專利名稱：一種重組蛋白的高效變復性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白的高效變復性的方法，對重組表達而不具有生物活性的蛋白質(zhì)進行高效穩(wěn)定的變復性。整個蛋白質(zhì)變復性時間短，經(jīng)本發(fā)明復性后的蛋白性質(zhì)穩(wěn)定并具有生理活性。此外，經(jīng)本發(fā)明復性的重組蛋白可直接進行下游的層析純化而無須更換條件，并適合于工業(yè)化放大生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
原核表達系統(tǒng)作為一種成熟的蛋白表達系統(tǒng)，因表達量高，操作簡便和成本較低一直以來都受到工業(yè)化生產(chǎn)的青睞。因此借助大腸桿菌系統(tǒng)進行基因工程重組表達具有成本低，大規(guī)模發(fā)酵容易等優(yōu)點，但重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中基本以包涵體形式表達，表達產(chǎn)物不具有生物活性，往往需要進行煩瑣的蛋白質(zhì)變復性實驗才能獲得部分活性。
包涵體是蛋白質(zhì)凝集形成的致密顆粒，主要是由于重組蛋白高水平表達所致。因為蛋白質(zhì)合成速度過快，以至于在蛋白質(zhì)折疊過程中，沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對；分子內(nèi)部的疏水區(qū)間暴露于溶液中，使多肽的疏水區(qū)之間相互作用及碰撞，形成不正確的折疊而聚集。但對于生物制藥工業(yè)來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質(zhì)，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質(zhì)的破壞，并且還便于進行下游分離和純化。
該類含有二硫鍵的蛋白包括組織型纖溶酶原激活劑和人腦利鈉肽。組織型纖溶酶原激活劑或者變體蛋白含有多對二硫鍵及不規(guī)則的疏水區(qū)域(重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因的克隆及工程菌的構(gòu)建與鑒定，陳于紅等人，2004)；人腦利鈉肽為具有32個氨基酸的多肽，含有一對二硫鍵(N-末端原腦利鈉肽對心血管疾病預測價值的研究進展，曹莉，2004)。兩者經(jīng)原核表達后形成的包涵體蛋白變復性過程復雜；復性后蛋白質(zhì)不穩(wěn)定且容易發(fā)生沉淀；整個復性周期較長而容易喪失活性。因此，本發(fā)明提供一種重組蛋白的高效變復性的方法，對于利用基因工程技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)高效穩(wěn)定的基因藥物，提高療效、安全性以及降低生產(chǎn)成本均有重要意義。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明所提供的一種重組蛋白的高效變復性的方法，其特征在于整個蛋白質(zhì)復性階段使用了含有不同pH值與不同濃度和比例的還原劑/氧化劑所組成的復合動態(tài)緩沖液。該法不僅適用于大腸桿菌表達形成的包涵體或其它異體蛋白，或者是非大腸桿菌表達而失去生物活性的，又或者與生物活性有差異的表達蛋白；還適用于含有二硫鍵的組織型纖溶酶原激活劑及其變體衍生物和人腦利鈉肽及其變體衍生物。通過該法進行蛋白質(zhì)變復性，復性后重組蛋白具有性質(zhì)穩(wěn)定且純度高，得率較高以及明顯的生理活性等特點，適合于工業(yè)化大規(guī)模高效生產(chǎn)的應用。
目前有的復性蛋白的專利主要采用了柱上復性的手段(CN 1410435A，CN1077715A，CN 1508150A)，由于局限于純化填料空間大小以及洗脫條件等因素，必然對于蛋白充分復性的效果有所影響，因此對于其工業(yè)化的大規(guī)模應用是具有實際困難的。相對于專利(CN 1556206A)，我們所復性的蛋白為未經(jīng)添加任何人工純化位點的，因此無須使用額外的蛋白酶進行切割而影響成本，而且我們所復性后的蛋白能夠直接進行親和層析和凝膠過濾層析，直接達到生產(chǎn)的需要，因此具有更為明顯的優(yōu)勢。
本發(fā)明首先將誘導表達的重組蛋白充分破壁并對包涵體蛋白進行清洗和分離，以除去脂類和膜蛋白，避免包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解。然后將洗滌后的包涵體蛋白溶解于pH值為10.0以上的含有尿素、甘氨酸和一定濃度與比例的氧化/還原劑的變性緩沖液中，從而打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展；并使分離的包涵體中含有的一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵全部打開。
