專利名稱：抗hiv1/2抗原的單鏈抗體及其快速檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗HIV1/2抗原的單鏈抗體及利用該單鏈抗體的快速檢測(cè)試劑。
背景技術(shù)：
自1983年人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)首次分離成功以來(lái)，HIV在全球范圍迅速流行，2000年12月為止全世界有3810萬(wàn)人感染HIV，每年530萬(wàn)新增感染人數(shù)。絕大部分HIV感染者在感染后10年內(nèi)發(fā)展為艾滋病(Acquired Immure Deficiency Syndrome，AIDS)，病死率極高。目前我國(guó)大陸的HIV感染人數(shù)已超過(guò)100萬(wàn)，新感染人數(shù)每年以30％的速度增長(zhǎng)。由于目前還沒有根治HIV病毒感染的方法，對(duì)HIV感染人群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，防止其由特殊人群向一般人群傳播就成了控制人群HIV感染率的唯一方法。
針對(duì)HIV檢測(cè)的方法眾多，包括分子生物學(xué)、病原學(xué)、基因芯片、血清抗體等方法，但目前最主流的檢測(cè)方法還是血清抗體、抗原的檢測(cè)。有研究結(jié)果表明，HIV感染后前期(4-6周)抗體檢測(cè)為陰性，但此時(shí)患者體內(nèi)病毒已存在，且具有很強(qiáng)的傳染性，為了提高HIV攜帶者的檢出率，應(yīng)同時(shí)予以其它方法的檢查以縮短“窗口期”(HIV感染者在感染HIV至檢出HIV特異性抗體之間的時(shí)間)，如PCR、病原學(xué)、抗原等方法檢查，但PCR和病原學(xué)的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高，實(shí)驗(yàn)條件苛刻，應(yīng)用性差，而快速抗原檢測(cè)試劑由于簡(jiǎn)便、快速、特異性高，得以廣泛應(yīng)用。但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的快速抗原檢測(cè)試劑普遍存在特異性差、抗干擾能力差等問(wèn)題，阻礙了快速抗原檢測(cè)試劑在我國(guó)的推廣應(yīng)用，而進(jìn)口抗原檢測(cè)試劑由于價(jià)格昂貴，也導(dǎo)致無(wú)法在我國(guó)推廣使用，從而造成HIV攜帶者漏檢率高的難題，因此如何提高特異性、增強(qiáng)抗干擾能力、縮短“窗口期”是目前快速抗原檢測(cè)試劑中急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗HIV1特異性核衣殼蛋白的單鏈抗體、提供一種抗HIV2特異性核衣殼蛋白的單鏈抗體以及提供一種利用本發(fā)明單鏈抗體制作的用于檢測(cè)血清中HIV1/2抗原的膠體金快速檢測(cè)試劑，用以提高檢測(cè)試劑的特異性、增強(qiáng)抗干擾能力、縮短“窗口期”，以便快速檢測(cè)試劑的推廣應(yīng)用，從而有效解決HIV攜帶者漏檢率高的難題。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方法獲取HIV的p24和p32全長(zhǎng)DNA片段，合成第二鏈后，克隆到相關(guān)真核質(zhì)粒中，免疫小鼠，連接擴(kuò)增系列抗體的重鏈和輕鏈基因，獲得單鏈抗體基因；再用噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選親和力高的單鏈抗體基因，高效表達(dá)、純化獲取HIV1/2單鏈抗體；最后利用HIV1/2單鏈抗體，制備膠體金快速HIV1/2抗原試劑并進(jìn)行性能的檢測(cè)和臨床的試用。
以下敘述本發(fā)明的主要內(nèi)容一種抗HIV-1特異性核衣殼蛋白p24的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體具有如序列表中<210>1所示的基因序列，共計(jì)726個(gè)核苷酸，劃線部分為接頭序列共45個(gè)核苷酸，接頭前為重鏈序列共354個(gè)核苷酸，接頭后為輕鏈序列共327個(gè)核苷酸。
一種抗HIV-2特異性核衣殼蛋白p32的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體具有如序列表中<210>2所示的基因序列，共計(jì)726個(gè)核苷酸，劃線部分為接頭序列共45個(gè)核苷酸，接頭前為重鏈序列共357個(gè)核苷酸，接頭后為輕鏈序列共324個(gè)核苷酸。
一種用于檢測(cè)血清中HIV1/2抗原的膠體金快速檢測(cè)試劑，其特征在于該試劑含有上述兩種單鏈抗體。
抗原檢測(cè)中的抗原實(shí)質(zhì)上是HIV在增殖的過(guò)程中合成的特異性蛋白，檢測(cè)到這些蛋白也就表明體內(nèi)存在HIV。p24是HIV1特異性核衣殼蛋白，該蛋白在急性感染數(shù)天后即可出現(xiàn)，是最早在血清中出現(xiàn)的HIV特異性蛋白，該蛋白的檢測(cè)能夠縮短HIV1檢測(cè)的窗口期。而p32蛋白是HIV2特異性核衣殼蛋白，對(duì)p32的檢測(cè)同樣能夠縮短對(duì)HIV2檢出的窗口期。
