專利名稱：用于區(qū)別朊病毒的肽的制作方法
I.背景朊病毒病或傳染性海綿狀腦病(TSE)已經(jīng)贏得了科學(xué)界的關(guān)注，不僅是因?yàn)樗鼈兿蜿P(guān)于傳染物特性的傳統(tǒng)理念發(fā)起了挑戰(zhàn)，還因?yàn)樗鼈儗κ称泛脱喊踩斐蓾撛诘膰?yán)重公共健康威脅。此外，近年來一種新的變體疾病形式vCJD的流行性發(fā)生更加強(qiáng)調(diào)了疾病在動物與人之間傳播的可能性。本發(fā)明描述了合成肽用于診斷動物和人中的傳染性海綿狀腦病(TSE)的用途。
朊病毒——引起TSE的病原體傳染性海綿狀腦病(TSE)包括一組對人和動物都有影響的快速發(fā)展的神經(jīng)變性致命疾病。TSE具有包括破壞性癡呆、包括肌陣攣的錐體的和錐體束外的病征、多病灶海綿狀變化、星形神經(jīng)膠質(zhì)增生(astrogliosis)、淀粉樣蛋白斑、神經(jīng)元丟失、無炎癥反應(yīng)在內(nèi)的臨床和神經(jīng)病理學(xué)特征，并且其特征通常是具有長潛伏期。
有人提出，TSE病可能是由“慢病毒”或類病毒引起的(Gajdusek1977)。然而，瘙癢病傳染力對輻射、核酸酶以及破壞遺傳材料的其它試劑的極端抗性卻與“病毒”理論相矛盾。TSE傳染物的所有這些“異?！碧卣魇笵r.Stanley Prusiner于1982年提出了“朊病毒”這一概念(Prusiner 1982)。朊病毒(PrP)，其表示無核酸的蛋白感染顆粒，是一種存在于人及動物中的糖蛋白。該蛋白的細(xì)胞形式(PrPC)具有兩個N-連接糖基化位點(diǎn)以及在C-末端具有一個GPI錨。已經(jīng)在神經(jīng)元中最普遍地發(fā)現(xiàn)了該蛋白，而且，在非常低的程度上，也已經(jīng)在其它比如白細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板這樣的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了該蛋白(Holada 2000)。朊病毒蛋白的傳染性瘙癢病形式(PrPSc)是其細(xì)胞前體的蛋白酶抗性同工型，且主要發(fā)現(xiàn)于腦中。在vCJD患者的扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)中也已發(fā)現(xiàn)了更低水平的PrPSc(Parizek 2001)。由于Prusiner的“朊病毒”是瘙癢病、并擴(kuò)展至所有TSE病的傳染物這一理念，使得出現(xiàn)了通常被稱作朊病毒病、用于描述一類被認(rèn)為與該蛋白有關(guān)的病理學(xué)的概念。
人朊病毒病已知為克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病(CJD)，通常影響老年人。根據(jù)疾病的表型，大多數(shù)CJD為散發(fā)性(sCJD)的，而約10％為家族性CJD(fCJD)。只有在最近，才在年輕的成年人中出現(xiàn)了一種新的CJD變體(vCJD)。自1995年以來，已經(jīng)報(bào)道了超過100個病例。朊病毒病影響多種家畜及野生動物物種，常對其表現(xiàn)形式給予獨(dú)特的命名，例如，綿羊和山羊的瘙癢病(McGowan 1922)、鹿科動物的慢性消耗性疾病(CWD，Williams 1980)和牛的牛海綿狀腦病(BSE，或“瘋?！辈?，Wells 1987)。
PrPC和PrPSc的特征根據(jù)Prusiner的“只有蛋白(protein only)”假說，導(dǎo)致朊病毒病的傳染性病原體是一種蛋白。朊病毒的主要成分似乎是異常折疊的PrP，稱作PrPSc(疾病特異性，“瘙癢病”同工型)。據(jù)信，PrPSc是從其正常的對應(yīng)體PrPC通過構(gòu)象變化形成的(Cohen，1998)。盡管關(guān)于轉(zhuǎn)變機(jī)制仍然是模糊不清的，但是仍被普遍接受的是在PrPSc存在下，作為底物起作用的正常PrPC發(fā)生構(gòu)象結(jié)構(gòu)變化，并通過一個自我催化過程成為PrPSc，導(dǎo)致PrPSc聚集和淀粉樣棒的形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Hope 1986，Horwich 1997)。根據(jù)圓二色性和紅外光譜學(xué)顯示的包括蛋白中的β折疊結(jié)構(gòu)在量上的顯著提高、以及α螺旋可能在量上的略微減少的關(guān)鍵構(gòu)象變化最為支持從PrPC到PrPSc的結(jié)構(gòu)變化(Pan 1993，Caughey 1991)。從PrPC到PrPSc的轉(zhuǎn)變效率似乎依賴于兩種PrP構(gòu)象異構(gòu)體間的序列同源性程度。由于這一獨(dú)特的機(jī)制，朊病毒病易于在相同物種內(nèi)傳播，并且當(dāng)PrP序列同源性足夠時，在物種間傳播(Raymond，2000)。因此，如果正確的話，這一假設(shè)的朊病毒病傳播機(jī)制將可能通過這些腦病在動物與人之間的傳播而提供引發(fā)流行病的潛力。
蛋白酶抗性是另一個使PrPSc區(qū)別于PrPC的特征。在培養(yǎng)的細(xì)胞和腦或來自許多GSS患者的樣品中，PrPSc較其細(xì)胞前體PrPC要小。即使細(xì)胞朊病毒和瘙癢病朊病毒是同一PRNP基因組產(chǎn)物的兩種同工型，PrPC也可以被蛋白酶K處理完全降解，而PrPSc只發(fā)生有限的消化。該消化產(chǎn)生一種稱作PrP 27-30的蛋白形式，其中已經(jīng)除去了N-末端。PrP 27-30已被假定為以PrPC為宿主的PrPSc復(fù)制所需的PrPSc核心。經(jīng)蛋白酶處理的朊病毒分子，PrP 27-30或PrPres，與瘙癢病傳染力密切相關(guān)(Gabizon 1988)，這也為PrPSc是一種傳染性蛋白提供了又一證明。
另一特征，它可能與β折疊結(jié)構(gòu)的顯著增加以及相伴隨的蛋白酶抗性有關(guān)，是所觀察到的PrPSc與PrPC間的溶解性差異。盡管PrPC是一種可溶性蛋白，但PrPSc同工型是高度不可溶的。此外，還發(fā)現(xiàn)PrPC是經(jīng)由錨定于膜中的GPI尾部而附著于神經(jīng)元表面的(Shyng1994)，但是卻在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了PrPres(Taraboulos1990)，它很可能與晚期內(nèi)體和溶酶體腔結(jié)合(Arnold 1995)，而且PrPSc還位于來自感染腦的富集級分的無定形聚集體中(Meyer 1986).
