專利名稱：一種蛇毒多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及蛇毒多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
蛇毒是毒蛇蛇腺分泌的物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、止血、抑制血栓形成和抗腫瘤等藥理作用，并制成了一些蛇毒制劑應(yīng)用于臨床。但因?yàn)樯叨臼莿?dòng)物毒物中成分最復(fù)雜的一類，每一種蛇毒所含的活性成分，粗略估計(jì)至少有20種，主要包括各種毒素、酶以及活性多肽，大部分的活性組分直接進(jìn)入體內(nèi)都可能使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，例如心臟毒性、神經(jīng)毒性等，這些毒副作用是限制蛇毒制劑在臨床治療方面應(yīng)用的主要原因。
隨著生物化學(xué)、生物物理學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，對蛇毒的研究層次逐漸從粗毒水平向蛇毒組分分離純化及其功能研究的水平深入，研究熱點(diǎn)也逐漸從研究較為透徹的蛇毒對神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的作用方面轉(zhuǎn)為抗腫瘤作用及機(jī)制方面。目前，蛇毒中分離純化了多種具有抗腫瘤作用的組分，這些組分主要是一些細(xì)胞毒素、磷脂酶A2和解離素。
蝮蛇在我國分布廣泛，從東北到華南十四個(gè)省的地區(qū)都有蝮蛇的分布，蝮蛇毒的來源豐富，價(jià)格相對便宜。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國內(nèi)的學(xué)者只從蝮蛇毒中分離了一些神經(jīng)生長因子、具有抗血小板聚集的多肽，國外的學(xué)者也只是從蝮蛇毒中分離出了一種具有細(xì)胞毒作用的神經(jīng)毒素，而蝮蛇毒中抗腫瘤的高純度的有效成分暫時(shí)沒有得到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的蛇毒多肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的蛇毒多肽的制備方法。
本發(fā)明蛇毒多肽具有如下序列N-GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)上述式中字母為單字母符號(hào)的氨基酸序列縮寫，所代表的氨基酸殘基的定義如下S為絲氨酸、E為谷氨酸、N為天冬酰胺、D為天冬氨酸、P為脯氨酸、G為甘氨酸、C為半胱氨酸，端頭N表示氨基末端。
本發(fā)明蛇毒多肽，分子量為7480Da。
本發(fā)明所述的蛇毒多肽的制備方法，系將蝮蛇粗毒在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行分離純化。
本發(fā)明所述的蛇毒多肽的制備方法，具體包括蝮蛇粗毒充分溶于水，離心取上清液，在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行分離純化，層析色譜條件是流動(dòng)相為0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，在梯度為0-80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為120min；檢測波長為210nm，分離溫度為20-28℃。
本發(fā)明所述的高效液相色譜C18反相制備柱是用5μm，孔徑為300的反相硅膠C18顆粒作為固定相充填劑制備得到。
為了更好的理解本發(fā)明，下面用本發(fā)明蛇毒多肽進(jìn)行體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果用來說明蛇毒多肽在腫瘤治療藥物領(lǐng)域中的用途。
采用人肝癌細(xì)胞株Hep3B為模型進(jìn)行蛇毒多肽的抗腫瘤活性檢測。具體方法如下所述。
實(shí)驗(yàn)方法1)Hep3B細(xì)胞培養(yǎng)生長至指數(shù)生長期時(shí)，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g離心3min，細(xì)胞沉淀以10％FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至5×104/ml，96孔培養(yǎng)板每孔接種200μl，置于37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
2)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔中加入10μl蛇毒多肽，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3)細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)后，每孔加入10μl的CCK-8(cell counting kit 8)試劑，37℃，5％CO2及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
4)用酶標(biāo)儀測定在波長為450nm處的吸光度值(0D)，600nm作為參考波長，細(xì)胞生長抑制率按公式抑制率＝(對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對照孔OD值)×100％計(jì)算。
結(jié)果見表1，形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1、圖2、圖3。
表1 蛇毒多肽對Hep3B細(xì)胞增殖的影響

注1、2、3、4、5為復(fù)孔。
正常培養(yǎng)Hep3B細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞密度均勻分布，細(xì)胞呈梭形生長良好。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入蛇毒多肽一小時(shí)后，細(xì)胞與細(xì)胞之間開始出現(xiàn)空洞，隨著時(shí)間延長，空洞變大，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞出現(xiàn)漂浮，至24小時(shí)以后，全部細(xì)胞漂浮。
本發(fā)明蛇毒多肽具有良好的抗腫瘤活性，小劑量就顯示出較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長的特性。本發(fā)明所述的制備蛇毒多肽所采用的一步分離法可以在上樣量少、分離時(shí)間短、分離步驟少的情況下，得到高純度的微量蛋白組分。


圖1無蛇毒多肽處理的對照Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖2蛇毒多肽處理6小時(shí)后引起的Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖3蛇毒多肽處理24小時(shí)后引起的Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖。
圖4蝮蛇粗毒的高效液相分離圖譜，蝮蛇粗毒經(jīng)C18反相高效液相色譜層析和梯度洗脫，箭頭1所指為蛇毒多肽。
圖5蛇毒多肽純度檢測的高效液相圖，在洗脫時(shí)間為21min，蛇毒多肽為單一對稱峰，純度為95.67％。
圖6蛇毒多肽質(zhì)譜圖。