本發(fā)明實(shí)施的過(guò)程中，成功地應(yīng)用了基因工程及其試劑制作的新技術(shù)①基因免疫又稱DNA疫苗，由編碼病原體抗原的基因和質(zhì)粒DNA組成，這種重組質(zhì)粒被直接導(dǎo)入免疫對(duì)象體內(nèi)。進(jìn)入機(jī)體后，質(zhì)粒DNA不與宿主染色體整合，但編碼病原體抗原的基因可利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在其中合成抗原蛋白，繼而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫。核酸疫苗與傳統(tǒng)疫苗的區(qū)別主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生的，無(wú)需純化抗原，避免了繁瑣復(fù)雜的純化過(guò)程以及在純化過(guò)程中可能出現(xiàn)天然構(gòu)象喪失的問(wèn)題，該技術(shù)的應(yīng)用可避免產(chǎn)生非特異性、低親和力抗體的產(chǎn)生，而且把數(shù)月至數(shù)年的免疫細(xì)胞的獲取縮短為數(shù)星期。②單鏈抗體是繼單克隆抗體后新一代基因工程抗體，它在DNA水平上將輕、重鏈可變區(qū)基因用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账?接頭)連起來(lái)，使之在適當(dāng)?shù)纳矬w中表達(dá)成為一條單一的肽鏈，最易于在原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和批量生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)是研制和生產(chǎn)周期短，成本低，產(chǎn)量高，便于抗體的基因改造。③噬菌體表面展示技術(shù)是一種篩選高親和力抗體的技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)PCR將全套抗體H鏈和L鏈V區(qū)基因克隆出來(lái)，以噬菌體為載體，在cpI-II或cpVIII衣殼蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的膜表面，使噬菌體表面表達(dá)異源性分子，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。形成的融合蛋白不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)其保持的外源蛋白的天然構(gòu)象也能被相應(yīng)的抗原或受體所識(shí)別。經(jīng)輔助病毒感染后，借助cpIII的信號(hào)肽穿膜作用，進(jìn)入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部，隨后攜帶有表達(dá)載體的宿主菌就會(huì)釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒。這一技術(shù)的主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型(含有抗體基因片段)和表型(與抗原特異結(jié)合)統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)。④免疫復(fù)合物解離分析技術(shù)，是指用酸、堿或加熱的方法使免疫復(fù)合物發(fā)生解離，從而提高對(duì)p24抗原和p32抗原檢測(cè)的敏感性和檢出的陽(yáng)性率，處理后樣品的檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相同。⑤免疫膠體金技術(shù)是四大免疫標(biāo)記技術(shù)之一，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。本試劑盒采用了該技術(shù)兩種基本方法中的斑點(diǎn)免疫層析法，只需將試紙條下端浸入檢測(cè)液中，數(shù)分鐘即可得檢測(cè)結(jié)果。
開發(fā)出檢測(cè)p24和p32抗原的試劑，有巨大的臨床價(jià)值1、為檢測(cè)處在HIV感染窗口期的患者和AIDS病人臨床治療效果提供了檢測(cè)手段；2、為確定HIV感染產(chǎn)婦的嬰兒是否攜帶HIV提供檢測(cè)手段；3、為HIV攜帶的確診提供手段。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的抗HIV1單鏈抗體效價(jià)高，抗干擾能力強(qiáng)，特異性好且能識(shí)別不同HIV1分離株。
2、本發(fā)明的抗HIV2單鏈抗體效價(jià)高，抗干擾能力強(qiáng)，特異性好且能識(shí)別不同HIV2分離株。
3、本發(fā)明的膠體金快速檢測(cè)試劑檢測(cè)譜廣，能同時(shí)檢測(cè)HIV1/2；敏感度高，采用了高親和力的單鏈抗體及其免疫復(fù)合物解離分析技術(shù)。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。


圖1是重組真核質(zhì)粒pIRES-p24的構(gòu)建示意圖。
圖2是重組質(zhì)粒pIRES1-p24的鑒定電泳圖，圖2中1、Marker；2、pIRES1-p24質(zhì)粒雙酶切；3、重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。
圖3是VH、VL擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖3中1、VL PCR產(chǎn)物；2、VH PCR產(chǎn)物；3、Marker。
