專利名稱：一個(gè)源于梨孢菌的真菌致病力新基因MgKIN17及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)、農(nóng)藥學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一個(gè)來源于梨孢菌的、在侵染器官形成與致病力中起重要作用的新基因MgKIN17的啟動(dòng)子與編碼區(qū)的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明提供的核苷酸序列和氨基酸序列可以作為靶位點(diǎn)應(yīng)用于抗真菌藥劑的篩選與設(shè)計(jì)中，也可以利用該核苷酸序列的某一區(qū)段作為探針應(yīng)用于梨孢菌及其它真菌的與該序列具有一定同源性的基因的克隆中。
背景技術(shù)：
由梨孢菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的水稻病害，也是我國水稻的主要病害之一，重病田可導(dǎo)致水稻絕收。該病在我國部分省市幾乎每年都有大發(fā)生，在全國范圍也曾數(shù)次大流行。最近的一次全國大面積流行是1993年。當(dāng)年在全面防治的情況下，稻瘟病仍然導(dǎo)致稻谷減產(chǎn)上百億斤。2004年，重慶和四川等省市暴發(fā)大面積的稻瘟病，僅重慶的合川市(縣級(jí)市)就有2萬畝水稻發(fā)生稻瘟病，其中近5000畝水稻絕收，曾作為重要農(nóng)業(yè)問題被報(bào)道。除水稻之外，梨孢菌還能侵染包括小麥、大麥以及一些草坪草在內(nèi)的50多種禾本科植物，導(dǎo)致瘟病。同時(shí)，該菌具有許多重要作物的病原真菌所共有的侵染過程，包括分生孢子產(chǎn)生與萌發(fā)、附著胞形成、侵入、侵染菌絲的擴(kuò)展。此外，梨孢菌可進(jìn)行遺傳雜交和轉(zhuǎn)化。為此，許多發(fā)達(dá)國家的研究者將梨孢菌作為模式病原真菌，正在全面、深入地開展植物病原真菌致病性和致病型變異的分子機(jī)理研究，期望通過此類研究來尋找真菌特異性靶標(biāo)以設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥。
梨孢菌的侵染過程始于分生孢子與寄主表面的接觸。在濕潤條件下，分生孢子尖端釋放尖端粘液(STM)，將分生孢子與基質(zhì)牢固地連在一起。在適宜的溫度下發(fā)芽，隨后的芽管生長和分化依賴于其所接觸表面的理化性質(zhì)如疏水性、表面硬度、角質(zhì)單體、蠟質(zhì)和極性脂類，稻葉表面的這些性質(zhì)都能誘導(dǎo)附著胞的形成(Dean，1997)。附著胞是芽管特化膨大的半球型侵染結(jié)構(gòu)，附著胞進(jìn)一步分化產(chǎn)生侵染釘。其中，黑色素在附著胞內(nèi)外周的沉積和甘油的產(chǎn)生使得附著胞具有巨大的膨壓(8.0Mpas或1161Psi；Howard，1991)，從而驅(qū)使侵染釘主動(dòng)刺破寄主表皮，侵入后再從侵染釘上分化出泡狀初生侵染菌絲和次生侵染菌絲，在寄主細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)蔓延。功能性附著胞的形成是包括梨孢菌在內(nèi)的許多植物病原真菌侵入植物寄主表皮所必需的，在對(duì)病原真菌的致病性中起著決定性作用。
附著胞的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的分子過程。目前已克隆了不少與梨孢菌附著胞形成有關(guān)的基因，包括MPG1(Talbot et.al.1993)、CPKA(Mitchel and Dean，1995)、MAGB(Liuand Dean.1997)、PMK1(Xu and Hamer 1996)、ACR1(Lau and Hamer，1998)、MAC1(Chaoiand Dean 1997)；PTH11(DeZwaan et.al.1999)和CBP1(Kamakura et.al.2002)。其中MPG1、MAGB、PTH11和CBP1等基因產(chǎn)物的功能是感知外界信號(hào)，MPG1編碼的疏水蛋白與稻葉表面的信號(hào)分子互作，將產(chǎn)生的信號(hào)傳遞給MagB編碼的異源三聚體G蛋白上的α亞基，G蛋白α亞基激活由MAC1編碼的腺苷酸環(huán)化酶，從而激活了cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Liu and Dean，1997；Choi and Dean，1997)。cAMP結(jié)合PKA的調(diào)節(jié)亞基，使其釋放催化亞基，催化亞基磷酸化下游的目標(biāo)蛋白。Δcpka突變體的附著胞形成推遲，沒有致病性，但能從傷口侵入，引起發(fā)病。由PTH11編碼的PTH11p也在附著胞形成途徑的上游起作用，PTH11p可能刺激細(xì)胞內(nèi)脂類的降解，釋放甘油二酯，甘油二酯作為信號(hào)分子刺激附著胞的形態(tài)建成(DeZwaan et al.，1999)。ACR1缺失突變體的附著胞形成率降低(Lau and Hamer，1998)，PMK1調(diào)節(jié)附著胞分化的起始(Xu and Hamer 1996)。
此外，還有一些附著胞形成受影響的遺傳位點(diǎn)得以鑒定，但基因還未克隆，如CON1and CON7(Shi and Leung 1995)；APF1(Silue et.al.1998)；APP1，APP2 and APP3(Zhuet.al.1996)；APP5(Chun and Lee 1999)。盡管如此，附著胞分化和形成機(jī)制仍不明晰。
鑒定、克隆植物病原真菌的致病性和致病力基因，尤其是在侵染器官形成中起重要作用的基因，可為設(shè)計(jì)、篩選抗真菌藥物提供有用的靶標(biāo)位點(diǎn)(Smith et al，1990；Pollastroet al.，1996；Babiychuk et al.，1995；Vahlensieck et al.，1995；Nistelrooy et al.，1995；Thompson et al.；1997)。目前在有些真菌上已經(jīng)證明了一些藥物的靶位，例如，Botryotiniafuckeliana的Mbc1和Daf1基因產(chǎn)物分別是殺菌劑benzimidazoles和dicarboximide的作用靶點(diǎn)(Pollastro et al.，1996)；S.cerevisiae中的ACC1基因產(chǎn)物乙酰輔酶A羧化酶和Penicillium italicum中的CYP51基因產(chǎn)物脫甲基酶是多肽殺菌劑sorphen A的作用位點(diǎn)(Vahlensieck et al.，1995；Nistelrooy et al.，1995)。三環(huán)唑是用于稻瘟病防治的重要?dú)⒕鷦?，該藥劑以梨孢菌的三羥萘還原酶為作用靶位點(diǎn)(Thompson et al.，1997)，抑制功能性附著胞中黑色素的形成。因此，進(jìn)一步通過分子遺傳學(xué)研究鑒定、克隆新的在梨孢菌附著胞形成和致病性/致病力中發(fā)揮重要作用的基因，可為設(shè)計(jì)、篩選新型藥物提供豐富的靶標(biāo)。同時(shí)，對(duì)于其它類似病原真菌的致病機(jī)制研究、乃至設(shè)計(jì)、篩選抗其它真菌的新型殺菌劑亦具很好的參考價(jià)值。為此，本發(fā)明采用插入突變和基因互補(bǔ)證明了梨孢菌中一個(gè)對(duì)分生孢子發(fā)芽、附著胞和侵染釘形成以及致病力有顯著影響的新基因MgKIN17。該基因基因的啟動(dòng)子、編碼蛋白的表達(dá)和修飾可作為靶標(biāo)位點(diǎn)，用于新農(nóng)藥的設(shè)計(jì)和篩選。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)新的、對(duì)梨孢菌等真菌的分生孢子發(fā)芽、功能性附著胞和侵染釘?shù)男纬梢约爸虏×τ兄匾绊懙幕騇gKIN17，其特征為如SEQ ID NO1所示的的第1位到第3544位的核苷酸序列。該基因的特征還在于其編碼的cDNA和蛋白質(zhì)分別具有SEQ ID NO2所示的的第1位到第987位的核苷酸序列和SEQ ID NO3所示的的第1位到第328位的氨基酸序列。該基因的啟動(dòng)子特征在于SEQ ID NO4所示的的第1位到第1519位的核苷酸序列。
本發(fā)明所提供的基因MgKIN17是所通過插入突變途徑從梨孢菌中克隆的。具體過程包括首先，通過篩選梨孢菌REMI轉(zhuǎn)化體庫獲得致病力降低的突變體；然后，通過遺傳雜交和Southrn雜交分析突變表型與插入標(biāo)記的遺傳共分離情況；進(jìn)一步，通過質(zhì)粒拯救獲得被插入標(biāo)記破壞的目標(biāo)基因的側(cè)翼序列，并以該側(cè)翼序列為探針篩選基因組TAC文庫獲得含有目的基因的克??；最后，通過適當(dāng)酶切從TAC克隆中分離目的基因。目標(biāo)基因的驗(yàn)證和注釋分別采用通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和分離的cDNA來完成?；騿?dòng)子測(cè)定是將含有推定啟動(dòng)子的全長基因與報(bào)告基因GFP連接并轉(zhuǎn)化梨孢菌，通過觀察GFP在侵染各個(gè)階段的表達(dá)來進(jìn)行的。
本發(fā)明所涉及的梨孢菌REMI轉(zhuǎn)化體庫是指通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的質(zhì)粒整合技術(shù)(Restrict Enzyme Mediated Integration，REMI)構(gòu)建的、含有若干獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的梨孢菌菌株群體。
