專利名稱：支化聚合物糖及其核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于改性糖及其核苷酸的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肽的表達(dá)后的體外改性是補(bǔ)救那些依賴于由工程化表達(dá)系統(tǒng)控制糖基化的方法的缺陷的有吸收力的策略；包括聚糖結(jié)構(gòu)的改性或聚糖在新部位的引入兩者。可利用重組體真核糖基轉(zhuǎn)移酶的綜合工具箱，使得具有通常設(shè)計(jì)的糖基化模式和糖基結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物復(fù)合糖的體外酶合成成為可能。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/9831826；US2003180835；和WO 03/031464。
基于酶的合成的優(yōu)點(diǎn)是區(qū)域選擇性和立體選擇性。此外，酶合成使用未受保護(hù)的底物進(jìn)行。三種主要類型的酶用于合成碳水化合物，糖基轉(zhuǎn)移酶(如，唾液酸轉(zhuǎn)移酶，寡糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶)，和糖苷酶。糖苷酶進(jìn)一步分類為外切糖苷酶(如，β-甘露糖苷酶，β-葡糖苷酶)，和內(nèi)切糖苷酶(如，Endo-A，Endo-M)。這些類別的酶的每一種成功地在合成上用于制備碳水化合物。作為一般性綜述，參見(jiàn)Crout等人，Curr.Opin.Chem.Biol.298-111(1998)。
糖基轉(zhuǎn)移酶改性糖肽上的低聚糖結(jié)構(gòu)。糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)于產(chǎn)生具有良好立體化學(xué)和區(qū)域化學(xué)控制的特定產(chǎn)物是有效的。糖基轉(zhuǎn)移酶已用于制備低聚糖和改性末端N-和O-連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的糖肽上。例如，將糖肽的末端低聚糖完全唾液酸化和/或巖藻糖基化以提供更一致的糖結(jié)構(gòu)，它改進(jìn)糖肽藥代動(dòng)力學(xué)和各種其它生物性能。例如，β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶用于合成乳糖胺，糖基轉(zhuǎn)移酶在合成碳水化合物中的功用的說(shuō)明(參見(jiàn)，如Wong等人，J；Org Chem.475416-5418(1982))。此外，許多合成過(guò)程使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶以從胞苷-5′-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)移唾液酸到半乳糖的3-OH或6-OH(參見(jiàn)，如Kevin等人，Chem.Eur.J.21359-1362(1996))。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用于從鳥(niǎo)苷-5′-二磷酸巖藻糖轉(zhuǎn)移巖藻糖單元到糖受體的特定羥基的合成途徑。例如，Ichikawa由涉及用克隆的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的唾液酸化乳糖胺的巖藻糖基化的方法制備唾液酸基Lewis-X(Ichikawa等人，J.Am.chem.Soc.1149283-9298(1992))。對(duì)于治療用途的復(fù)合糖合成中的最新進(jìn)展的討論，參見(jiàn)Koeller等人，Nature Biotechnology 18835-841(2000)。也參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；和WO/98 31826。
除調(diào)節(jié)多肽上糖基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)以外，興趣已經(jīng)著眼于制備糖肽，該糖肽被一個(gè)或多個(gè)非糖改性基團(tuán)(如水溶性聚合物)改性。聚(乙二醇)(″PEG″)是結(jié)合到多肽的例示的聚合物。用于衍生肽治療劑的PEG的使用顯示了降低肽的免疫原性。例如，美國(guó)專利號(hào)4,179,337(Davis等人)公開(kāi)了非致免疫多肽，如結(jié)合到聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的酶和肽類激素。每摩爾多肽使用10-100摩爾聚合物。盡管結(jié)合物的體內(nèi)清除時(shí)間相對(duì)于多肽的清除時(shí)間被延長(zhǎng)，但是僅保持約15％生理活性。因此，延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期被肽效力的急劇降低抵銷。
肽活性的損失可直接歸因于用于結(jié)合水溶性聚合物的化學(xué)的非選擇性本質(zhì)。連接PEG(和它的衍生物)到肽的主要模式是通過(guò)肽氨基酸殘基的非特異鍵合。例如，美國(guó)專利號(hào)4,088,538公開(kāi)了共價(jià)結(jié)合到PEG的酶的酶活性聚合物-酶結(jié)合物。相似地，美國(guó)專利號(hào)4,496,689公開(kāi)了α-1蛋白酶抑制因子與聚合物(如PEG)的共價(jià)連接復(fù)合物。Abuchowski等人(J.Biol.Chem.2523578(1977)公開(kāi)了MPEG到牛血清白蛋白的胺基團(tuán)的共價(jià)連接。美國(guó)專利號(hào)4,414,147公開(kāi)了通過(guò)將干擾素連接到二羧酸的酸酐(如聚(乙烯琥珀酸酐))而使干擾素減少疏水性的方法。PCT WO87/00056公開(kāi)了PEG和聚(氧乙基化)多元醇對(duì)例如蛋白質(zhì)(如干擾素-β、白細(xì)胞介素-2和免疫毒素)的結(jié)合。EP 154,316公開(kāi)和要求保護(hù)化學(xué)改性的淋巴因子，如包含直接鍵合到淋巴素至少一個(gè)伯氨基的PEG的IL-2。美國(guó)專利號(hào)4,055,635公開(kāi)了共價(jià)連接到聚合物物質(zhì)(如多糖)的蛋白水解酶的水溶性復(fù)合物的藥物組合物。
連接PEG到肽的另一種模式是通過(guò)糖肽上糖基殘基的非特異性氧化。氧化糖被用作連接PEG部分到肽的部位。例如M′Timku1u(WO94/05332)公開(kāi)了氨基-PEG用于將PEG添加到糖蛋白的用途。糖基部分被隨機(jī)氧化成對(duì)應(yīng)的醛，它隨后偶合到氨基-PEG。
在每種上述方法中，將聚(乙二醇)以隨機(jī)、非特異方式加入到肽主鏈的反應(yīng)性殘基上。對(duì)于治療性肽的生產(chǎn)，很明顯，需要采用導(dǎo)致特異標(biāo)記、可容易表征、基本均勻的產(chǎn)物的形成的衍生策略。制備特異性標(biāo)記肽的有前途的途徑是通過(guò)使用酶(如糖基轉(zhuǎn)移酶)使改性糖部分附加到肽上。改性糖部分必須起糖基轉(zhuǎn)移酶底物的功能并被適當(dāng)?shù)鼗罨?。因此，需要提供獲得活化的改性糖的容易路徑的合成途徑。本發(fā)明提供了這樣的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了聚合物物質(zhì)，結(jié)合到這些聚合物物質(zhì)的糖和活化糖以及包括這些聚合物的核苷酸糖。聚合物物質(zhì)包括水溶性和水不溶性物質(zhì)兩者。此外，聚合物是支化或直鏈聚合物。例示的糖部分包括直鏈和環(huán)狀結(jié)構(gòu)和醛糖以及酮糖。
聚合物改性基團(tuán)可以在糖部分的任何位置連接。在以下的討論中，本發(fā)明通過(guò)參考實(shí)施方案舉例說(shuō)明，其中聚合物改性基團(tuán)連接到呋喃糖的C-5或吡喃糖的C-6。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到討論的焦點(diǎn)是為了更清楚的說(shuō)明，使用在此說(shuō)明的方法和本領(lǐng)域公認(rèn)的方法，聚合物部分可以連接到吡喃糖和呋喃糖兩者的其它位置。
在例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合到聚合物的糖或糖核苷酸 在通式I和I I中，R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基。R2是H、OH或包括核苷酸的基團(tuán)。根據(jù)此實(shí)施方案的例示的R2具有如下通式 其中R8是核苷。
符號(hào)R3，R4，R5，R6和R6′獨(dú)立地表示H、取代或未取代烷基、OR9、NHC(O)R10。標(biāo)記d是0或1。R9和R10獨(dú)立地選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基或唾液酸。R3，R4，R5，R6和R6′中的至少一個(gè)包括聚合物改性部分(如PEG)。在例示的實(shí)施方案中，R6和R6′與它們連接的碳一起是唾液酸側(cè)鏈的組分。在進(jìn)一步例示的實(shí)施方案中，此側(cè)鏈被聚合物改性部分官能化。
在例示的實(shí)施方案中，聚合物部分通常通過(guò)核上的雜原子，通過(guò)連接基L結(jié)合到糖核，如下所示 R11是聚合物部分而L選自鍵和連接基團(tuán)。標(biāo)記w表示選自1-6，優(yōu)選1-3和更優(yōu)選1-2的整數(shù)。例示的連接基團(tuán)包括取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基部分和唾液酸。連接基的例示的組分是?；鶊F(tuán)。
當(dāng)L是一條鍵時(shí)，它在R11的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)和L前體上的補(bǔ)充反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)之間形成。在與R11的反應(yīng)之前，L可以在糖核上就位?；蛘?，R11和L可以被引入預(yù)形成的組合體(cassette)，該預(yù)形成的組合體隨后連接到糖核。如在此說(shuō)明的那樣，具有適當(dāng)反應(yīng)性官能團(tuán)的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此外，前體的結(jié)合用本領(lǐng)域公知的化學(xué)進(jìn)行。
在例示的實(shí)施方案中，L是從氨基酸或小肽(如，1-4個(gè)氨基酸殘基)形成的連接基團(tuán)，提供改性糖，其中聚合物改性部分通過(guò)取代的烷基連接基連接。例示的連接基是甘氨酸。
在例示的實(shí)施方案中，R6包括聚合物改性部分。在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，R6包括聚合物改性部分和連接基L兩者，連接基L結(jié)合改性部分到分子的剩余部分。
在例示的實(shí)施方案中，聚合物改性部分是包括兩個(gè)或多個(gè)連接到中心部分的聚合物鏈的支化結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明這一實(shí)施方案的有用的聚合物改性部分前體的例示的結(jié)構(gòu)具有如下通式
根據(jù)此通式的糖和核苷酸糖基本是純水溶性聚合物。X3′是包括可電離(如，COOH等)或其它反應(yīng)性官能團(tuán)的基團(tuán)(參見(jiàn)，例如下文)。C是碳。X5優(yōu)選是非反應(yīng)性基團(tuán)(如H，未取代烷基，未取代雜烷基)。R12和R13獨(dú)立地是選擇的聚合物臂，如非肽，非反應(yīng)性聚合物臂。X2和X4是優(yōu)選在生理?xiàng)l件下基本非反應(yīng)性的連接片段，它們可以相同或不同。或者，這些連接可包括被設(shè)計(jì)成在生理相關(guān)條件下降解的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)，如酯、二硫化物等。X2和X4結(jié)合聚合物臂R12和R13到C。當(dāng)X3′與連接基、糖或連接基-糖組合體上補(bǔ)充反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)，X3′轉(zhuǎn)化成連接片段X3的組分。
通過(guò)前體與合適的糖或糖連接基的反應(yīng)，本發(fā)明提供了具有如下通式的糖和核苷酸糖 ；和 其中由各種符號(hào)表示的基團(tuán)的鑒別與以上討論的相同。La是取代或未取代烷基或取代或未取代雜烷基基團(tuán)。在例示的實(shí)施方案中，La是唾液酸的側(cè)鏈基團(tuán)，它被所示的聚合物改性部分官能化。
聚合物改性部分包括兩個(gè)或多個(gè)可以是水溶性或基本不溶于水的重復(fù)單元。用于本發(fā)明的化合物的例示的水溶性聚合物包括PEG(如m-PEG)，PPG(如m-PPG)，聚唾液酸，聚谷氨酸酯，聚天冬氨酸酯，聚賴氨酸，聚亞烯亞胺，生物可降解聚合物(如，聚交酯，聚甘油酯)，和官能化PEG，如末端官能化的PEG。
本發(fā)明的聚合物結(jié)合物的糖部分選自天然和非天然呋喃糖和己糖兩者。非天然糖任選地包括烷基化或酰基化羥基和/或胺基團(tuán)，如環(huán)上的醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖包括在環(huán)上位置的H、羥基、醚、酯或酰胺取代基，在天然糖中在該位置不存在這樣的取代基。或者，碳水化合物缺少應(yīng)在衍生其名稱的碳水化合物中發(fā)現(xiàn)的取代基，如脫氧糖。仍然進(jìn)一步的例示的非天然糖包括氧化(如、-酮酸和-糖醛酸)和還原(糖醇)碳水化合物兩者。糖部分可以單糖，低聚糖和多糖。
用于本發(fā)明的例示的天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、巖藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木糖、核糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、和唾液酸。
例示的基于唾液酸的結(jié)合物具有如下通式 其中AA是不包括羧基基團(tuán)的氨基酸殘基的那個(gè)部分而NP是核苷酸磷酸。ONP也可以由活化部分替代以形成活化糖。如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的那樣，聚合物改性部分-連接基也可以在C-6，C-7和/或C-9連接到唾液酸側(cè)鏈。
也提供了生產(chǎn)活化唾液酸-PEG結(jié)合物的合成方法，該結(jié)合物是酶(如糖基轉(zhuǎn)移酶)的合適的底物。該方法包括如下步驟(a)在適于在甘露糖胺和N-保護(hù)的氨基酸之間形成酰胺結(jié)合物的條件下接觸甘露糖胺與活化的N-保護(hù)的氨基酸(或被聚合物改性部分、連接基前體或連接基-聚合物改性部分組合體官能化的氨基酸)；(b)在適于將酰胺結(jié)合物轉(zhuǎn)化成唾液酸酰胺結(jié)合物的條件下接觸酰胺結(jié)合物與丙酮酸鹽和唾液酸醛縮酶；(c)在適于形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物的條件下接觸唾液酸酰胺結(jié)合物與胞苷三磷酸和合成酶；(d)從胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物脫除N-保護(hù)基團(tuán)，由此產(chǎn)生游離胺；和(e)接觸游離胺與活化的PEG(直鏈或支化的)，由此形成胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