存在表明瘙癢病傳染力與PrP 27-30間的緊密關(guān)聯(lián)的增多的證據(jù)。甚至在最純的樣品中，估計(jì)的PrP分子與傳染性單位的比率也是～104至105(Horwich 1997，Bolton 2001)。在如此低的傳染力水平下，傳染力可能需要其它成分、輔因子或共價(jià)修飾。對表達(dá)嵌合人-小鼠PrPC的小鼠易感性的轉(zhuǎn)基因研究暗示，除PrPC之外存在至少一種可能作為PrPSc形成中的分子侶伴起作用的宿主因子，暫時稱作因子X(Telling 1995)。
朊病毒病的傳染力和傳播性朊病毒病是可傳播的。動物朊病毒病的傳播性已經(jīng)通過給健康動物接種感染動物的腦勻漿物實(shí)驗(yàn)性地建立了很久了，比如將瘙癢病從綿羊接種給綿羊(Cuillé1936)和跨物種接種給山羊(Pattison 1957)，將庫魯癥和CJD從人接種給黑猩猩(Gajdusek 1966，Gibbs 1968)。重要突破是瘙癢病向小鼠的成功傳播(Chandler 1961)，這通過提供一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛蟠蟠龠M(jìn)了TSE研究。近來的牛BSE和人中的CJD新變體(vCJD)的產(chǎn)生，對于BSE而言被認(rèn)為是由于食物接觸了用于動物飼料的瘙癢病綿羊畜體混合物的結(jié)果(Brown 1997)，對于vCJD而言是由于食物接觸了來自感染有BSE的牛的牛肉的結(jié)果(Bruce1997)。vCJD與BSE間的關(guān)聯(lián)還得到從與人最接近的模型BSE-適應(yīng)的獼猴、以及從用引起B(yǎng)SE和vCJD的試劑接種的近交小鼠的研究獲得的神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)的支持(Lasmézas 1996)。對北美的黑尾鹿和駝鹿中的CWD的流行性擴(kuò)張尤其關(guān)注的是，CWD是否象BSE一樣可以傳染給可能通過打獵或處理及食用感染的肉而接觸該疾病的人類。朊病毒病在人類中的悲劇性無意識傳播已經(jīng)有文件證明，比如通過食用已故同類的腦組織而引起的庫魯癥流行，以及通過使用激素、組織移植、以及污染的醫(yī)療器械而產(chǎn)生的醫(yī)原性CJD傳播。
沒有有力的證據(jù)表明任一種CJD病與可能具有交叉物種屏障的動物TSE有關(guān)。庫魯癥的流行已經(jīng)為獲得性人朊病毒病提供了最大的證據(jù)。盡管沒有vCJD患者已經(jīng)被文獻(xiàn)記載為人-至-人傳播的犧牲者，但是BSE與vCJD間的緊密關(guān)聯(lián)仍舊吸引了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。對人感染的關(guān)注是基于這一觀察的PrPSc易于在BSE和vCJD的淋巴網(wǎng)狀組織而不是在經(jīng)典的CJD中檢測到(Hill 1997)，之后得到這一推測從綿羊傳遞給牛的瘙癢病病原體已經(jīng)改變了宿主范圍并且變得更適應(yīng)于人類。對于這樣的行為的實(shí)驗(yàn)先例是熟知的小鼠適應(yīng)型瘙癢病品系經(jīng)由倉鼠的傳遞改變了它們重新傳遞給小鼠的傳播性(Kimberlin1987，Kimberlin 1989)；人類的庫魯病或CJD品系直到傳遞給靈長類或貓才會傳播給雪貂或山羊(Gibbs 1979)；和牛BSE品系直到通過小鼠傳遞才會傳播給倉鼠(Foster 1994)。作為選擇，如果BSE源自牛中的一個自發(fā)突變，那么對這一新的傳染性海綿狀腦病(TSE)品系的物種易感性實(shí)驗(yàn)研究未曾得到足以預(yù)測到人不是易感的這樣的發(fā)展。
對人類CJD和vCJD病的研究表明，基因組易感性可能仍然是另一個可以影響TSE在人類中傳播的因素。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)散發(fā)性CJD患者對于第129位密碼子的Met/Met或Val/Val是純合的(Belay 1999)。無論如何，所有報(bào)道的vCJD病例都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)是Met/Met純合的。
vCJD流行的大小和持續(xù)期仍然是不確定的。根據(jù)所做的假設(shè)和所使用的模型計(jì)算，提出了不同的預(yù)測。對總vCJD的一種估計(jì)預(yù)計(jì)為少至205個病例(Valleron 2001)。另一方面，如果僅從BSE傳染的話對下一個80年vCJD死亡率的另一種預(yù)測是50至50,000。如果BSE被證實(shí)感染綿羊而且如果之后它能夠進(jìn)入人類食物鏈的話，它可能會上升至150,000(Ferguson 2002)。盡管如果必要的參數(shù)要么是弄錯了要么是得不到從而不可能做出準(zhǔn)確的預(yù)測，但有一件事是確定的，即如果vCJD傳染力存在于血液中，則任何預(yù)測都是低估的。此外，vCJD已經(jīng)被證實(shí)是一種新的疾病實(shí)體并且并非簡單的是對人類CJD監(jiān)視提高的結(jié)果(Hillier 2002)。