圖4是單鏈抗體基因構(gòu)建示意圖。
圖5是單鏈抗體基因的擴(kuò)增、酶切和純化示意圖。
圖6是單鏈抗體基因的富集和篩選示意圖。
圖7是重組質(zhì)粒pET24-scFv-p24酶切電泳圖，圖7中1、pET24-scFv-p24質(zhì)粒雙酶切；2、scFv-p24PCR產(chǎn)物；3、Marker。
圖8是pET24-scFv-p24蛋白的表達(dá)、純化電泳圖，圖8中1、scFv-p24親和層析洗脫液；2、scFv-p24包涵體；3、Marker；4、scFv-p24超聲上清。
圖9是膠體金快速檢測(cè)HIV1/2抗原檢測(cè)板，圖9中1、加樣孔；2、觀察孔；3、檢測(cè)線1；4、檢測(cè)線2；5、控制線；6、廢液收集海綿。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)基因免疫、高親和力單鏈抗體基因的獲取、單鏈抗體蛋白的制備、膠體金快速檢測(cè)試劑的研制等實(shí)施例加已說(shuō)明，但是并不是將本發(fā)明局限于此。那些應(yīng)用于本發(fā)明的技術(shù)有許多非關(guān)鍵性的參數(shù)，要獲得相似的結(jié)果，可以對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行修改或變化。實(shí)施方式以p24單鏈抗體的獲取為例，p32單鏈抗體類同p24單鏈抗體的獲取。
實(shí)施例1HIV1真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其基因免疫(見圖1)(1)目的基因的獲取已獲取HIV1總cDNA，根據(jù)NCBI已知的p24序列，設(shè)計(jì)分別帶Cla I和BstxI酶切位點(diǎn)的引物，PCR獲取目的基因；(2)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切、純化和連接A.反應(yīng)體系cDNA模板約100ng，Cla I酶2.5IU，BstxI酶2.5IU，10×通用Buffer 2μl，加水至總反應(yīng)體系20μl；B.酶切產(chǎn)物純化酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切出含目的片段的膠塊，放入Ep管中，加入TE約200μl，再加等體積的Tris飽和酚于70℃融化，12000rpm/min離心10min，等體積的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA，回收片段溶于10μlTE中；C.連接PCR酶切片段約100ng，真核質(zhì)粒酶切片段約100ng，10×T4Buffe2μl，T4連接酶5U，加雙蒸水至20μl，放置16℃連接過(guò)夜；(3)感受態(tài)細(xì)胞的制備A.接種環(huán)刮取凍存的E.coli DH5α菌種，接種于LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16h；B.挑取單菌落，接種到4ml LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm/min振搖培養(yǎng)，取0.1ml培養(yǎng)物接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2h至OD600為0.5；C.再將1ml細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的EP管中，冰浴10min，4℃、5000rpm/min離心10min，棄上清，以0.5ml冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl210mmol/LTris·Cl(pH8.0)的溶液重懸沉淀；D.冰浴20min，4℃、5000rpm/min離心10min，棄上清，以0.2ml冰浴預(yù)冷的100mmol/L CaCl2-甘油溶液重懸沉淀細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞；E.將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無(wú)菌微量離心管中，每管200μl，標(biāo)明菌株、日期，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆迷摶蚝蚿IRES1neo真核質(zhì)粒用Cla I和BstxI酶切后連接，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α后，擴(kuò)增工程菌，提取并純化重組質(zhì)粒；(4)轉(zhuǎn)化和鑒定A.10μl連接液加入200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴45min，42℃水浴1min，重新放入冰浴15min，加LB培養(yǎng)基至1ml，37℃，200rpm/min振搖培養(yǎng)1h，取200μl上述培養(yǎng)物，含將轉(zhuǎn)化菌涂布于含50μg/ml neo的LB平板上，37℃培養(yǎng)14-16h，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落；B.挑取菌落擴(kuò)增，再PCR酶切的方法鑒定(見圖2)；(5)基因免疫把該質(zhì)粒免疫Balb/c小鼠，隔一星期注射一次，共四次，完成基因免疫。
