專利名稱：一種植物dreb轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域中一種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一個來源于大米草(Spartina anglica)的與耐逆性相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。闡明植物對逆境的反應(yīng)機制，將為植物抗逆的分子育種提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
植物的許多基因已被證明受非生物逆境脅迫的誘導(dǎo)。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達調(diào)控中起著重要作用。
轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。
目前已知在植物中與非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有具有EREBP(乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element binding protein)/AP2(APETALA2)結(jié)構(gòu)域的DREB類轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族等等。
Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在對逆境應(yīng)答基因rd29A基因的啟動子區(qū)域的研究中，發(fā)現(xiàn)了一個逆境脅迫應(yīng)答順勢作用元件，即脫水應(yīng)答元件(DRE，dehydration-responsive element)。此后，發(fā)現(xiàn)許多逆境應(yīng)答基因啟動子區(qū)域含有DRE元件。Liu等人首次利用酵母單雜交系統(tǒng)，從擬南芥的cDNA表達文庫中克隆到二種編碼與DRE元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DREB，dehydration-responsive element binding protein)cDNA，分別命名為DREB1A，DREB2A。它們在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域(EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域)。這類含有EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，與逆境信號傳遞有關(guān)。劉強等認為，一個DREB基因可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達。Kasuga等的研究證實，導(dǎo)入到擬南芥的DREB1A基因可以同時促進與逆境脅迫耐性有關(guān)的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表達，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性大大增強。同樣，低溫耐性轉(zhuǎn)錄因子CBF1(dreb1b)的轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力有顯著提高。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的綜合抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的植物DREB轉(zhuǎn)錄因子，名稱為DMY-DREB，其來源于大米草，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列1由223個氨基酸殘基組成。自序列1的氨基端第53位至第111位氨基酸殘基是AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物DREB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(DMY-DREB)也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由669個脫氧核苷酸組成，自5′第1位至669位脫氧核苷酸為編碼序列。
含有本發(fā)明基因的表達載體、細胞系、宿主菌及表達盒均屬于本發(fā)明的保護范圍。
利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到含有DMY-DREB的表達載體，如pC2300Prd29A-dmydrebA(物理圖譜如圖1所示)。
所述表達盒包括植物啟動子、DMY-DREB基因和終止子。
所述植物啟動子可為組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子。
本發(fā)明的DMY-DREB基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，其中，單子葉植物可為草坪草、小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米等，雙子葉植物可為馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油料種子、甜菜或向日葵等。
攜帶有DMY-DREB基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株。
實驗表明，本發(fā)明的DMY-DREB蛋白及其編碼基因能增強植物對逆境，特別是冷脅迫的耐性。該基因?qū)V泛用于培育耐逆轉(zhuǎn)基因植物，具有深遠的理論意義及廣泛的實踐意義。


