專利名稱：重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程制備多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。
二.技術(shù)背景血小板是參與凝血作用的關(guān)鍵成分，造血干細(xì)胞首先經(jīng)過(guò)逐步分化成為巨核系定向祖細(xì)胞，然后再分化為成熟的巨核細(xì)胞，最后裂解產(chǎn)生血小板。這一復(fù)雜的分化成熟過(guò)程受眾多造血因子調(diào)控，同時(shí)也受造血干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及周圍的骨髓細(xì)胞之間的相互作用影響。目前，一致認(rèn)為血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)是調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞生成和增殖的最重要的細(xì)胞因子，它與IL-3，SCF共同作用，促使造血干細(xì)胞分化為定向的巨核細(xì)胞，然后在TPO、IL-3、SCF、IL-6、IL-11等因子參與下發(fā)育成為成熟的巨核細(xì)胞[Rasko JE Inter.J.Biochem.Cell.Biol.1998，30657]。1994年后Bartley等先后克隆得到TPO的cDNA基因，為治療血小板缺乏癥展示了希望[Bartley TD，et al.Cell，1994，77(7)1117]。天然的人TPO全長(zhǎng)332個(gè)氨基酸，其N端的153個(gè)氨基酸有完全的TPO受體結(jié)合活性和生物活性，而C端部分包含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，主要與成熟TPO的分泌有關(guān)，同時(shí)也與TPO在人體內(nèi)的半衰期有關(guān)。rhTPO雖然能快速提高體內(nèi)血小板的水平，但是血小板穩(wěn)定的時(shí)間不長(zhǎng)，效果不理想。
人干細(xì)胞因子(SCF)是促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞存活的細(xì)胞因子，可以抑制造血干細(xì)胞的凋亡[Domen J.，et al.J.Exp.Med.(2000)1921707-1718]。SCF能夠在多級(jí)造血水平上與包括TPO在內(nèi)的其他細(xì)胞因子協(xié)同作用促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞及各種血細(xì)胞的增殖和存活。SCF雖然不能單獨(dú)促進(jìn)巨核細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖，但是在TPO存在時(shí)，SCF有很強(qiáng)的協(xié)同作用，能有效的提高巨核細(xì)胞的增殖的速度和延長(zhǎng)生存時(shí)間。
構(gòu)建由不同造血細(xì)胞因子組成的融合蛋白可以改善使用單一細(xì)胞因子的不足。TPO/SCF融合蛋白除了能夠提高巨核細(xì)胞的增殖的速度和延長(zhǎng)生存時(shí)間外，其SCF基團(tuán)還可以充分發(fā)揮其促進(jìn)造血干細(xì)胞存活的功能，防止由于干細(xì)胞或巨核細(xì)胞的前體細(xì)胞供應(yīng)不足而導(dǎo)致血小板升高后又迅速下降。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是構(gòu)建一種重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子(rhTPO/SCF)雙功能蛋白基因，并采用與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因融合表達(dá)的方式在Sf9細(xì)胞中高效表達(dá)并分離純化重組蛋白，以達(dá)到可應(yīng)用水平，使之成為一種性能比TPO更好的恢復(fù)血小板水平的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括1.重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能融合蛋白基因的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。2.高效表達(dá)融合型GST-rhTPO/SCF的重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒AcNPV-rhTPO/SCF的構(gòu)建。3.rhTPO/SCF在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及分離純化和鑒定。
1.天然的TPO全長(zhǎng)332個(gè)氨基酸，天然的分泌型可溶性SCF為165個(gè)氨基酸。我們?cè)O(shè)計(jì)的rhTPO/SCF雙功能蛋白基因是含有TPO的1-157位氨基酸、16個(gè)氨基酸的連接肽、SCF的1-145位氨基酸編碼序列和終止密碼的DNA片段。其DNA序列和氨基酸序列如下AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTA CTT CGT GAC TCC CAT 60Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG 120Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu 40CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA 180Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala 60CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA 240Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn 80CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAA CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 300Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 360Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala 120CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT 420His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg 140TTC CTG ATG CTT GTA GGG GGG TCA ACA CTA TGT GTC AGG CGG GCC CCA CCC GGA GGA GGA 480Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly 160GGT TCC CCG GGC GGA TCC GGA GGA GGA GGC TCC GGC GGC GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT 540Gly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg 180GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG 600
Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 200ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG 660Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu 220ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT 720Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser 240GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG 780Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val 260GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC 840Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 280AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG 900Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys 300GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT TCT TCA ACA TTA AGT TAG TAA 960Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser 320rhTPO/SCF基因的構(gòu)建流程如圖1所示，以pUC18-SCF為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法合成5’端帶BamHI酶切位點(diǎn)和部分連接肽(GSGGGGSGG)的編碼序列，3’端帶兩個(gè)連續(xù)終止密碼子和HindIII酶切位點(diǎn)的含有SCF第1-145位氨基酸編碼序列的基因片段，并將其克隆入pBluscript質(zhì)粒載體的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pBluscript-3’SCF。然后以pUC18-TPO為模板，用引物3，4經(jīng)PCR法，在pfu高溫聚合酶的催化下，合成5’端帶XbaI和BglII位點(diǎn)，3’端帶部分連接肽(GGGGSPG)的編碼序列，含有TPO的第1-157位氨基酸密碼子的基因片段，該片段的末端為平端，經(jīng)XbaI酶切后，克隆入pBluscript-3’SCF的XbaI和BamHI位點(diǎn)之間(pBluscript-3’SCF先經(jīng)BamHI酶切，Klenow補(bǔ)平，再用XbaI酶切)，得到pBluscript-TS。在該重組質(zhì)粒中，TPO的第1-157位氨基酸的編碼序列與SCF的第1-145位氨基酸的編碼序列通過(guò)16個(gè)氨基酸(GGGGSPGGSGGGGSGG)的連接肽編碼區(qū)連接，從而獲得TPO/SCF雙功能蛋白基因，全長(zhǎng)960bp。經(jīng)測(cè)序證明，得到的基因序列與設(shè)計(jì)完全一致。(測(cè)序結(jié)果見附圖2，3)。
引物15’CCGGATCCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGAAGGGATCTGCAGGAATCGT 3’引物25’GGAAGCTTTTACTAACTTAATGTTGAAGAAAC 3’引物35’CCTCTAGATCTAGCCCGGCTCCTCCTGCT 3’引物45’CGCCCGGGGAACCTCCTCCTCCGGGTGGGGCCCGCCTGAC 3’1.pBluscript-TS經(jīng)HindIII酶切，Klenow補(bǔ)平，BglII酶切后得到TPO/SCF基因片段，并克隆于桿狀病毒載體pAcSecG2T(PharMingen International)的BamHI和SmaI位點(diǎn)之間得到pAcSecG2T-TS。將上述重組轉(zhuǎn)移載體DNA與野生型苜蓿夜蛾核型多角體病毒DNA用脂質(zhì)體介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞Sf9，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組和4輪有限稀釋法純化并結(jié)合重組蛋白的體外活性測(cè)定，篩選出高效表達(dá)GST-rhTPO/SCF的重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
2.將重組病毒以合適的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，感染后48小時(shí)收集細(xì)胞，懸浮于1×PBS溶液，超聲破碎細(xì)胞，離心后，取上清液用于Glutathione Sephrose4B柱親和層析(Amersham Pharmacia Biotech Inc)，分離純化得到GST-TPO/SCF，最后經(jīng)凝血酶切割和再次Glutathione Sephrose4B柱親和層析即可獲得重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能蛋白精品(圖4)。
本發(fā)明構(gòu)建的rhTPO/SCF雙功能基因?qū)⒁欢谓囟痰腡PO基因(1-157位氨基酸)和一段截短的SCF單體基因(1-145位氨基酸)用一段16肽(GGGGSPGGSGGGGSGG)編碼序列以頭尾連接方式連接形成新型人血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能融合蛋白基因。該基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物在保持TPO活性的同時(shí)，由于同時(shí)具有TPO受體和SCF受體的結(jié)合能力，能夠有效的促進(jìn)造血干細(xì)胞的存活，刺激造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞的分化和增殖，改善單獨(dú)使用TPO時(shí)，血小板升高太快和血小板水平恢復(fù)后穩(wěn)定時(shí)間短的問(wèn)題。
構(gòu)建的重組病毒按本發(fā)明所述方法感染單層Sf9細(xì)胞，收集細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)累積的重組蛋白表達(dá)量約為0.5mg/L。
按本發(fā)明提供的分離純化方法從Sf9細(xì)胞中獲得的rhTPO/SCF，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，呈分子量約35KD的一條帶，純度大于90％。用于TF1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其比活為2.0×105units/mg；用于Mo7e細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其比活為8.3×105units/mg。
四.


