專利名稱：一種從柿子中提取柿子多酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柿子提取物的制備方法，具體地說，涉及一種從柿子中提取柿子多酚的方法。
背景技術(shù)：
柿子，除味道可口外，還有藥用功效，具《本草綱目》記載“食用柿子，能美容而補(bǔ)虛益肺?！笔恋偈侵箍饶鎳I吐的良藥；柿露清火解毒，對(duì)治便血有特效，又有治療喉嚨、口舌瘡?fù)吹墓δ?。柿子還有潤肺止咳、清熱生津、化痰軟堅(jiān)之功效。鮮柿生食，對(duì)肺癆咳嗽虛熱肺痿、咳嗽痰多、虛勞咯血等癥有良效。紅軟熟柿，可治療熱病煩渴、口干唇爛、心中煩熱、熱痢等癥。
植物中的多酚成分具有抗癌作用已得到證明，例如，綠茶中的兒茶素單體ECG和EGCG、棉籽中的棉子酚、柳樹皮中的氯原酸、櫟樹和橡樹中的櫟精和橡精等都屬于多酚類。德國科學(xué)家日前對(duì)多酚抑制腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)理有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，并且發(fā)現(xiàn)許多植物中都包含這種天然抗癌物質(zhì)。研究小組在實(shí)驗(yàn)中選取了白血病細(xì)胞、肺部腫瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使只有微量的多酚也能夠抑制腫瘤細(xì)胞里的酶，而這些酶對(duì)引發(fā)腫瘤細(xì)胞生長“信號(hào)”分子的產(chǎn)生是必需的。在植物藥療法中，多酚被認(rèn)為是預(yù)防和抑制腫瘤的物質(zhì)。
柿子多酚不光具有抗癌作用，而且柿子中含有一類特殊的多酚物質(zhì)，和現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的其它多酚類物質(zhì)如葡萄籽多酚、松樹皮多酚、茶多酚等相比存在很大的差異。其多酚類物質(zhì)主要是由多個(gè)茶多酚結(jié)構(gòu)聚合而成的一類大分子的物質(zhì)，將此類多酚水解后可以得到具有強(qiáng)抗氧化生理活性的低聚體酚類物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)表明，抗氧化性能指標(biāo)TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)和ORAC(Oxygen RadicalAbsorbance Capacity)顯示柿子多酚具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能有效去除過氧化物質(zhì)。
經(jīng)過專利檢索，目前還沒有發(fā)現(xiàn)以柿子為原料提取柿子多酚的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在以克服現(xiàn)有技術(shù)中沒有以柿子為原料提取柿子多酚的缺陷，提供一種從柿子中提取柿子多酚的方法，本發(fā)明方法提取物中柿子多酚重量含量為70％以上。本發(fā)明方法生產(chǎn)的柿子多酚含量高、避免了活性成分的損失、簡化了生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期。
為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明從柿子中提取柿子多酚的方法，它是一種以柿子為原料，經(jīng)提取溶媒提取、濃縮、分離純化提取柿子多酚的方法，提取物中柿子多酚重量含量為70％以上。
本發(fā)明方法所用柿子可以為鮮柿子和/或干柿子。
本發(fā)明方法可以在提取前先將柿子進(jìn)行破碎，柿子經(jīng)破碎后有利于各種成分的充分溶出；鮮果將其榨碎即可。
本發(fā)明方法所述提取方法為加熱提取或超聲波提取或微波提取。
本發(fā)明方法所述提取方法為加熱提取，提取次數(shù)是影響收率和含量的一個(gè)關(guān)鍵，一般提取次數(shù)為1～3次，根據(jù)試驗(yàn)，綜合考慮提取設(shè)備使用空間的利用率及成品的有效物含量，提取次數(shù)最好為2次；溶媒用量為3～12倍，溫度為40～100℃，提取時(shí)間為溶媒沸騰后1～3小時(shí)。