實(shí)施例2HIV1單鏈抗體基因的獲取(見圖4)(1)小鼠脾細(xì)胞mRNA提取、cDNA合成及PCR擴(kuò)增VH和VL(見圖3)A.摘取免疫鼠脾臟，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；B.用鼠抗體重、輕鏈可變區(qū)特異性引物，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板；C.用PCR方法擴(kuò)增VH和VL片段。PCR條件為94℃55s，55℃110s，72℃110s，共計(jì)25個(gè)循環(huán)；D.瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收擴(kuò)增片段；(2)VH、VL與Linker的連接A.紫外分析VH、VL和Linker引物的濃度，使其摩爾濃度大致相等，采用重疊延伸拼接法(gene splicing by overlap extension，SOE)重組成單鏈抗體基因；B.反應(yīng)體系為50μl反應(yīng)體積中加入VH和VLcDNA各約150ng、Linkerprimer4ul、10mmol/L dNTP 5μl、25mmol/L MgCl225μl、PCR 10×buffer 5μl、Taq5U。反應(yīng)條件為94℃55s，61℃4min，8個(gè)循環(huán)反應(yīng)完后；
C.再加入含酶切位點(diǎn)的起始primer 4μl、10×PCR buffer 5μl、10mmol/LdNTP 5μl、Taq 5U，補(bǔ)水至100μl。PCR反應(yīng)條件為94℃55s，55℃110s，72℃110s，總計(jì)30個(gè)循環(huán)。通過(guò)引物擴(kuò)增，組裝出的ScFv cDNA的5’及3’端分別帶上了Sfi I和Not I的酶切位點(diǎn)，電泳回收擴(kuò)增片段(見圖5)；實(shí)施例3p24噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及其單鏈抗體基因的富集、篩選(1)構(gòu)建p24 ScFv的克隆及表達(dá)質(zhì)粒A.SfiI、NotI雙酶切回收片段，電泳純化回收(見圖5)；B.相應(yīng)雙酶切pCANTAB5E載體電泳純化回收，PCR片段和載體物質(zhì)的量之比約為5∶1；C.連接反應(yīng)T4DNA連接酶8U，10×T4buffer 2μl，反應(yīng)總體積20μl，16℃連接過(guò)夜；(2)構(gòu)建鼠脾細(xì)胞噬菌體抗體庫(kù)A.20μl連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化200μl新鮮制備的E coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法如實(shí)施例1；B.轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于6塊含50μg/ml氨芐青霉素的SOBAG平皿上，37℃培養(yǎng)24h；C.用2×YT培養(yǎng)基洗下全部轉(zhuǎn)化菌落，并于2×YT-AG培養(yǎng)基中把菌液稀釋至A600nm＝0.2，37℃搖床培養(yǎng)至A600nm＝0.6，加入M13K07使其終濃度為1010pfu/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2h；D.菌液5000rpm/min，離心15min，棄上清，用2×YT-AK重懸菌體，37℃，200rpm/min搖床培養(yǎng)過(guò)液。6000rpm/min，離心15min，收集上清，PEG/NaCl沉淀噬菌體，電泳估計(jì)噬菌體濃度，用PBS調(diào)整濃度約為1012pfu/ml的懸液；(3)抗p24的scFv的富集及篩選(見圖6)
A.購(gòu)買的p24蛋白(5μg/ml)3ml包被在25cm2的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，1％牛血清白蛋白(BSA)封閉；B.將已制備好的噬菌體懸液100μl加等體積的1％BSA，37℃孵育1h；C.倒去培養(yǎng)皿內(nèi)的封閉液，再加入已封閉好的噬菌體，37℃孵育3h；D.然后用PBS和PBS Tween20各洗皿10次，再加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG11ml，37℃培養(yǎng)80min，轉(zhuǎn)入5ml 2×YT-AG中再培養(yǎng)1h；E.加入M12K07至終濃度為1010pfu/ml，繼續(xù)培養(yǎng)1h。用同樣的方法制備噬菌體，再進(jìn)行下一輪免疫親和富集。如此反復(fù)3次，每次富集所得噬菌體感染的TG1均涂布于SOBAG上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；F.抗p24scFv的篩選從SOBAG上挑選單菌落，重新制備重組噬菌體，109菌落形成單位(pfu)加到預(yù)先包被p24的微孔板上，用ELISA方法檢測(cè)各克隆產(chǎn)生的重組噬菌體；G.scFv進(jìn)行鑒定、測(cè)序?qū)Y選出的陽(yáng)性克隆用起始引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Sfi I、Not I雙酶切鑒定；H.確證后的陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒后用雙脫氧末端終止法測(cè)序。