核苷可以選自天然和非天然核苷兩者。用于本發(fā)明的例示的天然核苷包括胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。本領(lǐng)域充分展示了非天然核苷的結(jié)構(gòu)和它們的制備方法。
本發(fā)明的例示的改性糖核苷酸包括聚合物改性的GDP-Man，GDP-Fuc，UDP-Gal，UDP-GalNAc，UDP-Glc，UDP-GlcNAc，UDP-Glc，UDP-GlcUA和CMP-SA等。例子包括UDP-Gal-2′-NH-PEG，UDP-Glc-2′-NH-PEG，CMP-5′-PEG-SA等。由本發(fā)明覆蓋的化合物包括其中L-R11部分結(jié)合到呋喃糖或吡喃糖的那些，如在呋喃糖的C-5或在吡喃糖的C-6，通常通過(guò)連接到此碳原子的雜原子。
當(dāng)本發(fā)明的化合物是核苷酸糖或活化糖時(shí)，核苷酸糖的聚合物結(jié)合物通常是酶的底物，該酶轉(zhuǎn)移糖部分和它的聚合物取代基到底物的適當(dāng)受體部分上。因此，本發(fā)明也提供了使用核苷酸糖或活化糖和適當(dāng)酶的聚合物結(jié)合物通過(guò)糖結(jié)合改性的底物。可以使用本發(fā)明的化合物進(jìn)行糖結(jié)合的底物包括肽(如糖肽、肽)、脂質(zhì)(如糖脂)和配基(鞍氨醇，神經(jīng)酰胺)。


圖1是唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表，對(duì)于該唾液酸轉(zhuǎn)移酶，選擇的改性唾液酸核苷酸和活化糖是底物。
圖2是制備唾液酸-聚(乙二醇)結(jié)合物的本發(fā)明的通用合成方案。
圖3是制備唾液酸-甘氨酰-聚(乙二醇)結(jié)合物的本發(fā)明的合成方案。
發(fā)明詳述和實(shí)施方案縮寫(xiě)支化和未支化PEG，聚(乙二醇)，如m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；支化和未支化PPG，聚(丙二醇)，如m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；Gal NAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸酯；Sia，唾液酸；和NeuAc，N-乙酰神經(jīng)氨基。
定義術(shù)語(yǔ)″唾液酸″表示九個(gè)碳羧基化糖家族的任何成員。唾液酸家族的最通常成員是N-乙?；?神經(jīng)氨酸(2-酮基-5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃糖-1-酮酸(通?？s寫(xiě)為Neu5Ac，NeuAc，或NANA)。家族的第二成員是N-羥乙?；?神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；橇u基化的。第三個(gè)唾液酸家族成員是2-酮基-3-脫氧-壬酮糖酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamor i等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。也包括9-取代唾液酸如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac如9-O-lactyl-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。對(duì)于唾液酸家族的綜述參見(jiàn)，如Varki，Glycobiology 225-40(1992)；唾液酸化學(xué)，代謝和功能，R.Schauer，Ed.(Springer-Yerlag，紐約(1992))。唾液酸化合物的合成和在唾液酸化中的用途公開(kāi)于1992年10月1日公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)WO 92/16640。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″改性糖″(modified sugar)表示在本發(fā)明的方法中酶法加成到肽的氨基酸或糖基殘基上的天然或非天然碳水化合物。改性糖選自許多酶底物，包括但不限于糖核苷酸(單-，二-，和三-磷酸)，活化糖(如，糖基鹵化物，糖基甲磺酸酯)和既未活化也不是核苷酸的糖?！甯男蕴恰逵伞甯男曰鶊F(tuán)″(modifying group，或稱修飾基團(tuán))共價(jià)官能化。有用的改性基團(tuán)包括但不限于水溶性聚合物、治療部分(moieties，或稱基團(tuán))、診斷部分、生物分子等。改性基團(tuán)優(yōu)選不是天然的或未改性碳水化合物。選擇由改性基團(tuán)的官能化部位使得它不防止″改性糖″被酶法加成到肽。
術(shù)語(yǔ)″水溶性″表示在水中具有一定可檢測(cè)程度的溶解度的部分。檢測(cè)和/或定量化水溶解度的方法是本領(lǐng)域公知的。例示的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可具有混合序列或由單一氨基酸組成，如聚(賴氨酸)。例示的多糖是聚(唾液酸)。例示的聚(醚)是聚(乙二醇)，如m-PEG。聚(乙烯亞胺)是例示的聚胺，和聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。例示的聚合物典型地由2-8個(gè)聚合物單元組成。
水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即PEG)。然而，應(yīng)當(dāng)理解其它相關(guān)聚合物也適用于本發(fā)明的實(shí)施，并且術(shù)語(yǔ)PEG或聚(乙二醇)的使用希望在此方面是包括性的和不是排它性的。術(shù)語(yǔ)PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG，二官能PEG，多臂PEG，叉狀PEG，支化PEG，懸垂(pendent)PEG(即含有一個(gè)或多個(gè)懸垂于聚合物主鏈的官能團(tuán)的PEG或相關(guān)聚合物)，或其中具有可降解鍵的PEG。
聚合物主鏈可以是線性或支化的。支化聚合物主鏈通常是本領(lǐng)域已知的。典型地，支化聚合物含有中心支化核部分和多個(gè)連接到中心支化核的線性聚合物鏈。PEG通常以支化形式使用，它可以通過(guò)將環(huán)氧乙烷加成到各種多元醇(如甘油、季戊四醇和山梨醇)而制備。中心支化部分也可以衍生自幾種氨基酸，如賴氨酸。支化聚(乙二醇)可以用通用形式表示為R(-PEG-OH)m，其中R表示核部分，如甘油或季戊四醇，而m表示臂的數(shù)目。多臂PEG分子，如在美國(guó)專利號(hào)5,932,462中描述的那些也可以用作聚合物主鏈，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。
許多其它聚合物也適于本發(fā)明。非肽和水溶性，具有2-約300個(gè)末端的聚合物主鏈特別適用于本發(fā)明。合適的聚合物的例子包括但不限于其它聚(亞烷基二醇)，如聚(丙二醇)(″PPG″)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯屬醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯(polyphosphazene)、聚_唑啉，聚(N-丙烯?；鶈徇?，如美國(guó)專利號(hào)5,629,384所述，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考，及其共聚物、三元共聚物和混合物。盡管聚合物主鏈的每個(gè)鏈的分子量可變化，它典型地為約100Da-約100,000Da，通常約6,000Da-約80,000Da。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″糖結(jié)合″表示改性糖物質(zhì)到多肽(如本發(fā)明的突變的人生長(zhǎng)激素)的氨基酸或糖基殘基的酶介導(dǎo)的結(jié)合?！逄墙Y(jié)合″的亞類是″二醇-PEG化″，其中改性糖的改性基團(tuán)是聚(乙二醇)，及其烷基衍生物(如，m-PEG)或反應(yīng)性衍生物(如，H2N-PEG，HOOC-PEG)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″糖基連接基團(tuán)″表示改性基團(tuán)(如，PEG部分，治療部分，生物分子)共價(jià)連接到其上的糖基殘基；糖基連接基團(tuán)結(jié)合改性基團(tuán)到結(jié)合物的剩余部分。在本發(fā)明的方法中，″糖基連接基團(tuán)″共價(jià)連接到糖基化或非糖基化肽，由此將試劑連接到肽的氨基酸和/或糖基殘基?！逄腔B接基團(tuán)″通常由″改性糖″到肽的氨基酸和/或糖基殘基的酶連接而衍生自″改性糖″。糖基連接基團(tuán)可以是在改性基團(tuán)-改性糖組合體形成期間降解的糖衍生結(jié)構(gòu)(如，氧化→席夫堿形成→還原)，或糖基連接基團(tuán)可以是完整的?！逋暾奶腔B接基團(tuán)″表示衍生自糖基部分的連接基團(tuán)，其中連接改性基團(tuán)和到結(jié)合物的剩余部分的糖單體不降解，如氧化(如被偏高碘酸鈉氧化)。本發(fā)明的″完整的糖基連接基團(tuán)″可以通過(guò)糖基單元的加成或一個(gè)或多個(gè)糖基單元從母糖結(jié)構(gòu)的脫除衍生自天然低聚糖。
在取代基被從左到右書(shū)寫(xiě)的它們常規(guī)的化學(xué)式指定情況下，它們同等地包括化學(xué)上一致的取代基，該化學(xué)上一致的取代基來(lái)自從右向左書(shū)寫(xiě)的結(jié)構(gòu)，如-CH2O-也被寫(xiě)作-OCH2-。
術(shù)語(yǔ)″烷基″自身或作為另一個(gè)取代基的一部分，除非另外說(shuō)明，表示直鏈或支鏈、或環(huán)狀烴基、或其組合，它們可以是完全飽和的、單或多不飽和的并且可包括二價(jià)和多價(jià)目基團(tuán)，具有指定的碳原子數(shù)目(即C1-C10表示1-10個(gè)碳)。飽和烴基的例子包括但不限于基團(tuán)如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基、(例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的)同系物和異構(gòu)體等。不飽和烷基是具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的例子包括，但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、和高級(jí)同系物和異構(gòu)體。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)″烷基″也用于包括以下更詳細(xì)定義的烷基衍生物，如″雜烷基″。限于烴基的烷基稱為″均烷基″。
術(shù)語(yǔ)″亞烷基″自身或作為另一個(gè)取代基的一部分表示衍生自烷烴的二價(jià)基團(tuán)，如例示的為，但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并進(jìn)一步包括以下描述為″雜亞烷基″的那些基團(tuán)。典型地，烷基(或亞烷基)含有1-24個(gè)碳原子，并且含有10個(gè)或更少碳原子的那些基團(tuán)在本發(fā)明中是優(yōu)選的。″低級(jí)烷基″或″低級(jí)亞烷基″是更短鏈烷基或亞烷基，通常含有8個(gè)或更少碳原子。
術(shù)語(yǔ)″烷氧基″，″烷基氨基″和″烷基硫代″(或硫代烷氧基)以它們常規(guī)的意義使用，并且表示分別通過(guò)氧原子，氨基，或硫原子連接到分子剩余部分的那些烷基。
術(shù)語(yǔ)″雜烷基″自身或與另一個(gè)術(shù)語(yǔ)結(jié)合，除非另外說(shuō)明，表示直鏈或支鏈、或環(huán)狀烴基、或其組合，由所述數(shù)目的碳原子和至少一個(gè)雜原子組成，該雜原子選自O(shè)、N、Si和S，并且其中氮和硫原子可任選地被氧化而氮雜原子任選地被季化。一個(gè)或多個(gè)雜原子O，N和S和Si可以位于雜烷基的任何內(nèi)部位置或位于烷基連接到分子剩余部分的位置。例子包括，但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH-CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。相似地，術(shù)語(yǔ)″雜亞烷基″按自身或作為另一個(gè)取代基的一部分表示衍生自雜烷基的二價(jià)基團(tuán)，如例示的為，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于雜亞烷基，雜原子也可占據(jù)一個(gè)或兩個(gè)鏈末端(如，亞烷氧基，亞烷基二氧基，亞烷基氨基，亞烷基二氨基等)。仍然進(jìn)一步，對(duì)于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)的取向不被書(shū)寫(xiě)連接基團(tuán)的通式的方向暗示。例如，通式-C(O)2R′-表示-C(o)2R′-和-R′C(O)2-兩者。
術(shù)語(yǔ)″環(huán)烷基″和″雜環(huán)烷基″按它們自身或與其它術(shù)語(yǔ)結(jié)合，除非另外說(shuō)明，分別表示″烷基″和″雜烷基″的環(huán)狀形式。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)連接到分子剩余部分的位置。環(huán)烷基的例子包括，但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的例子包括，但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)，1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
術(shù)語(yǔ)″鹵代″或″鹵素″按它們自身或作為另一個(gè)取代基的一部分，除非另外說(shuō)明，表示氟、氯、溴或碘原子。另外，術(shù)語(yǔ)如″鹵代烷基″意在包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術(shù)語(yǔ)″鹵代(C1-C4)烷基″意在包括，但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
術(shù)語(yǔ)″芳基″除非另外說(shuō)明，表示可以是單個(gè)環(huán)或多個(gè)環(huán)(優(yōu)選1-3個(gè)環(huán))的多不飽和、芳香的取代基，它們稠合在一起或共價(jià)連接。術(shù)語(yǔ)″雜芳基″表示包含1-4個(gè)雜原子的芳基(或環(huán))，該雜原子選自N，O，和S，其中氮和硫原子任選地被氧化，而氮原子任選地被季化。雜芳基可以通過(guò)雜原子連接到分子的剩余部分。