本發(fā)明所涉及的突變體篩選主要通過兩個(gè)途徑來實(shí)施的。一是將孢子接種于洋蔥表皮上，觀察其侵染過程；另一個(gè)方面是將孢子接種于水稻葉片上，觀察其在感病水稻品種上的致病性的有無或者致病力強(qiáng)弱。對(duì)這兩方面的測(cè)定，本發(fā)明都采用了常規(guī)的噴霧接種的方法。本發(fā)明所獲得的突變體在孢子萌發(fā)率、附著胞形成率、侵染釘形成率和致病力上與野生型相比，具有明顯的缺陷。
本發(fā)明中的遺傳共分離分析是指分析突變體中插入標(biāo)記潮霉素抗性基因與突變表型的共分離情況。所采用的方法是遺傳雜交的方法。即將此突變體與一個(gè)不具有突變表型和潮霉素抗性的、并且交配型相反的菌株進(jìn)行雜交，分析其各個(gè)子囊孢子后代的孢子萌發(fā)率、附著胞形成率、侵染釘形成率、致病力與潮霉素抗性。如果其中所有不具潮霉素抗性的后代均為野生型，則說明該突變體的突變表型與插入標(biāo)記潮霉素抗性基因是共分離的，即為插入突變體。
本發(fā)明所涉及的Southern雜交分析，是指以插入質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記(在本發(fā)明中為潮霉素抗性基因)為探針對(duì)所獲插入突變體進(jìn)行基因組Southern雜交，以分析插入質(zhì)粒在梨孢菌基因組中的插入位點(diǎn)數(shù)和拷貝數(shù)等整合情況。
本發(fā)明所涉及的目的基因克隆，首先是根據(jù)遺傳共分離分析和Southern雜交分析結(jié)果進(jìn)行目標(biāo)插入位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)粒拯救。具體地，選取適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化突變體基因組DNA，對(duì)含有插入質(zhì)粒和部分側(cè)翼序列的DNA片段進(jìn)行自身環(huán)化、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以獲得并測(cè)定在插入位點(diǎn)側(cè)端的基因組序列。進(jìn)一步，以所獲側(cè)翼序列為探針篩選梨孢菌的基因組文庫。本發(fā)明中所用的基因組文庫為梨孢菌的TAC文庫，其平均克隆片段大小為50kb，共覆蓋全基因組的16-18倍。本發(fā)明中，以側(cè)端序列進(jìn)行篩庫，得到8個(gè)陽性克隆，它們都含有如SEQ ID NO1所示的第1位到第3544位的核苷酸序列。
本發(fā)明所涉及的MgKIN17的基因功能確認(rèn)通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的，具體包括互補(bǔ)載體的構(gòu)建以及將載體導(dǎo)入梨孢菌中，得到梨孢菌的重組轉(zhuǎn)化體?；パa(bǔ)載體的構(gòu)建是指將所克隆的含有目標(biāo)基因全長的DNA片斷與一個(gè)帶有不同的選擇標(biāo)記(在本發(fā)明中為新霉素抗性基因)的載體相連。在本發(fā)明中，將外源載體導(dǎo)入梨孢菌優(yōu)選方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)者也可以根據(jù)自己的熟練程度靈活地選用其他的轉(zhuǎn)化方法。在本發(fā)明中，互補(bǔ)載體所導(dǎo)入的梨孢菌菌株是本發(fā)明所得到的插入突變體，互補(bǔ)載體在該突變體基因組中的異位整合使該突變體的突變表現(xiàn)恢復(fù)正常。
本發(fā)明還提供了MgKIN17的cDNA克隆。該cDNA克隆過程包括提取含有目標(biāo)基因MgKIN17的一段基因組核苷酸序列，利用FGENESH(http//www.softberry.com/berry.phtml)和GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)進(jìn)行編碼區(qū)、啟動(dòng)子和加尾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物(圖7)，并通過PCR從梨孢菌侵染的水稻葉片的cDNA文庫擴(kuò)增獲得，其序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明還提供了MgKIN17所編碼的蛋白質(zhì)，其具有如SEQ ID NO3所示序列或與SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的氨基酸序列。該蛋白可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。本發(fā)明提供了小麥赤霉菌(Giberella zeae)、玉米莖腐病菌(Giberella monilliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麥穎枯病菌(Phaeosphaerianodorum)中與MgKIN17具有40％氨基酸序列一致性的同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明所涉及的基因其插入突變導(dǎo)致梨孢菌分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率降低，并且在感病水稻品種上的致病力顯著減弱。因此，本發(fā)明最重要的用途是應(yīng)用上述成果，設(shè)計(jì)和篩選能夠破壞該基因表達(dá)、剪切及其編碼蛋白的表達(dá)的化合物；或設(shè)計(jì)和篩選能對(duì)該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行修飾或阻斷其的核定位的化合物；從而開發(fā)新型的抗真菌的藥物。此外，本發(fā)明的用途還包括以該基因的DNA或cDNA的某一區(qū)段作為探針、或根據(jù)該基因的DNA或cDNA的序列設(shè)計(jì)引物通過PCR在梨孢菌中再分離該基因，或者在其它真菌中分離的、與該基因具有一定序列同源性的序列。
以上述所克隆基因編碼蛋白的表達(dá)、修飾為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)、篩選新型抗真菌藥物，或者以具有如SEQ ID NO3所示序列或與SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的蛋白中任一區(qū)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)多肽，并制備抗體用于檢測(cè)在化合物處理狀況下蛋白的表達(dá)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
以上述所克隆基因的啟動(dòng)子為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)和篩選新型抗真菌藥物，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
以下通過


以更進(jìn)一步理解本發(fā)明。

附圖1.野生菌株P(guān)131與突變體H680及互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體在水稻感病品種梅雨明上的致病性比較。圖示說明左為互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體HC2，中為野生型P131，右為突變體H680。接種孢子濃度為5×105/ml，接種后96小時(shí)拍照。
附圖2.野生菌株P(guān)131與突變體H680在載玻片上的附著胞形成率的比較。圖示說明右為突變體H680，左為野生型P131。
附圖3.互補(bǔ)載體pKN3.5構(gòu)建示意圖。
附圖4.野生菌株P(guān)131與突變體H680及互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體HC3在洋蔥內(nèi)表皮上同期附著胞形成比較。圖示說明左上，野生型P131；左下，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體HC3；右，突變體H680。
附圖5.互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體HC2、突變體H680與P131在洋蔥表皮上的的孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和侵染釘形成率的比較。圖示說明上，接種后2-24hr的分生孢子萌發(fā)率；中，接種后4-48hr的附著胞形成率；下，接種后4-72hr的侵染釘形成率；調(diào)查孢子總數(shù)為100。
附圖6.質(zhì)粒插入破壞MgKIN17位置示意圖。黑線表示MgKIN17基因，紅線表示插入質(zhì)粒pUCATPH，REMI轉(zhuǎn)化的介導(dǎo)酶為HindIII，質(zhì)粒插入的位置為1345bp。
附圖7.cDNA擴(kuò)增示意圖。圖示說明上為擴(kuò)增引物；下為各引物在DNA片段上的匹配位置，綠色部分為cDNA區(qū)域。
附圖8.MgKIN17基因編碼蛋白的核定位分析。圖示說明左列為明視場(chǎng)所拍攝，中間列為暗視場(chǎng)藍(lán)光下所拍攝，右列為明暗視場(chǎng)所拍攝照片疊加圖。