圖1為DMY-DREB植物表達載體物理圖譜圖2為DMY-DREB轉(zhuǎn)基因煙草的PCR驗證照片圖3為DMY-DREB轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒實驗結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、DMY-DREB及其編碼基因的獲得用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，F(xiàn)jellstrom RG，Elliott LF.，A rapidone-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses.NucleicAcids Res.1995.Jul 11；23(13)2569-70.)提取大米草基因組DNA，具體方法如下取大米草葉片，以液氮研磨，每1克的植物材料中加入5毫升經(jīng)68℃預(yù)熱的CTAB溶液(用前加10mM巰基乙醇)，60℃加熱30分鐘。然后加入等體積氯仿∶異戊醇，15000g離心15分鐘，取上清。在上清液中加入2/3倍體積的異丙醇，混勻，用注射針針尖將DNA絲攪出置于新管中，再加入75％乙醇，洗滌沉淀及離心管壁，然后將乙醇吸干，空氣烘干剩余的乙醇，加入TE溶解DNA。并于-20℃保存。以PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法擴增DMY-DREB基因DNA片段。在DREB類蛋白的同源區(qū)設(shè)計兼并引物，列如下F15′-ACCGC(T/C)GAGATGGC(G/A/C)GC(T/G)C-3′R1，5′-CC(A/G)AG(A/G)CGAGTC(A/C)G(G/C)GAA-3′25ul PCR反應(yīng)體系為1μg基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM引物F1和1μM引物R1，以及1個單位的Taq聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)以擴增DMY-DREB基因DNA片段94℃預(yù)變性5分鐘；再94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。將擴增得到的約90bpDNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用pGEM-Teasy vector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按該系統(tǒng)提供的方案克隆該片段，測序(三博遠志生物技術(shù)公司)。序列分析表明該序列與DREB類蛋白基因的保守區(qū)片段高度同源。根據(jù)該保守區(qū)段設(shè)計3’RACE的特異性引物。取1μg總RNA進行3’RACE。RACE程序按照寶生物工程(大連)有限公司提供的3’RACE試劑盒的說明書進行。3’RACE的5’端引物為GSP15‘-CGTGCCTCAACTTCGCGGACT-3’，3’端引物由試劑盒提供。PCR條件為先94℃5min；然后94℃30s→54℃30s→72℃30s，共30個循環(huán)；最后72℃10min。3’RACE產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，合成5‘RACE引物。取1μg總RNA進行5’RACE，RACE程序按照寶生物工程(大連)有限公司提供的5’RACE試劑盒的說明書進行。其中，5’RACE的5’磷酸化引物為5‘-CCCGACGAACCTCCC-3’，用于PCR擴增的引物分別為S15’-ATCCGCTCCGCTGTGCGTCTCG-3’，S25’-CCTCGACGGCCACATTGCTC-3’，A15‘-GGACTCGCCTCGGCTGCTCA-3’，A25‘-CAGAGCAATGTGGCCGTCGAG-3’。以5‘磷酸化引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以S1和A1為引物進行第一輪擴增，然后再用稀釋100倍的第一輪PCR產(chǎn)物作模板，以S2和A2為引物進行第二輪PCR擴增。其中，第一輪PCR反應(yīng)條件先94℃5min；然后94℃30s→56℃30s→72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃10min。第二輪PCR反應(yīng)條件先94℃預(yù)變性5min；然后94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃10min。
總RNA按照如下方法提取以液氮研碎-70℃保存的4℃冷預(yù)處理大米草葉片，每0.1g的葉片中加入1ml TRIZOL RNA提取液(鼎國生物技術(shù)公司)，按供應(yīng)商提供的方案進行總RNA的提取。將得到的RNA用DNase酶(Prmega，America)按供應(yīng)商提供的方案進行消化，以去除殘存的DNA。
所得5’-RACE和3’-RACE產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，合成引物，以1μg大米草葉片總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，克隆DMY-DREB的cDNA。合成的引物序列如下F25′-GTCGACATGGACATCGGCGCGTTC-3′；R25′-TCAGTAGCTCCAGAGCCTGA-3′。25ulPCR反應(yīng)體系含有1μg cDNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM引物F2和1μM引物R2，以及1個單位的Pfu酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)以擴增DMY-DREB的cDNA94℃預(yù)變性5分鐘；再94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。
將擴增得到的片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，并插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V位點，得到質(zhì)粒pBS::dmydreb。測序(三博遠志生物技術(shù)公司)，測序結(jié)果表明該片段大小為669bp，具有序列表中序列2的核苷酸序列；序列分析表明該cDNA的自5′第1位至669位脫氧核苷酸編碼具有序列1的氨基酸殘基序列的DMY-DREB。自序列2的5’端第157到第333位核苷酸為AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列，編碼59個氨基酸殘基；DMY-DREB的自序列1的氨基端第53位至第111位氨基酸殘基是AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域。