芳基和雜芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-_唑基、4-_唑基、2-苯基-4-_唑基、5-_唑基、3-異_唑基、4-異_唑基、5-異_唑基、2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氫苯并[1，4]二_英-6-基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。每個(gè)以上提及的芳基和雜芳基環(huán)體系的取代基選自上述的可接受取代基。
為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，術(shù)語(yǔ)″芳基″當(dāng)與其它術(shù)語(yǔ)(如，芳氧基，芳基硫氧基，芳基烷基)結(jié)合使用時(shí)包括以上定義的芳基和雜芳基環(huán)兩者。因此，術(shù)語(yǔ)″芳基烷基″用于包括那些基團(tuán)，其中芳基連接到烷基(如，芐基，苯乙基，吡啶基甲基等)，所述烷基包括那些烷基，其中碳原子(如，亞甲基)被例如氧原子替代(如，苯氧基甲基，2-吡啶氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等)。
每個(gè)上述術(shù)語(yǔ)(如，″烷基，″″雜烷基，″″芳基″和″雜芳基″)意在包括指定的基團(tuán)的取代和未取代形式兩者。以下提供了每種類型基團(tuán)的優(yōu)選取代基。
烷基和雜烷基(包括通常稱為亞烷基，烯基，雜亞烷基，雜烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)烷基，環(huán)烯基，和雜環(huán)烯基的那些)的取代基通常稱為″烷基取代基″，并且它們可以是選自，但不限于如下的各種基團(tuán)中的一種或多種數(shù)目為零到(2m′+1)的-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其中m′是這樣的基團(tuán)中碳原子的總數(shù)目。R′，R″，R_和R″″每個(gè)優(yōu)選獨(dú)立地表示氫、取代或未取代雜烷基、取代或未取代芳基，如被1-3個(gè)鹵素取代的芳基、取代或未取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如每個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地選擇，象每個(gè)R′，R″，R_和R″″基團(tuán)那樣(當(dāng)多于一個(gè)的這些基團(tuán)存在時(shí))。當(dāng)R′和R″連接到相同的氮原子時(shí)，它們可以與氮原子結(jié)合以形成5-，6-，或7-元環(huán)。例如，-NR′R″意在包括，但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從取代基的以上討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)″烷基″意在包括下列基團(tuán)，所述基團(tuán)包括結(jié)合到氫原子以外的基團(tuán)的碳原子，如鹵代烷基(如、-CF3和-CH2CF3)和?；?如、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
相似于對(duì)于烷基所述的取代基，對(duì)于芳基和雜芳基的取代基通常稱為″芳基取代基″。取代基選自，例如鹵素、-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-鹵素、-SiR′R″R_、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R_、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R_)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR_、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(o)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，數(shù)目為從零到芳族環(huán)體系上開(kāi)放化合價(jià)的總數(shù)目；并且其中R′，R″，R_和R″″優(yōu)選獨(dú)立地選自氫、取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基、取代或未取代芳基和取代或未取代雜芳基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，例如每個(gè)R基團(tuán)獨(dú)立地選擇，象每個(gè)R′，R″，R′″和R″″基團(tuán)那樣(當(dāng)多于一個(gè)的這些基團(tuán)存在時(shí))。在以下的方案中，符號(hào)X表示上述的″ R″。
在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被通式為-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替代，其中T和U獨(dú)立地是-NR-、-O-、-CRR′-或單鍵，而q是0-3的整數(shù)。或者，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被通式為-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B獨(dú)立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或單鍵，而r是1-4的整數(shù)。這樣形成的新環(huán)的單鍵中的一個(gè)可任選地被雙鍵替代?；蛘撸诜蓟螂s芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被通式為-(CRR′)s-X-(CR″R′″)d-的取代基替代，其中s和d獨(dú)立地是0-3的整數(shù)，而X是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR′-。取代基R，R′，R″和R′″優(yōu)選獨(dú)立地選自氫或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″雜原子″意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
PEG的反應(yīng)性衍生物(或其它連接基)連接一個(gè)或多個(gè)肽部分到連接基的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明不被反應(yīng)性PEG類似物的特性限制。聚(乙二醇)的許多活化衍生物是市售的和文獻(xiàn)中可得到。選擇和(如果需要)合成適當(dāng)?shù)幕罨疨EG衍生物是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)(采用該衍生物以制備用于本發(fā)明的底物)。參見(jiàn)Abuchowski等人Cancer Biochem.Bophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，tresylate(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基琥珀酰亞胺衍生物活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等人，聚(乙二醇)化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)療應(yīng)用，Harris，Ed.，P1enum Press，紐約，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，咪唑基甲酸酯(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等人，Blood，711641-1647(1988))，4-二硫代吡啶(Woghiren等人，Biocon jugate Chem.，4314-318(1993))，異氰酸酯(Byun等人，ASAIOJournal，M649-M-653(1992))和環(huán)氧化物(美國(guó)專利號(hào)4,806,595，授予Noishiki等人，(1989)。其它連接基團(tuán)包括在氨基和活化PEG之間的尿烷鍵。參見(jiàn)Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
術(shù)語(yǔ)″氨基酸″表示天然和合成氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及以后改性的那些氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物表示與天然氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即α碳結(jié)合到氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)，如高絲氨酸、原亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這樣的類似物含有改性R基團(tuán)(如，原亮氨酸)或改性肽主鏈，但保持與天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。″氨基酸模擬物″表示結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的通用化學(xué)結(jié)構(gòu)，但采用與天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。
″肽″表示聚合物，其中單體是氨基酸、氨基酸類似物和/或氨基酸模擬物并且通過(guò)酰胺鍵結(jié)合在一起，或者稱為多肽。另外，也包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。不是基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明。此外，改性以包括反應(yīng)性基團(tuán)、糖基化部位、聚合物、治療部分、生物分子等的氨基酸也可用于本發(fā)明。用于本發(fā)明的所有氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。通常優(yōu)選是L-異構(gòu)體。此外，其它肽模擬物也可用于本發(fā)明。在此使用的″肽″表示糖基化和非糖基化肽兩者。也包括由表達(dá)肽的體系不完全糖基化的肽。對(duì)于通用綜述，參見(jiàn)Spatola，A.F.，氨基酸，肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，紐約，p.267(1983)。
術(shù)語(yǔ)″核苷″表示糖基胺，該糖基胺是核酸的組分并且包括連接到β-D-呋喃核糖以形成核糖核苷，或連接到2-脫氧-β-D-呋喃核糖以形成脫氧核糖核苷的含氮堿基。堿基可以是嘌呤如，腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤，或嘧啶如，胸苷，胞苷，尿苷或假尿苷。核苷也包括被微生物使用的不常見(jiàn)核苷。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″靶向部分″表示在身體的特定組織或區(qū)域中選擇性定位的種類。定位由分子決定子的特定識(shí)別、靶向劑或結(jié)合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等介導(dǎo)。靶向試劑到特定組織或區(qū)域的其它機(jī)理是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例示的靶向部分包括抗體、抗體片段、鐵傳遞蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，EPO等。
在此使用的″治療部分″表示用于治療的任何試劑，包括，但不限于、抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥、細(xì)胞毒素、和放射性試劑?！逯委煵糠帧灏ㄉ锘钚詣┑乃幬锴绑w，構(gòu)建物(其中一個(gè)以上的治療部分結(jié)合到載體，如多價(jià)試劑)。治療部分也包括蛋白質(zhì)和包括蛋白質(zhì)的構(gòu)建物。例示的蛋白質(zhì)包括，但不限于紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、干擾素(如，干擾素-α、-β、-γ)，白細(xì)胞介素(如，白細(xì)胞介素II)，血清蛋白(如，因子VII，VIIa，VIII，IX，和X)、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵胞激素(FSH)和促黃體素(LH)和抗體融合蛋白(如腫瘤壞死因子受體((TNFR)/Fc域融合蛋白))。
在此使用的″抗腫瘤藥″表示用于對(duì)抗癌癥的任何試劑，包括，但不限于細(xì)胞毒素和試劑(如抗代謝物、烷基化試劑、蒽環(huán)類化合物、抗生素、抗有絲分裂劑、丙卡巴肼、羥基脲、門冬酰胺酶、皮質(zhì)激素、干擾素和放射性試劑)。也包括在術(shù)語(yǔ)″抗腫瘤藥″的范圍內(nèi)的是具有抗腫瘤活性的肽，如TNF-α的結(jié)合物。結(jié)合物包括，但不限于在治療性蛋白質(zhì)和本發(fā)明的糖蛋白之間形成的那些。代表性的結(jié)合物在PSGL-1和TNF-α之間形成。
在此使用的″細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒試劑″表示對(duì)細(xì)胞有害的任何試劑。例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(authracinedione)、米托蒽醌、金霉素、放線霉素D、1-去氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同系物。其它毒素包括，例如蓖麻毒素、CC-1065和類似物、倍癌霉素(duocarmycin)。進(jìn)一步的其它毒素包括diptheria毒素、和蛇毒(如，眼鏡蛇蛇毒)。
在此使用的″放射性試劑″包括有效診斷或破壞腫瘤的任何放射性同位素。例子包括，但不限于銦-111、鈷-60。另外，天然放射性元素如鈾、鐳、和釷(它們通常表示放射性同位素的混合物)是放射性試劑的合適例子。金屬離子典型地與有機(jī)螯合部分螯合。
許多有用的螯合基團(tuán)、冠醚、穴狀配體等是本領(lǐng)域已知的并且可以引入本發(fā)明的化合物(如，EDTA，DTPA，DOTA，NTA，HDTA等和它們的膦酸酯類似物如DTPP，EDTP，HDTP，NTP等)。參見(jiàn)，例如Pitt等人，″用于鐵超負(fù)荷的治療的螯合劑的設(shè)計(jì)，″于INORGANIC CHEMISTRY INBIOLOGY AND MEDICINE；Martell，Ed.；美國(guó)化學(xué)會(huì)，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，大環(huán)配體復(fù)合物的化學(xué)；CambridgeUniversity Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，紐約，1989，以及其中包含的參考文獻(xiàn)。
