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海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)生的化合物在抗生物污損中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):3576007閱讀:162來源:國知局
專利名稱:海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)生的化合物在抗生物污損中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供了一種使用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)新的抗菌和抗生物污損活性化合物以及這些化合物的實(shí)際應(yīng)用方法。本發(fā)明所涉及生產(chǎn)抗菌和抗生物污損化合物微生物為白粉寄生菌(Ampelomycessp.),鐮孢菌(Fusarium sp.)及一種棘頭海綿(Acanthellacavernosa)附生菌UST03110-009。這些化合物既有抗菌活性又有抑制幼蟲附著活性,因此具有顯著的抗生物污損活性。
背景技術(shù)
海洋環(huán)境中的水下工業(yè)設(shè)施,如排水管,船體的龍骨,螺旋槳,養(yǎng)魚網(wǎng)箱等易于受到生物污損。海洋生物如細(xì)菌,海藻,真菌以及原生動(dòng)物附生在物體表面,形成群落并產(chǎn)生粘液層,即生物膜。生物膜的形成可以看成是一種微生物污損,生物膜不僅分泌一些誘導(dǎo)大型污損生物如海洋無脊椎動(dòng)物的浮游態(tài)幼蟲和藻類的孢子附著的化學(xué)信號(hào)物質(zhì),而且會(huì)產(chǎn)生一些損害鋼鐵的化學(xué)物質(zhì),造成生物腐蝕。長有鈣質(zhì)殼或管的大型污損生物如貽貝,管蟲和藤壺等危害尤其大,經(jīng)常阻塞管道或附著在水下物體表面而影響這些設(shè)施的運(yùn)轉(zhuǎn)。
無論水下設(shè)施的微生物污損還是大型生物污損都會(huì)造成工業(yè)上的巨大經(jīng)濟(jì)損失。降低燃料效率,增加設(shè)施的清理和維護(hù)費(fèi)用以及其它一些損耗。海洋細(xì)菌和海洋無脊椎動(dòng)物如管蟲和藤壺是引起生物污損和生物腐蝕的主要生物。生物污損和生物腐蝕是相互伴生現(xiàn)象,引起航運(yùn)業(yè)以及海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的損失。生物污損會(huì)增加船體龍骨的摩擦的10%,降低螺旋槳的推動(dòng)力的20%,因此要多消耗50%的燃料來保持相同的行進(jìn)速度。此外,生物污損還會(huì)加快船體腐蝕速度的200%,縮短船體壽命的50%。每年由于生物污損造成的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境損失達(dá)到幾十億美元。有毒抗污損涂料的生產(chǎn)以及廢料處理又會(huì)多造成幾十億美元的損失。近三十年來,含TBT的抗生物污損涂料是最有效的防污漆,但由于毒性高和對(duì)環(huán)境的危害,聯(lián)合國國際海事組織已經(jīng)簽署公約2003年1月1日起禁止含有TBT的海洋涂料的生產(chǎn)。因此迫切需要尋找新的對(duì)環(huán)境無害的抗生物污損活性化合物。
海洋微生物是可持續(xù)性利用的生物資源,為解決目前存在的問題提供了新的途徑。利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)生物產(chǎn)品比利用高等動(dòng)物或植物有更大的優(yōu)點(diǎn)。另外,由于發(fā)酵過程中人力消耗少,因此應(yīng)用微生物發(fā)酵更經(jīng)濟(jì)。從海洋微生物分離鑒定出的抗菌和抗生物污損活性化合物,也將來可能通過更經(jīng)濟(jì)的工業(yè)規(guī)模的化學(xué)合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從海洋微生物中分離鑒定出4個(gè)無毒或低毒且具有顯著抗污損活性(抗菌和抗幼蟲附著活性)化合物。
四個(gè)化合物如下(i)3-氯-2,5-二羥基苯甲醇(3-chloro-2,5-dihydroxy benzylalcohol,化合物1) (ii)3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione/cyclo-(Pro-Phe),化合物2) (iii)3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide),化合物3) (iv)琥珀酸(succinic acid,化合物4) 上述化合物及其取代產(chǎn)物也可以通過其它一些技術(shù)或途徑制備,獲得滿意的抗污損活性(抗菌和抗幼蟲附著活性),例如化合物1中-Cl也可用-F替代而不影響活性。
本發(fā)明提供一個(gè)利用本發(fā)明涉及的一個(gè)或多個(gè)化合物及其功能衍生物的配方抑制水下物體表面污損生物的附著,這個(gè)方法對(duì)環(huán)境無害。
本發(fā)明提出利用本發(fā)明涉及的化合物及其衍生物制備無毒,無重金屬,對(duì)環(huán)境無害的海洋防污漆。