將變性完全的重組蛋白稀釋注入含有一定濃度與比例的L-Arg，表面活性劑Tween 80和氧化/還原劑GSSH/GSH的復性緩沖液中進行復性。復性過程中采用低溫和磁力攪拌，分批加入變性蛋白，濃度控制在0.1~1mg/ml，使變性蛋白在復性液中始終處于低濃度狀態(tài)，從而避免形成絮狀沉淀。使用表面活性劑Tween 80可促進蛋白質(zhì)復性并防止絮集；使用L-Arg可使不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，并促使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率；使用氧化/還原劑GSSH/GSH可促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。
開始復性時，加入復性緩沖液將pH值調(diào)至9.5左右，防止自由硫醇的質(zhì)子化作用而影響正確配對的二硫鍵的形成。在復性過程中，將每一步的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值調(diào)低0.2~0.5；氧化劑濃度增加50~100％，還原劑濃度相應降低50％~100％，以致最終溶液的pH值接近中性或者該重組蛋白質(zhì)的生理值，同時復性過程中逐步降低還原劑的濃度并提高氧化劑的濃度，以至于其還原劑的終濃度為0~10mM；氧化劑的終濃度為1~100mM。
采用以上方法進行復性后的組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白未經(jīng)Lysine Resin和Sephadex G-25純化已具有90％的純度；而純化后可得到95％的純度。進行纖溶平板活性測定，可知重組蛋白具有約1M IU/10mg的溶栓活性。復性后蛋白長期保存于4℃下依然具有明顯的生理活性。綜上所述，本發(fā)明所提供的一種重組蛋白的高效變復性的方法具有以下特點變復性步驟簡單且容易操作；復性蛋白的回收率高并且性質(zhì)穩(wěn)定；復性后可獲得濃度與純度較高的活性蛋白；復性過程周期短；復性方法適宜于工業(yè)化放大。
具體而言，本發(fā)明提供了一種重組蛋白的高效變復性的方法，其特征在于不同的蛋白質(zhì)復性階段使用了含有不同pH值與不同濃度和比例的氧化/還原劑劑所組成的復合動態(tài)緩沖液，這種方法的步驟包括(1)使用pH值為10.0以上的變性緩沖液溶解重組蛋白，且緩沖液中含有2.0mM以上的還原劑；優(yōu)選該步驟使用pH值為10~11的變性緩沖液溶解重組蛋白，且緩沖液中含有2~22mM的還原劑，其中還原劑優(yōu)選是DTT和/或GSH；(2)加入復性緩沖液，使得到的溶液pH值比步驟(1)得到溶液的pH值降低了0.5~1.0，而且使氧化劑濃度比步驟(1)的氧化劑濃度增加100~300％，還原劑濃度比步驟(1)中的還原劑濃度降低50％~100％；(3)然后調(diào)節(jié)復性緩沖液，使得到的溶液pH值比上一步驟得到溶液的pH值降低了0.2~0.5，而且使氧化劑濃度比上一步驟的氧化劑濃度增加10~100％，還原劑濃度比上一步驟中的還原劑濃度降低50％~100％；(4)重復步驟(3)若干次，使每一步所得的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值降低0.2~0.5，而且使氧化劑濃度比上一步驟的氧化劑濃度增加50~100％，直至最終溶液的pH值接近中性或者該重組蛋白質(zhì)的生理值并使氧化劑的終濃度為1~100mM。當達到最終溶液的pH值接近中性或者該重組蛋白質(zhì)的生理值并使氧化劑的終濃度為1~100mM時，復性完成。優(yōu)選復性停止時最終溶液的pH為7.3~7.6，氧化劑的終濃度為1~10mM。
在以上方法中，優(yōu)選調(diào)節(jié)復性緩沖液的步驟中不加入還原劑，而僅僅通過依靠加入氧化劑的量來調(diào)節(jié)復性緩沖液中的氧化還原劑比例，而增加氧化劑的濃度并相應減少還原劑的濃度。
在以上方法中，優(yōu)選重組蛋白在每一步的不同緩沖液中都能靜止或者動態(tài)的放置60分鐘以上，優(yōu)選放置2~6小時。動態(tài)放置的方式有攪拌、震蕩等。
在以上方法中，優(yōu)選復性緩沖液的pH值與氧化還原劑的調(diào)節(jié)是可以在原有緩沖液中進行調(diào)節(jié)，也可以是使用重新配置的緩沖液。在原有緩沖液中進行調(diào)節(jié)即在上一步驟得到的溶液中加入額外的酸/堿和/或氧化還原劑來進行調(diào)解pH和氧化還原劑濃度。