根據(jù)載體設(shè)計(jì)測(cè)序引物如下F1 5’-AACGTGAAAAAATTATTATTC-3’R1 5’-GAGTATGTCTTTTAAGTAAAT-3’實(shí)施例4HIV1單鏈抗體基因的表達(dá)及其純化(1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建A.同實(shí)施例1相同的方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，不同的是原來(lái)引物的Cla I和BstxI酶切位點(diǎn)替換為Nde I和Xhol I，質(zhì)粒替換為pET24b(見圖7)；(2)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)含重組質(zhì)粒pET24-scFv-p24的E.coliBL21(DE3)于37℃在平皿中長(zhǎng)出單斑后，轉(zhuǎn)入2ml左右Amp的LB中，37℃，200rpm/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用1μmol/ml IPTG，37℃誘導(dǎo)2h左右，離心收集菌體，超聲波破碎菌體，再離心后的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳；SDS-PAGE電泳分析等常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)詳見金冬雁等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社相關(guān)章節(jié)。
(3)scFv-p24蛋白的復(fù)性A.包涵體的分離與洗滌將細(xì)菌沉淀懸浮于PBS中，超聲破碎。4℃離心9000rpm/min、15min，棄上清，先以含1M尿素的包涵體洗滌液洗滌沉淀3次，再以含2M尿素的洗滌液洗滌；B.包涵體的變性溶解于已洗滌的包涵體沉淀中加入1ml 8M尿素，混勻，37℃水浴作用1h，測(cè)定蛋白濃度；C.純化蛋白的復(fù)性用稀釋液(1.7mM NaH2PO4，18mM Na2HPO4，0.5M NaCl)將蛋白連續(xù)稀釋后，將溶液裝入透析袋中，于4℃對(duì)透析液I(0.5M尿素，20mMTris.Cl，pH8.0，1mm EDTA)透析36h后，再對(duì)透析液II(20mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，2mM GSH，0.2mM GSSG)透析36h；D.濃縮將透析袋包埋在PEG20000中，于4℃冰箱進(jìn)行濃縮，分別于濃縮至初始體積的2/3、1/2、1/3、1/6及1/12時(shí)收集樣品，4℃離心10000rpm/min，5min，取上清50μl于BeckmanDU600上測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的濃度，SDS-PAGE分析；(4)scFv-p24蛋白的純化(見圖8)A.取Ni2+-NTA瓊脂糖裝柱，用Binding buffer(5mmol/L imidazole，0.5mol/L NaCl，1mmol/L PMSF，20mmol/L Tris-Cl，pH8.0)平衡。透析液緩慢過(guò)柱后，用Binding buffer洗柱，再用6ml的Wash buffer(0.5mol/L NaCl，60mmol/L imidazole，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)洗柱，最后用Elute Buffer(1mol/L imidazole，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9)洗脫蛋白；B.把含目的蛋白的洗脫液上樣于已用20mmol/L NaH2PO4-Cit緩沖液(pH 6.8)平衡的Sephadex G 100，繼續(xù)以NaH2PO4-Cit緩沖液(pH 6.8)緩沖液洗脫，收集峰蛋白，凍干得到純品，SDS-PAGE電泳鑒定；C.ELISA測(cè)定蛋白含量具體步驟參照沈關(guān)新、同汝麟等編著的《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》湖北科學(xué)技術(shù)出版社，第121-123頁(yè)。
實(shí)施例5用于檢測(cè)血清中HIV1/2抗原的膠體金快速檢測(cè)試劑的制備一種檢測(cè)HIV1/2抗原的快速診斷試劑(見圖9)，HIV1/2抗原快速檢測(cè)板由上蓋、底板和試紙條組成，試紙條夾于上蓋和底板之間；按樣品流動(dòng)的順序分為四個(gè)區(qū)域，交聯(lián)區(qū)、分析區(qū)、對(duì)照區(qū)、廢液收集區(qū)；上蓋上有樣品加入孔和反應(yīng)觀察孔，底板上留有用于固定試紙條的擋板；試紙條以硝酸纖維膜為基體，在其一端，位于加樣孔下固定吸收海綿，其上方有兩層薄膜，上面的為晶體吸附膜，起到調(diào)節(jié)樣品pH值的作用，下面的為吸附scFv-p24和scFv-p32的薄膜；在硝酸纖維膜的中間分析區(qū)(反應(yīng)觀察孔區(qū))，先后點(diǎn)樣HIV1單鏈抗體的反應(yīng)線1，HIV2單鏈抗體的反應(yīng)線2；p24和p32抗原的控制線；試紙的另一端固定海綿作為廢液收集區(qū)。檢測(cè)樣品時(shí)控制線呈現(xiàn)紅色為有效，反應(yīng)線1和反應(yīng)線2任何一條或兩條呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間在五分鐘內(nèi)。