政府已經(jīng)采取了對策來消除BSE發(fā)病率的傳播。在美國和英國禁止了反芻動物蛋白飼料(1988)。已經(jīng)采取了一系列措施來預(yù)防潛在的受感染肉進(jìn)入人類的食物鏈。為進(jìn)一步降低人類風(fēng)險(xiǎn)，F(xiàn)DA和CBER已經(jīng)在2001年8月發(fā)布了一項(xiàng)新政策，無限期推遲了在1980-1996年間在英國停留累積≥6個月的供體(FDA 2001)。
朊病毒病的診斷測定開發(fā)用于朊病毒檢測的靈敏而可靠的測定對于疾病監(jiān)視、風(fēng)險(xiǎn)評估以及當(dāng)與未來的療法相結(jié)合時用于疾病預(yù)防和根治是絕對重要的。目前，基本有三種測定用于診斷朊病毒病。(1)動物傳染力生物測定是迄今為止用于測量嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn)性瘙癢病的傳染性朊病毒的最靈敏方法，其通常通過用患病動物的腦勻漿物腦內(nèi)注射給受體動物來完成。然而，在不同動物物種中對朊病毒病傳染力的定量測量由于“物種屏障”以及所存在的在病理學(xué)、溫育時間和PrPSc分子特征方面有區(qū)別的不同朊病毒“品系”而受到限制。因此，這一耗時的昂貴的死后診斷大多用作一種用于區(qū)分嚙齒類動物中的不同朊病毒品系的研究工具，并用作校準(zhǔn)傳染性腦材料的參考。(2)目前的PrP免疫測定基于對蛋白酶抗性-PrPSc的檢測，這是所有朊病毒病的唯一已知的分子特點(diǎn)。多年來，通過免疫化學(xué)法對PrPSc的檢測(免疫組織化學(xué)和蛋白印跡)已經(jīng)提供了對動物和人類中朊病毒病的最準(zhǔn)確診斷(Schaller 1999，Biffiger 2002)。它們被廣泛用于死后診斷。為此已經(jīng)得到了許多針對PrP的各個區(qū)域的單克隆和多克隆抗體，比如US4806627和EP0861900中所述的廣泛使用的3F4、6H4。然而，只有極少數(shù)聲稱能夠區(qū)分PrPC(常常以更大的量存在)和PrPSc。Korth在1997年報(bào)道的以及Paramithiotis在2003年報(bào)道的單克隆抗體都是IgM，而且用這些抗體沒有開發(fā)出診斷測定。因此，幾乎所有當(dāng)前的免疫化學(xué)方法在檢測PrPSc之前都需要一個通常通過非特異性蛋白水解比如蛋白酶K(PK)消化來降低或去除PrPC的步驟。這樣的預(yù)處理從PrPSc切除最初的60-70個殘基，得到一個稱作PrPres的PK-抗性PrP27kDa-30kDa核心。然后識別該蛋白剩余的C末端區(qū)域的抗-PrP抗體可以用于檢測僅存在于病理學(xué)樣品中的N-末端截短的PrPSc或PrPres。為進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，還要預(yù)處理組織切片，通常用酸水解以降低與PrPC相關(guān)的背景。因此，PrPres在這些免疫測定中是前體PrPSc的代替品。在各種免疫測定形式中，根據(jù)雙-、單-和未糖基化PrP帶的遷移，蛋白印跡具有揭示詳細(xì)PrP分子模式的優(yōu)勢。該方法也已經(jīng)被廣泛用于區(qū)分人和動物朊病毒病中的不同的腦PrPres亞型。除蛋白印跡外，現(xiàn)在還已經(jīng)開發(fā)了用于較高樣品通量、靈敏度提高、以及更好定量的其它測定形式，包括傳統(tǒng)的ELISA、解離增強(qiáng)的鑭系元素?zé)晒饷庖邷y定(DELFIA，Barnard 2000和一種在US20020137114A1中描述的方法)以及與ELISA和熒光檢測相結(jié)合的構(gòu)象依賴性免疫測定(CDI)(Safar 1998，US 20010001061A1，US20020001817A1)。然而，盡管有這一形式，但PrPSc只有在強(qiáng)制性PK消化后才能與PrPC區(qū)分開來，這可能會難于最優(yōu)化全異的生物樣品。(3)還描述了其它樣品處理方法，包括綿羊瘙癢病臨床前診斷的第三眼瞼淋巴組織的免疫組織化學(xué)(O′Rourke 2000，US6165784，US6261790)，用磷鎢酸鈉做化學(xué)處理以從腦和其它外周組織勻漿物富集PrPSc(Wadsworth 2001)，以及在感染動物或人尿中檢測一種新的朊病毒蛋白同工型(Shaked 2001b，WO0233420A2)。其它檢測系統(tǒng)也已經(jīng)有文獻(xiàn)記載，包括毛細(xì)管電泳及傅立葉變換紅外光譜學(xué)。這些方法仍然處于它們的初期開發(fā)階段，并且在技術(shù)上很復(fù)雜。除了通過去除細(xì)胞朊病毒、之后通過非區(qū)別性抗-朊病毒抗體識別來對病原性朊病毒所作的傳統(tǒng)鑒定之外，發(fā)現(xiàn)其它試劑能夠?qū)rPSc與PrPC區(qū)分開來，比如纖溶酶原和血纖蛋白原。所提供的證據(jù)提示，各種物種的PrPSc的共有特性，而非朊病毒一級序列或各PrPSc分子的特異性三級結(jié)構(gòu)，可能負(fù)責(zé)與纖溶酶原結(jié)合(Fischer 2000，Maissen 2001)。WO0200713和US20010053533A1中已經(jīng)描述了利用纖溶酶原和其它血清/血漿蛋白捕獲和檢測病原性朊病毒蛋白的用途(Aguzzi 2001)。