在以上方法中，優(yōu)選復性緩沖液中的還原劑可以是β巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，二硫蘇糖醇(DTT)，或還原型谷胱甘肽(GSH)；復性緩沖液中的氧化劑可以是氧化型谷胱甘肽(GSSH)，過氧化氫(H2O2)或者氧氣O2。更優(yōu)選的氧化劑是氧化型谷胱甘肽(GSSH)；更優(yōu)選的還原劑是還原型谷胱甘肽(GSH)。復性緩沖液中可含有去污劑，尿素，SDS，Tris-Cl，甘氨酸，EDTA，L-精氨酸，和/或蛋白酶抑制劑。優(yōu)選的復性緩沖液含Tris-Cl，L-精氨酸，EDTA，Tween 80，GSSH和GSH。
在以上方法中，優(yōu)選復性緩沖液的pH值的動態(tài)變化與氧化還原劑的濃度的動態(tài)變化的速度是可調(diào)節(jié)的。動態(tài)變化的方式指復性緩沖液的pH值和氧化還原劑的濃度的調(diào)節(jié)時間是變化的，可以是2~6小時。
在以上方法中，優(yōu)選復性緩沖液的pH值與氧化還原劑的濃度是同時發(fā)生變化的。例如，在調(diào)節(jié)復性緩沖液時加入含有酸堿和氧化還原劑的溶液來進行調(diào)節(jié)pH和氧化還原劑濃度，優(yōu)選加入含有鹽酸和GSSH的溶液。
在以上方法中，優(yōu)選調(diào)節(jié)復性緩沖液的步驟之間，pH值和/或氧化還原劑的濃度的調(diào)整幅度是相同的。例如，每一步調(diào)節(jié)都降低pH值0.4，和/或增加GSSH濃度0.25mM。
在以上方法中，優(yōu)選復性過程中復性緩沖液的氧化還原劑的濃度比例改變，而pH值可以不變。例如，每一步調(diào)節(jié)均增加GSSH濃度0.25mM，而pH值一次性降低到7.4。
在以上方法中，優(yōu)選重組蛋白可以是大腸桿菌表達形成的包涵體或其它異體蛋白。其中，重組蛋白可以是形成二硫鍵的包涵體蛋白；重組蛋白也可以是非大腸桿菌表達而失去生物活性的，或者與生物活性有差異的表達蛋白。在一個具體的實施方式中，具有二硫鍵的重組蛋白可以是組織型纖溶酶原激活劑(Tissue Plasminogen Activator，TPA)及其變體衍生物，優(yōu)選如陳于紅等人(南京大學學報(自然科學版)，2004年01期)所述的重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白。在一個具體的實施方式中，具有二硫鍵的重組蛋白可以為人腦利鈉肽(Nesiritide，BNP)的多肽及其變體衍生物，優(yōu)選如Rapid Transcritional Activation and Easy mRNA Turnoverof Brain Natriuretic Peptide in Cardiocyte Hypertrophy.OsamuNakagawa，Yoshihiro Ogawa，Hiroshi Itoh，etc.J.Clin.Invest，Volume96，September 1995，1280-1287。


圖1重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白表達的電泳結(jié)果M.蛋白質(zhì)分子量參照 1.不進行IPTG誘導的對照2.誘導表達1小時后的重組蛋白的總菌3.誘導表達2小時后的重組蛋白的總菌4.誘導表達3小時后的重組蛋白的總菌5.誘導表達4小時后的重組蛋白的總菌圖2重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白破碎、洗滌和變復性的電泳結(jié)果M.蛋白質(zhì)分子量參照 1.誘導表達重組蛋白的總菌2.重組蛋白的裂解總菌 3.重組蛋白的裂解沉淀4.重組蛋白經(jīng)1號洗滌緩沖液清洗的上清
5.重組蛋白經(jīng)2號洗滌緩沖液清洗的上清6.重組蛋白經(jīng)變性緩沖液溶解的上清7.重組蛋白經(jīng)復性緩沖液復性的上清圖3重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白復性過程的電泳結(jié)果M.蛋白質(zhì)分子量參照1.重組蛋白的復性上清(pH9.5)2.重組蛋白的復性上清(pH9.0) 3.重組蛋白的復性上清(pH8.8)4.重組蛋白的復性上清(pH8.6) 5.重組蛋白的復性上清(pH8.4)6.重組蛋白的復性上清(pH8.0) 7.重組蛋白的復性上清(pH7.8)8.重組蛋白的復性上清(pH7.6) 9.重組蛋白的復性上清(pH7.4)圖4重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白纖溶平板的活性鑒定1.100IU標準品 2.200IU標準品3.300IU標準品 4.500IU標準品5.1000IU標準品6.0.5ul重組蛋白7.1ul重組蛋白 8.2ul重組蛋白9.3ul重組蛋白 10.10ul PBS(空白對照)具體實施方式