另外，允許螯合劑、冠醚和環(huán)糊精到其它分子的連接的多樣途徑是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。參見(jiàn)，例如Meares等人，″體內(nèi)螯合物-標(biāo)記蛋白質(zhì)和多肽的性能?！逵贛ODIFICATION OF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS；″Feeney，等人，Eds.，美國(guó)化學(xué)會(huì)，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Biocon jugate Chem.，9108-117(1998)；Song等人，Biocon jugateChem.，8249-255(1997)。
介紹本發(fā)明提供了聚合物物質(zhì)，以及結(jié)合到這些聚合物的糖、活化糖、和核苷酸糖。核苷酸糖的聚合物結(jié)合物通常是酶的底物，所述酶轉(zhuǎn)移糖部分和它的聚合物取代基到底物的適當(dāng)受體部分上。因此，本發(fā)明也提供了使用核苷酸糖和適當(dāng)酶的聚合物結(jié)合物通過(guò)糖結(jié)合改性的底物。可以使用本發(fā)明的化合物進(jìn)行糖結(jié)合的底物包括肽，如糖肽，脂質(zhì)，如配糖酯和配基(鞍氨醇，神經(jīng)酰胺)。
如在先前部分中討論的那樣，本領(lǐng)域公認(rèn)的共價(jià)PEG化的化學(xué)方法依賴于通過(guò)反應(yīng)性基團(tuán)在氨基酸或碳水化合物上的化學(xué)結(jié)合。通過(guò)對(duì)結(jié)合物和反應(yīng)條件的仔細(xì)設(shè)計(jì)，使用化學(xué)介導(dǎo)的結(jié)合策略制備有用的結(jié)合物。聚合物對(duì)蛋白質(zhì)或糖蛋白的化學(xué)結(jié)合的主要缺點(diǎn)是缺乏活化聚合物的選擇性，它通常導(dǎo)致在涉及蛋白質(zhì)或糖蛋白生物活性的部位的聚合物的連接。已開(kāi)發(fā)了幾種方案以解決部位選擇性結(jié)合化學(xué)，然而，僅開(kāi)發(fā)了適于各種重組蛋白質(zhì)的一種通用方法。
與本領(lǐng)域公認(rèn)的方法形成對(duì)照，本發(fā)明提供了化合物，該化合物以新穎的策略用于支化水溶性聚合物的高度選擇性、部位定向的糖結(jié)合，如糖-PEG化。在本發(fā)明的例示的實(shí)施方案中，支化水溶性聚合物的部位定向連接通過(guò)特異肽序列的體外酶糖基化、使用本發(fā)明的核苷酸糖或活化糖完成。糖-結(jié)合可以采用糖基轉(zhuǎn)移酶(如唾液酸轉(zhuǎn)移酶)用酶法進(jìn)行，該轉(zhuǎn)移酶能夠轉(zhuǎn)移物質(zhì)支化水溶性聚合物-糖(如PEG-唾液酸)到糖基化部位(″糖-PEG化″)。
如以上討論的那樣，本發(fā)明提供了被聚合物部分改性的具有任何所需碳水化合物結(jié)構(gòu)的糖結(jié)合物。糖核苷酸和基于這些糖結(jié)構(gòu)的活化糖也是本發(fā)明的組成部分。聚合物改性部分由酶法，化學(xué)法或其組合連接到糖部分，由此產(chǎn)生改性核苷酸糖。糖被聚合物改性部分在任何所需位置取代。在例示的實(shí)施方案中，糖是在一個(gè)或多個(gè)C-1，C-2，C-3，C-4或C-5處取代的呋喃糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了被聚合物改性部分在一個(gè)或多個(gè)C-1，C-2，C-3，C-4，C-5或C-6取代的吡喃糖。優(yōu)選，聚合物改性部分直接連接到從碳懸垂的氧、氮或硫。或者， 聚合物改性部分連接到位于糖和改性部分之間的連接基。連接基連接到從選擇的碳懸垂的氧、氮或硫。
在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物改性部分附加到一定位置，選擇該位置使得獲得的結(jié)合物起酶底物的作用，該酶用于結(jié)合改性糖部分到另一種物質(zhì)，如肽、糖肽、脂質(zhì)、糖脂等。例示的酶在此更詳細(xì)地討論并包括糖基轉(zhuǎn)移酶(唾液酸轉(zhuǎn)移酶，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，半乳糖轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰半乳糖轉(zhuǎn)移酶，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶等)。本發(fā)明的例示的糖核苷酸和活化糖結(jié)合物也包括突變體糖苷酶和突變體糖神經(jīng)酰胺酶的底物，改性該底物以具有合成、而不是水解活性。
在例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合物包括結(jié)合到一種或多種聚合物(如支化聚合物)的糖、活化糖或核苷酸糖。例示的聚合物包括水溶性和水不溶性類別兩者。
在例示的實(shí)施方案中，聚合物改性基團(tuán)直接或間接連接到吡喃糖或呋喃糖。例如 ；和 在通式I和II中，R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基。R2是H、OH、NH或包括核苷酸的部分。根據(jù)此實(shí)施方案的例示的R2具有如下通式 其中X1表示O或NH和R8是核苷。
符號(hào)R3，R4，R5，R6和R6′獨(dú)立地表示H、取代或未取代烷基、OR9、NHC(O)R10。標(biāo)記d是0或1。R9和R10獨(dú)立地選自H、取代或未取代烷基、取代或未取代雜烷基或唾液酸。R3，R4，R5，R6，和R6′中的至少一個(gè)包括聚合物改性部分(如PEG)。在例示的實(shí)施方案中，R6和R6′中與它們連接的碳一起是唾液酸側(cè)鏈的組分。在仍然進(jìn)一步例示的實(shí)施方案中，此側(cè)鏈被聚合物改性部分(或連接基-聚合物改性部分)在一個(gè)或多個(gè)C-6，C-7或C-9改性。
符號(hào)R3，R4，R5和R6獨(dú)立地表示H、OR9、NHC(O)R10。R9和R10獨(dú)立地選自H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基。R3，R4，R5，R6，和6′中的至少一個(gè)包括聚合物改性部分。
在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，糖部分是氧化和結(jié)合到聚合物改性部分的唾液酸部分，如描述于普通轉(zhuǎn)讓的U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)No._____(代理人案卷號(hào)No.040853-01-5150)，提交日2005年1月6日。
在例示的實(shí)施方案中，聚合物改性部分通過(guò)連接基結(jié)合到糖核 其中R11是聚合物部分而L選自鍵和連接基團(tuán)，而w是1-6，優(yōu)選1-3和更優(yōu)選1-2的整數(shù)。
當(dāng)L是鍵時(shí)，它在R11的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)與L前體上的補(bǔ)充反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)之間形成。如在此說(shuō)明的那樣，具有適當(dāng)反應(yīng)性官能團(tuán)的前體的選擇和制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此外，按照本領(lǐng)域公知的化學(xué)進(jìn)行前體結(jié)合。
在例示的實(shí)施方案中，L是從氨基酸、氨基酸模擬物、或小肽(如，1-4個(gè)氨基酸殘基)形成的連接基團(tuán)，提供改性糖，其中聚合物改性部分通過(guò)取代的烷基連接基連接。連接基通過(guò)氨基酸的胺部分和羧酸(或反應(yīng)性衍生物，如活性酯，酰鹵等)的反應(yīng)形成，該氨基酸具有L和R11前體上的補(bǔ)充反應(yīng)性的基團(tuán)。結(jié)合物的元素可以采用基本上任何方便的順序結(jié)合。例如在結(jié)合R11和L的前體之前，L的前體可以在糖核上就位?；蛘?，L上帶有反應(yīng)性官能度的R11-L組合體(cassette)并隨后通過(guò)此物質(zhì)上補(bǔ)充反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)連接到糖。
在例示的實(shí)施方案中，聚合物改性部分是R3和/或R6。在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，R3和/或R6包括聚合物改性部分和連接基L兩者，連接基L結(jié)合聚合物部分到分子的剩余部分。在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，聚合物改性部分是R3。在再一個(gè)例示的實(shí)施方案中，R3包括聚合物改性部分和連接物L(fēng)兩者，連接物L(fēng)結(jié)合聚合物部分到分子的剩余部分。在又一個(gè)例示的實(shí)施方案中，其中糖是唾液酸，聚合物改性部分在R5處或在唾液酸側(cè)鏈的位置，如C-9處連接。
線性聚合物結(jié)合物在例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與線性聚合物(如水溶性或水不溶性聚合物)之間形成的糖或活化糖結(jié)合物或核苷酸糖結(jié)合物。在本發(fā)明的結(jié)合物中，聚合物連接到糖、活化糖或糖核苷酸。如在此討論的那樣，聚合物直接或通過(guò)連接基連接到糖部分。
根據(jù)此實(shí)施方案的例示的化合物具有根據(jù)通式I或II的結(jié)構(gòu)，其中至少一個(gè)R1，R3，R4，R5或R6具有如下通式 根據(jù)此實(shí)施方案的另一個(gè)例子具有如下通式 其中s是0-20的整數(shù)而R11是線性聚合物改性部分。
任何分子量(如2Kda，5Kda，10Kda，20Kda，30Kda和40Kda)的PEG部分均可用于本發(fā)明。
支化聚合物結(jié)合物在例示的實(shí)施方案中，聚合物改性部分是包括兩個(gè)或多個(gè)連接到中心部分的聚合物鏈的具有如下通式的支化結(jié)構(gòu) 其中R11和L如以上所討論并且w′是2-6、優(yōu)選2-4和更優(yōu)選2-3的整數(shù)。
用于形成根據(jù)本發(fā)明此實(shí)施方案的結(jié)合物的例示的前體具有如下通式 根據(jù)此通式的支化聚合物是基本純的水溶性聚合物。X3′是包括可電離(如COOH、H2PO4、HSO3、HPO3等)或其它反應(yīng)性官能團(tuán)的部分，如下文所述。C是碳。X5優(yōu)選是非反應(yīng)性基團(tuán)(如，H，未取代烷基，未取代雜烷基)，并且可以是聚合物臂。R12和R13獨(dú)立地是選擇的聚合物臂，如非肽、非反應(yīng)性聚合物臂。X2和X4優(yōu)選是在生理?xiàng)l件下基本非反應(yīng)性的連接片段，它們可以相同或不同?；蛘?，這些鍵可包括一個(gè)或多個(gè)被設(shè)計(jì)成在生理相關(guān)條件下降解的部分，如酯、二硫化物等。X2和X4結(jié)合聚合物臂R12和R13到C。當(dāng)X3′與連接基、糖或連接基-糖組合體上補(bǔ)充反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)，X3′轉(zhuǎn)化成連接片段X3的組分。
X2和X4的例示的連接片段包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)aO、(CH2)aS或(CH2)aY′-PEG或(CH2)aY′-PEG，其中Y′是S或O而a是1-50的整數(shù)。
在例示的實(shí)施方案中，前體(III)，或其活化衍生物通過(guò)在X3′和糖部分上補(bǔ)充反應(yīng)性的基團(tuán)之間的反應(yīng)結(jié)合到糖、活化糖或糖核苷酸。或者，X3′與前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)成連接基L。通式I和II的一個(gè)或多個(gè)R1，R3，R4，R5或R6可包括支化聚合物改性部分。
在例示的實(shí)施方案中，如下部分 是連接基臂L。在此實(shí)施方案中，例示的連接基衍生自天然或非天然氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物、或從一種或多種這樣的物質(zhì)形成的小肽。例如，在本發(fā)明的化合物中發(fā)現(xiàn)的某些支化聚合物具有如下通式 Xa是通過(guò)支化聚合物改性部分和糖部分的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)的反應(yīng)、或前體到連接基的反應(yīng)形成的連接部分。例如，當(dāng)X3′是羧酸時(shí)，它可以活化并直接結(jié)合到從氨基-糖(如，GalNH2，G1cNH2，ManNH2等)懸垂的胺基團(tuán)，形成是酰胺的Xa。以下描述另外的例示的反應(yīng)性官能團(tuán)和活化前體。標(biāo)記c表示1-10的整數(shù)。其它符號(hào)具有與以上討論的那些相同的同一性。
在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，Xa是采用另一個(gè)連接基形成的連接部分 其中Xb是連接部分并且獨(dú)立地選自對(duì)于Xa說(shuō)明的那些基團(tuán)，而L1是鍵、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基。
Xa和Xb的例示的物質(zhì)包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
例如， 其中s是0-20的整數(shù)而R11是線性聚合物改性部分。
在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，X4是結(jié)合到R13的肽鍵，它是氨基酸，二-肽或三-肽，其中α-胺部分和/或側(cè)鏈雜原子被聚合物改性。
在進(jìn)一步例示的實(shí)施方案中，R6包括支化聚合物改性基團(tuán)并且改性糖或核苷酸糖具有選自如下的通式 ；和 其中由各種符號(hào)表示的基團(tuán)的特性與以上討論的相同。La是取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基部分。在例示的實(shí)施方案中，La是唾液酸側(cè)鏈的部分，唾液酸被所示的聚合物改性部分改性。
在仍然另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有如下通式的糖和核苷酸糖
由各種符號(hào)表示的基團(tuán)的特性與以上討論的相同。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，通式VI和VIII中的連接基臂同樣適用于在此說(shuō)明的其它改性糖。
以上說(shuō)明的本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步參考下列物質(zhì)舉例說(shuō)明，所述物質(zhì)中聚合物是水溶性聚合物，特別是聚(乙二醇)(″PEG″)，如甲氧基-聚(乙二醇)(″m-PEG″)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到以下內(nèi)容中的重點(diǎn)是為清楚的說(shuō)明和使用PEG作為例示的聚合物的各種基序同樣適用于其中采用PEG以外的聚合物的物質(zhì)。