圖1是從白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)中分離純化3-氯-2,5-二羥基苯甲醇流程2是從菌株UST030110-009中分離純化3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺流程3是從鐮孢菌(Fusarium sp.)中分離純化琥珀酸流程4顯示化合物3-氯-2,5-二羥基苯甲醇濃度與藤壺幼蟲附著率的關(guān)系圖5顯示化合物3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮對(duì)藤壺幼蟲附著的抑制作用圖6顯示化合物3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺對(duì)藤壺幼蟲附著的抑制作用圖7化合物琥珀酸對(duì)藤壺幼蟲附著的抑制作用圖8顯示化合物琥珀酸對(duì)藤壺幼蟲死亡率的影響圖9顯示含琥珀酸的植物凝膠上1,2和3天形成的生物膜中的細(xì)菌密度(重蒸水為空白對(duì)照)圖10顯示含琥珀酸的植物凝膠上1,2和3天形成的生物膜對(duì)幼蟲附著的影響圖11線性圖顯示含琥珀酸的植物凝膠表面上的細(xì)菌密度與管蟲附著的關(guān)系(實(shí)地試驗(yàn))圖12顯示植物凝膠基質(zhì)中琥珀酸的釋放速率圖13顯示實(shí)地試驗(yàn)中涂布含1%和10% of琥珀酸油漆的塑料板表面的管蟲密度圖14顯示無毒油漆中琥珀酸的釋放率具體實(shí)施方式
A.本發(fā)明涉及的制備抗菌、抗生物污損活性化合物的菌株菌株UST040128-009為從香港岸邊培養(yǎng)6天的天然生物膜中分離到,經(jīng)鑒定為白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)。用無菌蓋玻片將玻璃片上的生物膜刮下,懸浮于500ul無菌復(fù)方氯化鈉溶液(Ringersolution,Oxoid)。然后用無菌復(fù)方氯化鈉溶液釋稀樣品至10倍和100倍。取200ul樣品涂布于含0.3%玫瑰紅鈉(Rose Bengal,Acros)和100mg/L的抗生素鏈霉素和青霉素G的玉米粉瓊膠板上(corn meal agar,CMA,Oxoid)。將接種后的瓊膠板置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。在解剖鏡下觀查真菌菌絲。挑取特殊的真菌菌落,轉(zhuǎn)移到新玉米粉瓊膠板上進(jìn)一步分離純化真菌。采用分子生物學(xué)方法測(cè)定真菌菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的序列,基因序列代碼為序列號(hào)1(SEQ ID No1)。
菌株UST030110-009為海南三亞棘頭海綿(Acanthellacavernosa)的附生菌。在水下將海綿樣品從礁石上取下置于干凈的塑料袋中帶到水面。在實(shí)驗(yàn)室中將海綿切碎,然后懸浮于500ul無菌復(fù)方氯化鈉溶液。然后用復(fù)方氯化鈉溶液釋稀樣品至10倍和100倍。取200ul樣品涂布于含0.3%玫瑰紅鈉和100mg/L的抗生素鏈霉素和青霉素G的玉米粉瓊膠板上。將接種后瓊膠板上置于25℃培養(yǎng)箱。培養(yǎng)2天后,在解剖鏡下觀查真菌菌絲。挑取特殊的真菌菌落,轉(zhuǎn)移到新的玉米粉瓊膠板上進(jìn)一步分離純化真菌。采用分子生物學(xué)方法測(cè)定真菌菌株18S rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列,基因序列代碼分別為序列號(hào)4(SEQ ID No4)和序列號(hào)5(SEQ ID No5)。
海洋真菌-鐮孢菌(Fusarium sp.)通過分子生物學(xué)方法測(cè)定18SrRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),基因序列代碼分別為序列號(hào)2(SEQ ID No2)和序列號(hào)3(SEQ ID No3)。
B.海洋微生物制備抗菌和抗生物污損活性化合物(1)3-氯-2,5-二羥基苯甲醇(3-chloro-2,5-dihydroxy benzylalcohol)將活化的白粉寄生菌(Ampelomyces sp.)菌種接種到3L盛有2L滅菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基組成為葡萄糖(20g/L),蛋白胨(10g/L),海水(800ml/L)淡水(200ml/L)。在搖床上室溫培養(yǎng)21天,速度80轉(zhuǎn)/分鐘。經(jīng)活性檢測(cè),菌絲體和發(fā)酵液的粗提物都有抗菌、抗生物污損活性。因此需要將菌絲體和發(fā)酵液分離,分別提取。
圖1為發(fā)酵液中活性成分的提取與純化流程。發(fā)酵結(jié)束,菌絲體和發(fā)酵液用紗布分離。濾液用乙酸乙酯提取三次(濾液∶乙酸乙酯3∶1)。合并乙酸乙酯萃取液,合并后減壓濃縮。(其它合適的溶劑也可用做粗提物的提取,如二氯甲烷,氯仿,乙醚和正丁醇)。菌絲體用甲醇提取三次(此處也可用其它溶劑如乙醇,正丁醇,丙酮和乙酸乙酯),合并甲醇提取液減壓濃縮。用超聲波或研缽破壞細(xì)胞壁有助于提高提取率。
乙酸乙酯和甲醇提取物部分合并,減壓蒸干,獲褐色粗提物3.78g。將粗提物懸浮于10倍體積的重蒸水中,然后分別用等體積的正己烷,乙酸乙酯萃取。(這一步也可用其它合適的試劑代替,獲得相同的結(jié)果。如,石油醚代替正己烷,乙醚、氯仿和正丁醇代替乙酸乙酯。)將乙酸乙酯提取物過葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱,以甲醇為洗脫劑,流速1ml/min。每個(gè)餾分為4毫升/管,結(jié)合薄層色譜(硅膠,氯仿-甲醇5∶1)和抗生物污損活性分析每個(gè)餾分,相同部分合并?;钚圆糠稚瞎枘z柱(1.0×50cm,230-400目,E.Merck),用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑,梯度洗脫。活性部分再用二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶1)純化。最后用反相高效液相色譜進(jìn)一步純化(色譜柱Lichrospher 100 RP C18EC 5,250×4mm i.d.;分離條件梯度30%甲醇-水至70%甲醇-水;流速1ml/min)。得到純化合物。該化合物為3-氯-2,5-二羥基苯甲醇,在25℃可溶于甲醇,乙醇,丙醇,丁醇,乙酸乙酯,丙酮,乙腈。