可以認為，不需進一步的解釋，本領(lǐng)域的人員就可以根據(jù)前面的描述，充分利用本發(fā)明。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(第三版)(科學出版社，北京，2002)等實驗手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的表達構(gòu)建表達重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的菌株可以按照陳于紅等人(南京大學學報(自然科學版)，2004年01期)所述的方式來進行。也可以參照分子克隆的實驗方法進行重組克隆。挑取新鮮的重組克隆于10ml含有終濃度為2％的葡萄糖和0.5mg/ml的氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基，并在37℃下以250rpm培養(yǎng)過夜。以1∶100的接種比例轉(zhuǎn)移新鮮菌液于1L含有終濃度為2％的葡萄糖和0.5mg/ml的氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基，并在37℃下以250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.7~0.8，然后使用終濃度為0.1~0.3mM IPTG進行誘導表達，連續(xù)培養(yǎng)4小時后以8000rpm/10min離心收菌。分別制備誘導前后的重組工程菌樣品進行SDS-PAGE電泳分析(圖1)。
實施例2重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的裂解與洗滌將由實施例1獲得的誘導表達的重組工程菌離心沉淀，并取該菌體重懸于13ml的溶解緩沖液[50mM Tris-Cl，25％蔗糖，1mM EDTA，10mM DTT，0.1％疊氮鈉，pH8.0]中，然后轉(zhuǎn)移到50ml離心管中。以上步驟都可以在冰上操作。然后加入100ul溶菌酶，250ul DNase I，50ul MgCl2(0.5M)，輕輕震蕩均勻后在冰上放置30分鐘。然后加入12.5ml的裂解緩沖液[50mMTris-Cl，100mM NaCl，10mM DTT，1％。脫氧膽酸鈉，0.1％疊氮鈉，pH8.0]，并仔細反復顛倒數(shù)次使液體混合均勻，室溫放置30~60分鐘。然后加入0.5MEDTA 350ul，仔細反復顛倒數(shù)次混合均勻后置于-80℃中10分鐘，再取至37℃解凍。如以上步驟，在-80℃和37℃反復凍溶兩次后，加人0.5M MgCl2200ul使溶液旋濁度降低。靜置30~60分鐘，再加入0.5M EDTA 350ul并仔細的使用槍頭反復吹勻沉淀。
將細胞裂解溶液在4℃下以11000g離心20分鐘，小心的倒棄上清，然后將沉淀重懸于10ml的1號洗滌緩沖液[50mM Tris-Cl，0.5％ TritonX-100，100mM Nacl，1mM EDTA，1mM DTT，0.1％疊氮鈉，pH8.0]中。在-80℃和37℃方法反復凍溶一次，并將所有的沉淀仔細吹勻。接著在4℃下11000g離心20分鐘，小心的倒棄上清，并將沉淀重懸于10ml的2號洗滌緩沖液[50mM Tris-Cl，100mM Nacl，1mM EDTA，1mM DTT，0.1％疊氮鈉，pH8.0]中。在-80℃和37℃反復凍溶一次，并將所有的沉淀仔細吹勻，然后4℃下11000g離心20分鐘，收集沉淀。圖2顯示了重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白經(jīng)過破碎、洗滌和變復性步驟后的效果。
實施例3重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的變復性將實施例2所獲得的沉淀重懸于9ml pH值為l0.5的變性緩沖液[8M尿素，0.1M Tris-Cl，1mM甘氨酸，1mM EDTA，10mM DTT，1mM GSH，0.1mM GSSH，10mM β-巰基乙醇]中，37℃下以250rpm震蕩1小時，直到沉淀完全溶解。
將以上溶解后的變性蛋白質(zhì)以1∶20~1∶50的稀釋比例注入復性緩沖液[50mM Tris-Cl，15mM L-精氨酸，2mM EDTA，0.1％ Tween 80，0.25mM GSSH，1mM GSH]中，使pH值為9.5，而且使得整體蛋白濃度不超過1mg/ml，并在4℃下磁力攪拌6~12小時。然后每隔2~6小時小心加入1M鹽酸來降低整體緩沖液的pH值0.2～0.5，并通過添加125mM GSSH來增加整體氧化劑GSSH濃度50~100％，并依次使整體還原劑GSH濃度降低50~100％，然后4℃下繼續(xù)緩慢攪拌。將以上調(diào)整緩沖液pH值和氧化劑濃度的步驟重復若干次，直至最終緩沖液的pH值為7.3~7.6，而且整個復性過程中逐步降低還原劑的濃度并提高氧化劑的濃度，以至于其還原劑的終濃度為0~10mM；氧化劑的終濃度為1~100mM。至此，復性過程結(jié)束。在一個具體實施方式