水溶性聚合物許多水溶性聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可用于實(shí)施本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)水溶性聚合物包括物質(zhì)如糖(如葡聚糖，直鏈粉淀，透明質(zhì)酸，聚(唾液酸)，類肝素，肝素等)；聚(氨基酸)，如聚(門冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(如聚(丙烯酸)、聚(醚)，如聚(乙二醇)；肽，蛋白質(zhì)等。聚合物典型地包括至少兩個(gè)聚合物單元。在例示的實(shí)施方案中，聚合物是2-25個(gè)單元。在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，聚合物包括2-8個(gè)聚合物單元。本發(fā)明可以采用任何水溶性聚合物實(shí)施，僅有的限制在于聚合物必須包括結(jié)合物剩余部分可以連接于其上的點(diǎn)。
聚合物的活化方法也可以見(jiàn)于WO 94/17039，美國(guó)專利號(hào)5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，美國(guó)專利號(hào)5,219,564，美國(guó)專利號(hào)5,122,614，WO 90/13540，美國(guó)專利號(hào)5,281,698，和另外WO93/15189，以及用于在活化聚合物與肽，如凝血因子VIII(WO94/15625)，血紅蛋白(WO 94/09027)、運(yùn)氧分子(美國(guó)專利號(hào)4,412,989)，核糖核酸酶和超氧化物岐化酶之間的結(jié)合(Veronese等人，App.Biochem.Biotecb.11141-45(1985))。
優(yōu)選的水溶性聚合物是那些其中聚合物樣品中聚合物分子的基本部分具有大約相同的分子量的聚合物；這樣的聚合物是″均勻分散的″。
本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)參考聚(乙二醇)結(jié)合物說(shuō)明。可得到PEG官能化和結(jié)合的幾篇綜述和專題文章。參見(jiàn)，例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，酶學(xué)方法13530-65(1987)；Wong等人，Ehzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，治療性藥物載體體系中的關(guān)鍵綜述9249-304(1992)；Zalipsky，Biocon jugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra，等人，Pharmazie，575-29(2002)。使用反應(yīng)性分子制備反應(yīng)性PEG分子和形成結(jié)合物的途徑是本領(lǐng)域已知的。例如，美國(guó)專利號(hào)5,672,662公開(kāi)了選自如下的聚合物酸的活性酯的水溶性和可分離的結(jié)合物線性或支化聚(環(huán)氧烷烴)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯屬醇)、和聚(丙烯?；鶈徇?。
美國(guó)專利號(hào)6,376,604說(shuō)明了在有機(jī)溶劑中通過(guò)使聚合物的末端羥基與二(1-苯并三唑基)碳酸酯反應(yīng)制備水溶性和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法。活性酯用于形成與生物活性劑(如蛋白質(zhì)或肽)的結(jié)合物。
WO 99/45964描述了包括生物活性劑和活化的水溶性聚合物的結(jié)合物，該水溶性聚合物包括聚合物主鏈，該主鏈含有通過(guò)合適鍵連接到聚合物主鏈的至少一個(gè)末端，其中至少一個(gè)末端包括含有連接到支化部分的近反應(yīng)性基團(tuán)的支化部分，其中生物活性劑連接到至少一個(gè)近反應(yīng)性基團(tuán)。其它支化聚(乙二醇)描述于WO 96/21469，美國(guó)專利號(hào)5,932,462描述了采用支化PEG分子形成的結(jié)合物，該P(yáng)EG分子包括支化末端，該末端包括反應(yīng)性官能團(tuán)。游離反應(yīng)性基團(tuán)可用于與生物活性物質(zhì)(如蛋白質(zhì)或肽)反應(yīng)，在聚(乙二醇)和生物活性物質(zhì)之間形成結(jié)合物。美國(guó)專利號(hào)5,446,090描述了雙官能PEG連接基和它在形成結(jié)合物中的用途，該結(jié)合物在每個(gè)PEG連接基末端具有肽。
包括可降解PEG連接的結(jié)合物描述于WO 99/34833；和WO99/14259，以及描述于美國(guó)專利號(hào)6,348,558。這樣的可降解連接適用于本發(fā)明。
以上說(shuō)明的本領(lǐng)域公認(rèn)的聚合物活化方法可用于在這里介紹的本發(fā)明所述的支化聚合物的形成以及這些支化聚合物到其它物質(zhì)(如糖、糖核苷酸等)的結(jié)合。
以下討論例示的改性基團(tuán)?？梢詫?duì)它們向肽賦予一種或多種所需性能的能力選擇改性基團(tuán)。例示的性能包括但不限于提高的藥物動(dòng)力學(xué)、提高的藥效動(dòng)力學(xué)、改進(jìn)的生物分布、提供多價(jià)物質(zhì)、改進(jìn)的水溶性、提高或減少的親油性和組織靶向。
用于本發(fā)明的例示的聚(乙二醇)分子包括，但不限于具有如下通式的那些 其中A2是H、OH、NH2、取代或未取代烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代雜芳基、取代或未取代雜環(huán)烷基、取代或未取代雜烷基，如乙縮醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q、或-(CH2)qC(Yb)Zb。標(biāo)記″e(cuò)″表示1-2500的整數(shù)。標(biāo)記b，d，和q獨(dú)立地表示0-20的整數(shù)。符號(hào)Za和Zb獨(dú)立地表示OH、NH2、離去基團(tuán)，如咪唑、對(duì)硝基苯基、HOBT、四唑、鹵化物、S-Ra、活化酯的醇部分；-(CH2)pC(Yb)V、或-(CH2)pU(CH2)sC(Yb)v。符號(hào)Ya表示H(2)、＝O、＝S、＝N-Rb。符號(hào)Xa，Ya，Yb，A1，和U獨(dú)立地表示基團(tuán)O、S、N-Rc。符號(hào)V表示OH、NH2、鹵素、S-Ra、活化酯的醇組分、活化酰胺的胺組分、糖-核苷酸、和蛋白質(zhì)。標(biāo)記p，q，s和v是獨(dú)立地選自0-20的整數(shù)。符號(hào)Ra，Rb，和Rc獨(dú)立地表示H，取代或未取代烷基，取代或未取代雜烷基，取代或未取代芳基，取代或未取代雜環(huán)烷基和取代或未取代雜芳基。
用于本發(fā)明的線性和支化聚合物(如PEG)的具體實(shí)施方案包括
和這些物質(zhì)的碳酸酯和活性酯，如 可用于形成線性和支化聚合物物質(zhì)，這些物質(zhì)的連接基臂結(jié)合物以及在這些化合物與糖和核苷酸糖之間的結(jié)合物。標(biāo)記e和f獨(dú)立地選自1-2500。
適于活化直鏈PEG用于制備在此說(shuō)明的化合物的其它例示的活化、或離去基團(tuán)包括但不限于如下物質(zhì) 在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的是對(duì)于前體上的選擇部分到聚合物改性部分選擇適當(dāng)?shù)幕罨鶊F(tuán)。
采用這些和其它物質(zhì)活化的PEG分子和制備活化PEG的方法說(shuō)明于WO 04/083259。
在例示的實(shí)施方案中，支化聚合物是基于半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸、二-或三-賴氨酸核的PEG。因此，進(jìn)一步例示的支化PEG包括
標(biāo)記e和f獨(dú)立地選自1-2500。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，支化PEG部分基于三-賴氨酸肽。三-賴氨酸可以是單-，二-，三-，或四-PEG-基化的。根據(jù)此實(shí)施方案的例示的物質(zhì)具有如下通式
其中e，f和f′獨(dú)立地選自1-2500的整數(shù)；和q，q′和q″獨(dú)立地選自0-20的整數(shù)。
在本發(fā)明的例示的實(shí)施方案中，PEG是m-PEG(5kD，10kD，20kD，30kD或40kD)。例示的支化PEG物質(zhì)是賴氨酸-、絲氨酸-或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG是20kD m-PEG。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，用于本發(fā)明的支化聚合物包括以上說(shuō)明的情況的變化形式。例如以上顯示的二-賴氨酸-PEG結(jié)合物可包括三個(gè)聚合物子單元，第三個(gè)鍵合到在以上結(jié)構(gòu)中顯示為非改性的α-胺。相似地，被三個(gè)或四個(gè)聚合物子單元官能化的三-賴氨酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到支化聚合物的一個(gè)或多個(gè)m-PEG臂可以由具有不同末端(如OH、COOH、NH2，C2-C10-烷基等)的PEG部分替代。此外，很容易通過(guò)在α-碳原子和側(cè)鏈的官能團(tuán)之間插入烷基連接基(或除去碳原子)改性以上的結(jié)構(gòu)。因此，″高(homo)″衍生物和高級(jí)同系物，以及低級(jí)同系物在用于本發(fā)明的支化PEG的核范圍以內(nèi)。
在此描述的支化PEG物質(zhì)容易通過(guò)下列路線中說(shuō)明的方法制備 其中Xb是O、NH或S而r是1-10的整數(shù)。標(biāo)記e和f獨(dú)立地選自1-2500的整數(shù)。例示的支化PEG物質(zhì)是10,000，15,000，20,000，30,000和40,000道爾頓。
因此，根據(jù)此方案，將天然或非天然氨基酸與活化的m-PEG衍生物(在此情況下甲苯磺酸酯)接觸，通過(guò)烷基化側(cè)鏈雜原子X(jué)b形成化合物1。將單-官能化m-PEG氨基酸與反應(yīng)性m-PEG衍生物經(jīng)受N-?；瘲l件，由此裝配支化m-PEG 2。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，甲苯磺酸酯離去基團(tuán)可以改為任何合適的離去基團(tuán)，如鹵素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。相似地，用于酰基化胺的反應(yīng)性碳酸酯可以改為活性酯，如N-羥基琥珀酰亞胺等，或者酸可以使用脫水劑(如二環(huán)己基碳化二亞胺，羰二咪唑等)原位活化。
在以上說(shuō)明的例示的方案中，改性基團(tuán)是線性PEG部分，然而，任何改性基團(tuán)，如水溶性聚合物、水不溶性聚合物、支化聚合物、治療部分等可以通過(guò)而引入糖基部分。
用于本發(fā)明的化合物的進(jìn)一步支化聚合物物質(zhì)由PBG官能化的支化核舉例說(shuō)明，如以下說(shuō)明的例子 其中R14是OH或另一個(gè)反應(yīng)性官能團(tuán)。例示的反應(yīng)性官能團(tuán)是C(O)Q′，其中選擇Q′使得C(O)Q′是反應(yīng)性官能團(tuán)。用于Q′的例示的物質(zhì)包括鹵素、NHS、五氟苯基、HOBT、HOAt、和對(duì)硝基苯基。標(biāo)記″e(cuò)″和標(biāo)記″f″是獨(dú)立地選自1-2500的整數(shù)。
以上說(shuō)明的支化化合物、和用于本發(fā)明化合物的另外的支化化合物容易從如下材料制備 聚合物改性糖物質(zhì)本發(fā)明的核苷酸糖的糖部分可以選自天然和非天然呋喃糖和己糖兩者。非天然糖任選地包括烷基化或酰基化羥基和/或胺部分，如環(huán)上的醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖在環(huán)上的一定位置包括H、羥基、醚、酯或酰胺取代基，在天然糖中在該位置不存在這樣的取代基。糖部分可以是單糖，低聚糖或多聚糖。
用于本發(fā)明的例示的天然糖包括葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、木糖、核糖、N-乙酰葡萄糖、唾液酸和N-乙酰半乳糖。
相似地，核苷可以選自天然和非天然(或罕見(jiàn))核苷兩者。用于本發(fā)明的例示的天然核苷包括胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。罕見(jiàn)核苷可包括但不限于這樣的分子如阿糖尿苷和阿糖胸苷。本領(lǐng)域充分展示了非天然和罕見(jiàn)核苷以及它們的制備方法。
本發(fā)明的例示的改性糖核苷酸包括GDP-Man，GDP-Fuc，UDP-Gal，UDP-Gal-NH2，UDP-GalNAc，UDP-Glc，UDP-Glc-NH2，UDP-GlcNAc，UDP-Glc，UDP-GlcUA和CMP-Sia。如以上討論的本發(fā)明的糖，本發(fā)明的糖核苷酸可以被聚合物改性部分(或連接基-改性部分)在糖的任何位置取代。例如，由本發(fā)明覆蓋的化合物包括那些其中L-R11部分結(jié)合到呋喃糖類核苷酸糖的C-5或吡喃糖類核苷酸糖的C-6的化合物。
連接到在此公開(kāi)的結(jié)合物的例示的部分包括，但不限于PEG衍生物(如，烷基-PEG，?；?PEG，?；?烷基-PEG，烷基-?；?PEG氨基甲?；?PEG，芳基-PEG)，PPG衍生物(如，烷基-PPG，?；?PPG，?；?烷基-PPG，烷基-?；?PPG氨基甲?；?PPG，芳基-PPG)，治療部分，診斷部分，甘露糖-6-磷酸酯，肝素，類肝素，SLex，甘露糖，甘露糖-6-磷酸酯，唾液酸基Lewis X，F(xiàn)GF，VFGF，蛋白質(zhì)，軟骨素，角質(zhì)素，皮膚素，白蛋白，整聯(lián)蛋白(integrins)，觸角低聚糖，肽等。結(jié)合各種改性基團(tuán)到糖部分的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的(聚(乙二醇)化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)療應(yīng)用，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；聚(乙二醇)化學(xué)和醫(yī)療應(yīng)用，J.Milton Harris，Ed.，ACS學(xué)術(shù)討論會(huì)叢刊No.680，美國(guó)化學(xué)會(huì)，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，SanDiego，1996；和Dunn等人，Bds.聚合物藥物輸送系統(tǒng)，ACS學(xué)術(shù)討論會(huì)叢刊Vol.469，美國(guó)化學(xué)會(huì)，Washington，D.C.1991)。
