏水性氨基酸，使復(fù)合物的疏水性大大減弱。
在分離純化過(guò)程中IGF-II與IGFBP-6含量比值的變化也說(shuō)明IGF-II與IGFBP-6以復(fù)合物的形式從疏水介質(zhì)上洗脫。如圖5和表1所示在離子交換層析洗脫液中，IGF-II與IGFBP-6的含量比為38％∶62％；在疏水交換層析洗脫液中，兩者的比值降為28％∶72％，接近兩者的分子量的比值。說(shuō)明疏水交換層析除去了大部分游離的蛋白，純化出了結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物。
表1凝膠成像分析(與圖5對(duì)應(yīng))

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以看出，IGF-II是人體重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。雖然成熟的IGF-II是只有67個(gè)氨基酸的小肽，但對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的解析至今尚未成功。自從Bell等人(BellGI，Merryweather JP，et al.Sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin-like growthfactor II.Nature.1984 Aug 30-Sep 5；310(5980)775-7.)于1984年成功克隆得到人IGF-II的cDNA序列以來(lái)，人IGF-II先后以不同的形式在多種表達(dá)體系中表達(dá)，但都因表達(dá)產(chǎn)量低、不能正確復(fù)性而未獲得成功(Hammarberg B，Moks T，et al.Differential stability ofrecombinant human insulin-like growth factor II in Escherichia coli and taphylococcus aureus.JBiotechnol.1990 Jun；14(3-4)423-37.)。這制約著對(duì)IGF-II結(jié)構(gòu)的研究。
本發(fā)明利用Pp酵母體系表達(dá)IGF-II的研究中，IGF-II可以以60mg/L的產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。但在進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)研究中卻發(fā)現(xiàn)由于二硫鍵的錯(cuò)誤折疊，IGF-II以高度聚合體的形式存在，大大制約了結(jié)構(gòu)和功能的研究。
蛋白質(zhì)二硫鍵的折疊不是自發(fā)進(jìn)行的，需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的輔助分子及折疊酶的幫助才能完成。酵母細(xì)胞具有真核生物細(xì)胞所特有的分泌路徑——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)→高爾基體→質(zhì)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)擁有蛋白質(zhì)折疊的輔助分子，蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的過(guò)程就是進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊和翻譯后加工的過(guò)程，所以分泌的表達(dá)產(chǎn)物往往具有正確的構(gòu)象和生物活性。IGFBP-6也是富含二硫鍵的蛋白，分子中共有16個(gè)半胱氨酸，形成8對(duì)二硫鍵，Pp酵母中表達(dá)的IGFBP-6沒(méi)有形成分子間二硫鍵引發(fā)的聚合體(參見(jiàn)圖6)，說(shuō)明在Pp酵母表達(dá)體系中由α-factor信號(hào)肽引導(dǎo)的蛋白分泌表達(dá)可以成功的實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的折疊。
單獨(dú)存在時(shí)發(fā)生聚合是胰島素家族共同存在的問(wèn)題。胰島素和前胰島素會(huì)自發(fā)聚集成六聚體，大大影響了藥用胰島素的吸收和血藥濃度。聚合的原因是由于分子之間帶電氨基酸的相互吸引。經(jīng)過(guò)對(duì)胰島素氨基酸的突變得到了具有生物活性的單體胰島素，大大加快了藥物的利用率。由于結(jié)構(gòu)上的同源性，IGF-I也存在相似的問(wèn)題。Bhabatosh等人在釀酒酵母中表達(dá)IGF-I時(shí)，IGF-I也形成了基于二硫鍵的聚合體，他們對(duì)IGF-I相應(yīng)的帶電氨基酸進(jìn)行突變，消除了二硫鍵引發(fā)的聚合[34]。分析IGF-II的氨基酸組成，存在與胰島素和IGF-I高度同源的帶電氨基酸(參見(jiàn)圖7)，具有自發(fā)聚集的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。很可能是同樣的機(jī)制造成分子間自發(fā)聚集的傾向，干擾了新合成的IGF-II的折疊，導(dǎo)致二硫鍵的錯(cuò)配。
基于上述實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明IGFBP-6與IGF-II存在密切關(guān)系，IGFBP-6對(duì)體內(nèi)IGF-II從翻譯表達(dá)、運(yùn)輸?shù)交钚缘恼{(diào)節(jié)都起重要的作用。本試驗(yàn)中IGFBP-6的存在，從機(jī)理上分析可能是通過(guò)有效隔離IGF-II分子之間的相互作用，使新合成的IGF-II有充分的時(shí)間和空間進(jìn)行折疊，也可能是在IGF-II折疊過(guò)程中與之伴隨起到分子伴侶的作用，使IGF-II二硫鍵得以正確折疊(參見(jiàn)圖8)，有效避免了聚合的發(fā)生。