(1)膠體金顆粒的制備應(yīng)用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，100ml雙蒸水加熱至沸騰，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的HAuCl 41ml，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％檸檬酸三鈉1.5ml(膠體金顆粒直徑25nm)，加熱30min，至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，冷卻，4℃避光保存；
(2)膠體金最低蛋白穩(wěn)定量的確定采用分光光度計(jì)測(cè)定法，利用比色法確定金標(biāo)記最適pH為8.2，用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金pH值為8.2，p24或p32單鏈抗體溶液高速離心除去聚集物，抗體用0.01的PBS緩沖液(pH7.8)稀釋至0.2mg/ml，稀釋后的抗體與其他試劑按下表操作，加入試劑后，靜止2h，含蛋白質(zhì)量小的管呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白質(zhì)達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管中的溶液則保持紅色不變。使紅色保持不變的蛋白含量即為蛋白質(zhì)最適保護(hù)量，在此基礎(chǔ)上增加20％為穩(wěn)定膠體金的蛋白質(zhì)的實(shí)際用量，實(shí)驗(yàn)確定蛋白用量為18μg/ml膠體金；表1膠體金最低蛋白穩(wěn)定量加樣表

(3)免疫膠體金的標(biāo)記用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的K2CO3調(diào)節(jié)100ml膠體金溶液pH為8.2，p24單鏈抗體用0.01mol/L的PBS緩沖液稀釋至0.2mg/ml，10000rpm/min，4℃離心1h；取上清，加入相應(yīng)體積的穩(wěn)定膠體金的最小蛋白質(zhì)量(18μg/ml膠體金)，快速攪拌下將抗體逐滴加入膠體金中，放置10min；(4)膠體金標(biāo)記蛋白純化先用低速離心，棄去沉淀；將上清以30000g、4℃下離心60min，棄上清。取沉淀物重懸于0.02M PBS(pH8.2內(nèi)含1％BSA或聚乙二醇)，高速離心洗三次，最后將膠體金標(biāo)記物懸于原液體積1/10的TBS中，電鏡檢查后，加入0.05％疊氮鈉防腐，保存于4℃冰箱中備用；(5)免疫層析測(cè)試條的制備樣品墊、結(jié)合墊(加入標(biāo)記好的膠體金，干燥)、硝酸纖維素膜(檢測(cè)帶6mg/ml，1μl/cm；質(zhì)控帶2mg/ml，1μl/cm)、吸水墊依次貼上帶有粘合劑的底襯卡，切成0.4cm的條，干燥室溫貯存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例6HIV1/2抗原檢測(cè)試劑方法學(xué)評(píng)價(jià)包括對(duì)HIV1/2抗原檢測(cè)試劑的靈敏性、特異性的檢測(cè)及其方法對(duì)比試驗(yàn)(1)HIV1/2抗原檢測(cè)試劑靈敏性檢測(cè)用購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)p24和p32蛋白配成標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入質(zhì)控血清中配成已知p24和p32濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清，每個(gè)濃度檢測(cè)三次，結(jié)果相同見下表表2HIV1抗原靈敏度的測(cè)試

表3HIV2抗原靈敏度的測(cè)試

(2)干擾試驗(yàn)A.向含0.8pg/mL p24和1pg/mL p32抗原的質(zhì)控血清加抗壞血酸，分別至100μmol/L，300μmol/L，500μmol/L，HIV1/2檢測(cè)試劑的HIV1和HIV2檢測(cè)線均顯示為陽(yáng)性；B.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的質(zhì)控血清加抗膽紅素分別至70μmol/L，140μmol/L，280μmol/L，560μmol/L HIV1/2檢測(cè)試劑的HIV1和HIV2檢測(cè)線均顯示為陽(yáng)性；C.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的質(zhì)控血清加血紅蛋白，分別至2.5g/L，5g/L，10g/L，20g/L，HIV1/2檢測(cè)試劑的HIV1和HIV2檢測(cè)線均顯示為陽(yáng)性；D.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的質(zhì)控血清加葡萄糖，分別至20mmol/L，100mmol/L，200mmol/L，HIV1/2檢測(cè)試劑的HIV1和HIV2檢測(cè)線均顯示為陽(yáng)性；E.向含0.8pg/ml p24和1pg/ml p32抗原的質(zhì)控血清分別加至終濃度為100g/L草酸鉀，100g/L草酸鈉，1000μmol/L尿酸，1000μmol/L肌酐，HIV1/2檢測(cè)試劑的HIV1和HIV2檢測(cè)線均顯示為陽(yáng)性；以上干擾物濃度均超出人血清所能達(dá)到的最高限，結(jié)果表明常見的干擾物對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。