本發(fā)明所述柿子提取后需要進(jìn)行回收低碳醇處理，溫度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上，回收低碳醇的藥液與原料重量比應(yīng)控制在1∶2～5之間。
本發(fā)明方法中所述提取溶媒為水或低碳醇。所述低碳醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇，所述低碳醇的重量濃度為1％～95％。
本發(fā)明方法所述超聲波提取條件為工作頻率15～80kHz，時(shí)間5～120min；微波提取條件為工作頻率900～2500MHz，時(shí)間5～120min。
本發(fā)明所述分離純化為柱層析分離純化。
本發(fā)明柱層析分離純化為1)提取液經(jīng)濃縮(真空濃縮，溫度控制在60攝氏度以下，真空度0.08MPa以上，濃縮至原來提取液體積的1/4-1/2)、回收低碳醇、離心(臥式離心機(jī)4800r/min)后，直接進(jìn)入大孔樹脂柱，流速控制在0.5～1.5BV/hr左右；2)用去離子水洗柱至流出液清澈，約2h；3)用低碳醇洗柱至洗脫液澄清、透明，流速略慢于吸附的速度；4)收集從大孔樹脂柱中的流出的澄清、透明，略帶醇味的洗脫液，收集洗脫液約是樹脂量的1～3倍左右；5)醇水洗脫液經(jīng)濃縮(真空濃縮，溫度控制在60攝氏度以下，真空度0.06-0.1MPa，濃縮至10～15婆美度左右，即濃縮至原來提取液體積的1/4-1/2。)，干燥(噴霧干燥進(jìn)風(fēng)口溫度160～200℃，出風(fēng)口溫度80～110℃)得柿子多酚。
其中所述低碳醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或戊醇，低濃度醇水溶液的濃度最低為體積濃度30％，高濃度醇水溶液的濃度最高為體積濃度95％；其中所述大孔樹脂為以聚苯乙烯為骨架的材料，如DIAION品牌，型號(hào)為D101、D130、AB-8或HP-20。
本發(fā)明方法制備的提取物中的柿子多酚中抗氧化性能指標(biāo)TEAC和ORAC顯示柿子多酚具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能有效去除過氧化物質(zhì)。
本發(fā)明方法生產(chǎn)的柿子多酚含量高，其重量含量為70％以上，避免了活性成分的損失、提高了生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期。
柿子多酚中抗氧化性能指標(biāo)TEAC(Trolox Equivalent AntioxidantCapacity)和ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)抗氧化活性試驗(yàn)血清中ORAC的抗氧化性能試驗(yàn)試劑準(zhǔn)備1.225mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)將39mL 0.45M NaH2PO4和61mL0.45M Na2HPO4混合，調(diào)節(jié)pH至7.0，用去離子水稀釋至200mL(室溫保存)；2.60nM R-藻紅蛋白(PE)用10mL去離子水溶解19.80μL R-藻紅蛋白(使用前搖勻)；3.18mM AAPH用10mL去離子水溶解488.1mg AAPH(使用前搖勻)方法血清的前處理1.將20μL的高氯酸和60μL血清于1.5-mL的試管中混勻；2.然后，加入300μL n-丁醇，等待十秒鐘；3.將試管于12,000rpm離心十分鐘；4.移取50L的上浮液到另一1.5-mL的試管中；5.用純氮吹干；6.加入2mL 225mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)ORAC試驗(yàn)1.將2mL預(yù)處理過的血清和2mL的PE于棕色試管中混勻；2.37℃預(yù)孵卵5分鐘；
3.通過在37攝氏度下加入2mLAAPH試劑開始熒光分析(激發(fā)光540nm，輻射光565nm)，在每3至5分鐘將部分反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至一小試管后測試熒光強(qiáng)度(如果熒光強(qiáng)度降低至原始值的20％以下，停止測試)注意1.ORAC試驗(yàn)過程中要避光，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室熒光燈；2.R-藻紅蛋白處理后要及時(shí)使用；3.AAPH溶解后，十分鐘內(nèi)必須使用，因?yàn)槿芤翰环€(wěn)定；4.ORAC實(shí)驗(yàn)后用1N HCl洗棕色試管，去除熒光蛋白。