中，以上復性的具體步驟如下1)調(diào)整pH到9.5和氧化性GSSH至終濃度0.25mM，緩慢攪拌6-12小時。
2)調(diào)整pH到9.0和氧化性GSSH至終濃度0.5mM，緩慢攪拌2~6小時。
3)調(diào)整pH到8.8和氧化性GSSH至終濃度0.75mM，緩慢攪拌2~6小時。
4)調(diào)整pH到8.6和氧化性GSSH至終濃度1.0mM，緩慢攪拌2~6小時。
5)調(diào)整pH到8.4和氧化性GSSH至終濃度1.25mM，緩慢攪拌2~6小時。
6)調(diào)整pH到8.2和氧化性GSSH至終濃度1.5mM，緩慢攪拌2~6小時。
7)調(diào)整pH到8.0和氧化性GSSH至終濃度1.75mM，緩慢攪拌2~6小時。
8)調(diào)整pH到7.8和氧化性GSSH至終濃度2.0mM，緩慢攪拌2~6小時。
9)調(diào)整pH到7.6和氧化性GSSH至終濃度2.25mM，緩慢攪拌2~6小時。
10)調(diào)整pH到7.4和氧化性GSSH至終濃度2.5mM，緩慢攪拌2~6小時。
圖3顯示了以上主要復性步驟所得的中間產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
實施例4重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的純化使用柱緩沖液A[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％ Tween 80，pH7.4]將賴氨酸樹脂親和填料(購自Amersham Biosciences，USA)進行清洗和平衡，然后將復性蛋白上樣到賴氨酸樹脂柱中，并使用8倍柱床體積的柱緩沖液B[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％ Tween 80，0.1M NaCl，pH7.4]進行清洗。最后使用柱緩沖液C[50mM Tris-Cl，2mM EDTA，0.1％ Tween 80，0.5M NaCl，0.2M賴氨酸，pH7.4]進行洗脫。
使用2倍柱床體積的0.01M PBS(pH7.4)平衡Sephadex G-25柱(購自Amersham Biosciences，USA)，然后將1/5的Sephadex G-25柱床體積的經(jīng)賴氨酸樹脂純化后的重組蛋白上樣到Sephadex G-25柱中，再使用1倍柱床體積的0.01M PBS(pH7.4)洗脫目的蛋白。
實施例5重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白的活性鑒定取20ml煮溶的緩沖液(0.1％瓊脂糖，20mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.01％ Tween 80，pH7.5)與1ml 20mg/ml纖維蛋白原(溶于50mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.01％Tween 80，pH7.5)混合，倒入預先加有20U的凝血酶100ul和4個酪蛋白單位的纖溶酶原100ul的平板上，快速混勻，凝固后用打孔器打孔若干個，孔徑3mm，空間距1cm左右。分別往上述纖維平板孔里加入以上過程制備出的重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白和纖溶酶原激活劑變體蛋白標準品(天普公司，廣州)，進行纖溶活性的測定。測定樣品溶圈的面積，與標準品的進行定量比較(圖4)。圖4的結(jié)果顯示通過本發(fā)明的復性過程得到的重組組織型纖溶酶原激活劑變體蛋白已經(jīng)達到了復性的要求，經(jīng)過對比計算表現(xiàn)出了該蛋白具有1M IU/10mg的纖溶活性。因此本發(fā)明提供了一種重組蛋白的高效變復性的方法，可以高效穩(wěn)定的獲取活性蛋白。