(3)方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)與Abbott公司p24抗原酶免疫測(cè)定(EIA)檢測(cè)試劑盒作方法對(duì)比試驗(yàn)表4Abbott公司HIV1抗原靈敏度的測(cè)試

重復(fù)三次結(jié)果相同，由此可知本試劑對(duì)HIV1抗原檢測(cè)的靈敏度0.8pg/ml要高于與Abbott公司p24抗原酶免疫測(cè)定(EIA)靈敏度1.0pg/ml。
序列表<110>王賢俊<120>抗HIV1/2抗原的單鏈抗體及其快速檢測(cè)試劑<160>3<210>1<211>726<212>DNA<213>逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬(Retroviridae，Lentivirus)<220>
<221>mat_pept ide<222>(1)…(726)<400>1atgggccagt gtgtgattct gcagcagtca ggggcagagc ttgtgaagcc agtggcctca 60gtcaagttgt ccacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatatgca ctgggtgagg 120cagaggcctg aacagatact ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatact 180gactatgacc cgaagttcca gggcaaggca ctataacagc agacacatcc tccaacacag 240cctacctgca gctcagcagc ctgcatctgg gacatggccg tctattactg tggtaggtac 300gactatgcta tggactactg gggccaaggg accacggtca ccttcgtctc ctcaggtgga360ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg acatcgagct cactcagacc420tctccaggag agcgcaggga tttgccaggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 480ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 540tatggaaaaa cgccagcaac gcggctttac ggttggcctt cgctgggtgg ccttttgctc 600acatgttctt tctttcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 660gagctgattc cgctcgccgc agccgaacga ccgcggagag cggccgcaaa agaagcgcgg 720atcgcg726
<210>2<213>逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒屬(Retroviridae，Lentivirus)<211>726<212>DNA<220>
<221>mat_pept ide<222>(1)…(726)<400>2atgatagcac agtgtgtgat tctgcagcag tcaggggagc ttgtgaagcc agtggcctca 60tttttgaagt ccacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatatgca ctgggtgagg 120cagaggcctg aacagatact ggagtggatt ggaaggattg atcctgcgaa tggtaatact 180gactatgacc cgaagttcca gggcaaggca cagctataac agacacatcc tccaacacag 240cctacctgca gctcagcagc ctgcatctgg gacactgccg tctattactg tggtaggtac 300gactatgcta tggactactg gggccaaggg atgacggtca actacgtctc ctcaggaggt360ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgctcgagga cactcagacc 420tctccaggag agcgcaggga ttttccaggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 480ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcgccatc 540tatggaaaaa cgccagcaac gcggctttct tacggttggc cttttggtgg ccttgcgctc 600acatgttctt tcctgcgttc tgccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 660gagctgattc cgctcgccgc agccgaacga ccgcggagag cggccgcaaa agaagcgatc 720cggttg 72權(quán)利要求