附圖1人血小板生成素/干細(xì)胞因子基因的構(gòu)建流程圖附圖2rhTPO/SCF基因的測(cè)序結(jié)果(3’端測(cè)序結(jié)果)附圖3rhTPO/SCF基因的測(cè)序結(jié)果(5’端測(cè)序結(jié)果)附圖4SDSPAGE電泳圖譜
a)Glutathione Sephrose4B親和柱層析洗脫峰b)Glutathione Sephrose4B親和柱層析洗脫峰經(jīng)凝血酶切刻后的產(chǎn)物c)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶d)rhTPO/SCFM.分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白五.具體實(shí)施方式
1.pUC18-SCF為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法合成SCF基因片段并將其克隆入pBluscript質(zhì)粒載體，得到pBluscript-3’SCF質(zhì)粒，然后以pUC18-TPO為模板，用引物3，4經(jīng)PCR法合成TPO基因片段并將其克隆入pBluscript-3’SCF質(zhì)粒載體，得到pBluscript-TS質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序證明，結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致。(流程見附圖1)2.將pBluscript-TS質(zhì)粒酶切，得到TPO/SCF基因片段，并插入AcNPV轉(zhuǎn)移載體pAcSecG2T，得到重組轉(zhuǎn)移載體pAcSecG2T-TS。將pAcSecG2T-TS與AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染Sf9，經(jīng)篩選并結(jié)合測(cè)活選出不含野生型病毒的重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
3.取倍增時(shí)間為21小時(shí)，活細(xì)胞占90％，密度為6×105細(xì)胞/mL的單層Sf9細(xì)胞，按感染復(fù)數(shù)(MOI)＝10感染重組病毒1小時(shí)后，傾去病毒液，換成新鮮的培養(yǎng)基。27℃培養(yǎng)48小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，懸浮于1×PBS，超聲破碎細(xì)胞后，12,000離心20分鐘。收集離心后的上清液以1mL/min流速上樣至2mL的Glutathione Sephrose4B層析柱，層析柱預(yù)先用1×PBS平衡。上樣后，先用1×PBS洗至基線，而后用洗脫液(pH8.0，50mM Tris-Cl，10mM還原型谷胱肽)以1mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰10mL。洗脫液對(duì)蒸餾水透析并凍干，凍干后，溶于300μl×PBS，再加入5單位的凝血酶，22℃酶切16小時(shí)，再以1mL/min流速上樣至2mL的Glutathione Sephrose4B層析柱，收集穿過(guò)峰，對(duì)蒸餾水透析后凍干，得到TPO/SCF雙功能蛋白精品。還原條件SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，rhTPO/SCF呈分子量約35KD的一條帶，純度大于90％。免疫印跡(Westenblotting)分析結(jié)果與其一致。
序列列表.txt重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子基因序列表<110>申請(qǐng)人的姓名或名稱南京大學(xué)<120>發(fā)明名稱重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能融合蛋白<160>序列表中序列的個(gè)數(shù)1<210>序列標(biāo)識(shí)符1<211>序列的長(zhǎng)度960<212>序列的類型DNA<213>生物體人(Homo sapiens)<400>核苷酸序列和氨基酸序列AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTA CTT CGT GAC TCC CAT 60Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His 201 6 11 16GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG 120Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu 4021 26 31 36CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA 180Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala 6041 46 51 56CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA 240Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn 8061 66 71 76CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAA CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 300Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu 10081 86 91 96CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 360Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala 120101 106 111 116CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT 420His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg 140121 126 131 136TTC CTG ATG CTT GTA GGG GGG TCA ACA CTA TGT GTC AGG CGG GCC CCA CCC GGA GGA GGA 480Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly 160141 146 151 156GGT TCC CCG GGC GGA TCC GGA GGA GGA GGC TCC GGC GGC GAA GGG ATC TGC AGG AAT CGT 540Gly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg 180161 166 171 176GTG ACT AAT AAT GTA AAA GAC GTC ACT AAA TTG GTG GCA AAT CTT CCA AAA GAC TAC ATG 600Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 200181 186 191 196ATA ACC CTC AAA TAT GTC CCC GGG ATG GAT GTT TTG CCA AGT CAT TGT TGG ATA AGC GAG 660Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu 220201 206 211 216ATG GTA GTA CAA TTG TCA GAC AGC TTG ACT GAT CTT CTG GAC AAG TTT TCA AAT ATT TCT 720Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser 240221 226 231 236GAA GGC TTG AGT AAT TAT TCC ATC ATA GAC AAA CTT GTG AAT ATA GTG GAT GAC CTT GTG 780Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val 260241 246 251 256GAG TGC GTG AAA GAA AAC TCA TCT AAG GAT CTA AAA AAA TCA TTC AAG AGC CCA GAA CCC 840Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 280261 266 271 276AGG CTC TTT ACT CCT GAA GAA TTC TTT AGA ATT TTT AAT AGA TCC ATT GAT GCC TTC AAG 900Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys 300281 286 291 296GAC TTT GTA GTG GCA TCT GAA ACT AGT GAT TGT GTG GTT TCT TCA ACA TTA AGT TAG TAA 960Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser 320301 306 311 316氨基酸序列為Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His1611 16Val Leu His Ser Arg Leu Ser Asn Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu21 26 31 36Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Asn Met Glu Glu Thr Lys Ala41 46 51 56Asn Asp Ile Leu Gly Aal Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Asn61 66 71 76Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Asn Leu Ser Gly Asn Val Arg Leu Leu81 86 91 96Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Asn Leu Pro Pro Asn Gly Arg Thr Thr Ala101 106 111 116His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg121 126 131 136Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly141 146 151 156