本化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振技術(shù)確定,并用電噴霧離子化質(zhì)譜(Waters Micromass ZQ ESI-MS,以下同)采用負(fù)離子模式測(cè)定分子量。質(zhì)譜條件探針電壓2.5kV;錐孔電壓18V;碎片電壓2V;探針溫度100℃;干燥氣N2溫度為300℃;干燥氣流速200立升/小時(shí)。將3-氯-2,5-二羥基苯甲醇溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5),用250微升進(jìn)樣器以5微升/分鐘導(dǎo)入質(zhì)譜。
3-氯-2,5-二羥基苯甲醇的質(zhì)譜圖顯示分子離子峰([M-H])在m/z172.75(100.0%),174.72(32.6%)。在質(zhì)譜圖(M-H)+2峰是[M-H]峰強(qiáng)度的1/3,表明化合物中含有Cl。
將3-氯-2,5-二羥基苯甲醇溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNMEX-400型核磁共振儀測(cè)定核磁共振氫譜。氫譜數(shù)據(jù)見表1表1 3-氯-2,5-二羥基苯甲醇?xì)渥V數(shù)據(jù)(400MHz)

將3-氯-2,5-二羥基苯甲醇溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNMEX-400型核磁共振儀測(cè)定核磁共振碳譜。碳譜數(shù)據(jù)見表2。
表2.3-氯-2,5-二羥基苯甲醇的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(100MHz)

(2)3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione/cyclo-(Pro-Phe))和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide)圖2是菌株UST030110-009制備化合物3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的流程圖。
將經(jīng)過活化的菌種接種到3L盛有1.5L無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基組成為葡萄糖(20g/L),蛋白胨(10g/L),海水(800ml/L)淡水(200ml/L)。在搖床上室溫培養(yǎng)15天,速度為120轉(zhuǎn)/分鐘。經(jīng)活性檢測(cè),菌絲體和發(fā)酵液的粗提物都有抗菌、抗生物污損活性。因此需要將菌絲體和發(fā)酵液分離,分別提取。菌絲體和發(fā)酵液用紗布分離。濾液用乙酸乙酯提取三次(濾液∶乙酸乙酯3∶1體積比)。乙酸乙酯萃取液合并后減壓濃縮。(其它合適的溶劑也可用做萃取溶劑,如二氯甲烷,氯仿,乙醚和正丁醇)。菌絲體用甲醇提取三次(此處也可用其它溶劑如乙醇,正丁醇,丙酮和乙酸乙酯)。用超聲波或研缽加干凈的砂破壞細(xì)胞壁可以提高提取效率。
乙酸乙酯和甲醇提取物部分合并,蒸干,懸浮于10倍體積的重蒸水中,然后依次用等體積的正己烷,乙酸乙酯萃取。(這一步也可用其它合適的試劑代替,如石油醚代替正己烷,乙醚、氯仿和正丁醇代替乙酸乙酯。)乙酸乙酯部分上葡聚糖凝膠LH-20柱,用甲醇洗脫,流速1ml/min,每個(gè)餾分為5毫升/管。經(jīng)瓊膠擴(kuò)散抗菌測(cè)試,合并后減壓濃縮活性組分。活性部分采用硅膠柱層析進(jìn)一步純化,洗脫劑為正己烷-乙酸乙酯(100%正己烷至100%乙酸乙酯)和乙酸乙酯-甲醇(100%乙酸乙酯至100%甲醇)。
乙酸乙酯部分結(jié)晶析出。晶體純度用反相高效液相色譜(Lichrospher 100RP C18EC 5,250×4mm i.d.;梯度50%乙腈-水至80%乙腈-水;流速1ml/min)分析。在色譜圖中只出現(xiàn)一個(gè)單峰,表明該晶體為純化合物(化合物2)。
甲醇部分上鍵合十八烷基硅膠柱,用甲醇-水洗脫,每個(gè)餾分3毫升/管。測(cè)定每個(gè)組分的純度與活性,最后獲得純化合物3。
采用核磁共振技術(shù)分析兩個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。經(jīng)分析白色粉末狀化合物2為3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮,在25oC可溶于甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮和乙腈。采用電噴霧離子化質(zhì)譜測(cè)定分子量。用正離子模式,質(zhì)譜條件探針電壓2.5kV;錐孔電壓18V;碎片電壓2V;探針溫度100℃;干燥氣氮?dú)鉁囟葹?00℃;干燥氣流速200立升/小時(shí)。3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5),采用250L進(jìn)樣器以5L/min的速度導(dǎo)入質(zhì)譜。3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮的質(zhì)譜圖顯示分子離子峰m/z244.89(100.0%),245.90(15.9%)。
將3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNM EX-400型核磁共振儀測(cè)定核磁共振氫譜。氫譜數(shù)據(jù)見表3。
表3 3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮的氫譜數(shù)據(jù)(400MHz)


將3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮溶于氘代甲醇采用JEOL Model JNM EX-400型核磁共振儀測(cè)定碳譜。碳譜數(shù)據(jù)見表4。
表4 3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(100MHz)