所有目前制備的朊病毒診斷測定方法都利用腦組織作為樣品來源。歐洲委員會(European Commission)在1999年評估了來自不同生產(chǎn)商的四種BSE測試試劑盒(Moynagh 1999)。它們?nèi)夹枰粋€單獨(dú)的樣品制備程序。根據(jù)試劑盒的說明書，腦組織勻漿物需要加工，包括變性、PK消化或PrPSc富集。DELFA、免疫印跡或平板ELISA形式中使用的測定檢測系統(tǒng)利用了化學(xué)發(fā)光或比色底物。
向臨死前朊病毒病診斷的挑戰(zhàn)基于PrPSc的臨死前測定的一個普遍問題是PrPSc是否存在于周邊組織或體液中。由于技術(shù)難度，獲得了很少的關(guān)于PrPSc在體液中的存在或其相關(guān)傳染力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而且這一主題仍有爭議。在瘙癢病倉鼠模型中，可以在血液中檢測到低水平的傳染力。盡管從患病倉鼠血液衍生而來的淋巴細(xì)胞富集的棕黃層的傳染力大于血漿中的，但它只能說明與整個血液接種物相比的相對小部分。存在于血液中的該傳染物的分子定義是不清楚的。在散發(fā)性CJD患者中尋找風(fēng)險(xiǎn)因子和可能的感染來源揭示了疾病與飲食、輸血或接受其它血液產(chǎn)物沒有顯著的相關(guān)性。盡管早期的報(bào)道顯示了向小鼠腦內(nèi)接種后在從CJD患者獲得的血液中可能存在傳染力(Manuelidis 1985，Tateishi 1985)，但最大量的傳染力或PrPres總是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)(CNS)，而在經(jīng)典的人朊病毒病的周邊組織中沒有總是發(fā)現(xiàn)它，vCJD的情形除外。在vCJD患者的周邊淋巴網(wǎng)狀組織比如扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)中存在易于檢測的PrPSc已經(jīng)引起了人們對如下情形的重要關(guān)注，即存在于淋巴網(wǎng)狀組織中的大量PrPres能夠與循環(huán)系統(tǒng)互作，且因此，在vCJD患者血液中可能存在痕量PrPSc從而可能發(fā)生血液傳播。血液中的其它TSE傳染力也已經(jīng)在各種動物實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。大多數(shù)用于傳染力研究的血液都獲自TSE-適應(yīng)的嚙齒類動物，比如小鼠和倉鼠。通過腦內(nèi)和靜脈內(nèi)傳播已經(jīng)建立了小鼠-適應(yīng)的BSE、小鼠-適應(yīng)的vCJD。唯一的一個例外模型是一項(xiàng)在綿羊中完成的研究。在該實(shí)驗(yàn)中，用取自另一接種了BSE腦裂解物的綿羊的全血輸血的綿羊發(fā)展了BSE癥狀(Houston 2000，Hunter 2002)。然而，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然需要進(jìn)行完全地評估。期望在血液中尋找這樣的傳染物將有助于我們更好地理解PrPSc與TSE病之間的關(guān)系。
重要的是要注意到，由于不同的蛋白含量、應(yīng)用該測定到大的樣品數(shù)的難度、不可避免的去除蛋白酶敏感的PrPSc折疊中間體或者甚至真實(shí)PrPSc級分從而導(dǎo)致降低檢測靈敏度，所以用于消除PrPC背景的苛刻樣品處理可能不適于其它周邊組織樣品或體液。這可能尤其與利用周邊組織和體液的測定有關(guān)，因?yàn)榭赡苤淮嬖诘退降腜rPSc(Horiuchi 1999，Jackson1999，Swietnicki 2000)。這些關(guān)注使得開發(fā)與PrPSc具有高親和力、可以不需要蛋白水解處理而進(jìn)行特異性檢測的免疫試劑成為必需的。
發(fā)現(xiàn)新的PrPSc檢測捕獲試劑無論接受“只有蛋白”或“只有朊病毒”的假說與否，都進(jìn)行著不斷的努力來搜尋除朊病毒外的可以對朊病毒病發(fā)病機(jī)理有貢獻(xiàn)的試劑或分子。這一搜尋由許多未知的問題驅(qū)動著。例如，無任何污染的合成朊病毒蛋白，不引發(fā)疾??；觸發(fā)正常PrPC向病原性PrPSc同工型轉(zhuǎn)變的機(jī)制是未知的。另一個未解決的問題涉及在動物和人中觀察到的各種根據(jù)疾病潛伏期、糖基化水平和損傷模式定義的朊病毒病表型。在對單PRNP基因型純合的近交小鼠中連續(xù)傳代后，所有的瘙癢病品系都保持它們的原始疾病特征(profile)。這些觀察結(jié)果將調(diào)查者引向這些問題不同表型的的品系是否受相同細(xì)胞朊病毒前體的不同構(gòu)象同工型的控制、或者是否存在另一種決定可遺傳品系的表型的因子。實(shí)際上，無細(xì)胞反應(yīng)中形成的體外轉(zhuǎn)變模型PrPres從未顯示出在動物中形成新的TSE傳染力(Caughey 2003)。這些問題使許多人相信漏掉了一個仍然需去被發(fā)現(xiàn)的、被Prusiner建議為“X蛋白”的成分。