序列列表.txtGly Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg161 166 171 176Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met181 186 191 196Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu201 206 211 216Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser221 226 231 236Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val241 246 251 256Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro261 266 271 276Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys281 286 291 296Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser301 306 311 31權(quán)利要求
1.一種重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能融合蛋白基因，其特征是設(shè)計(jì)并構(gòu)建一個(gè)人血小板生成素的1-157位氨基酸的編碼區(qū)、16個(gè)氨基酸(GGGGSPGGSGGGGSGG)的連接肽編碼區(qū)、可溶性人干細(xì)胞因子的1-145位氨基酸編碼區(qū)和終止密碼依次首尾相連接的DNA片段，重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白基因的核苷酸序列為agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactacttcg tgactcccat 60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg 120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca 180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa 240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcaacttt ctggacaggt ccgtctcctc 300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct 360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt 420ttcctgatgc ttgtaggggg gtcaacacta tgtgtcaggc gggccccacc cggaggagga480ggttccccgg gcggatccgg aggaggaggc tccggcggcg aagggatctg caggaatcgt540gtgactaata atgtaaaaga cgtcactaaa ttggtggcaa atcttccaaa agactacatg 600ataaccctca aatatgtccc cgggatggat gttttgccaa gtcattgttg gataagcgag 660atggtagtac aattgtcaga cagcttgact gatcttctgg acaagttttc aaatatttct 720gaaggcttga gtaattattc catcatagac aaacttgtga atatagtgga tgaccttgtg 780gagtgcgtga aagaaaactc atctaaggat ctaaaaaaat cattcaagag cccagaaccc 840aggctcttta ctcctgaaga attctttaga atttttaata gatccattga tgccttcaag 900gactttgtag tggcatctga aactagtgat tgtgtggttt cttcaacatt aagttagtaa 960
2.權(quán)利要求1所提供的基因構(gòu)建了一種能在昆蟲Sf9中高效表達(dá)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶一人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白的重組苜蓿夜蛾核型多角體病毒(AcNPV-rhTPO/SCF)，其特征是將人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白基因克隆于桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcSecG2T的BamHI和SmaI位點(diǎn)之間，得到重組轉(zhuǎn)移載體pAcSecG2T-rhTPO/SCF，其中rhTPO/SCF基因上游融合了帶凝血酶切割位點(diǎn)的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因片段，整個(gè)融合基因處于AcNPV的多角體蛋白啟動(dòng)子控制之下；將重組轉(zhuǎn)移載體DNA與野生型AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)4輪有限稀釋法純化并結(jié)合重組蛋白的體外活性測(cè)定，篩選出重組病毒AcNPV-rhTPO/SCF。
3.一種重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白的制備方法，其特征是用權(quán)利要求2所構(gòu)建的重組病毒感染貼壁培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞，27℃表達(dá)48小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白具有TF1細(xì)胞和Mo7e細(xì)胞增殖的生物活性；收集表達(dá)細(xì)胞，懸浮于1×PBS溶液，超聲破碎細(xì)胞，經(jīng)離心后，取上清液用于Glutathione Sephrose4B柱親和層析，最后經(jīng)凝血酶切割和再次層析即可獲得純度大于90％的重組人血小板生成素/干細(xì)胞因子融合蛋白，SDS-PAGE分析后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，rhTPO/SCF呈分子量約35KD的一條帶，用于TF1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其比活為2.0×105units/mg；用于Mo7e細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其比活為8.3×105units/mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述融合蛋白在制備治療放療、化療及骨髓移植病癥引起的血小板低下癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中的基因工程制備多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域。其目的是構(gòu)建一種血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能融合蛋白基因，并在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)和制備生物活性更高、副作用更小的重組血小板生成素/干細(xì)胞因子雙功能蛋白(rhTPO/SCF)。rhTPO/SCF基因?yàn)橐来魏蠺PO的1－157位氨基酸編碼序列、16個(gè)氨基酸的連接肽編碼序列和SCF的1－145位氨基酸編碼序列及終止密碼子的DNA片段。從感染重組病毒的貼壁培養(yǎng)Sf9細(xì)胞中制備的rhTPO/SCF用于TF1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其比活為2.0×10
文檔編號(hào)C07K19/00GK1778929SQ20051009460
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者秦浚川, 臧宇輝, 朱潔, 袁達(dá)文 申請(qǐng)人:南京大學(xué)