化合物3經(jīng)鑒定為3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺,無色晶體,在25℃可溶于甲醇,乙醇,丙醇,正丁醇,乙酸乙酯,氯仿,二氯甲烷和乙腈。采用電噴霧離子化質(zhì)譜正離子模式測(cè)定分子量。將化合物溶于甲醇-水-甲酸(90∶9.5∶0.5),用250L進(jìn)樣器以5L/min的速度導(dǎo)入質(zhì)譜。3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的質(zhì)譜圖顯示化合物的分子離子為m/z205.8。將化合物溶于氘代氯仿,采用JEOL ModelJNM EX-400型核磁共振儀測(cè)定氫譜。氫譜數(shù)據(jù)見表5。
表5 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)(400MHz)


將3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺溶于氘代氯仿,采用JEOL ModelJNM EX-400型核磁共振儀測(cè)定碳譜。碳譜數(shù)據(jù)見表6。
表6 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(100MHz)

(3)琥珀酸(succinic acid)經(jīng)活化的鐮孢菌(Fusarium sp.)菌種接種到3L培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)瓶盛有1.5L無菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,海水800ml/L,淡水200ml/L。置于搖床上室溫培養(yǎng)10天,轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘?;钚詼y(cè)定結(jié)果表明菌絲體和發(fā)酵液中都含有抗污損活性成分。因此為有效提取琥珀酸,采用醫(yī)用紗布分離菌絲體和發(fā)酵液。
圖3為提取與分離琥珀酸的過程。發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取三次(濾液∶乙酸乙酯3∶1)。合并萃取液,減壓蒸干(可用其它適當(dāng)溶劑如二氯甲烷,氯仿,乙醚和正丁醇替代乙酸乙酯)。菌絲體用甲醇萃取三次(乙酸乙酯可用乙醇、正丁醇、丙酮代替)。用超聲波或研缽加干凈的砂破壞細(xì)胞壁可以提高提取效率。
合并乙酸乙酯和甲醇粗提物減壓濃縮,獲得約1.6g粗提物。粗提物懸浮于10ml甲醇,然后用正己烷除去脂類(石油醚可替代正己烷),減壓濃縮甲醇相獲得1g抗菌活性部分?;钚圆糠植捎霉枘z柱層析,用100%二氯甲烷至100%甲醇進(jìn)行梯度洗脫,得到9個(gè)餾分?;钚詼y(cè)定結(jié)果表明15%二氯甲烷部分(600mg)具有活性?;钚圆糠诌M(jìn)一步用葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱分離獲得30個(gè)組分。其中4個(gè)餾分顯示抗菌活性。合并活性組分,進(jìn)一步用反相高效液相色譜(Lichrospher 100 RP C18EC 5,250×4mm i.d.;梯度90%水-乙腈至10%水-乙腈,流速1ml/min)純化。
通過核磁共振氫譜,碳譜鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。最后活性化合物確認(rèn)為琥珀酸。琥珀酸的分子量采用電噴霧離子化質(zhì)譜測(cè)定。質(zhì)譜條件探針電壓2.5kV;錐孔電壓18V;碎片電壓2V;探針溫度100℃;干燥氣氮?dú)鉁囟葹?00℃;干燥氣流速200立升/小時(shí)。琥珀酸溶于甲醇-水(90∶9.5)用250L進(jìn)樣器以5L/min的速度導(dǎo)入質(zhì)譜。琥珀酸的質(zhì)譜顯示分子離子m/z118,分子式為C4H6O4。將化合物溶于氘代甲醇,用核磁共振儀測(cè)定核磁共振氫譜和碳譜。琥珀酸及其化學(xué)位移如下

C.抗菌、抗生物污損(抑制幼蟲附著)活性(1)3-氯-2,5-二羥基苯甲醇(3-chloro-2,5-dihydroxy benzylalcohol)采用瓊膠擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性。浸有50g化合物的無菌紙片(6mm i.d.)覆蓋在涂布細(xì)菌的瓊膠板上。浸有同樣體積二甲亞砜的紙片做空白對(duì)照,加鏈霉素的濾紙片做陽性對(duì)照。然后將瓊膠板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后,測(cè)量抑菌圈大小。抗菌結(jié)果見表7。表7顯示3-氯-2,5-二羥基苯甲醇抗菌活性較強(qiáng),不僅能殺死誘導(dǎo)幼蟲附著的細(xì)菌而且能殺死病原菌。
表7 3-氯-2,5-二羥基苯甲醇的抗菌活性

采用24孔聚苯乙烯板測(cè)定3-氯-2,5-二羥基苯甲醇(化合物1)的抗幼蟲附著活性。純化合物溶于二甲亞砜,然后用無菌過濾海水稀釋成不同的濃度。每個(gè)孔中加入1ml測(cè)試液和10±2個(gè)成熟的藤壺幼蟲,每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)樣,無菌過濾海水做空白對(duì)照。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30℃培養(yǎng)箱中24小時(shí)。在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)附著的幼蟲數(shù)。用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
圖4顯示化合物3-氯-2,5-二羥基苯甲醇在0.1g/ml已顯示抗幼蟲附著活性。在濃度為5g/ml時(shí),幼蟲附著率只有大約10%,空白對(duì)照的幼蟲附著率為60%,明顯地抑制了藤壺幼蟲的附著。
按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼蟲附著活性。半數(shù)抑制有效濃度(EC50)為3.50g/ml,半數(shù)致死濃度(LC50)為266.68g/ml?;衔?的毒效比LC50/EC50為76.19,表明該化合物為無毒。有毒化合物如重金屬的毒效比接近1(Rittschof et al.1992),而無毒抗生物污損化合物的毒效比為10以上(Avelin et al.1993)。