圖7蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測定圖，其中從上至下，左側(cè)是空白對照1，標(biāo)準(zhǔn)1，殘基1G(Gly)；右側(cè)是殘基2E(Glu)，殘基3E(Glu)，殘基4C(Cys)。
圖8蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測定圖，其中從上至下，左側(cè)是殘基5D(Asp)，殘基6C(Cys)，殘基7G(Gly)；右側(cè)是殘基8S(Ser)，殘基9P(Pro)，殘基10E(Glu)。
圖9蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列測定圖，其中從上至下，左側(cè)是殘基11N(Asn)，殘基12P(Pro)，殘基13C(Cys)；右側(cè)是殘基14C(Cys)，殘基15D(Asp)。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的實(shí)施例，參考實(shí)施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，而沒有任何限制作用。
實(shí)施例11、分離純化1)蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超純水，4℃，5000rpm×5min離心，取上清進(jìn)樣。
2)用直徑為5μm，孔徑為300的反相硅膠C18顆粒作為固定相充填劑，制成高效液相色譜C18反相制備柱(20×300mm)，以0.1％三氟乙酸+乙腈為流動(dòng)相，流速為7ml/min，檢測波長為210nm，分離溫度為20℃，在HPLC層析系統(tǒng)上，在0-80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為120min。
4)自動(dòng)收集器根據(jù)檢測器的吸光度值按峰收集，收集后樣品在冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，凍干后在-20℃保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)果如圖4。
2、檢測純度分離得到的組分用直徑5μm，孔徑300的C18反相分析色譜柱(4.6×250mm)對其純度進(jìn)行檢測，流動(dòng)相0.1％三氟乙酸(TFA)+乙腈；流速1ml/min；檢測波長210nm，在0-40％的范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間是40min。純度檢測結(jié)果如圖4、圖5。
3、分子量測定采用電噴霧質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrum，ESI-MS)測定抗腫瘤蛇毒多肽的分子量。分子量為7480Da。分子量如圖6。
4、采用EDMAN降解法來測定抗腫瘤蛇毒多肽N端部份氨基酸序列?？鼓[瘤蛇毒多肽N-端15個(gè)氨基酸序列依次為GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)。氨基酸序列測定結(jié)果如圖7、圖8、圖9所示。
實(shí)施例21)蝮蛇粗毒40mg充分溶于500μl超純水，4℃，6000rpm×5min離心，取上清進(jìn)樣。
2)用直徑為5μm，孔徑為300的反相硅膠C18顆粒作為固定相充填劑，制成高效液相色譜C18反相制備柱(20×300mm)。色譜流動(dòng)相為0.1％三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，檢測波長為210nm，分離溫度為25℃，在HPLC層析系統(tǒng)上，以0.1％三氟乙酸+乙腈為流動(dòng)相，在0-80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為120min。。
3)自動(dòng)收集器根據(jù)檢測器的吸光度值按峰收集，收集后樣品在冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，凍干后在-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例31)尖吻蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超純水，4℃，5000rpm×5min離心，去除不溶性物質(zhì)，取上清液備用。
2)用直徑為5μm，孔徑為300的反相硅膠C18顆粒作為固定相充填劑，制成高效液相色譜C18反相制備柱(20×300mm)。色譜流動(dòng)相為0.1％三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，檢測波長為210nm，在HPLC層析系統(tǒng)上，以0.1％三氟乙酸+乙腈為流動(dòng)相，在0-80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為120min，分離溫度為28℃。
3)自動(dòng)收集器根據(jù)檢測器的吸光度值按峰收集，收集后樣品在冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，凍干后在-20℃保存2備用。
權(quán)利要求
1.一種蛇毒多肽，其特征在于具有如下序列N-GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)，式中S為絲氨酸、E為谷氨酸、N為天冬酰胺、D為天冬氨酸、P為脯氨酸、G為甘氨酸、C為半胱氨酸，端頭N表示氨基末端。
2.權(quán)利要求1所述的蛇毒多肽，其特征是分子量為7480Da。
3.權(quán)利要求1或2所述的蛇毒多肽制備方法，將蝮蛇粗毒在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行分離純化，其中層析色譜條件是流動(dòng)相0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，在梯度為0-80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間120min；檢測波長210nm，分離溫度20～28℃。
全文摘要
本發(fā)明蛇毒多肽及其制備方法屬于生化與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明蛇毒多肽具有式(I)所示序列，分子量是7480Da。其制備方法是用蝮蛇粗毒在HPLC層析系統(tǒng)上用C18反相柱進(jìn)行分離純化，色譜條件是流動(dòng)相0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速為7ml/min，在梯度0～80％范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫時(shí)間為0～120min；檢測波長為210nm，分離溫度20～28℃。本發(fā)明蛇毒多肽具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，其制備方法簡單方便。N－GEECDCGSPENPCCD (I)。
文檔編號(hào)C07K1/16GK1800208SQ20051012087
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者吳少瑜, 徐偉, 李志琴, 張嘉杰, 萬山河, 吳曙光 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)