附圖9.MgKIN17在侵染過程中的表達(dá)情況上排為明視場(chǎng)所拍攝，下排為暗視場(chǎng)藍(lán)光下所拍攝。
附圖10.幾種病原真菌中KIN17蛋白的序列比較。圖示說明MgKIN17、GzKIN17、GmKIN17、SsKIN17、BcKIN17和PnKIN17分別為來自梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Giberella zeae)、玉米莖腐病菌(Giberella monilliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)中的KIN17蛋白。
具體實(shí)施方案為了更好的理解本發(fā)明，以下通過實(shí)施例予以進(jìn)一步地說明，但并非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1突變體的篩選與鑒定。
a.分生孢子的制備將充分打斷的梨孢菌菌絲均勻地涂布到燕麥片培養(yǎng)基平板上，26℃-28℃培養(yǎng)，當(dāng)肉眼可見新生菌絲長出培養(yǎng)基表面時(shí)，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈，單層紗布蓋上于26℃-28℃光照培養(yǎng)48小時(shí)左右。
b.孢子懸浮液制備將(1)所述的孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50ml的離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25‰的吐溫20中。利用血球計(jì)數(shù)板和顯微鏡，調(diào)整分生孢子濃度至每毫升104孢子。
c.致病性的測(cè)定分別將野生型菌株和突變體的孢子懸浮液均勻地噴霧接種于五葉一心期水稻幼苗(各20株)的葉片正面，黑暗、保濕培養(yǎng)36后連續(xù)光照，于接種96小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)葉片5cm長度內(nèi)的感病病斑數(shù)，結(jié)果如表1。用同樣的方法制備分生孢子的懸浮液，調(diào)整分生孢子濃度到每毫升5×105孢子，均勻地噴霧接種于新鮮的洋蔥內(nèi)表皮的正面，共約噴霧5-10ml孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)、附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成等過程，并計(jì)算分生孢子的萌發(fā)率，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成率(結(jié)果見附圖4和5)。
表1 突變體H680與野生型P131在水稻葉片上形成的病斑數(shù)比較

實(shí)施例2.突變體表型變化與插入標(biāo)記共分離分析。
將上述突變體H680與不具有潮霉素抗性，致病性正常的菌株S1528在西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。首先于25℃培養(yǎng)至菌落邊緣即將接到一起，然后將其移至20℃光照培養(yǎng)，約20天左右在菌落的交界處形成黑色突起的子囊殼。挑取成熟的子囊殼，于無菌水中輕輕擠破，釋放殼內(nèi)的子囊，將子囊懸浮液涂在水瓊脂平板上，24小時(shí)后挑取子囊內(nèi)子囊孢子萌發(fā)的單根菌絲于西紅柿燕麥片培養(yǎng)基上培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)這些子囊孢子后代的潮霉素抗性和洋蔥表皮上觀察記載孢子萌發(fā)率和附著胞、侵染釘和侵染菌絲形成率。結(jié)果如表2所示，所有對(duì)HygB敏感的21個(gè)子囊孢子后代均表現(xiàn)野生型表型，相對(duì)應(yīng)的是，所有8抗潮霉素的子囊孢子后代均表現(xiàn)為突變體表型，由此推測(cè)，H680的突變表型與HygB抗性共分離，而且是質(zhì)粒單位點(diǎn)插入造成的。
表2 突變體H680的突變表型與HygB抗性共分離分析

注HygBr抗HygB；HygBs不抗HygB；實(shí)施例3 與梨孢菌附著胞形成有關(guān)的基因的克隆。
1.質(zhì)粒拯救。選取插入質(zhì)粒pUCATPH中沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶完全消解突變體的基因組，乙醇沉淀精制后進(jìn)行自連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。酶切鑒定重組轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，該質(zhì)粒中除含有pUCATPH的序列外，其兩側(cè)還帶有部分基因組的序列。將這兩段毗鄰插入位點(diǎn)的序列與梨孢菌數(shù)據(jù)庫比較，判斷被破壞的基因(圖6)。
2.基因組TAC文庫的篩選用所拯救質(zhì)粒中帶有的部分基因組序列為探針，篩選梨孢菌的基因組TAC文庫獲得8個(gè)陽性克隆，它們都包括所需基因的全長，其序列如SEQ ID NO1所示。
3.MgKIN17cDNA的克隆取保存于4℃的梨孢菌侵染的感病水稻葉片cDNA文庫，吸取5ml抽提λDNA，異丙醇沉淀精制，根據(jù)預(yù)測(cè)的基因序列合成引物，擴(kuò)增基因ORF。其序列如SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例4互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化梨孢菌與互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體的致病性測(cè)定梨孢菌的轉(zhuǎn)化采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將互補(bǔ)載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法如下1.原生質(zhì)體的制備。500ml三角瓶裝入150mlCM培養(yǎng)基(Yeast extract 0.1％，Caseinenzymatic hydrolysate 0.05％，Casein acidic hydrolysate 0.05％，glucose 1％，CaNO3·4H2O0.1％，KH2PO40.02％，MgSO4·7H2O 0.025％，NaCl 0.015％)，接入約106個(gè)分生孢子，在26-28℃、100rpm條件下?lián)u培30-32h，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0.7MNaCl溶液洗滌后轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，每1g菌絲加入1ml的酶滲透液(含20mg/ml driselase，用0.7M NaCl配制)，26-28℃、100rpm條件下酶解3～4h后，用0.7M NaCl洗滌菌絲體，經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質(zhì)體，4,000rpm離心15min，先用25ml STC(1.2M Sorbitol，10mM Tris-pH 7.5，50mM CaCl2)洗滌原生質(zhì)體一次，然后分別用10ml STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質(zhì)體濃度調(diào)至0.5～1×108個(gè)/ml。
2.梨孢菌轉(zhuǎn)化將原生質(zhì)體分裝于滅菌的50ml離心管中，每管150μl，加入等體積的線性化的載體(約2ug)和STC混合液，冰上放置20min，然后逐滴緩慢加入2ml/管PTC溶液(60％Polyethylene glycol 3350，10mM Tris-pH 7.5，CaCl250mM)，冰上靜止20min，加入25ml/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000rpm、4℃離心15min，去上清，然后每管加入3ml的LR培養(yǎng)基(0.1％Yeast extract，0.1％Casein enzymatic hydrolysate，1MSucrose)，室溫靜置培養(yǎng)12～13h后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入約12ml冷卻至50℃左右的SR(LR+1.6％agar)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12ml的0.7％Top agar(冷卻至50℃左右，含400μg/ml的Neomycin)。28℃培養(yǎng)4～6天，將出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至CM培養(yǎng)基(含350μg/ml的Neomycin)上，二次篩選后將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入燕麥片番茄培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進(jìn)行單孢分離。