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白的高效變復性的方法，其特征在于不同的蛋白質(zhì)復性階段使用了含有不同pH值與不同濃度和比例的還原劑/氧化劑所組成的復合動態(tài)緩沖液，這種方法的步驟包括(1)使用pH值為10.0以上的變性緩沖液溶解重組蛋白，且緩沖液中含有2.0mM以上的還原劑；(2)加入復性緩沖液，使得到的溶液pH值比步驟(1)所得到溶液的pH值降低了0.5~1.0，而且使氧化劑濃度比步驟(1)中的氧化劑濃度增加100~300％，還原劑濃度比步驟(1)中的還原劑濃度降低50％~100％；(3)調(diào)節(jié)復性緩沖液，使得到的溶液pH值比上一步驟得到溶液的pH值降低了0.2~0.5，而且使氧化劑濃度比上一步驟的氧化劑濃度增加50~100％，還原劑濃度比上一步驟中的還原劑濃度降低50％~100％；(4)重復步驟(3)若干次，使每一步所得的溶液的pH值都比上一步的溶液的pH值降低0.2~0.5，而且使氧化劑濃度比上一步驟的氧化劑濃度增加50~100％，直至最終溶液的pH值接近中性或者該重組蛋白質(zhì)的生理值并使氧化劑的終濃度為1~100mM。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)復性緩沖液的步驟中不加入還原劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組蛋白在每一步的不同緩沖液中都能靜止或者動態(tài)的放置60分鐘以上。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復性緩沖液的pH值與氧化還原劑的調(diào)節(jié)是可以在原有緩沖液中進行調(diào)節(jié)，或可以是使用重新配置的緩沖液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復性緩沖液中的還原劑可以是β巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，二硫蘇糖醇(DTT)，和/或還原型谷胱甘肽(GSH)；復性緩沖液中的氧化劑可以是氧化型谷胱甘肽(GSSH)，過氧化氫(H2O2)或者氧氣O2。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復性過程中，復性緩沖液的pH值的動態(tài)變化以及氧化還原劑的濃度的動態(tài)變化的速度是可調(diào)節(jié)的。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，復性緩沖液的pH值與氧化還原劑的濃度是同時發(fā)生變化的。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)復性緩沖液的步驟之間，pH值和/或氧化還原劑的濃度的調(diào)整幅度是相同的。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，復性過程中復性緩沖液的氧化還原劑的濃度比例改變，而pH值可以不變。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，復性緩沖液中可含有去污劑，尿素，SDS，Tris-Cl，甘氨酸，EDTA，L-精氨酸，和/或蛋白酶抑制劑。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組蛋白可以是大腸桿菌表達形成的包涵體或其它異體蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，重組蛋白可以是形成二硫鍵的包涵體蛋白。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，重組蛋白可以是非大腸桿菌表達而失去生物活性的，或者與生物活性有差異的表達蛋白。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，具有二硫鍵的重組蛋白可以是組織型纖溶酶原激活劑(Tissue Plasminogen Activator，TPA)及其變體衍生物。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，具有二硫鍵的重組蛋白可以為人腦利鈉肽(Nesiritide，BNP)的多肽及其變體衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組蛋白的高效變復性的方法，對重組表達而不具有生物活性的蛋白質(zhì)進行了高效快速的變復性。通過采用含有尿素和一定濃度比例的氧化還原劑GSSH/GSH等組成的變性緩沖液對充分洗滌后的包涵體蛋白進行溶解，隨后將變性蛋白稀釋注入含有L－精氨酸和一定濃度比例的氧化還原劑GSSH/GSH等組成的復性緩沖液中進行復性，并在復性過程中逐步提高緩沖液中氧化還原劑GSSH/GSH的比例及調(diào)低pH，直至復性結(jié)束。經(jīng)該方法復性的幾種在大腸桿菌中表達并形成包涵體的蛋白質(zhì)，其生物活性強且穩(wěn)定，因此是工業(yè)化高效變復性的方法。
文檔編號C07K14/435GK1775800SQ20051013457
公開日2006年5月24日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者林鍵, 秦超, 李勝峰 申請人:百奧泰生物科技(廣州)有限公司