血清中TEAC的抗氧化性能試驗(yàn)試劑準(zhǔn)備(1)1.25mM trolox溶液(標(biāo)準(zhǔn))在10ml 5mM PBS(pH7.4)里溶解3.13mg Trolox，-20℃保存(2)450mM過氧化氫(培養(yǎng)基)將0.5ml 30％過氧化氫(H2O2)和9.3ml 5mM PBS混勻，4℃保存(使用時(shí)用5mM PBS稀釋成450μM H2O2溶液)(3)5mM ABTS(磷酸氫二氨)溶液(色原體)將27.43mg ABTS溶解在10ml 5mM PBS中，4℃棕色試管避光保存(使用時(shí)用5mM PBS稀釋至500μM ABTS溶液)(4)70μM Met Mb溶液(色原體)1)純化Met Mb將68mg肌球素(Mb)溶解于10ml 5mM PBS(400μM Mb)將2.44mg of K3[Fe(CN)6]溶解于10ml 5mM PBS(740μMK3[Fe(CN)6])取10ml 400μM Mb和10ml 740μM K3[Fe(CN)6]混合后，室溫下放置，活化15分鐘將Met Mb溶液通過用5mM PBS平衡過的Sephadex G15-120柱(2.5φ×40cm)用下面的公式計(jì)算洗提收率2)計(jì)算純度和濃度用下列的微平衡計(jì)算各部分的純度[Met Mb]＝146A490-108A560+2.1A580[Ferryl Mb]＝-62A490+242A560-123A580[MbO2]＝2.8A490-127A560+153A580(減去700nm處的值來修正背景吸收)當(dāng)總蛋白血紅素＞95％收集Met Mb部分，用上面的公式計(jì)算洗出液中的濃度。
3)制備70μM Met Mb溶液用5mM PBS稀釋純化后的Met Mb溶液，4℃保存實(shí)驗(yàn)方法(1)36μL 70μM Met Mb到1.5-ml的樣品試管中；(2)向試管中加入300μl 500μM ABTS和487μl 5mM PBS(3)加入10μl血清或1.25mM trolox溶液(4)慢慢混勻后，將試管于0℃儲(chǔ)存5分鐘(5)然后加入167μl 450μM H2O2，混勻，放置十秒鐘(6)室溫下(20-25℃)精確控制時(shí)間，反應(yīng)5分鐘(7)用紫外分光光度計(jì)于734nm測試樣品Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)(1)參考每單位1.25mM trolox溶液來計(jì)算血清樣品的吸光率(2)參考1.00mM trolox來計(jì)算血清樣品中TEAC(mM)的值具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1)前處理將柿子鮮果榨碎。
2)提取將原料與去離子水按1∶3比例混合裝入提取罐，加熱至沸騰后保持溫度2小時(shí)，收取第一次提取料液，第二次提取再加入3倍量的去離子水，加熱沸騰保溫2小時(shí)，收取第二次提取料液。
3)減壓濃縮將提取液導(dǎo)入濃縮器中進(jìn)行減壓濃縮，溫度控制在60攝氏度以下，真空度控制在0.06MPa以上。
4)離心將濃縮后的提取液通過離心機(jī)離心。
5)濃縮、離心后的提取液直接進(jìn)大孔樹脂柱；6)用水洗柱至流出液清澈；7)用乙醇洗柱至流出液無味；8)收集從大孔樹脂柱中的流出液；9)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至10婆美度；10)噴霧干燥、滅菌包裝實(shí)施例21)前處理將揀選、剔除雜質(zhì)后的柿子干果和鮮果破碎；2)提取將合格的原料投入到潔凈的提取罐中，加入5倍量65％(v/v)乙醇，第一次回流提取3h，從溶媒沸騰計(jì)時(shí)，控制溫度80℃，保溫到時(shí)，壓出藥液，第二次再加入3倍量65％(v/v)的乙醇回流提取2h，合并濾液；3)回收乙醇將提取的藥液抽入濃縮罐中進(jìn)行減壓濃縮、回收乙醇，溫度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上?；厥罩翢o醇味后，將藥液壓入儲(chǔ)液罐；4)加水，靜置，冷卻回收乙醇的藥液與原料比應(yīng)控制在1∶4左右，不夠則加水，靜置，冷卻；5)離心將冷卻的藥液用離心機(jī)離心，藥液應(yīng)是無任何沉淀物；6)柱吸附將離心后的藥液進(jìn)D101樹脂柱；7)水洗吸附完畢后，用去離子水進(jìn)行水洗，水洗約2h左右。