3、致病性測(cè)定分別將野生型菌株、突變體和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體的孢子懸浮液均勻地噴霧接種于五葉一心期水稻幼苗的葉片正面(每菌株接種20株)，黑暗、保濕培養(yǎng)36后連續(xù)光照，于接種96小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)葉片5cm長度內(nèi)的感病病斑數(shù)，結(jié)果如表3。用同樣的方法制備分生孢子的懸浮液，調(diào)整分生孢子濃度到每毫升5×105孢子，均勻地噴霧接種于新鮮的洋蔥內(nèi)表皮的正面，共約噴霧5-10ml孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成等過程，并計(jì)算分生孢子的萌發(fā)率，附著胞、侵染釘及侵染性菌絲的形成率(結(jié)果見圖5)表3 突變體H680、互補(bǔ)轉(zhuǎn)化體HC3和野生型P131在水稻葉片上形成病斑數(shù)比較

實(shí)施例5MgKIN17的亞細(xì)胞定位將GFP基因的完整閱讀框連接于MgKIN17基因的編碼框的下游，構(gòu)建融合基因并導(dǎo)入到帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體中。按實(shí)施例4中所述轉(zhuǎn)化方法，采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將此載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌野生型菌株P(guān)131的原生質(zhì)體。挑取具有新霉素抗性的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下觀察MgKIN17-GFP融合蛋白在梨孢菌分生孢子中亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明MgKIN17定位于細(xì)胞核內(nèi)(附圖8)。
實(shí)施例6MgKIN17的啟動(dòng)子界定與表達(dá)動(dòng)態(tài)分析為確定MgKIN17基因的啟動(dòng)子區(qū)域和表達(dá)動(dòng)態(tài)，將推定的含有啟動(dòng)子的完整MgKIN17基因去掉翻譯終止密碼子(2504bp)以后的DNA序列并與-GFP報(bào)告基因融合，然后連入到帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體中。按實(shí)施例4中所述轉(zhuǎn)化方法，采用不破壞載體內(nèi)基因的限制性內(nèi)切酶將此載體線性化，轉(zhuǎn)化梨孢菌野生型菌株P(guān)131的原生質(zhì)體。挑取具有新霉素抗性的轉(zhuǎn)化子接種洋蔥內(nèi)表皮，接種后不同時(shí)間連續(xù)觀察GFP蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果證明在翻譯起始位點(diǎn)上游1519bp長度的DNA片段具有驅(qū)動(dòng)MgKIN17-GFP融和基因在分生孢子、成熟但未褐色化的附著胞、侵染釘以及初生侵染菌絲中的表達(dá)(附圖8和附圖9)。MgKIN17基因啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO4所示。
實(shí)施例7病原真菌中KIN17蛋白的生物信息學(xué)分析為明確KIN17蛋白在病原真菌中是否保守，針對(duì)下述病原真菌玉米莖腐病菌(Giberella monilliformis)、小麥赤霉菌(Giberella zeae)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaerianodorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，將MgKIN17蛋白的氨基酸序列對(duì)這些真菌基因組序列進(jìn)行tBLAST檢索，獲得與之同源的DNA片段。進(jìn)而通過序列拼接、軟件預(yù)測(cè)，分別得到其在上述真菌中同源蛋白的氨基酸序列，其序列分別如SEQ ID NO5、6、7、8和9所示，并將對(duì)應(yīng)的KIN17蛋白分別命名為GmKIN17、GzKIN17、PnKIN17、SsKIN17和BcKIN17。序列比較分析表明上述真菌中的KIN17蛋白在氨基酸序列上與MgKIN17的一致性分別達(dá)到60％、61％、42％、56％和50％。利用ClustalW，繪制的上述真菌的KIN17蛋白的同源性關(guān)系見附圖10。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種源于梨孢菌的真菌致病力新基因MgKIN17及其用途<130>彭友良2003-2<160>9<210>1<211>3354<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>1agctcctcgt acttgttctg gatggccgtg cccgtcaagc cgatgcgaca gagtgcgttg 60acctcagtca ttgcttttgt gatctcggat cgtcgctcct tgatattatg acattcgtcg 120acaaccacgg catcccagct gaccgtgttt acgcgctctt tctgcagcct gtacgtggcc 180ggggtcgtaa gcatgacctc aagccgacct gactttgcgg tgtcaagcac atcgtctttg 240ccgggtccat gataggactc gaccttccac cagccccatc gcgccagttc ttgtctccag 300ttctccatta cggagctggg gcagacaacc agcactttgt agtaccggcg acccagcctc 360ttgaccttgc gcatccgctt cgagtcacga aaatcaccgg ttttcccgaa tgcagctgtc 420aggaacgcag caacctgaac cgtcttgccc agtcccatgt catcgccgag aatgcatccc 480ctctggtaga cgaatgcctc atgcatgaaa gaaacgccgt cgacctgata atcacgtagg 540tactgggcta ttggtgccgg tatgatacct gctgaccttt ctagctcgac gtcctcatac 600ggtcgacatg gcttgattct atcgccaaactgtggtcgga cctctcgtcg ctggccatca 660tcttcatcat cagtgaagtc aatgtccgtg tagtccggtg gaagaagcaa cccggcttct 720tggagagttg cgcggtcccg gttgaactgc ctcttgcggt gctttaaata ctctgggata 780tcagcatgga cgttgtcctc tggcgccgta tcctcgccga gatccctaat cgcttcggcc 840aaggaacgtg cgtttcgtcg tccatgattg gtaatagcgt ttccaggttc agacttgatg 900cttttctttt tcttcgcact acgtcttccc tttgcttgtt tcttctcagt ccgttccttc 960tcggcctcct cctccgagtc cgtccacgga atagtctcaa ttggcggggg cacaggctcg 1020gctttgcgct taccaagtgc cgtcttggaa catcggtcgg caccaaggcc cttgccttct 1080gattccgaac tgtctatcac gactaattcc gcaggcattg ttatgcatga ttgttgatat 1140gaacgcgggg tagacgaaac caaatgaggg atgacgcgtc tatcgtttaa ttgaaaacac 1200gcgagagcag gtgagcgcgc gaaagttcgg ttggtcgcat cggtgagacc cactgattca 1260cccgcattag tggggctacg tcggttttgc ctgcaacgga acctccgccg ttccctttgt 1320gtcttgtcgc cgcaactttg gctcaagctt gcagccacga tctattgcaa ggcgtcctga 1380caaccaagtt tccggaatct gaaatcgaca ccatcgtaaa cgccaccaca gacgcattgg 1440