1.一種抗HIV1特異性核衣殼蛋白的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體具有如下所示的基因序列ATGGGCCAGT GTGTGATTCT GCAGCAGTCA GGGGCAGAGC TTGTGAAGCC AGTGGCCTCAGTCAAGTTGT CCACAGCTTC TGGCTTCAAC ATTAAAGACA CCTATATGCA CTGGGTGAGGCAGAGGCCTG AACAGATACT GGAGTGGATT GGAAGGATTG ATCCTGCGAA TGGTAATACTGACTATGACC CGAAGTTCCA GGGCAAGGCA CTATAACAGC AGACACATCC TCCAACACAGCCTACCTGCA GCTCAGCAGC CTGCATCTGG GACATGGCCG TCTATTACTG TGGTAGGTACGACTATGCTA TGGACTACTG GGGCCAAGGG ACCACGGTCA CCTTCGTCTC CTCAGGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGG ACATCGAGCT CACTCAGACCTCTCCAGGAG AGCGCAGGGA TTTGCCAGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCCTATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCTTTAC GGTTGGCCTT CGCTGGGTGG CCTTTTGCTCACATGTTCTT TCTTTCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGTGAGCTGATTC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGCGGAGAG CGGCCGCAAA AGAAGCGCGGATCGCG共計(jì)726個(gè)核苷酸，劃線部分為接頭序列共45個(gè)核苷酸，接頭前為重鏈序列共354個(gè)核苷酸，接頭后為輕鏈序列共327個(gè)核苷酸。
2.一種抗HIV2特異性核衣殼蛋白的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體具有如下所示的基因序列ATGATAGCAC AGTGTGTGAT TCTGCAGCAG TCAGGGGAGC TTGTGAAGCC AGTGGCCTCATTTTTGAAGT CCACAGCTTC TGGCTTCAAC ATTAAAGACA CCTATATGCA CTGGGTGAGGCAGAGGCCTG AACAGATACT GGAGTGGATT GGAAGGATTG ATCCTGCGAA TGGTAATACTGACTATGACC CGAAGTTCCA GGGCAAGGCA CAGCTATAAC AGACACATCC TCCAACACAGCCTACCTGCA GCTCAGCAGC CTGCATCTGG GACACTGCCG TCTATTACTG TGGTAGGTACGACTATGCTA TGGACTACTG GGGCCAAGGG ATGACGGTCA ACTACGTCTC CTCAGGAGGTGGAGGCGGTT CAGGCGGAGG TGGCTCTGGC GGTGGCGGAT CGCTCGAGGA CACTCAGACCTCTCCAGGAG AGCGCAGGGA TTTTCCAGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGCCATCTATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCTTTCT TACGGTTGGC CTTTTGGTGG CCTTGCGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTC TGCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGTGAGCTGATTC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGCGGAGAG CGGCCGCAAA AGAAGCGATCCGGTTG共計(jì)726個(gè)核苷酸，劃線部分為接頭序列共45個(gè)核苷酸，接頭前為重鏈序列共357個(gè)核苷酸，接頭后為輕鏈序列共324個(gè)核苷酸。
3.一種用于檢測(cè)血清中HIV1/2抗原的膠體金快速檢測(cè)試劑，其特征在于該試劑含有權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的單鏈抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗HIV1/2抗原的單鏈抗體及利用該單鏈抗體的快速檢測(cè)試劑，該抗HIV1/2抗原的單鏈抗體具有特定的基因序列，利用本發(fā)明抗HIV1/2抗原的單鏈抗體可以制作用于檢測(cè)血清中HIV1/2抗原的膠體金快速檢測(cè)試劑，從而提高檢測(cè)試劑的特異性、增強(qiáng)抗干擾能力、縮短“窗口期”，便于快速檢測(cè)試劑的推廣應(yīng)用，因此可以有效解決HIV攜帶者漏檢率高的難題。
文檔編號(hào)C07K16/42GK1803841SQ20051011081
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月24日
發(fā)明者王賢俊 申請(qǐng)人:王賢俊