(2)3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮(3-benzyl-hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione/cyclo-(Pro-Phe))和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(3-methyl-N-(2-phenylethyl)butanamide)采用瓊膠擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性。浸有50g化合物的無菌紙片(6mm i.d.)覆蓋在涂布細(xì)菌的瓊膠板上。浸有同樣體積二甲亞砜的紙片做空白對(duì)照,加鏈霉素的濾紙片做陽性對(duì)照。瓊膠板置于30℃培養(yǎng)箱中24小時(shí)后,測(cè)量抑菌圈大小。3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的抗菌結(jié)果分別見表8和表9。
表8 3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮(化合物2)的抗菌活性結(jié)果

表9 3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(化合物3)的抗菌活性結(jié)果

采用24孔聚苯乙烯板測(cè)定3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮的毒性。將純化合物溶于二甲亞砜,用無菌過濾海水稀釋成不同的濃度。每個(gè)孔中加入1ml測(cè)試液和10±2個(gè)成熟的藤壺幼蟲,每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)樣,無菌過濾海水做空白對(duì)照。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30℃培養(yǎng)箱中24小時(shí)。在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)死亡的幼蟲數(shù)。在50g/ml濃度下3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺幼蟲沒有中毒現(xiàn)象。
圖5和圖6分別為化合物3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮(化合物2)和3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺(化合物3)的抑制藤壺幼蟲附著活性。
按Rittschof等(1994)的方法分析抗幼蟲附著活性。3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮的半數(shù)抑制有效濃度(EC50)為67.30g/ml,半數(shù)致死濃度(LC50)為114.83g/ml?;衔?的毒效比LC50/EC50為1.70。3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺的EC50為36.45g/ml,LC50為81.35g/ml,化合物3的毒效比LC50/EC50為2.23。按照前述標(biāo)準(zhǔn),這兩種化合物為低毒化合物(Rittschof et al.1992和Avelin et al.1993)。
(3)琥珀酸(succinic acid)采用瓊膠擴(kuò)散法測(cè)定琥珀酸的抗菌活性。靶細(xì)菌為9株幼蟲附著誘導(dǎo)菌Vibrio halioticoli,Micrococcus luteus,Pseudoalteromonassp.,Loktanella hongkongensis,Rhodovulum sp.(MB253),Vibriofluvialis,Staphylococcus haemolyticus,Ruegeria CtaxMed-2,Vibriosp.(NAP-4)和5株病原菌Vibrio furnissii,Vibrio vulnificus,Shewanella algae,Staphylococcus aureus和Moraxellaphenylpyruvica。浸有100g化合物的無菌紙片(6mm i.d.)覆蓋在涂布細(xì)菌的瓊膠板上。加同樣體積乙腈的紙片做空白對(duì)照,加鏈霉素的濾紙片做陽性對(duì)照。瓊膠板置于30℃培養(yǎng)箱中24小時(shí)后,測(cè)量抑菌圈大小。
藤壺成蟲采自香港(22°19’N,114°16’E)潮間帶。以纖細(xì)角毛藻(Chaetoceros gracilis Schutt)為食物,在0.22-μm過濾海水中將藤壺的無節(jié)幼體培養(yǎng)到金星幼體階段,每毫升2個(gè)幼蟲,培養(yǎng)溫度28℃。用產(chǎn)生的金星階段幼體進(jìn)行活性試驗(yàn)。
采用24孔聚苯乙烯板測(cè)定琥珀酸的抗幼蟲附著活性。將純化合物溶于二甲亞砜,用無菌過濾海水稀釋成不同的濃度溶液(60-140μg/ml)。每個(gè)孔中加入1ml測(cè)試液和15±2個(gè)成熟的藤壺幼蟲,每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)樣,無菌過濾海水做空白對(duì)照。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于30℃培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)。在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)附著的幼蟲數(shù)。用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