以它們的改性形式的本發(fā)明的例示的糖核苷酸包括核苷酸單-，二-或三磷酸酯或其UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷的類似物。甚至更優(yōu)選，改性糖核苷酸選自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-巖藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙?；费苌镆灿糜诒景l(fā)明的方法。
在其它實(shí)施方案中，改性糖是活化糖。用于本發(fā)明的活化改性糖典型地是由合成轉(zhuǎn)變以包括活化離去基團(tuán)的糖苷。在此使用的術(shù)語(yǔ)″活化離去基團(tuán)″表示那些部分，它們?nèi)菀自诿刚{(diào)節(jié)的親核取代反應(yīng)中轉(zhuǎn)移。許多活化糖是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Vocadlo等人，碳水化合物化學(xué)和生物，Vol.2，Erns t等人Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，德國(guó)，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed，等人，J.Biol.Chem.27437717(1999))。
活化基團(tuán)(離去基團(tuán))的例子包括氟、氯、溴、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。用于本發(fā)明的優(yōu)選活化離去基團(tuán)是不顯著地空間阻礙糖苷到受體的酶轉(zhuǎn)移的那些。因此，活化糖苷衍生物的優(yōu)選實(shí)施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，特別優(yōu)選糖基氟化物。在糖基氟化物中，最優(yōu)選α-半乳糖基氟化物，α-甘露糖基氟化物，α-葡萄糖基氟化物，α-巖藻糖基氟化物，α-木糖基氟化物，α-唾液酸基氟化物，α-N-乙酰葡萄糖胺基氟化物，α-N-乙酰半乳糖胺基氟化物，β-半乳糖基氟化物，β-甘露糖基氟化物，β-葡萄糖基氟化物，β-巖藻糖基氟化物，β-木糖基氟化物，β-唾液酸基氟化物，β-N-乙酰葡萄糖胺基氟化物，β-N-乙酰半乳糖胺基氟化物。
按照說(shuō)明，糖基氟化物可以從游離糖通過(guò)首先乙?；遣⑶胰缓蟛捎肏F/吡啶處理它而制備。這產(chǎn)生被保護(hù)的(乙?；?糖基氟化物(即，α-二醇氟化物)的熱力學(xué)最穩(wěn)定端基異構(gòu)體。如果需要穩(wěn)定較小的端基異構(gòu)體(即，β-糖基氟化物)，它可以由如下方式制備采用HBr/HOAc或采用HCl轉(zhuǎn)化過(guò)乙?；奶且援a(chǎn)生端基異構(gòu)體溴化物或氯化物。此中間體與氟化物鹽(如氟化銀)反應(yīng)以產(chǎn)生糖基氟化物。乙?；腔锟梢酝ㄟ^(guò)與溫和(催化)堿在甲醇(如NaOMe/MeOH)中的反應(yīng)而解保護(hù)。此外，許多糖基氟化物是可市購(gòu)的。
其它活化的糖基衍生物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備。例如，糖基甲磺酸酯可以由如下方式制備使糖的完全芐基化半縮醛形式用甲磺酰氯處理，隨后催化氫化以脫除芐基。
在進(jìn)一步例示的實(shí)施方案中，改性糖是具有觸角結(jié)構(gòu)的低聚糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，觸角的一個(gè)或多個(gè)末端帶有改性部分。當(dāng)多于一個(gè)的改性部分連接到具有觸角結(jié)構(gòu)的低聚糖時(shí)，低聚糖可用于″放大″改性部分；結(jié)合到肽的每個(gè)低聚糖單元將多拷貝的改性基團(tuán)連接到肽上。以上圖中說(shuō)明的本發(fā)明典型的結(jié)合物的通用結(jié)構(gòu)包括通過(guò)采用觸角結(jié)構(gòu)制備本發(fā)明結(jié)合物產(chǎn)生的多價(jià)物質(zhì)。許多觸角糖結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，而本方法可以沒(méi)有限制地采用它們實(shí)施。
在例示的實(shí)施方案中，活化的改性糖是多變體酶的底物，該酶轉(zhuǎn)移糖到底物的適當(dāng)受體部位上。例示的突變體酶包括，如普通轉(zhuǎn)讓的PCT公開(kāi)WO03/046150和W003/045980中描述的那些。
其中糖部分被水溶性聚合物(如水溶性聚合物改性的水溶性聚合物改性糖、活化糖和核苷酸糖物質(zhì)用于本發(fā)明。例示的改性糖核苷酸帶有通過(guò)糖上胺部分改性的糖基。改性糖核苷酸(如糖核苷酸的糖基-胺衍生物)也適用于本發(fā)明的方法。例如，糖基胺(沒(méi)有改性基團(tuán))可以酶法結(jié)合到肽(或其它物質(zhì))而游離的糖基胺部分隨后結(jié)合到所需的改性基團(tuán)?；蛘?，改性糖核苷酸可起酶底物的作用，該酶轉(zhuǎn)移改性糖到底物上的糖基受體，如肽、糖肽、脂質(zhì)、苷元(aglycone)、糖脂等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖結(jié)合到支化聚合物物質(zhì)，如在此說(shuō)明的那些。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖部分是改性唾液酸。當(dāng)唾液酸是糖時(shí)，唾液酸被改性基團(tuán)在丙酮基(pyruvyl)側(cè)鏈上的9-位置或在胺部分上的5-位置改性，該胺部分正常地在唾液酸中乙酰化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中糖核是半乳糖或葡萄糖，R5是NHC(O)Y。
在例示的實(shí)施方案中，改性糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。如以下對(duì)于N-乙酰半乳糖胺所示，6-氨基-糖部分容易由標(biāo)準(zhǔn)方法制備
(a.半乳糖氧化酶；NH4OAc，NaBH3CN；b. 在以上方案中，標(biāo)記n表示1-2500，優(yōu)選10-1500，和更優(yōu)選10-1200的整數(shù)。符號(hào)″A″表示活化基團(tuán)，如鹵素、活化酯(如，N-羥基琥珀酰亞胺酯)的組分、碳酸酯(如，對(duì)硝基苯基碳酸酯)的組分等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它PEG-酰胺核苷酸糖容易由此和類似方法制備。此外，如本文所述，支化聚合物可以取代線性PEG。
本發(fā)明的另一種例示的聚合物改性核苷酸糖具有如下通式，其中C-6位置是改性的 其中X6是鍵或O，J是S或O，而y是0或1。標(biāo)記e和f獨(dú)立地選自1-2500。
在其它例示的實(shí)施方案中，酰胺部分被基團(tuán)(如尿烷或脲)代替。
在以下的討論中，對(duì)適用于實(shí)施本發(fā)明的改性糖的許多具體例子進(jìn)行了描述。在例示的實(shí)施方案中，唾液酸衍生物用作改性基團(tuán)連接到其上的糖核。對(duì)唾液酸衍生物的討論重點(diǎn)是僅為了清楚的說(shuō)明而不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到各種其它糖部分可以采用類似于使用唾液酸作為例子說(shuō)明的方式活化和衍生。例如，許多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖以命名一些糖底物，它們很容易被本領(lǐng)域公認(rèn)的方法改性。參見(jiàn)，例如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000))。
在圖2中，描述了根據(jù)本發(fā)明的通用方案。因此，根據(jù)圖2，在甘露糖胺和受保護(hù)的氨基酸之間的酰胺結(jié)合物由如下方式形成在適當(dāng)?shù)臈l件下接觸甘露糖胺與N-保護(hù)的氨基酸以形成結(jié)合物。受保護(hù)的氨基酸的羧基末端原位活化或它任選地轉(zhuǎn)化成貯存穩(wěn)定的反應(yīng)性基團(tuán)，如N-羥基-琥珀酰亞胺。氨基酸可以選自任何天然或非天然氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何在本發(fā)明的方法中保護(hù)側(cè)鏈氨基酸免受不希望的反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)臈l件下酰胺結(jié)合物與丙酮酸鹽和唾液酸醛縮酶反應(yīng)以轉(zhuǎn)化酰胺結(jié)合物成唾液酸酰胺結(jié)合物，它隨后由唾液酸酰胺結(jié)合物與核苷酸磷酸前體和適當(dāng)酶的反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成核苷酸磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物。在例示的實(shí)施方案中，前體是胞苷三磷酸而酶是合成酶。在核苷酸糖的形成之后，氨基酸胺被解保護(hù)，提供游離的、反應(yīng)性胺。胺被用作結(jié)合改性部分到核苷酸糖的部位。在圖2中，例示的改性部分為水溶性聚合物，即聚(乙二醇)，如PEG，m-PEG等。
本發(fā)明進(jìn)一步在圖3中舉例說(shuō)明，它描述了制備唾液酸-甘氨酰-PEG-胞苷一磷酸的方案。相似于圖2中說(shuō)明的方案，圖3源自甘露糖胺。糖采用FMOC-甘氨酸，使用受保護(hù)的氨基酸的N-羥基琥珀酰亞胺活化衍生物結(jié)合。由唾液酸醛縮酶對(duì)結(jié)合物和丙酮酸鹽的作用將獲得的酰胺結(jié)合物轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的唾液酸。使用胞苷三磷酸和合成酶將獲得的唾液酸結(jié)合物轉(zhuǎn)化成胞苷一磷酸類似物。通過(guò)從氨基酸胺部分脫除保護(hù)基團(tuán)解保護(hù)CMP-類似物，將此部分轉(zhuǎn)化成用于結(jié)合反應(yīng)(conjugation)的反應(yīng)性部位。胺部分與活化PEG物質(zhì)(m-PEG-O-硝基苯基碳酸酯)反應(yīng)，由此形成唾液酸-甘氨酰-PEG-胞苷一磷酸。
基于唾液酸的例示的糖核具有如下通式 其中D是-OH或(R11)w′-L-。符號(hào)G表示H、(R11)w′-L-或-C(O)(C1-C6)烷基。R11如以上所述。D和G中的至少一個(gè)是R11-L-。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括如下結(jié)構(gòu)的糖、活化糖或糖核苷酸 其中L2如在對(duì)L的論述中所述，如鍵、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基。標(biāo)記e表示1-約2500的整數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖或糖核苷酸包括如下結(jié)構(gòu) 其中s選自0-20的整數(shù)，而e是1-2500。
由支化聚合物官能化的選擇的基于唾液酸的核苷酸糖具有如下通式 其中AA是氨基酸殘基，PEG是聚(乙二醇)或甲氧基-聚(乙二醇)而NP是核苷酸，它通過(guò)磷酸二酯鍵(″核苷酸磷酸″)連接到糖基部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到ONP可以由在此討論的活化部分替代。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，唾液酸衍生物的結(jié)構(gòu)是選自如下的成員 其中X6是鍵或O，而J是S或O。標(biāo)記a，b和c獨(dú)立地選自0-20，而e和f獨(dú)立地選自1-2500。
此外，如以上討論的那樣，本發(fā)明提供了由水溶性聚合物改性的核苷酸糖，它是直鏈或支化的。例如，具有以下所示通式的化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi) 其中X6是鍵或O，而J是S或O。標(biāo)記e和f獨(dú)立地選自1-2500。
也提供了包括本發(fā)明組合物的肽和糖肽、脂質(zhì)和糖脂的結(jié)合物。結(jié)合物由如下方式形成；在適當(dāng)?shù)臈l件下結(jié)合本發(fā)明的核苷酸糖或活化糖和底物與糖部分的適當(dāng)受體部分和酶(改性核苷酸糖是該酶的底物)，以將改性糖從核苷酸糖轉(zhuǎn)移到受體部分上。例如，本發(fā)明提供了具有如下通式的結(jié)合物
其中J和X6如以上所討論。標(biāo)記a，b，c，e和f如以上所討論。
本發(fā)明的選擇的化合物基于具有甘露糖、半乳糖和葡萄糖的立體化學(xué)的物質(zhì)。這些化合物的通式是 其中R3-R6之一是改性部分，如聚合物改性部分或聚合物改性部分-連接基構(gòu)建物。
如以上討論的那樣，本發(fā)明的某些化合物是聚合物改性的糖核苷酸。以它們的改性形式用于本發(fā)明的例示的糖核苷酸包括核苷酸單-，二-或三磷酸或其類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，改性糖核苷酸選自UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷。甚至更優(yōu)選，改性糖核苷酸選自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-巖藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-Sia。在例示的實(shí)施方案中，核苷酸單-二-或三-磷酸連接到C-1。
糖核苷酸的糖基-胺衍生物也適用于本發(fā)明的方法。例如，糖基胺(沒(méi)有改性基團(tuán))可以酶法結(jié)合到肽(或其它物質(zhì))而游離糖基胺部分隨后結(jié)合到所需的改性基團(tuán)。
本發(fā)明的糖核苷酸結(jié)合物通常由如下通式描述 其中符號(hào)如以上討論的表示基團(tuán)。當(dāng)糖核是甘露糖時(shí)，聚合物改性部分優(yōu)選在R3，R4或R6。對(duì)于葡萄糖，聚合物改性部分任選地在R5或R6。標(biāo)記″u″是0，1或2。
基于GDP甘露糖的本發(fā)明的進(jìn)一步例示的核苷酸糖具有如下結(jié)構(gòu) 在進(jìn)一步例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于UDP半乳糖具有如下結(jié)構(gòu)的結(jié)合物 在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖并具有如下通式 在三個(gè)前述通式的每一個(gè)中，基團(tuán)和標(biāo)記的同一性如以上所討論。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，線性PEG部分可以被支化聚合物或在此所述的其它線性聚合物物質(zhì)替代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，其中糖核是半乳糖或葡萄糖，R5是NHC(O)Y。