有人提出用朊病毒顆粒中存在一個緊密結(jié)合的RNA或DNA分子來解釋具有不同表型的不同瘙癢病品系在PRNP基因純合的動物中的增殖(Weissmann 1991)。經(jīng)回行再聚焦(return refocusing)凝膠電泳高度純化的瘙癢病朊病毒分析揭示了剩余核酸的小尺寸(Kellings1992)。然而，在最近的一份報(bào)道中，Narang指出，用純化自瘙癢病-倉鼠腦、并與非病原性朊病毒混合的ssDNA接種的動物發(fā)展了臨床疾病(Narang 2002)。根據(jù)他的發(fā)現(xiàn)，他假定，由該ssDNA編碼的“輔助蛋白”可能參與從PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)變。根據(jù)那些體外構(gòu)象和轉(zhuǎn)變研究，假定該DNA作為PrPSc構(gòu)象的守護(hù)者以及促進(jìn)PrPSc轉(zhuǎn)變和聚焦的催化劑起作用(Cordeiro 2001)。最近有報(bào)道，PrPC向PrPres的體外化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化需要特異性的RNA分子(Deleault 2003)。由Ortho-Clinical Diagnostics開發(fā)的能夠區(qū)別性捕獲PrPSc而不捕獲PrPC的抗核酸單克隆抗體(US60/434,627，US60/446,217)是另一個證實(shí)PrPSc與核酸結(jié)合的證據(jù)。
已知，從病腦中分離出的PrPSc還與大量聚糖結(jié)合。它們包括朊病毒棒中的1，4-連接的葡萄糖單位、鞘脂、多糖和PrPSc聚集體中的其它膜組分(Appel 1999，Klein 1998)、和朊病毒淀粉樣斑中的硫酸蛋白聚糖(Snow 1990)，這是在免疫組織化學(xué)中發(fā)現(xiàn)的一種特性，其中已經(jīng)顯示通過硫酸乙酰肝素抗體(抗-HS)和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖抗體(抗-HSPG)的結(jié)合早在感染后70天以及在整個疾病過程中與異常PrP相關(guān)(McBride 1998)。通過可能不同于核酸參與從PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)變的機(jī)制，聚糖也將細(xì)胞朊病毒蛋白轉(zhuǎn)化為β折疊構(gòu)象。PrPC向PrPSc的體外轉(zhuǎn)變以及在朊病毒傳染力重構(gòu)實(shí)驗(yàn)中，硫酸聚糖已經(jīng)顯示出促進(jìn)轉(zhuǎn)變或增強(qiáng)傳染力(Wong 2001，Shaked 2001a，Diaz-Nido 2002)。利用重組GST∷全長朊病毒和GST∷朊病毒片段，Warner最近證實(shí)了重組朊病毒與肝素和硫酸乙酰肝素的直接結(jié)合(Warner 2002)。朊病毒序列中的肽區(qū)域23-52在所有HS和HSPG結(jié)合測試中都是陽性的。由于該肽未能與全長朊病毒競爭結(jié)合肝素，所以作者建議在完整PrPC中可能有另一個主要的GAG-結(jié)合位點(diǎn)。另一個有趣的觀察結(jié)果是，已經(jīng)報(bào)道纖溶酶原結(jié)合腦-衍生的PrPSc，但不與PrPC結(jié)合。盡管還沒有證實(shí)纖溶酶原與PrPSc直接互作，但有人建議纖溶酶原的三環(huán)域(Kringle region)中有一個結(jié)合位點(diǎn)，該區(qū)域具有已知的對肝素的親和力。另一個值得注意的觀察結(jié)果是，來自不同物種(牛和豬)或來自不同器官(肺、腎和腸)的GAG已顯示出對朊病毒結(jié)合的不同親和力。親和力的差異可能是由于朊病毒序列本身引起的，或可能依賴于所測試GAG中特定糖單位的存在。
根據(jù)這些觀察結(jié)果，提議了許多設(shè)計(jì)用于通過與獨(dú)特PrPSc構(gòu)象或PrPSc相關(guān)分子的肽親和力選擇性捕獲PrPSc而不是PrPC的肽。利用不經(jīng)蛋白酶預(yù)處理的免疫沉淀通過從病腦勻漿物鑒定和捕獲PrPSc的能力篩選出這些肽。
(1)肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽聚糖(GAG)比如肝素和硫酸乙酰肝素與PrPSc淀粉樣聚集體結(jié)合。由于GAG∷PrPSc中的結(jié)合親和力遠(yuǎn)高于GAG∷PrPC中的，所以有可能利用特征為聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域以選擇性捕獲PrPSc而非PrPC的肽。為此，合成了描述為肝素或硫酸乙酰肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽(1)纖連蛋白羧基末端的WQPPRARI(Woods 1993，Hines 1994)，(2)淀粉樣蛋白前體的NWCKRGRKNCKTH(Small 1994)，(3)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-1的N-末端的NYKKPKLG(Lou 1996)和(4)層粘連蛋白α1鏈的C-末端G-結(jié)構(gòu)域的KDFLSIELVRGRVK(Yoshida 1999)。