圖7琥珀酸在110gml-1濃度下顯示抗藤壺幼蟲附著活性。單因素方差分析分析表明琥珀酸顯著地抑制藤壺幼蟲附著(F9,40=133.85,p<0.001)。毒效比LC50/EC50為94.11,表明該化合物無毒。圖8為琥珀酸濃度對(duì)藤壺幼蟲死亡率的影響。
按照Harder等(2004)的方法將琥珀酸摻入植物凝膠(Phytagel)基質(zhì)中。方法如下將植物凝膠溶于90℃的重蒸水中,配成4%(重量/體積)的植物凝膠溶液。冷卻到70℃,加入琥珀酸的濃溶液(5.5mg ml-1),與植物凝膠溶液在15ml離心管中混合,琥珀酸的終濃度為550μg ml-1,擰上蓋子,置于60℃水浴中,使植物凝膠慢慢冷卻凝固形成透明圓柱體。取出植物凝膠圓柱體,切成1厘米厚的膠片。用摻有重蒸水的膠片做空白對(duì)照。48片膠用于三天的試驗(yàn)18片膠用于測(cè)定模擬自然狀態(tài)下植物凝膠中琥珀酸的釋放速率。9片膠在試驗(yàn)結(jié)束后,用4%福爾馬林固定進(jìn)行細(xì)菌數(shù)統(tǒng)計(jì),結(jié)果見圖9);12片用于抗幼蟲附著活性測(cè)試(圖10)。
圖9為植物凝膠表面在自然海水中1,2和3天形成的生物膜上的細(xì)菌密度,用重蒸水做對(duì)照,(琥珀酸,化合物4,濃度為550μg ml-1)。資料為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,3個(gè)重復(fù)樣。圖10顯示自然海水中植物凝膠表面1,2和3天形成的生物膜對(duì)幼蟲附著的影響,(琥珀酸濃度為550μg ml-1)。資料表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,4個(gè)重復(fù)樣。圖11為線性圖。表明植物凝膠表面的細(xì)菌密度與管蟲附著率的相關(guān)性。圖12顯示植物凝膠膠片浸入海水中一定時(shí)間后琥珀酸殘留量。按照下列方法將琥珀酸加入無毒油漆中測(cè)定抗幼蟲活性將琥珀酸摻入無毒油漆(Levis Ferro Vernis)中,濃度分別為(10%mg/ml和1% mg/ml)。無毒油漆和抗污油漆(International.Interspeed Ultra biocidal paint)用做對(duì)照。將油漆涂到5個(gè)塑料板(大小100cm2)上,置于野外海水中。定期取出塑料板,統(tǒng)計(jì)附著的管蟲數(shù)(Hydroides elegans),換算成每平方米管蟲個(gè)數(shù)。在實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定油漆中琥珀酸釋放速率試驗(yàn)。
圖13顯示現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果,顯示涂有含1%和10%琥珀酸油漆平板上的管蟲數(shù)。用抗污油漆和無毒油漆做空白和陽性對(duì)照。圖14顯示實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中無毒油漆中琥珀酸釋放率。
D.活性衍生物的制備本發(fā)明涉及的4個(gè)抗菌、抗生物污損活性化合物的共同特征是a.都由海洋微生物產(chǎn)生,b.都對(duì)動(dòng)物低毒或無毒,可作為對(duì)環(huán)境無害的抗污損(抗菌、抗幼蟲附著)活性物質(zhì)的范例,以天然化合物為前體,經(jīng)化學(xué)修飾可以提高活性,降低成本以及其它優(yōu)點(diǎn)。
另外,上述本發(fā)明涉及的化合物可以制備成各種旋光異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體等形式,還可以與有機(jī)酸等成鹽,也可合成一些衍生物如N-氧化物,藥物前體和生物等排體。藥物前體即化合物的無活性形式,即無活性化合物在體內(nèi)代謝過程中,從母體分子消去一個(gè)或幾個(gè)保護(hù)基團(tuán)而轉(zhuǎn)化為活性化合物。生物等排性是化合物的一個(gè)原子或一組原子可以用類似的一個(gè)或一組原子替代,而活性不改變。生物等排體是合成具有與母體化合物生物活性性質(zhì)相同的新化合物。立體化學(xué)或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同也可產(chǎn)生生物等排體。本發(fā)明的技術(shù)權(quán)利范圍還包括制備藥物前體、生物等排體和N-氧化物及其鹽類或化合物的各種異構(gòu)體。因此本發(fā)明還包括上述化合物的所有各異構(gòu)形式、鹽和衍生物。
本發(fā)明涉及的術(shù)語“功能衍生物”為上述化合物的藥物前體、生物等排體、N-氧化物,鹽類以及各種異構(gòu)體,與母體化合物相比在某些方面有優(yōu)勢(shì)??梢酝ㄟ^各種高通量化學(xué)合成方法如通過組合化學(xué)制備功能衍生物,與高效生物活性篩選技術(shù)結(jié)合,擴(kuò)大抗菌、抗生物污損活性化合物庫。
E.抗生物污損涂料的制備選取本發(fā)明涉及的抗生物污損活性成分,采用現(xiàn)有技術(shù)制備抗污涂料,例如,將活性成分摻入或擴(kuò)散于成膜天然樹脂,氯乙烯醋酸乙烯共聚物以及其它可水解,可溶或不溶性樹脂等聚合物中。抗污涂料應(yīng)釋放出足量有效的活性成分至表面防止生物污損。
在本發(fā)明正文中涉及的術(shù)語“有效量”即在特殊環(huán)境中達(dá)到抗污損效果(抗菌或抗幼蟲附著)的活性成分的量。
本發(fā)明制備抗菌藥物和抗污涂料首選活性成分嵌入基質(zhì)的方法,但是本發(fā)明并不局限于上述實(shí)例描述的嵌入方法,其它摻入基質(zhì)的方法也屬本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。