tcaactttgt ccttgccaga acctctatca atcccactcg tctatcccga aaaaagaaaa 1500ccagacccag tcacccaaaa tggggaaagc agagttcggc acgaccaagc atctgagcaa 1560ccagatgaag gccaaaggcc ttcagcggct tcgcttctac tgcacgccat gccagcgtca 1620gatgcgcgac gacaacgcct tcaagcagca ctgcatgagc gagtctcacg tgcgcaacat 1680gctcattgtg ggcgaggacc cgaagaagta catccgcgag tacagcgagg ccttcctcaa 1740ggactttgtc aacctgctca agacgggcca ccgcgacaag caggtccaga tcaaccactt 1800ctaccaagag tacatagcca acaaggagca cgtccacatg aacagtaccc agtggtccag 1860tctgacagag tttgccaaat accttggtaa ggagggcata tgtcgcgttg aggagaacga 1920gaagggcatc cacatatcct ggatcgacga ctcgcccgag gcgctcaaga ggcaggaggc 1980gcttaagcgg aaagaggcgc aggacagggg cgacgaggag cgagagcagc gcttgctgaa 2040ggagcagata aagcgcgcgc agaaggatgc cgccgctcga gcggccgggg agaatggcgc 2100atcaacagag caagaccagg aggacaaggg gttgcgacgg gaagaaggcg agaagatcaa 2160actgtctatt ggggttaagc ctgcagccag caaaccggaa cccgcaccgg tagagcagcc 2220cgcagctgca actcttgacg aagaaacccc agcaactgga gaggccaagt tggcggaagc 2280gactacagat tccaagcctg tatcgctgaa gtttggagcc aaaccagctg ccaagaatgt 2340ctttgcctcc aagaaaaacg ctttttcaag cggcgcaaag aaagttaaga ttgagcagcc 2400caaaaagata agtgaggcag agaggataat gcgcgaggag atggggcgca agaggtcaag 2460agagttttct ggttcagggg gccctagtaa acgccaaagg atgtaaagtc tttctttttt 2520ttcgtaacgg tttttatagg cctggagtct ggcggcgtta atattctcag ttctataccc 2580atgggcgcct ctcgcggggt ttgtatggtc caaccaaagt tatatagagg ggaaggaaga 2640taagacatga caatgaaaag cataatcata atcatatcac ctgcgagcgc aaatcttgaa 2700tgttgacgag tcaaattgaa tgccaactag gtttattcgc taagcactta aatcccagac 2760ccagactcct tgccgatccc ataaaaaaac accatctcaa acacttaaac gtctgcctct 2820gtggcacttc catcacggct aaagattgaa aatagcgtta gcaggtacct ccagcaacat 2880taaacaaaac aagtaggaca gtcgacaaac atacgggatg tactgtatcc tatactcgtc 2940ctcgatcgta gccctaacat catccggcag ctggccagag accttgatgg cataaacccc 3000cctgacgtag ccgtccagcc gctgccactt tgcgacccaa gactttgtcg ggtcggccag 3060cgagatcagg ccctcgaaaa cctgcgacgt gcagctctcg atctggtccg tcgagccctg 3120aaggtgcagg aagtcttcac agttggggca cccctcatcg tagaagcgct acgtggcaaa 3180aggtcagcga ctgggttctg ttctgtgcct ggttgttcga cgggtggttg ttttgcgcgc 3240gtgaacaaaa ccgttggcgc ggttgtttat cgacaaggtc aataaaaccg ggcaacctta 3300ccttttggtg aacaacaatc gagcagacca tgcatgcgcg taaatggcgc tgatctctgg 3360gtgcgacgta gctctcggac atggcgatgg tgttgctctt gtggttttgc gacaacccgg 3420aaatgctaaa tgcgacaact tgggaaaacg agtgaaagtg gtttggggaa cgaatcttaa 3480cgatgctggc agcttcaagg aatcttgact acatatggat cgaatgatgg ctggtggggc 3540tagc 3544
<210>2<211>987<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>2atggggaaag cagagttcgg cacgaccaag catctgagca accagatgaa ggccaaaggc60cttcagcggc ttcgcttcta ctgcacgcca tgccagcgtc agatgcgcga cgacaacgcc 120ttcaagcagc actgcatgag cgagtctcac gtgcgcaaca tgctcattgt gggcgaggac 180ccgaagaagt acatccgcga gtacagcgag gccttcctca aggactttgt caacctgctc 240aagacgggcc accgcgacaa gcaggtccag atcaaccact tctaccaaga gtacatagcc 300aacaaggagc acgtccacat gaacagtacc cagtggtcca gtctgacaga gtttgccaaa 360taccttggta aggagggcat atgtcgcgtt gaggagaacg agaagggcat ccacatatcc 420tggatcgacg actcgcccga ggcgctcaag aggcaggagg cgcttaagcg gaaagaggcg 480caggacaggg gcgacgagga gcgagagcag cgcttgctga aggagcagat aaagcgcgcg 540cagaaggatg ccgccgctcg agcggccggg gagaatggcg catcaacaga gcaagaccag 600gaggacaagg ggttgcgacg ggaagaaggc gagaagatca aactgtctat tggggttaag 660cctgcagcca gcaaaccgga acccgcaccg gtagagcagc ccgcagctgc aactcttgac 720gaagaaaccc cagcaactgg agaggccaag ttggcggaag cgactacaga ttccaagcct 780gtatcgctga agtttggagc caaaccagct gccaagaatg tctttgcctc caagaaaaac 840gctttttcaa gcggcgcaaa gaaagttaag attgagcagc ccaaaaagat aagtgaggca 900gagaggataa tgcgcgagga gatggggcgc aagaggtcaa gagagttttc tggttcaggg 960ggccctagta aacgccaaag gatgtaa 987<210>3<211>328<212>PRT<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>3Met Gly Lys Ala Glu Phe Gly Thr Thr Lys His Leu Ser Asn Gln Met1 5 10 15Lys Ala Lys Gly Leu Gln Arg Leu Arg Phe Tyr Cys Thr Pro Cys Gln20 25 30
Arg Gln Met Arg Asp Asp Asn Ala Phe Lys Gln His Cys Met Ser Glu35 40 45Ser His Val Arg Asn Met Leu Ile Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Arg Glu Tyr Ser Glu Ala Phe Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Leu65 70 75 80Lys Thr Gly His Arg Asp Lys Gln Val Gln Ile Asn His Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ala Asn Lys Glu His Val His Met Asn Ser Thr Gln Trp100 105 110Ser Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys Tyr Leu Gly Lys Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Asn Glu Lys Gly Ile His Ile Ser Trp Ile Asp Asp130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Lys Arg Gln Glu Ala Leu Lys Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Arg Gly Asp Glu Glu Arg Glu Gln Arg Leu Leu Lys Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Lys Asp Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gly Glu Asn180 185 190Gly Ala Ser Thr Glu Gln Asp Gln Glu Asp Lys Gly Leu Arg Arg Glu195 200 205Glu Gly Glu Lys Ile Lys Leu Ser Ile Gly Val Lys Pro Ala Ala Ser