(2)“縮合的”三環(huán)肽三環(huán)域參與纖溶酶原與PrPSc的選擇性結(jié)合。還已知，三環(huán)域具有肝素/硫酸乙酰肝素結(jié)合活性(Mizuno 1994)，其中涉及帶正電荷的氨基酸(比如Arg和Lys)(Soeda 1989)。在一份單獨(dú)的出版物中，在所建議的朊病毒序列中發(fā)現(xiàn)有兩個保守三肽“YYR”、或更確切的是三個不連續(xù)“YYX”與PrPSc互作但不與PrPC互作(Paramithiotis2003，WO0078344A1)。在人纖溶酶原序列中有趣地發(fā)現(xiàn)，五個三環(huán)域中的四個中有四個Tyr-Arg-Gly序列(三環(huán)域1、3、4和5)；在纖溶酶原中有六個Tyr-Arg或Arg-Tyr或Arg-Lys序列。此外，通過在三環(huán)圈中形成二硫鍵使幾個相距較遠(yuǎn)的Tyr、Arg或Lys殘基靠近在一起(

圖1)?；谶@些觀察，假定纖溶酶原三環(huán)域以及朊病毒序列中的氨基酸Tyr、Arg和Lys，可能通過與PrPSc復(fù)合物結(jié)合的聚糖的互作，可以解釋與PrPSc的選擇性結(jié)合。為此，合成了兩個“縮合的三環(huán)”肽YRGYRGYRGYRG和YRGRYGYKGKYGYRG。
(3)核酸結(jié)合肽核酸是另一類與PrPSc聚集體結(jié)合的分子?？?DNA抗體已經(jīng)被有效用于捕獲PrPSc。組蛋白是一組已知與核DNA結(jié)合的蛋白。因此，為評估它們捕獲PrPSc的能力，合成了三個肽(1)H2B(21-41)的AQKKDGKKRKRSRKESYSIYV，(2)H3(1-21)的ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA，和(3)H4(2-24)的SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR。
II.發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種分離、濃縮和監(jiān)控TSE疾病相關(guān)的病原性朊病毒蛋白的非侵入性途徑。本發(fā)明描述了八個肽(肽-1、肽-2、肽-3、肽-5、肽-6、肽-7、肽-8和肽-9)和它們從朊病毒病感染的動物和人的腦勻漿物捕獲PrPSc的能力。這八個肽不從無朊病毒病的個體捕獲細(xì)胞朊病毒蛋白。所提供用于支持本發(fā)明的證據(jù)證實(shí)，正如所研究的，PrPSc以高親和力與許多其它分子比如核酸和聚糖結(jié)合。該證據(jù)還證實(shí)，這一結(jié)合是強(qiáng)的、對PK消化處理有抗性的，而且PrPSc可以容易地用肽通過識別這樣結(jié)合的結(jié)合配偶體分離出來。
本發(fā)明涉及所述肽通過與PrPSc高親和力結(jié)合的聚糖或核酸連同用于檢測PrPSc的任何朊病素序列特異性抗體用于捕獲PrPSc的用途。
在另一方面，本發(fā)明涉及如上所述的肽，其優(yōu)選與病原性朊病毒結(jié)合但不與朊病毒蛋白正常細(xì)胞形式結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明涉及如上所述的肽，其用于通過所結(jié)合的聚糖或核酸的高親和力識別連同朊病毒序列特異性抗體來檢測PrPSc。
在另一方面，本發(fā)明涉及如上所述用于在生物試劑生產(chǎn)中分離、純化、捕獲、去除及監(jiān)控PrPSc的肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于確定PrPSc的存在的組合物和試劑盒，其包括如上所述用于測定方法中的捕獲或者檢測步驟的肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于確定PrPSc抗體的存在的組合物和試劑盒，所述抗體是應(yīng)答高親和力結(jié)合的作為病原性朊病毒蛋白結(jié)合配偶體的聚糖或核酸而產(chǎn)生的。
仍在另一方面，本發(fā)明涉及抗-PrPSc抗體及利用所述能夠與PrPSc互作和/或與PrPSc結(jié)合的聚糖或核酸對其的生產(chǎn)，以及它們在檢測聚糖∷PrPSc或核酸∷PrPSc復(fù)合物和朊病毒病感染的用途。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種非苛刻樣品處理程序，涉及為利用上述肽而進(jìn)行聚糖酶或核酸酶消化。
III.附圖簡述圖1人纖溶酶原序列和三環(huán)域。 五個三環(huán)域中的四個具有四個YRG序列。 有6個YK、RY、RK序列。●，在幾個三環(huán)圈二硫鍵附近有許多Y、R或K。
圖2倉鼠PrPSc的IP捕獲和免疫印跡。將正常(4μl)和瘙癢病(3μl)倉鼠腦勻漿物直接加樣于凝膠中或利用綴合有生物素化的肽的鏈霉抗生物素蛋白磁珠直接做免疫沉淀。通過用3F4做免疫印跡檢測PrP。PK消化瘙癢病裂解物以用于直接加樣。用于IP捕獲的勻漿物不經(jīng)PK處理。