序列表<110>香港科技大學(xué)<120>海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)生的化合物在抗生物污損中的應(yīng)用<160>5<210>1<211>514<212>DNA<213>白粉寄生菌(Ampelomyces sp)<223>序列位置第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)<400>1GTACTGCGGA AGGATCATCA CTAGANGTAG TAGGCTTTGC CTGCTATCTC TTACCCATGT60TTTTGAGTAC CTTACGTTTC CTCGGTGGGT CCGCCCACCG ATTGGACAAA TTTAAACCCT120TTGCAGTTGA AATCAGCGTC TGAAAAAACT TAATAGTTAC AACTTTCAAC AACGGATCTC180TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAGTGTGA ATTGCAGAAT240TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCCT TGGTATTCCA TGGGGCATGC300CTGTTCGAGC GTCATTTGTA CCTTCAAGCT CTGCTTGGTG TTGGGTGTTT GTCTCCTGTA360GACTCGCCTT AAAACAATTG GCAGCCGGCG TATTGATTTC GGAGCGCAGT ACATCTCGCG420CTTTGCACTC ATAACGACGA CATCCAAAAG TACATTTTTA CACTCTTGAC CTCGGATCAG480GTAGGGATAC CCGCTGAACT TTAGCATATC AATA514<210>2<211>661<212>DNA<213>鐮孢菌(Fusarium sp.)<223>序列位置18S rRNA<400>2TTGGGGCTGT ACAAAGNCTG AGTATGATTA TAGGGACAGT CGGGGGCATC AGTATTCAAT60TGTCAGAGGT GAAATTCTTG GATTTATTGA AGACTAACTA CTGCGAAAGC ATTTGCCAAG120GATGTTTTCA TTAATCAGGA ACGAAAGTTA GGGGATCGAA GACGATCAGA TACCGTCGTA180GTCTTAACCA TAAACTATGC CGACTAGGGA TCGGACGGTG TTATTTTTTG ACCCGTTCGG240CACCTTACGA GAAATCAAAG TGCTTGGGCT CCAGGGGGAG TATGGTCGCA AGGCTGAAAC300TTAAAGAAAT TGACGGAAGG GCACCACCAG GGGTGGAGCC TGCGGCTTAA TTTGACTCAA360CACGGGGAAA CTCACCAGGT CCAGACACAA TGAGGATTGA CAGATTGAGA GCTCTTTCTT420GATTTGTGGG TGGTGGTGCA TGGCCGTTCT TAGTTGGTGG AGTGATTTGT CTGCTTAATT480GCGATAACGA ACGAGACCTT AACCTGCTAA ATAGCCCGTA TTGCTTTGGC AGTAACGCTG540GCTTCTTCAG AGGGACTATC GGCTCAGCCG ATGGCAAGTT TGAGGGCAAT AAACCAGGGT600CCTGTGATGC CCTTAGATGT TCCTGGGGCC GGACGCAGCG CTACACTGGC CGGAAGCCCG660T661<210>3<211>532<212>DNA<213>鐮孢菌(Fusarium sp.)<223>序列位置內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)<400>3
AATANTCAGC AGAGGGAGGG ATCATTACGA GTTTACAACT CCCAAACCCC TGTGAACATA60CCTATACGTT GCCTCGGCGG ATCAGCCCGC GTCCCCGTAA AACGGGACGG CCCGCCCGAG120CGACCCCTAA ACTCTGTTTT CTAGTGGAAC TTCTGAGTAA AACAAACAAA TAAATCAAAA180CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA ATGCGATAAG240TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA300GTATTCTGGC GGGCATGCCT GTTCGAGCGT CATTTCAACC CTCAAGCTCA GCTTGGTGTT360GGGACTCGCG GTAACCCGCG TTCCCCAAAT CGATTGGCGG TCACGTCGAG CTTCCATAGC420GTAGTAATCA TACACCTCGT TACTGGTAAT CGTCGCGGCA CGCCGTTAAA CCCCAACTTC480TGAATGTTGA CCTCGGATCA GGTAGGAATA CCCGTGAATT AAGCATATCA TA532<210>4<211>734<212>DNA<213>海洋真菌UST03110-009<223>序列位置18S rRNA<400>4CGNNGGCTGT ATTTATGTGG TTTCGTATGA CTGCGTAATG ATTAATAGGG ACAGTCGGGG60GCATCAGTAT TCAATTGTCA GAGGTGAAAT TCTTGGATTT ATTGAAGACT AACTACTGCG120AAAGCATTTG CCAAGGATGT TTTCATTAAT CAGTGAACGA AAGTTAGGGG ATCGAAGACG180ATCAGATACC GTCGTAGTCT TAACCATAAA CTATGCCGAC TAGGGATCGG GCGGTGTTTC240TATTGTGACC CGCTCGGCAC CTTACGAGAA ATCAAAGTGT TTGGGTTCTG GGGGGAGTAT300GGTCGCAAGG CTGAAACTTA AAGAAATTGA CGGAAGGGCA CCACCAGGCG TGGAGCCTGC360GGCTTAATTT GACTCAACAC GGGGAAACTC ACCAGGTCCA GATGAAATAA GGATTGACAG420ATTGAGAGCT CTTTCTTGAT TTTTCAGGTG GTGGTGCATG GCCGTTCTTA GTTCGTGGGG480TGACTTGTCT GCTTAATTGC GATAACGAAC