210 215 220Lys Pro Glu Pro Ala Pro Val Glu Gln Pro Ala Ala Ala Thr Leu Asp225 230 235 240Glu Glu Thr Pro Ala Thr Gly Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Thr Thr245 250 255Asp Ser Lys Pro Val Ser Leu Lys Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Lys260 265 270Asn Val Phe Ala Ser Lys Lys Asn Ala Phe Ser Ser Gly Ala Lys Lys275 280 285Val Lys Ile Glu Gln Pro Lys Lys Ile Ser Glu Ala Glu Arg Ile Met290 295 300Arg Glu Glu Met Gly Arg Lys Arg Ser Arg Glu Phe Ser Gly Ser Gly305 310 315 320Gly Pro Ser Lys Arg Gln Arg Met325<210>4<211>1519<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>4agctcctcgt acttgttctg gatggccgtg cccgtcaagc cgatgcgaca gagtgcgttg60acctcagtca ttgcttttgt gatctcggat cgtcgctcct tgatattatg acattcgtcg 120acaaccacgg catcccagct gaccgtgttt acgcgctctt tctgcagcct gtacgtggcc 180ggggtcgtaa gcatgacctc aagccgacct gactttgcgg tgtcaagcac atcgtctttg 240ccgggtccat gataggactc gaccttccac cagccccatc gcgccagttc ttgtctccag 300ttctccatta cggagctggg gcagacaacc agcactttgt agtaccggcg acccagcctc 360ttgaccttgc gcatccgctt cgagtcacga aaatcaccgg ttttcccgaa tgcagctgtc 420
aggaacgcag caacctgaac cgtcttgccc agtcccatgt catcgccgag aatgcatccc 480ctctggtaga cgaatgcctc atgcatgaaa gaaacgccgt cgacctgata atcacgtagg 540tactgggcta ttggtgccgg tatgatacct gctgaccttt ctagctcgac gtcctcatac 600ggtcgacatg gcttgattct atcgccaaac tgtggtcgga cctctcgtcg ctggccatca 660tcttcatcat cagtgaagtc aatgtccgtg tagtccggtg gaagaagcaa cccggcttct 720tggagagttg cgcggtcccg gttgaactgc ctcttgcggt gctttaaata ctctgggata 780tcagcatgga cgttgtcctc tggcgccgta tcctcgccga gatccctaat cgcttcggcc 840aaggaacgtg cgtttcgtcg tccatgattg gtaatagcgt ttccaggttc agacttgatg 900cttttctttt tcttcgcact acgtcttccc tttgcttgtt tcttctcagt ccgttccttc 960tcggcctcct cctccgagtc cgtccacgga atagtctcaa ttggcggggg cacaggctcg 1020gctttgcgct taccaagtgc cgtcttggaa catcggtcgg caccaaggcc cttgccttct 1080gattccgaac tgtctatcac gactaattcc gcaggcattg ttatgcatga ttgttgatat 1140gaacgcgggg tagacgaaac caaatgaggg atgacgcgtc tatcgtttaa ttgaaaacac 1200gcgagagcag gtgagcgcgc gaaagttcgg ttggtcgcat cggtgagacc cactgattca 1260cccgcattag tggggctacg tcggttttgc ctgcaacgga acctccgccg ttccctttgt 1320gtcttgtcgc cgcaactttg gctcaagctt gcagccacga tctattgcaa ggcgtcctga 1380caaccaagtt tccggaatct gaaatcgaca ccatcgtaaa cgccaccaca gacgcattgg 1440tcaactttgt ccttgccaga acctctatca atcccactcg tctatcccga aaaaagaaaa 1500ccagacccag tcacccaaa 1519<210>5<211>338<212>PRT<213>玉米莖腐菌(Giberella monilliformis)<400>5Met Pro Lys Ala Glu Val Gly Ser Thr Lys Tyr Val Ala Asn Arg Met1 5 10 15Lys Ala Lys Gly Leu Gln Arg Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Val Cys Glu20 25 30Lys Gln Cys Arg Asp Ala Asn Gly Phe Arg Gln His Thr Met Ser Glu35 40 45
Ser His Val Arg Gln Met Leu Leu Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Lys Ser Tyr Thr Gln Gln Phe Gln Ser Asp Phe Leu Gln Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Gly His Gly Glu Lys Gln Val His Ile Asn Gln Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Arg Asn Lys Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Ser Phe100 105 110Ala Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys His Leu Gly Arg Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Asn Asp Lys Gly Ile His Ile Ala Trp Ile Asp Arg130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Glu Ala Leu Arg Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Gln Gly Asn Glu Glu Ile Glu Gln Arg Met Ile Arg Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Ala Thr Ala Gly Ser Arg Glu Glu Glu Lys Glu180 185 190Glu Asp Asn Glu Ala Arg Glu Leu Lys Arg Gln Glu Gly Glu Lys Ile195 200 205Lys Leu Ser Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Ser Glu Thr Lys Ser Ser210 215 220Glu Ser Pro Ala Leu Asp Met Thr Ala Pro Glu Ala Glu Ser Ser Lys
225 230 235 240Thr Ala Asp Thr Thr Thr Asp Lys Gly Lys Glu Pro Glu Val Ala Pro245 250 255Ala Lys Pro Gly Gly Phe Gly Gly Leu Ser Met Lys Leu Gly Gly Lys260 265 270Pro Gln Thr Lys Asn Val Phe Ala Gln Ala Lys Lys Asn Ala Leu Ala275 280 285Ser Gly Ser Lys Lys Pro Ala Lys Ile Glu Gln Pro Lys Lys Met Ser290 295 300Glu Ala Glu Arg Ile Met Lys Glu Glu Met Glu Lys Lys Arg Ser Arg305 310 315 320Glu Ser Ala Gly Phe Ser Phe Gly Met Gly Ser Gly Lys Lys Gln Arg325 330 335Asn Asn<210>6<211>337<212>PRT<213>小麥赤霉菌(Giberella zeae)<400>6Met Gly Lys Ala Glu Val Gly Ser Thr Lys Phe Val Ala Asn Arg Met1 5 10 15Lys Ala Lys Gly Leu Gln Arg Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Pro Cys Glu20 25 30Lys Gln Cys Arg Asp Ala Asn Gly Phe Lys Gln His Thr Met Ser Glu