圖3BSE PrPSc的IP捕獲和免疫印跡。將來自正常牛(10μl)或來自BSE(5μl)的腦勻漿物加入1ml IP緩沖液中，用于肽-磁珠免疫沉淀。之后將免疫沉淀的PrP用PK處理并用SDS-PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析，用6H4檢測。從BSE腦勻漿物中捕獲的PrP是真實(shí)的PrPSc，因?yàn)橛肞K處理(50μg/ml，37℃，1小時)產(chǎn)生PK-抗性核心PrPres片段。還在不存在(-)或存在(+)PK(50μg/ml，37℃，1小時)時將從BSE和正常對照中澄清出的腦勻漿物溫育或直接加樣到SDS凝膠上作為對照。
圖4用肽從vCJD的腦中免疫捕獲PrPSc。用肽綴合的磁珠在獲自被路易體癡呆(LBD)或vCJD(99/090)影響的患者的5μL澄清的腦勻漿物中免疫沉淀PrP。然后將免疫沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE(4-12％凝膠)分析以及利用抗-PrP抗體3F4做蛋白印跡。將5μL未處理的LBD勻漿物和5μL經(jīng)PK處理或未處理的vCJD腦勻漿物直接加樣到SDS-凝膠中以顯示朊病毒含量。
IV.詳述腦勻漿物制備從Baltimore Research and Education Foundation獲得正常和瘙癢病倉鼠腦裂解物作為溶于PBS中的10％全腦組織勻漿物(w/v)。向裂解物中加入1/10體積的10×去污劑勻漿緩沖液對該裂解物做進(jìn)一步處理，該緩沖液由溶于PBS中的5％脫氧膽酸鈉和5％IgpalCA-630(與NP-40相當(dāng))組成，4℃溫育1小時，之后在1000g離心10分鐘。收集所得上清液并用于測定。
由英國Veterinary Laboratories Agency(VLA)提供正常和BSE牛腦組織。由英國National CJD Surveillance Unit(NCJDSU)提供人vCJD和路易體(Lewy body)癡呆腦組織。以與倉鼠腦勻漿物制備相同(或類似)的方式處理腦組織。
合成肽由ResGen(Invitrogen Corporation現(xiàn)在的一個部門)合成、或從Upstate Group，Inc.購買，得到了九個肽。各肽用生物素在帶有氨基己酰間隔區(qū)(K(Lc))的C-末端賴氨酸上進(jìn)行標(biāo)記，或者通過氨基己酰間隔區(qū)(AMCAP)在N-末端上進(jìn)行標(biāo)記。
肽ID 肽序列 序列來源制備單位肽一WQPPRARIG-K(Lc)-生物素 纖連蛋白ResGen肽二生物素-AMCAP-淀粉樣蛋白前體 ResGenNWCKRGRKNCKTH肽三生物素-AMCAP-NYKKPKLG成纖維細(xì)胞生長因子 ResGen(FGF)-1肽四生物素-AMCAP-層粘連蛋白A鏈 ResGenKDFLSIELVRGRVK肽五YRGYRGYRGYRG-K(Lc)-生物素 “縮合的”三環(huán)-A ResGen肽六YRGRYGYKGKYGYRG-K(Lc)-生物 “縮合的”三環(huán)-B ResGen素肽七AQKKDGKKRKRSRKESYSIYV- 人組蛋白2B UpstateGGK(Lc)-生物素肽八ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA- 人組蛋白3 UpstateGGK(Lc)-生物素肽九SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVL 人組蛋白4 UpstateR-GSGSK(Lc)-生物素肽十生物素-AMCAP-TIADRYYRETARVP16蛋白，HSV-2 ResGen
將生物素化的肽以1mg/mL溶解于PBS中，并于-20℃儲藏直至使用。
生物素化的肽與鏈霉抗生物素蛋白磁珠綴合用PBS洗滌0.5mL DynabeadsM-280鏈霉抗生物素蛋白(DynalBiotech，NY，美國，Cat.#112.06)兩次，用磁鐵將珠子從緩沖液中分離出來(Dynal Magnetic Particle Concentrator，MPC)。向洗滌過的珠子中加入100ug肽和1mL PBS。于37℃下旋轉(zhuǎn)溫育1-2小時。用MPC將珠子從緩沖液中分離出來，用1ml PBS(0.1％BSA)洗滌兩次，并于洗滌時在室溫下旋轉(zhuǎn)5分鐘。然后于37℃用溶于含0.1％BSA的0.2M Tris-HCl，pH8.0中的1mM生物素封閉肽-綴合的珠子2小時。之后用1ml PBS(0.1％BSA)洗滌珠子2次，并用1ml PBS(0.1％BSA，1％ Tween 20)洗滌一次，每次在室溫下溫育10分鐘。然后用1ml PBS(0.1％BSA)洗滌珠子一次，然后于4℃保存于1ml PBS(0.05％疊氮化鈉)中。
蛋白酶K消化腦裂解物PK消化的條件用或不用非離子去污劑將腦勻漿物懸浮于PBS緩沖液中?？倓驖{物蛋白濃度不超過2.5mg/mL。以50ug/mL的終濃度加入PK(Roche Diagnostics，IN，美國，Cat.#1373196)。于37℃溫育0.5至1小時。通過加入Pefabloc SC(Roche Diagnostics，IN，美國，Cat.#1585916)至終濃度為4mM終止消化。