本試驗(yàn)的結(jié)果證明了IGFBP-6可以有效的幫助IGF-II在翻譯過(guò)程中的二硫鍵折疊，大大提高了IGF-II分泌表達(dá)的效率，兩者能以復(fù)合物的形式共同表達(dá)。為下一步IGF-II和IGFBP-6的結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
為實(shí)現(xiàn)IGFBP-6和IGF-II等分子數(shù)的表達(dá)，本發(fā)明從載體的構(gòu)建和重組方式兩方面進(jìn)行了設(shè)計(jì)。首先，構(gòu)建了兩種基因表達(dá)單元的等拷貝數(shù)的表達(dá)載體，每個(gè)表達(dá)單元具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)率終止子，從結(jié)構(gòu)上保證了兩種蛋白以相同的機(jī)率得到甲醇的誘導(dǎo)，起始轉(zhuǎn)錄和翻譯。另外，在轉(zhuǎn)化酵母菌時(shí)，如果用BglII酶切，線性化的載體利用載體上的5’AOX1和3’AOX1與酵母染色體上的5’AOX1和3’AOX1基因進(jìn)行同源重組，外源基因有可能丟失。因?yàn)槊恳粋€(gè)表達(dá)單元的5’AOX1的都可以進(jìn)行同源重組整合，就會(huì)使上游的表達(dá)單元丟失(圖9A)。而SalI線性化載體后，則利用載體上的HIS4基因與酵母染色體上的his4基因進(jìn)行同源重組，這樣所有插入的外源基因的表達(dá)單元都可以整合入酵母染色體，進(jìn)一步確保兩種蛋白以相同的拷貝數(shù)存在(圖9B)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明兩種相互作用的蛋白共表達(dá)而非融合表達(dá)，很好地實(shí)現(xiàn)兩種蛋白的翻譯加工，并以結(jié)合狀態(tài)分泌表達(dá)?？朔巳诤媳磉_(dá)時(shí)的一些缺陷，如因外源基因過(guò)大導(dǎo)致的翻譯提前終止，兩種蛋白空間距離過(guò)近對(duì)折疊的不利影響等。為其他相互作用蛋白的共表達(dá)，提供了成功的經(jīng)驗(yàn)。
IGF分子在血液循環(huán)和組織局部都是與IGFBP分子結(jié)合成復(fù)合體的形式存在的，這既有效保護(hù)了IGF免遭降解，又避免了IGF活性的過(guò)度發(fā)揮對(duì)機(jī)體造成的危害。作為藥物的重組IGF-I的臨床前實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)用藥時(shí)致癌的副作用可以通過(guò)與IGFBP-3共同用藥來(lái)消除。本實(shí)驗(yàn)共表達(dá)IGF-II和IGFBP-6，分離純化出結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物，解決了共同給藥的問(wèn)題，又大大提高了表達(dá)純化的效率。
由于IGF分子在體內(nèi)是與IGFBP結(jié)合成復(fù)合物的形式在血液循環(huán)中運(yùn)輸?shù)?，而且IGFBP對(duì)IGF的生物活性也有重要的調(diào)節(jié)作用，兩者的關(guān)系非常密切。所以，IGFBP-6對(duì)IGF-II的翻譯加工過(guò)程很可能也有調(diào)節(jié)作用。
IGF-II與IGFBP-6在酵母中共分泌表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IGFBP-6能幫助IGF-II形成正確的二硫鍵，并大大提高了IGF-II分泌表達(dá)的效率，具有分子伴侶的作用；兩者成功實(shí)現(xiàn)了共分泌表達(dá)，并可通過(guò)分離純化工藝得到結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物。而且兩者共表達(dá)與聯(lián)合給藥具有明顯的優(yōu)點(diǎn)1.簡(jiǎn)化了重組藥物生產(chǎn)及純化的過(guò)程，2.得到的IGF-II具有正確的結(jié)構(gòu)和活性，3.確保IGF-II都是以結(jié)合狀態(tài)存在，避免了游離IGF-II隨意發(fā)揮其促增殖活性。
序列表<160>3<210>1<211>201<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gcttaccgcc ccagtgagac cctgtgcggc ggggagctgg tggacaccct ccagttcgtc 60tgtggggacc gcggcttcta cttcagcagg cccgcaagcc gtgtgagccg tcgcagccgt120ggcatcgttg aggagtgctg tttccgcagc tgtgacctgg ccctcctgga gacgtactgt180gctacccccg ccaagtccga g 201<210>2<211>639<212>DNA<213>智人<400>2cggtgcccag gctgcgggca aggggtgcag gcgggttgtc cagggggctg cgtggaggag 60gaggatgggg ggtcgccagc cgagggctgc gcggaagctg agggctgtct caggagggag120gggcaggagt gcggggtcta cacccctaac tgcgccccag gactgcagtg ccatccgccc180aaggacgacg aggcgccttt gcgggcgctg ctgctcggcc gaggccgctg