實施例2、DMY-DREB植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的耐逆性實驗以用CTAB法提取擬南芥基因組DNA為模板，用Rd29A-S和Rd29A-A PCR方法擴增擬南芥rd29A基因的啟動子序列。其中，Rd29A-S5’-TCTAGACGCATGATTTGATGGAGGAG-3’，Rd29A-A5’-TCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAA-3’。25ul PCR反應(yīng)體系含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Rd29A-S和1μM Rd29A-A，1U的Pfu酶(上海申友生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃5分鐘；再94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。將擴增得到的約944bp長的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript IIKS(-)(STRATAGENE公司)的EcoRV位點，測序(三博遠志生物技術(shù)公司)，測序結(jié)果表明該片段含有擬南芥rd29A基因的啟動子的全長序列，將含有該片段的質(zhì)粒命名為pBS::Prd29A。
以用CTAB法提取擬南芥基因組DNA為模板，用OS Trps16g2-S和OS Trps16g2-APCR方法擴增水稻核糖體小亞基s16基因的3’末端序列。其中，OS Trps16g2-S5’-ATCGATTCGGAGCGGTGTTCTCT-3’，OS Trps16g2-A5’-GATGGGCATCTGAACTGAGAAT-3’。25ul PCR反應(yīng)體系含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM OS Trps16g2-S和1μM OS Trps16g2-A，1U的Pfu酶(上海申友生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃5分鐘；再94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。將擴增得到的約764bp長的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescript II II KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoR V位點，測序(三博遠志生物技術(shù)公司)，測序結(jié)果表明該片段含有水稻核糖體小亞基s16基因的3’末端序列，將含有該片段的質(zhì)粒命名為pBS::Trps16g2。
將質(zhì)粒pBS::Trps16g2用Cla I酶切下含水稻核糖體小亞基s16基因的3’末端序列片段插入pBS::dmydreb的Cla I位點，得到質(zhì)粒pBS::dmydrebA-Trps16g2。
將質(zhì)粒pBS::dmydrebA-Trps16g2用Sal I酶切下含dmydrebA-Trps16g2序列片段插入pBS::Prd29A的Xho I位點，得到質(zhì)粒pBS::Prd29A-dmydrebA-Trps16g2。
將用XbaI酶切質(zhì)粒pBS::Prd29A-dmydrebA-Trps16g2得到的dmydrebA表達盒，克隆到pCAMBIA2300(購自CAMBIA公司)的Xba I酶識別位點之間，得到DMY-DREB的植物表達載體pC2300::Prd29A-dmydrebA，pC2300::Prd29A-dmydrebA質(zhì)粒圖如圖1所示，在此載體中DMY-DREB基因(dmydrebA)受rd29A啟動子的調(diào)控。將此載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到含有pC2300::Prd29A-dmydrebA的農(nóng)桿菌菌株，命名為TpC2300::Prd29A-dmydrebA，將質(zhì)粒pCAMBIA2300轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到含有pCAMBIA2300空載體的菌株TpCAMBIA2300。用無菌刀片將煙草無菌苗葉片切成四邊長約1cm的葉盤，分別在O.D.值為1的TpC2300::Prd29A-dmydrebA和TpCAMBIA2300(轉(zhuǎn)空載體對照)菌液中浸泡10分鐘，轉(zhuǎn)接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH5.2)，于25℃暗培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、羧芐青霉素250mg/L、蔗糖30g/L，pH5.8)中光照培養(yǎng)三天，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸0.1mg/L、羧芐青霉素250mg/L、卡那霉素75mg/L、蔗糖30g/L，pH5.8)；繼續(xù)培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、羧芐青霉素250mg/L、卡那霉素75mg/L、蔗糖30g/L，pH5.8)。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2-3cm時，用解剖刀將再生芽切下，并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH5.8。)中培養(yǎng)20天，共得到15棵轉(zhuǎn)基因植株和10株轉(zhuǎn)空載體植株。
用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，F(xiàn)jellstrom RG，Elliott LF.，A rapidone-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses.NucleicAcids Res.1995 Jul 11；23(13)2569-70.)提取轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA和pCAMBIA2300煙草基因組DNA，以100ng提取的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)。以實施例1中的引物F2和R2為引物，25ul PCR反應(yīng)體系含有100ng基因組DNA、1.5mMMgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM F2和1μMR2，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃5分鐘；再94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA煙草擴增產(chǎn)物在預(yù)計的669bp處有清晰的條帶(箭頭示)，而轉(zhuǎn)pCAMBIA2300煙草(空載體對照)無PCR產(chǎn)物條帶。圖2中，泳道1為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300煙草的PCR擴增產(chǎn)物；泳道2為pC2300::Prd29A-dmydrebA的PCR擴增產(chǎn)物；泳道3為轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA煙草的PCR擴增產(chǎn)物；泳道M為1kbDNA分子量標準。