8)洗脫用70％(v/v)乙醇進(jìn)行洗脫，收集略帶醇味，且洗脫液澄清，透明，收集洗脫液約是樹脂量的3倍左右；9)濃縮洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，溫度控制在60℃以下，真空度應(yīng)控制在0.06MPa以上，濃縮至15波美度左右。
10)噴霧干燥、滅菌包裝。
實(shí)施例31)前處理將揀選、剔除雜質(zhì)后的柿子干果破碎；2)提取將合格的原料與重量濃度為60％的乙醇按1∶10比例混合，進(jìn)行超聲波提取，提取條件為工作頻率80kHz，時(shí)間120min，提取2次；3)回收乙醇將提取的藥液抽入濃縮罐中進(jìn)行減壓濃縮、回收乙醇，溫度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上?；厥罩翢o醇味后，將藥液壓入儲(chǔ)液罐；4)加水，靜置，冷卻回收乙醇的藥液與原料比應(yīng)控制在1∶4左右，不夠則加水，靜置，冷卻；5)離心將冷卻的藥液用離心機(jī)離心，藥液應(yīng)是無任何沉淀物；6)柱吸附將離心后的藥液進(jìn)D101樹脂柱；7)水洗吸附完畢后，用去離子水進(jìn)行水洗，水洗約2h左右。
8)洗脫用70％(v/v)乙醇進(jìn)行洗脫，收集略帶醇味，且洗脫液澄清，透明，收集洗脫液約是樹脂量的3倍左右；9)濃縮洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，溫度控制在60℃以下，真空度應(yīng)控制在0.06MPa以上，濃縮至15波美度左右。
10)噴霧干燥、滅菌包裝。
實(shí)施例41)前處理將揀選、剔除雜質(zhì)后的柿子干果破碎；2)提取將合格的原料投入到潔凈的提取罐中，加入10倍量85％(v/v)甲醇，第一次回流提取3h，，第二次再加入8倍量85％(v/v)的甲醇回流提取2h，合并濾液；3)回收甲醇將提取的藥液抽入濃縮罐中進(jìn)行減壓濃縮、回收甲醇，溫度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上?；厥罩翢o醇味后，將藥液壓入儲(chǔ)液罐；4)加水，靜置，冷卻回收甲醇的藥液與原料比應(yīng)控制在1∶3左右，不夠則加水，靜置，冷卻；5)離心將冷卻的藥液用離心機(jī)離心，藥液應(yīng)是無任何沉淀物；6)柱吸附將離心后的藥液進(jìn)HP20樹脂柱；7)水洗吸附完畢后，用去離子水進(jìn)行水洗，水洗約2h左右。
8)洗脫用90％(v/v)甲醇進(jìn)行洗脫，收集略帶醇味，且洗脫液澄清，透明，收集洗脫液約是樹脂量的3倍左右；9)濃縮洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，溫度控制在60℃以下，真空度應(yīng)控制在0.06MPa以上，濃縮至15波美度左右。
10)噴霧干燥、滅菌包裝。
權(quán)利要求
1.一種從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于它是一種以柿子為原料，經(jīng)提取溶媒提取、濃縮、分離純化提取柿子多酚的方法，提取物中柿子多酚重量含量為70％以上。
2.如權(quán)利要求1所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述柿子為鮮柿子和/或干柿子。
3.如權(quán)利要求1所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述提取方法為加熱提取或超聲波提取或微波提取。
4.如權(quán)利要求1所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述加熱提取溶媒為水或低碳醇，提取次數(shù)為1～3次，溶媒用量為原料重量的3～12倍量；溫度為40～100℃，提取時(shí)間為溶媒沸騰后1～3小時(shí)。
5.如權(quán)利要求4所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述柿子提取后需要進(jìn)行回收低碳醇處理，溫度控制在60℃以下，真空度控制在0.06Mpa以上，回收低碳醇的藥液與原料重量比控制在1∶2～5之間。