ccttccggcc240cgcgcgcctg ctgttgcaga ggagaatcct aaggagagta aaccccaagc aggcactgcc300cgcccacagg atgtgaaccg cagagaccaa cagaggaatc caggcacctc taccacgccc360tcccagccca attctgcggg tgtccaagac actgagatgg gcccatgccg tagacatctg420gactcagtgc tgcagcaact ccagactgag gtctaccgag gggctcaaac actctacgtg480cccaattgtg accatcgagg cttctaccgg aagcggcagt gccgctcctc ccaggggcag540cgccgaggtc cctgctggtg tgtggatcgg atgggcaagt ccctgccagg gtctccagat600ggcaatggaa gctcctcctg ccccactggg agtagcggc 639<210>3<211>255<212>DNA<213>啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>3atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagctaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctttggata aaaga 25權(quán)利要求
1.一種制備有活性多肽或者蛋白質(zhì)的方法，包括1)獲得編碼所述多肽或者蛋白質(zhì)的基因序列，并獲得編碼該多肽或者蛋白質(zhì)的伴侶分子的基因序列；2)用上述序列構(gòu)建共表達(dá)載體；3)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使共表達(dá)載體表達(dá)該多肽或者蛋白質(zhì)和該伴侶分子；和4)收集表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)合物，其中含有該活性多肽或者蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共表達(dá)載體中的所述多肽或者蛋白質(zhì)的編碼基因序列和所述伴侶分子基因序列是等拷貝比例關(guān)系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共表達(dá)載體中的所述多肽或者蛋白質(zhì)的編碼基因序列和所述伴侶分子的基因序列是獨(dú)立地表達(dá)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共表達(dá)載體中的所述多肽的基因序列編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和所述伴侶分子的基因序列編碼IGFBP-6。
5.一種復(fù)合物，含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和IGFBP-6，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子-II是正確折疊的。
6.一種表達(dá)載體，含有胰島素樣生長(zhǎng)因子-II和IGFBP-6的基因。
7.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，是通過(guò)用權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
8.一種構(gòu)建共表達(dá)載體的方法，包括將胰島素樣生長(zhǎng)因子-II基因和IGFBP-6基因以等拷貝數(shù)量插入到表達(dá)載體中，使兩種基因獨(dú)立受到調(diào)控。
9.一種獲得有活性胰島素樣生長(zhǎng)因子-II的方法，包括將處于變性狀態(tài)下的胰島素樣生長(zhǎng)因子-II與IGFBP-6發(fā)生接觸，經(jīng)歷一段時(shí)間的作用，形成與IGFBP-6結(jié)合在一起的有活性胰島素樣生長(zhǎng)因子-II。
10.IGFBP-6作為伴侶分子在制備有活性的胰島素樣生長(zhǎng)因子-II中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種制備有活性多肽或者蛋白質(zhì)的方法，包括1)獲得編碼所述多肽或者蛋白質(zhì)的基因序列，并獲得編碼該多肽或者蛋白質(zhì)的伴侶分子的基因序列；2)用上述序列構(gòu)建共表達(dá)載體；3)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使共表達(dá)載體表達(dá)該多肽或者蛋白質(zhì)和該伴侶分子；和4)收集表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)合物，其中含有該活性多肽或者蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使胰島素樣生長(zhǎng)因子－II和IGFBP－6共表達(dá)，制得它們的復(fù)合物，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子－II是正確折疊的有活性分子。本發(fā)明所得到的復(fù)合物可以用于制備藥物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1920021SQ200510093020
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者陳照麗, 陳虹, 黃秉仁 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所