35 40 45Ser His Val Arg Gln Met Leu Leu Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Asn Asp Tyr Thr Lys Gln Phe Leu Ser Asp Phe Ile Leu Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Gly His Gly Glu Lys Gln Val His Ile Asn Arg Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ala Asn Lys Glu His Ile His Met Asn Ser Thr Lys Phe100 105 110Gly Ser Leu Thr Glu Leu Ala Lys His Leu Gly Arg Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Thr Glu Lys Gly Ile His Ile Ser Trp Ile Asp Lys130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Asp Ala Leu Arg Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Gln Gly Asn Glu Glu Leu Glu Gln Arg Met Ile Arg Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Ala Ala Ala Gly Asn Asp Glu Glu Lys Glu Glu180 185 190Asp Pro Glu Ala Arg Glu Leu Lys Arg Gln Glu Gly Glu Lys Ile Lys195 200 205Leu Ser Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Pro Asp Thr Lys Ala Ser Glu210 215 220
Ser Pro Ala Pro Asp Thr Ala Thr Ala Glu Ala Asp Thr Leu Lys Thr225 230 235 240Glu Glu Ile Ala Thr Glu Lys Arg Lys Glu Pro Asp Thr Ala Pro Ala245 250 255Lys Pro Ser Gly Phe Gly Gly Ile Ser Met Lys Leu Ala Gly Lys Pro260 265 270Gln Thr Lys Asn Val Phe Thr Gln Ala Lys Lys Asn Ala Leu Ser Ser275 280 285Gly Ser Lys Lys Pro Ala Lys Ile Glu Gln Pro Lys Lys Met Ser Glu290 295 300Ala Glu Arg Ile Met Lys Glu Glu Met Glu Lys Lys Arg Pro Arg Asp305 310 315 320Ser Thr Gly Phe Ser Phe Gly Met Gly Ser Asn Lys Lys Gln Lys Asn325 330 335Asn<210>7<211>291<212>PRT<213>小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)<400>6Met Pro Lys Ala Glu Val Gly Ser Thr Lys Trp Val Gly Asn Gln Met1 5 10 15
Lys Ser Arg Gly Leu Gln Arg Leu Arg Trp Trp Cys Glu Pro Cys Gln20 25 30Lys Gln Cys Arg Asp Ala Asn Gly Phe Lys Cys His Val Gln Ser Glu35 40 45Ala His Val Arg Gln Met Ala Val Val Gly Glu Asp Pro Arg Lys Tyr50 55 60Ile Ala Asn Phe Ser Thr Asp Phe Gln Arg Asp Phe Val Cys Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Ala His Gly Glu Lys Trp Ile Ser Ala Asn Lys Phe Tyr Asn85 90 95Glu Tyr Ile Arg Asp Lys Glu His Val His Met Asn Ala Thr Lys Trp100 105 110Ser Ser Leu Thr Glu Phe Thr Lys His Leu Gly Arg Glu Gly Ile Cys115 120 125His Val Lys Glu Asp Glu Lys Asp Gly Leu Met Ile Ala Trp Arg Asp130 135 140Thr Ser Ala Ala Ala Val Lys Arg Lys Glu Glu Ile Ala Glu Leu Glu145 150 155 160Ala Ala Glu Ala Arg Ser Gly Ala Gly Glu Asp Lys Met Leu Lys Lys165 170 175Met Ala Lys Arg Ala Gln Glu Glu Ala Glu Val Lys Lys Ala Ile Glu180 185 190Ala Lys Arg Ala Ala Ala Thr Ala Ala Met Ala Gln Lys Glu Asn Thr
195 200 205Thr Pro Pro Thr Glu Gly Gly Ser Ser Thr Glu Asp Lys Lys Val Asp210 215 220Ser Pro Val Asp Asp Met Val Gly Val Lys Lys Asp Ser Glu Glu Pro225 230 235 240Lys Ala Glu Pro Ala Pro Val Lys Leu Ser Phe Gly Met Lys Ala Lys245 250 255Val Pro Pro Pro Asn Lys Ala Gly Leu Gly Gln Met Lys Ser Gln Ser260 265 270Ile Phe Lys Arg Lys Lys Asp Asp Leu Glu Gln Lys Pro Gly Lys Lys275 280 285Val Lys Leu290<210>8<211>343<212>PRT<213>油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)<400>8Met Pro Lys Ala Glu Val Gly Ser Thr Lys Phe Leu Asn Asn Lys Leu1 5 10 15Lys Ser Lys Gly Leu Gln Arg Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Val Cys Glu20 25 30Arg Gln Met Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Met His Thr Gln Ser Glu35 40 45
Ser His Val Arg Gln Met Leu Leu Ile Gly Glu Asp Pro Lys Lys Phe50 55 60Ile Asn Asp Tyr Ser Asn Gln Phe Gln Arg Asp Phe Leu Gln Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Ser His Gly Glu Lys Gln Val Asn Leu Asn His Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ser Asn Lys Glu His Val His Met Asn Ser Thr Lys Trp100 105 110Pro Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys Phe Leu Gly Arg Glu Ser Leu Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Thr Asp Lys Gly Ile Gln Val Ala Trp Ile Asp Asn130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Asp Ala Ile Arg Lys Lys Glu Arg145 150 155 160Gln Asp Lys Gly Asp Glu Glu Arg Glu Gln Met Leu Ile Arg Glu Gln165 170 175Val Arg Arg Ala Lys Gln Asp Ala Glu Ala Arg Gly Glu Ser Glu Val180 185 190Asp Glu Gln Glu Arg Gly Leu Lys Arg Glu Glu Gly Glu Lys Ile Lys195 200 205Leu Ser Phe Gly Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Pro Glu Ser Lys Thr210 215 220Val Val Leu Pro Asp Ser Lys Met Pro Ala Gly Asp Ala Leu Pro Leu