水不溶性聚合物在另一個(gè)實(shí)施方案中，類似于以上討論的那些，改性糖包括水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。水不溶性聚合物，象水溶性聚合物一樣，典型地由至少兩個(gè)聚合物單元組成。在一個(gè)例示的實(shí)施方案中，聚合物由2-25個(gè)聚合物單元組成。在另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，聚合物由2-8個(gè)聚合物單元組成。本發(fā)明的結(jié)合物也可包括一種或多種水不溶性聚合物。本發(fā)明的此實(shí)施方案通過(guò)使用結(jié)合物作為載體而說(shuō)明，采用該載體以受控方式輸送治療肽。聚合物藥物輸送(傳遞，delivery)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Dunn等人，Eds.聚合物藥物和藥物輸送系統(tǒng)，ACS學(xué)術(shù)討論會(huì)叢刊Vol.469，美國(guó)化學(xué)會(huì)，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到基本上任何已知的藥物輸送系統(tǒng)均適用于本發(fā)明的結(jié)合物。
代表性水不溶性聚合物包括，但不限于聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對(duì)苯二甲酸酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、泊洛沙姆類和聚乙烯基苯酚及其共聚物。
用于本發(fā)明結(jié)合物的合成改性天然聚合物包括，但不限于烷基纖維素、羥基烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、和硝基纖維素。一大類合成改性天然聚合物的特別優(yōu)選成員包括，但不限于甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽、和丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物和海藻酸。
在此討論的這些和其它聚合物可以容易地從商業(yè)來(lái)源如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)，Polysciences(Warrenton，PA.)，Aldrich(Milwaukee，WI.)，F(xiàn)luka(Ronkonkoma，NY)，和BioRad(Richmond，CA)獲得，或從這些供應(yīng)商獲得的單體使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。
用于本發(fā)明結(jié)合物的代表性生物可降解聚合物包括，但不限于聚交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物、聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(交酯-共-己內(nèi)酯)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)、聚酸酐、聚原酸酯，其共混物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，如包括膠原，泊洛沙姆類等的那些。
用于本發(fā)明的聚合物包括″雜合″聚合物，該雜合聚合物包括在它們結(jié)構(gòu)的至少一部分中含有生物再吸收分子的水溶性材料。這樣的聚合物的例子是包括水不溶性共聚物的聚合物，該共聚物每個(gè)聚合物鏈含有可生物再吸收區(qū)域，親水性區(qū)域和多個(gè)可交聯(lián)官能團(tuán)。
對(duì)于本發(fā)明的目的，″水不溶性材料″包括基本不溶于水或含水環(huán)境的材料。因此，盡管共聚物的某些區(qū)域或鏈段可以是親水性或甚至水溶性的，聚合物分子作為整體在任何基本的量度不溶于水。
對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)″可生物再吸收分子″包括能夠代謝或破壞和再吸收和/或通過(guò)身體的正常排泄途徑消除的區(qū)域(部分)。這樣的代謝產(chǎn)物或降解產(chǎn)物優(yōu)選對(duì)身體是基本非毒性的。
可生物再吸收區(qū)域可以是疏水性或親水性的，只要共聚物作為整體不變成水溶性的。因此，可生物再吸收區(qū)域根據(jù)優(yōu)先選擇使得聚合物作為整體不溶于水。因此，選擇相對(duì)性能，即由可生物再吸收區(qū)域包含的官能團(tuán)的種類，和可生物再吸收區(qū)域與親水性區(qū)域的相對(duì)比例以保證有用的可生物再吸收組合物保持水不溶性的。
例示的可再吸收聚合物包括，例如聚(α-羥基-羧酸)/聚(氧化烯)的合成生產(chǎn)的可再吸收嵌段共聚物(參見(jiàn)Cohn等人，美國(guó)專利號(hào)4,826,945)。這些共聚物不交聯(lián)并且是水溶性的，從而使得身體可排泄降解的嵌段共聚物組合物。參見(jiàn)Younes等人，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優(yōu)選的可生物再吸收聚合物包括一種或多種選自如下的組分聚(酯)、聚(羥基酸)、聚(內(nèi)酯)、聚(酰胺)、聚(酯-酰胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚(硫代酯)、多糖及其混合物。仍然更優(yōu)選，可生物再吸收聚合物包括聚(羥基)酸組分。在聚(羥基)酸中，優(yōu)選是聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。
除形成體內(nèi)吸收(″生物再吸收″)的片段以外，用于本發(fā)明方法的優(yōu)選聚合物包衣也可形成可分泌和/或可代謝片段。
更高等級(jí)共聚物也可用于本發(fā)明。例如，Casey等人，美國(guó)專利號(hào)4,438,253，它在1984年3月20日公開(kāi)，公開(kāi)了從聚(乙醇酸)和羥基封端聚(亞烷基二醇)的酯交換生產(chǎn)的三-嵌段共聚物。公開(kāi)了這樣的組合物用作可再吸收單絲縫合線。這樣組合物的靈活性由芳族原碳酸酯(如四-對(duì)甲苯基原碳酸酯)向共聚物結(jié)構(gòu)中的引入控制。
也可以采用基于乳酸和/或乙醇酸的其它聚合物。例如，Spinu，美國(guó)專利號(hào)5,202,413，它在1993年4月13日公開(kāi)，公開(kāi)了可生物降解多嵌段共聚物，該共聚物含有聚交酯和/或聚乙醇酸交酯的按順序定向嵌段，由交酯和/或乙醇酸交酯到低聚物二醇或二元胺上的開(kāi)環(huán)聚合，隨后采用二官能化合物，如二異氰酸酯、二?；?、或二氯硅烷的擴(kuò)鏈而生產(chǎn)。
用于本發(fā)明的包衣的可生物再吸收區(qū)域可以設(shè)計(jì)為可水解和/或酶裂解的。對(duì)于本發(fā)明的目的，″可水解裂解的″表示共聚物，特別地可生物再吸收區(qū)域?qū)λ蚝h(huán)境中水解的易感性。相似地，在此使用的″可酶裂解的″表示共聚物，特別是可生物再吸收區(qū)域?qū)τ蓛?nèi)源或外源酶的裂解的易感性。
當(dāng)放入體內(nèi)時(shí)，親水性區(qū)域可以加工成可排泄和/或可代謝片段。因此，親水性區(qū)域可包括，例如聚醚、聚環(huán)氧烷烴、多元醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(烷基_唑啉)、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)及其共聚物和混合物。此外，親水性區(qū)域也可是，例如聚環(huán)氧烷烴。這樣的聚環(huán)氧烷烴可包括，例如聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧丙烷)及其混合物和共聚物。
是水凝膠組分的聚合物也用于本發(fā)明。水凝膠是能夠吸收相對(duì)大數(shù)量水的聚合物材料。水凝膠形成化合物的例子包括，但不限于聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、角叉菜膠和其它多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)，以及其衍生物等。可以生產(chǎn)穩(wěn)定，可生物降低和可生物再吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可包括顯示一種或多種這些性能的亞單元。
其整體性可以通過(guò)交聯(lián)控制的生物兼容性水凝膠組合物是已知的和目前優(yōu)選用于本發(fā)明的方法。例如，Hubbell等人，U.S.專利Nos.5,410,016，它在4月25，1995和5,529,914，它在1996年6月25日公開(kāi)，公開(kāi)了水溶性體系，該體系是含有在兩個(gè)水解不穩(wěn)定延伸物之間夾入的水溶性中心嵌段鏈段的交聯(lián)嵌段共聚物。這樣的共聚物進(jìn)一步由可光聚合的丙烯酸酯官能團(tuán)封端。當(dāng)交聯(lián)時(shí)，這些體系成為水凝膠。這樣共聚物的水溶性中心嵌段可包括聚(乙二醇)；然而水解不穩(wěn)定延長(zhǎng)物可以是聚(α-羥基酸)，如聚乙醇酸或聚乳酸。參見(jiàn)Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，凝膠是熱可逆凝膠。目前優(yōu)選的是包括組分，如泊洛沙姆類、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨酯水凝膠、聚氨酯-脲水凝膠及其組合的熱可逆凝膠。
在仍然另一個(gè)例示的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合物包括脂質(zhì)體的組分。脂質(zhì)體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如在Eppstein等人，美國(guó)專利號(hào)4,522,811中所述，該文獻(xiàn)在1985年6月1日公開(kāi)。例如，脂質(zhì)體制劑可以由如下方式制備在無(wú)機(jī)溶劑中溶解適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(如硬脂?；字Ｒ掖及贰⒂仓；字Ｄ憠A，花生酰基磷脂酰膽堿，和膽固醇)，然后蒸發(fā)該溶劑，在容器表面上留下干燥脂質(zhì)的薄膜。然后將活性化合物或其藥用鹽的水溶液引入容器。然后由手將容器起漩渦以從容器側(cè)面釋放脂質(zhì)材料和分散脂質(zhì)聚集體，因此形成脂質(zhì)體懸浮液。
上述微粒子和制備微粒子的方法通過(guò)例子提供了和它們不希望限定用于本發(fā)明的微粒子的范圍。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的是由不同方法制造的微粒子的陣列用于本發(fā)明。
在直鏈和支化兩者的水溶性聚合物的論述中以上討論的結(jié)構(gòu)格式對(duì)于水不溶性聚合物通常也是適用的。因此，例如半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸支化核可以由兩個(gè)水不溶性聚合物部分官能化。用于生產(chǎn)這些物質(zhì)的方法通常很類似于用于生產(chǎn)水溶性聚合物的那些。
治療性糖肽的體內(nèi)半衰期也可以由PEG部分如聚乙二醇(PEG)提高。例如，蛋白質(zhì)被PEG的化學(xué)改性(PEG化)增加了它們的分子大小并降低它們的表面和官能團(tuán)-可及性，它們每個(gè)依賴于連接到蛋白質(zhì)的PEG的大小。這導(dǎo)致血漿半衰期的改進(jìn)并導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解穩(wěn)定性，以及免疫原性和肝吸收的降低(Chaffee等人J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29113-127(1980))。有報(bào)導(dǎo)白細(xì)胞介素-2的PEG化增加了它的體內(nèi)抗瘤效力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))而衍生自單克隆抗體A7的F(ab′)2的PEG化改進(jìn)它的腫瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用PEG部分用本發(fā)明的方法衍生的肽的體內(nèi)半衰期相對(duì)于非衍生肽的體內(nèi)半衰期有所增加。
肽體內(nèi)半衰期的增加最好表達(dá)為此數(shù)量的百分比增加。百分比增加范圍的下限是約40％，約60％，約80％，約100％，約150％或約200％。范圍的上限是約60％，約80％，約100％，約150％，或大于約250％。
改性糖的制備通常，糖部分和改性基團(tuán)通過(guò)使用反應(yīng)性基團(tuán)連接在一起，該反應(yīng)性基團(tuán)典型地由連接過(guò)程轉(zhuǎn)變成新的有機(jī)官能團(tuán)或非反應(yīng)性物質(zhì)。糖反應(yīng)性官能團(tuán)位于糖部分上的任何位置。用于實(shí)施本發(fā)明的反應(yīng)性基團(tuán)和反應(yīng)類別通常是生物結(jié)合物化學(xué)領(lǐng)域公知的那些。可用于反應(yīng)性糖部分的目前有利的反應(yīng)類型是在相對(duì)溫和條件下進(jìn)行的那些。這些包括，但不限于親核取代(如，胺和醇與酰鹵，活性酯的反應(yīng))，親電取代(如，烯胺反應(yīng))以及到碳-碳和碳-雜原子多鍵的加成(如，Michael反應(yīng)，Diels-Alder反應(yīng))。這些和其它有用的反應(yīng)討論于，例如March，高級(jí)有機(jī)化學(xué)，3rd Ed.，John Wiley & Sons，紐約，1985；Hermanson，生物結(jié)合物技術(shù)，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，蛋白質(zhì)改性；化學(xué)進(jìn)展系列，Vol.198，美國(guó)化學(xué)會(huì)，Washington，D.C.，1982。
從糖核、連接基前體或聚合物改性部分前體懸垂的有用反應(yīng)性官能團(tuán)包括，但不限于(a)羧基及其各種衍生物，包括，但不限于N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基苯并三唑酯，酰鹵，?；溥颍虼?，對(duì)硝基苯基酯，烷基，烯基，炔基和芳族酯；(b)羧基，它可以轉(zhuǎn)化成，如酯，醚，醛等。
(c)鹵代烷基，其中鹵化物可以之后被親核基團(tuán)，例如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、負(fù)碳離子或醇鹽離子置換，因此導(dǎo)致新基團(tuán)在鹵素原子官能團(tuán)的共價(jià)連接；(d)親二烯體(dienophile)基團(tuán)，它能夠參與Diels-Alder反應(yīng)，例如馬來(lái)酰亞氨基(maleimido)；(e)醛或酮基，使得隨后的衍生通過(guò)羰基衍生物如，例如亞胺，腙，縮氨基脲或肟的形成，或通過(guò)機(jī)理如格氏加成或烷基鋰加成是可能的；(f)為與胺的隨后反應(yīng)(例如以形成磺酰胺)的磺酰鹵；(g)硫醇基團(tuán)，它可以，例如轉(zhuǎn)化成二硫化物或與酰鹵反應(yīng)；(h)胺或巰基，它可以，例如?；?，烷基化或氧化；(i)烯烴，它可經(jīng)歷，例如環(huán)加成，加成，Michael加成等；和(j)環(huán)氧化物，它可以與，例如胺和羥基化合物反應(yīng)。