將在生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH5.8。)中培養(yǎng)20天的轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA煙草和轉(zhuǎn)pCAMBIA2300(空載體對照)煙草分別轉(zhuǎn)入4℃冷處理12小時后，置于-10℃放置2小時，取出在25℃條件下培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA煙草生長良好，而轉(zhuǎn)pCAMBIA2300對照煙草已死亡，如圖3所示，圖3中左側(cè)煙草為轉(zhuǎn)pC2300::Prd29A-dmydrebA煙草，右側(cè)為轉(zhuǎn)pCAMBIA2300煙草。
序列表<160>2<210>1<211>223<212>PRT<213>大米草(Spartina anglica)<400>1Met Asp Ile Gly Ala Phe Ser Ser Asp Tyr Ser Ser Gly Thr Pro Ser1 5 10 15Pro Val Gly Gly Asp Asp Gly Ser Ser Pro Ser Tyr Met Thr Val Ser20 25 30Ser Ala Pro Pro Lys Arg Arg Ala Gly Arg Thr Lys Phe Lys Glu Thr35 40 45Arg His Pro Val Tyr Lys Gly Val Arg Arg Arg Asn Pro Gly Arg Trp50 55 60Val Cys Glu Val Arg Glu Pro His Gly Lys Gln Arg Ile Trp Leu Gly65 70 75 80Thr Phe Glu Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala85 90 95Met Ala Leu Arg Gly Arg Gly Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Pro100 105 110Arg Leu Leu Arg Val Pro Pro Val Gly Ala Gly His Asp Glu Ile Arg115 120 125Arg Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Gln Phe Arg Pro Ala Pro Asp Gln130 135 140Ser Asn Val Ala Val Glu Glu Pro Val Ala Thr Leu Pro Asp Pro Phe145 150 155 160Ser Ser Glu Thr His Ser Gly Ala Asp His Arg Pro Tyr Cys Gly Met165 170 175Val Asp Asp Arg Phe Asp Leu Gly Met Gln Gly Tyr Leu Asp Met Ala
180 185 190Gln Gly Met Leu Ile Asp Pro Pro Pro Met Gly Gly Ser Ser Gly Asn195 200 205Gly Gly Asp Asp Asp Asp Gly Gly Glu Val Arg Leu Trp Ser Tyr210 215 220<210>2<211>669<212>DNA<213>大米草(Spartina anglica)<400>2atggacatcg gcgcgttcag cagcgactac tcctcgggca cgccgtcccc ggtcggcggc60gacgatggct cctccccctc ctacatgacg gtgtcgtcgg cgccgcccaa gcggcgcgcc120ggccggacca agttcaagga gacgcggcac ccggtgtaca agggcgtgcg ccggcgtaac180cctgggcggt gggtctgcga ggtgcgggag ccgcacggca agcagcgaat ttggctcggg240acattcgaga ccgccgagat ggcggcgcgc gcgcatgacg tcgccgcgat ggcgctccga300gggcgcggcg cgtgcctcaa cttcgcggac tcgcctcggc tgctcagggt cccgcccgtg360ggcgcagggc acgacgagat tcgcagggcc gcggccgagg cggccgagca gttccgcccc420gcgcccgatc agagcaatgt ggccgtcgag gagccggtcg cgacactacc ggacccgttt480tctagcgaga cgcacagcgg agcggatcac cgcccgtatt gcggcatggt agacgacagg540ttcgacttgg ggatgcaggg gtacctcgac atggcgcaag ggatgctcat tgacccgcca600ccgatgggag gttcgtcggg gaatggtggt gacgatgatg acggcggtga ggtcaggctc660tggagctac669
權(quán)利要求
1.一種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中的SEQID №1的氨基酸殘基序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的細胞系。
7.含有權(quán)利要求3或4所述基因的宿主菌。
8.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達盒。
9.權(quán)利要求1或2所述的植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因在培育耐逆性植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐逆性為耐寒性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該植物DREB轉(zhuǎn)錄因子是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因能增強植物對逆境的耐性，特別是增強對低溫脅迫的耐性。
文檔編號C07H21/00GK1775803SQ200510117730
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日
發(fā)明者陳蕾, 徐建勇 申請人:北京北方杰士生物科技有限責任公司