GAGACCTTAA CCTGCTAAAT AGCCAGGCTA540GCTTTGGCTG GTCGCCGGCT TCTTAGAGGG ACTATCGGCT CAAGCCGATG GAAGTTTCGA600GGCAATAACA GGTCTGTGAT GCCCTTAGAT GTTCTGGGCC GACGCGCGCT ACACTGACAG660AGCCAACGAG TTCTTTTCCC TTGGCCGGAA GGTCTGGGTA ATCTTGTTAA AACTCTGTCG720TGCTGGGGAT AGAC 734<210>5<211>651<212>DNA<213>海洋真菌UST03110-009<223>序列位置內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)<400>5TCCGTATAGA TGCAGCTAGA CGGAGGGATC ANNGACATTG TTCAGCAANC AAGCGATGGC60GTCGTCCTTA GAACCGTCTC CGTGCGGCTC GGGGCGGCGT TTCATCAGCG GGCACGTCGC120GGCTTCCTGT TTTCAGGAAG TAATCCCATC TAGAATGGAC TCACGCGGGG TCGTCTGAAT180CCTTAACTTT ACGAGAACTC CCCATACTCC TTCGGTGGGG TGACCTGCCG TTGGAACCAA240CAAAAACCTT TTTTTTGCAT CTAGCATTAC CTGTTCTGAT ACAAACAATC GTTACAACTT300TCAACAATGG ATCTCTTGGC TCTGGCACTC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA360GTGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCTTGGT420ATTCCATGGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TCTACACCCT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGG480GCGTCTGTCC CGCCTCCGCG CGTGGACTCG CCCCAAATTC ATTGGCAGCG GTCTTCTTGC540CCCCCTCTCG CGCAGCACAT TGCGTTCTCG AGGGGTGGCG GGGCCCGGTC CACGAAGCCA600ACATTCACCC GTTCTTTGAC CTCGGATCAG GTAGGGATAC CGTGATTAGC G 65權(quán)利要求
1.一種用于水下結(jié)構(gòu)表面之防微生物污損和/或防大型生物污損的方法,包括給所述水下結(jié)構(gòu)表面涂覆一種抗污涂料,其中所述抗污涂料中添加了選自3-氯-2,5-二羥基苯甲醇、3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮、3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺和琥珀酸及其功能衍生物的抗污損成分。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述涂料中添加了3-氯-2,5-二羥基苯甲醇。
3.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述涂料中添加了3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮。
4.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述涂料中添加了3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺。
5.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述涂料中添加了琥珀酸。
6.一種具有抗菌和/或抗幼蟲附著活性的抗污涂料,其包括成膜成分和一種抗污損活性成分,其中所述抗污損活性成分是3-氯-2,5-二羥基苯甲醇或3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮或3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺或琥珀酸和/或其功能衍生物。
7.權(quán)利要求6所述的方法,其中所述成膜成分是可水解、可溶和不溶樹脂中的一種或幾種聚合物。
8.權(quán)利要求7所述的方法,其中抗污損活性成分是3-氯-2,5-二羥基苯甲醇。
9.權(quán)利要求7所述的方法,其中抗污損活性成分是3-芐基-六氫吡咯并吡嗪-1,4-二酮。
10.權(quán)利要求7所述的方法,其中抗污損活性成分是3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺。
11.權(quán)利要求7所述的方法,其中抗污損活性成分是為琥珀酸。
全文摘要
海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)生抗生物污損(抗菌和/或抗幼蟲附著)化合物。所產(chǎn)生的活性化合物為3-氯-2,5-二羥基苯甲醇,3-芐基-六氫吡咯[1,2-a]并吡嗪-1,4-二酮,3-甲基-N-(2-苯乙基)-丁酰胺和琥珀酸。這些化合物為無毒或低毒無重金屬物質(zhì)。這些活性化合物可以單獨(dú)或組合用于生產(chǎn)對(duì)環(huán)境無害的抗污損涂料活性成分。
文檔編號(hào)C07C229/34GK1800273SQ20051013701
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者錢培元, 李憲璀, 鄺福寧, 楊麗紅, 瑟蓋·弗拉迪米羅維克·多布雷特索維 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)
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