免疫沉淀(IP)、非還原電泳和PrPSc的免疫印跡檢測用肽綴合的磁珠從腦勻漿物中通過免疫沉淀捕獲PrPSc。IP程序由下列操作組成將50uL肽綴合的珠子與經(jīng)PK處理過的或未經(jīng)-PK處理的腦勻漿物在總計(jì)1mL IP緩沖液(溶于PBS中的3％Tween20和3％Igpal CA-630)中混合，并在25℃旋轉(zhuǎn)溫育2.5小時→用MPC裝置分離珠子并用IP洗滌緩沖液(溶于PBS中的2％Tween20和2％Igpal CA-630)洗滌珠子3次，每次30秒渦旋→通過用NuPAGE樣品緩沖液加熱珠子10-15分鐘將捕獲的PrPSc洗脫。將從IP捕獲洗脫的樣品加載到4-12％NuPAGEBis-Tris Gel(Invitrogen，CA，美國，Cat.#NP0302)中，并進(jìn)行非還原電泳，200V，45分鐘。免疫印跡過程按照下述完成于30V下將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)移到0.2umPVDF膜上(Invitrogen，Cat#LC2002)60分鐘→用溶于TBS中的BlockerTMCasein(0.05％Tween20)(Pierce Chemical Corp.，IL，美國，Cat.#37532)在25℃振蕩1小時或者在4℃下過夜以封閉該膜?！?∶3000稀度的3F4(Signet，MA，美國，Cat.#9620-02)或1∶5000稀度的6H4(Prionics AG，瑞士，Cat.#01-011)作為第一抗體檢測PrPSc。將膜與稀釋的抗體在溶于TBST緩沖液中(25mM Tri-Cl，0.2MNaCl，0.2％Tween20，pH8.0)的10％BlockerTMCasein中在25℃振蕩1小時。→用TBST緩沖液振蕩洗滌3×5分鐘?！鷮⒛づc1∶10,000至1∶30,000稀度的辣根過氧化物酶綴合的山羊多克隆抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，PA，美國，Cat.#115-035-003)在溶于TBST緩沖液中的50％BlockerTMCasein中于25℃振蕩溫育1小時?！肨BST緩沖液振蕩洗滌6×5分鐘?！蚰ど咸砑覧CL化學(xué)發(fā)光底物(Amersham Biosciences，NJ，美國，Cat.#RPN2109)或SuperSignal West Dura化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)以顯影5分鐘。→通過暴光于Bio Max MR-2膠片(Kodak，NY，美國)或ChemiDoc Gel Documentation System(Bio-Rad，CA，美國)獲得圖像。
V.優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用肽來通過識別PrPSc復(fù)合物中的高親和力結(jié)合分子比如聚糖、核酸以捕獲PrPSc。由于這些分子只與PrPSc而不與PrPC緊密結(jié)合，所以本發(fā)明提供了一種用于檢測PrPSc的非侵入性方法，而不需要PK消化或其它的蛋白修飾過程。預(yù)期溫和的條件將會保持病原性朊病毒蛋白的原始結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而提供了確定真實(shí)PrPSc存在的機(jī)會，而將由于苛刻的樣品處理而導(dǎo)致的PrPSc形成最小化。
使用合成肽提供了益處，因?yàn)樗鼈儾粌H顯示結(jié)合特異性，而且還在直接涂覆至固相以及進(jìn)行綴合以連接于給出信號的試劑比如辣根過氧化物酶(HRP)或被其它所需診斷測定形式所采用時易于操作。
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權(quán)利要求
1.含有選自下組的氨基酸序列的肽(肽一)WQPPRARIG-K；(肽二)NWCKRGRKNCKTH；(肽三)NYKKPKLG；(肽四)KDFLSIELVRGRVK；(肽五)YRGYRGYRGYRG-K；(肽六)YRGRYGYKGKYGYRG-K；(肽七)AQKKDGKKRKRSRKESYSIYV-GGK；(肽八)ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK；(肽九)SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR-GSGSK；(肽十)TIADRYYRETAR。
2.一種檢測PrPSc的方法，包括首先將樣品與權(quán)利要求1請求保護(hù)的肽接觸，然后檢測PrPSc。
3.一種檢測PrPSc的免疫測定，包括提供在其上結(jié)合有來自權(quán)利要求1的肽的固體支持物，將該固體支持物與樣品接觸，洗滌該支持物以除去任何未結(jié)合的樣品，將該固體支持物與朊病毒特異性抗體接觸，和進(jìn)行檢測步驟以確定PrPSc是否結(jié)合于該固體支持物。
4.一種檢測PrPSc的試劑盒，包括一種在其上結(jié)合有權(quán)利要求1的肽的固體支持物，和一種標(biāo)記的朊病毒特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在人和動物中檢測朊病毒病的肽。也描述了用于確定朊病毒病的組合物和試劑盒。
文檔編號C07K5/06GK1804628SQ20051010648
公開日2006年7月19日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者J·鄭 申請人:奧索臨床診斷有限公司