225 230 235 240Glu Thr Ala Lys Gly Val Asp Lys Ser Ser Glu Val Leu Ala Lys Asp245 250 255Gly Ser Lys Thr Ala Glu Ser Thr Asn Pro Asp Ala Ala Ala Pro Leu260 265 270Pro Ala Lys Val Ser Leu Lys Met Gly Phe Gln Ser Lys Pro Lys Asn275 280 285Val Phe Ala Ala Ala Lys Lys Asn Ala Leu Gly Gly Lys Lys Ala Pro290 295 300Val Phe Glu Gln Pro Lys Lys Met Ser Glu Ala Glu Arg Ile Met Lys305 310 315 320Glu Glu Ile Glu Arg Lys Arg Thr Arg Glu Gln Ser His Gly Gly Pro325 330 335Ser Gln Lys Arg Pro Arg Phe340<210>9<211>309<212>PRT<213>灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)<400>9Met Pro Lys Ala Glu Val Gly Ser Thr Lys Phe Leu Asn Asn Lys Leu1 5 10 15Lys Pro Lys Asp Phe Ser Asp Tyr Asp Gly Thr Ala Lys Ala Cys Glu20 25 30Arg Gln Met Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Met His Val Gln Ser Glu
35 40 45Ser His Val Arg Gln Ile Leu Leu Ile Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Asn Asp Phe Ser Asn Gln Phe Gln Arg Asp Phe Leu Gln Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Ser His Gly Glu Lys Gln Val Asn Leu Asn His Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ser Asn Lys Glu His Ile His Met Asn Ser Thr Lys Trp100 105 110Pro Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys Phe Leu Gly Arg Glu Ser Leu Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Ala Asp Arg Gly Ile Arg Val Ser Trp Ile Asp Asn130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Tyr Ala Ile Arg Lys Lys Glu Ile145 150 155 160Gln Asp Lys Gly Asp Glu Glu Arg Glu Gln Leu Leu Ile Arg Glu Gln165 170 175Met Asp Glu Gln Glu Arg Gly Leu Lys Arg Glu Glu Gly Glu Lys Ile180 185 190Gln Leu Ser Phe Gly Ala Lys Ser Ala Val Ser Asn Ser Glu Ser Lys195 200 205Thr Ile Glu Pro Glu Glu Ser Lys Thr Pro Ala Gly Asp Ala Pro Ser210 215 220
Leu Glu Thr Ala Lys Asp Glu Asp Lys Leu Ser Glu Ile Pro Ala Thr225 230 235 240Gly Asp Asp Arg Thr Thr Glu Ser Thr Asn Pro Glu Ala Ala Pro Pro245 250 255Ala Pro Ala Lys Val Ser Leu Lys Met Gly Phe Gln Ser Lys Pro Lys260 265 270Asn Val Phe Ala Ala Ala Lys Lys Asn Ala Leu Gly Gly Lys Lys Ala275 280 285Pro Ala Phe Glu Pro Pro Lys Lys Met Ser Glu Ala Glu Arg Ile Met290 295 300Lys Ala Thr Arg Asn30權(quán)利要求
1.一個(gè)在梨孢菌致病力中起重要作用的基因MgKIN17，其核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1所示的第1位至第3544位的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其cDNA序列為SEQ ID NO2所示的第1位至第987位的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的cDNA序列，它編碼具有SEQ ID NO3所示的第1位到第328位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其啟動(dòng)子的其核苷酸序列為SEQ IDNO4所示的第1位至第1519位的核苷酸序列
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的對(duì)梨孢菌致病力有重要影響的基因MgKIN17及其cDNA的全長核苷酸為探針或根據(jù)其設(shè)計(jì)引物通過PCR分離源于其它植物病原真菌的具有相同功能的基因。
6.利用權(quán)利要求3所述的對(duì)梨孢菌致病力有重要影響的蛋白MgKIN17，分離源于其它植物病原真菌的具有相同功能的蛋白。
7.權(quán)利要求5和6所述的真菌包括小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等。
8.利用權(quán)利要求1至4所述的對(duì)梨孢菌致病力有重要影響的基因MgKIN17構(gòu)建的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌。
9.權(quán)利要求1所述對(duì)梨孢菌致病力有重要影響的基因MgKIN17的表達(dá)作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用
10.權(quán)利要求3所述的對(duì)梨孢菌致病力有重要影響的MgKIN17蛋白的表達(dá)與修飾作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用
11.權(quán)利要求4所述MgKIN17基因的啟動(dòng)子及其結(jié)合蛋白作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求9至11所述的抗真菌藥劑包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米莖腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的藥劑。
全文摘要
本發(fā)提供了一個(gè)源于梨孢菌的新基因MgKIN17，其特征是具有SEQ ID NO1所示的第1位到第3544位的核苷酸序列，其cDNA和啟動(dòng)子的特征是具有SEQ ID NO2和NO4分別所示的核苷酸序列。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。本發(fā)明通過插入突變和基因互補(bǔ)證明該基因的破壞導(dǎo)致梨孢菌侵染器官形成和在水稻上形成病斑的能力顯著降低。小麥赤霉菌、玉米莖腐病菌、油菜菌核病菌、灰葡萄孢菌、小麥穎枯病菌等病原真菌具有與MgKIN17一致性高于40％的同源蛋白，可能具有相似的生物學(xué)功能。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾可作為靶位點(diǎn)用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑。
文檔編號(hào)C07K14/37GK1821409SQ20051010254
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
發(fā)明者彭友良, 丁勝利, 黃俊麗, 魏士平, 趙文生 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)