6.如權(quán)利要求4或5所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述低碳醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇。
7.如權(quán)利要求3所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于超聲波提取條件為工作頻率15～80kHz，時(shí)間5～120min。
8.如權(quán)利要求3所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于微波提取條件為工作頻率900～2500MHz，時(shí)間5～120min。
9.如權(quán)利要求1所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述分離純化為柱層析分離純化。
10.如權(quán)利要求9所述從荔枝中提取荔枝多酚的方法，其特征在于所述柱層析分離純化步驟為A提取液經(jīng)濃縮、回收低碳醇、離心后，直接進(jìn)入大孔樹脂柱，流速為0.5～1.5BV/hr；所述濃縮為真空濃縮，濃縮溫度控制在60℃以下，真空度為0.08MPa以上，濃縮至原來提取液體積的1/4-1/2；離心采用臥式離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為4800r/min；B用去離子水洗柱至流出液清澈，時(shí)間為2h；C用低碳醇洗柱至洗脫液澄清、透明，流速略慢于吸附的速度；D收集從大孔樹脂柱中的流出的澄清、透明，略帶醇味的洗脫液，收集洗脫液是樹脂量的1～3倍左右；E醇水洗脫液濃縮、干燥，所述濃縮為真空濃縮，溫度控制在60℃以下，真空度0.06-0.1MPa，濃縮至10～15婆美度；干燥為噴霧干燥進(jìn)風(fēng)口溫度160～200℃，出風(fēng)口溫度80～110℃。
11.如權(quán)利要求10所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述低碳醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或戊醇，低濃度醇水溶液的濃度最低為體積濃度30％，高濃度醇水溶液的濃度最高為體積濃度95％。
12.如權(quán)利要求11所述從柿子中提取柿子多酚的方法，其特征在于所述大孔樹脂為以聚苯乙烯為骨架的材料，型號(hào)為D101、D130、AB-8或HP-20。
13.一種如權(quán)利要求1-12之任一所述的制備方法制備的提取物，其特征在于所述提取物中的柿子多酚中抗氧化性能指標(biāo)TEAC和ORAC顯示柿子多酚具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能有效去除過氧化物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從柿子中提取柿子多酚的方法，它是一種以柿子為原料，經(jīng)提取溶媒提取、濃縮、分離純化、干燥提取柿子多酚的方法，它以水或低碳醇如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等作為溶媒；提取的方法采用水或低碳醇加熱提取，也可以采用超聲波提取、或者微波提??；分離純化可以采用柱層析分離純化。提取物中柿子多酚重量含量為70％以上；所述提取物中柿子多酚中抗氧化性能指標(biāo)TEAC和ORAC顯示柿子多酚具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能有效去除過氧化物質(zhì)。本發(fā)明方法生產(chǎn)的柿子多酚含量高、避免了活性成分的損失、簡化了生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期。
文檔編號(hào)C07B63/00GK1733754SQ200510093659
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者宋云飛, 孫步祥, 季永賢, 湯凌志, 梁遠(yuǎn)盛, 李 杰 申請(qǐng)人:桂林萊茵生物科技股份有限公司