可以選擇反應(yīng)性官能團(tuán)使得它們不參與，或干擾必須組裝反應(yīng)性糖核或改性基團(tuán)的反應(yīng)?；蛘撸梢杂杀Ｗo(hù)基團(tuán)的存在保護(hù)反應(yīng)性官能團(tuán)以不參與反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何保護(hù)特定的官能團(tuán)使得它不干擾選擇的成套反應(yīng)條件。對(duì)于有用的保護(hù)基團(tuán)的例子參見(jiàn)，例如Greene等人，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，John Wiley & Sons，紐約，1991。
在以下的討論中，說(shuō)明用于實(shí)施本發(fā)明的改性糖的具體例子。在例示的實(shí)施方案中，唾液酸衍生物用作改性基團(tuán)連接到其上的糖核。對(duì)唾液酸衍生物的討論重點(diǎn)是僅為了清楚的說(shuō)明而不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到各種其它糖部分可以采用類似于使用唾液酸作為例子說(shuō)明的方式活化和衍生。例如，許多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖以命名幾個(gè)糖底物，它們?nèi)菀子杀绢I(lǐng)域公認(rèn)的方法改性。參見(jiàn)，例如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000))。
在以下的方案1中，將氨基糖苷1采用受保護(hù)的氨基酸(如，甘氨酸)衍生物的活性酯處理，將糖胺殘基轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的受保護(hù)的氨基酸酰胺加合物。將加合物采用醛縮酶處理以形成α-羥基羧酸酯2。將化合物2通過(guò)CMP-SA合成酶的作用轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的CMP衍生物，隨后進(jìn)行CMP衍生物的催化氫化以生產(chǎn)化合物3。通過(guò)化合物3與活化的(m-)PEG或(m-)PPG衍生物(如，PEG-C(O)NHS，PPG-C(O)NHS)反應(yīng)，通過(guò)甘氨酸加合物的形成引入的胺用作PEG或PPG連接的部位，分別產(chǎn)生4或5。
方案1如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的那樣，聚合物改性部分也可以是支化部分，如在此描述的那些。
以下提供了制備本發(fā)明的支化聚合物改性糖的例示的方案 以下說(shuō)明制備本發(fā)明的聚合物改性糖的另一個(gè)例示的方案 表1說(shuō)明由聚合物改性部分(如支化-或直鏈PEG或PPG部分)衍生的糖單磷酸酯的代表性例子。表1的某些化合物由方案1的方法制備。其它衍生物由本領(lǐng)域公認(rèn)的方法制備。參見(jiàn)，例如Keppler等人，Glycobiology1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000))。其它胺反應(yīng)性聚合物改性部分前體和組分，如PEG和PPG類似物是市售的，或者它們可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的方法制備。
表1 其中R是聚合物(支化或直鏈)改性部分。
用于實(shí)施本發(fā)明的改性糖磷酸酯可以在其它位置以及以上說(shuō)明的那些被取代。唾液酸的目前優(yōu)選取代在以下通式中說(shuō)明 其中一個(gè)或多個(gè)Xc，Ya，Yb，Yc和Z是連接基團(tuán)，其優(yōu)選選自-O-、-N(H)-、-S，CH2-，和N(R)2。當(dāng)Xc，Ya，Yb，Yc和Z是連接基團(tuán)時(shí)，它連接到聚合物改性部分，如Rc，Rd，Re，Rf和Rg所示。或者，這些符號(hào)表示結(jié)合到支化-或直鏈水溶性或水不溶性聚合物、治療部分、生物分子或其它部分的連接基。當(dāng)Rc，Rd，Re，Rf或Rg不是聚合物改性部分時(shí)，XcRc，YaRd，YbRe，YcRf或ZRg的組合是H、OH或NC(O)CH3。
還提供了生產(chǎn)活化唾液酸-聚合物改性基團(tuán)結(jié)合物的方法，該結(jié)合物是酶的適當(dāng)?shù)孜?，該酶轉(zhuǎn)移改性糖部分到受體上，如糖基轉(zhuǎn)移酶。該方法包括如下步驟(a)在適當(dāng)?shù)臈l件下使甘露糖胺與活化的N-保護(hù)的氨基酸(或由聚合物改性部分，連接基前體或連接基-聚合物改性部分組合體官能化的氨基酸)接觸以在甘露糖胺和N-保護(hù)的氨基酸之間形成酰胺結(jié)合物；(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下使酰胺結(jié)合物與丙酮酸鹽和唾液酸醛縮酶接觸以轉(zhuǎn)化酰胺結(jié)合物成唾液酸酰胺結(jié)合物；(c)在適當(dāng)?shù)臈l件下使唾液酸酰胺結(jié)合物與胞苷三磷酸和合成酶接觸以形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物；(d)從胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物脫除N-保護(hù)基團(tuán)，因此產(chǎn)生游離胺；和(e)使游離胺與活化的PEG(直鏈或支化)接觸，由此形成胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
交聯(lián)基團(tuán)用于本發(fā)明方法的改性糖的制備包括改性基團(tuán)到糖殘基的連接和形成穩(wěn)定加合物，它是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。糖和改性基團(tuán)可以通過(guò)零-或更高級(jí)交聯(lián)劑偶合?？捎糜谶B接改性基團(tuán)到碳水化合物部分的例示的雙官能化合物包括但不限于雙官能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。連接碳水化合物到其它分子的通用過(guò)程是文獻(xiàn)中已知的。參見(jiàn)，例如Lee等人，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等人，WO 92/18135。在以下的討論中，將反應(yīng)性基團(tuán)處理為新生改性糖的糖部分上良性的。討論的重點(diǎn)是為了清楚的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到討論也與改性基團(tuán)上的反應(yīng)性基團(tuán)相關(guān)。
例示的策略涉及使用雜雙官能交聯(lián)劑SPDP(n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯將被保護(hù)巰基引入到糖上，然后解保護(hù)巰基，從而形成與改性基團(tuán)上的另一個(gè)巰基的二硫鍵。
許多試劑適用于采用分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)物改性改性糖的組分(對(duì)于交聯(lián)試劑和交聯(lián)過(guò)程的綜述參見(jiàn)Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，InENZYMES ASDRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，紐約，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，所有文獻(xiàn)在此引入作為參考)。優(yōu)選的交聯(lián)試劑衍生自各種零長(zhǎng)度、均-雙官能、和雜-雙官能交聯(lián)試劑。零-長(zhǎng)度交聯(lián)試劑包括兩個(gè)內(nèi)在化學(xué)基團(tuán)的直接結(jié)合(而沒(méi)有引入外部材料)。
改性糖到肽的結(jié)合使用介導(dǎo)結(jié)合的適當(dāng)酶，將改性糖結(jié)合到糖基化或非糖基化肽。因此，本發(fā)明的化合物，特別是核苷酸糖優(yōu)選是酶的底物，該酶從核苷酸糖轉(zhuǎn)移糖部分到氨基酸、糖基、或苷元受體部分上。用作受體(如半乳糖基受體)的糖給體的核苷酸糖，所述半乳糖基受體例如GalNAc，Galβ1，4GlcNAc，Galβ1，4GalNAc，Galβ1，3GalNAc，乳糖-N-四糖，Galβ1，3GlcNAc，Galβ1，3Ara，Galβ1，6GlcNAc，Galβ1，4Glc(乳糖)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它受體(參見(jiàn)，如Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
本發(fā)明的改性核苷酸糖是其底物的例示的酶包括糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶可以是克隆的，或從任何來(lái)源分離。許多克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶是已知的，如它們的多核苷酸序列。參見(jiàn)，如″克隆糖基轉(zhuǎn)移酶的WWW指導(dǎo)，″(http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm)。糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列和從其可以推論出氨基酸序列的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列也發(fā)現(xiàn)于各種公開(kāi)的可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括GenBank，Swiss-Prot，EMBL，和其它。
本發(fā)明的化合物為其底物的糖基轉(zhuǎn)移酶包括，但不限于半乳糖轉(zhuǎn)移酶，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶，葡萄糖醛酰基轉(zhuǎn)移酶，唾液酸轉(zhuǎn)移酶，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，和寡糖基轉(zhuǎn)移酶。合適的糖基轉(zhuǎn)移酶包括從真核生物，以及原核生物獲得的那些。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的，例示的為從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移L-巖藻糖到受體糖羥基位置的酶。
在另一組實(shí)施方案中，化合物是半乳糖轉(zhuǎn)移酶的底物。例示的半乳糖轉(zhuǎn)移酶包括α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，參見(jiàn)，如Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人Nature 345229-233(1990)，牛的(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠類(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))，豬的(GenBank L36152；Strahan 等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一種合適的α1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶涉及B血型抗原的合成(EC2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人類))。仍然進(jìn)一步的例示的半乳糖轉(zhuǎn)移酶是核Ga1-T1。仍然進(jìn)一步的例子包括β(1，4)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，它包括，例如EC2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛的(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989)，人類(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠類(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它合適的半乳糖轉(zhuǎn)移酶包括，例如α1，2半乳糖轉(zhuǎn)移酶(如來(lái)自，Schizosaccharomyces pombe，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。在本發(fā)明實(shí)施中也合適的是α1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的可溶解形式，如由Cho等人，J.Biol.Chem.，27213622-13628(1997)報(bào)導(dǎo)。
a)唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸轉(zhuǎn)移酶是本發(fā)明的化合物為其底物的另一種類型糖基轉(zhuǎn)移酶。例子包括ST3Gal III(如，鼠或人類ST3Gal III)，ST3Gal IV，ST3Gal I，ST6Gal I，ST3Gal V，ST6Gal II，ST6Gal NAc I，ST6Gal NAcII，和ST6Gal NAc III(在此使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶命名法如描述于Tsuji等人，Glycobiology 6v-xiv(1996))。稱為α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.99.6)的例示的α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal。參見(jiàn)Vanden Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一種例示的α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.4)轉(zhuǎn)移唾液酸到二糖或糖苷的非還原末端Gal。參見(jiàn)Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等人，J.Biol.Chem.26721004(1992)。進(jìn)一步的例示的酶包括Ga1-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。本發(fā)明的化合物為其底物的其它唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括形成聚唾液酸的那些。例子包括α-2，8-聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶，如ST8SiaI，ST8SiaII，ST8SiaIII，ST8SiaIV和ST8SiaV。參見(jiàn)例如，Angata等人J.Biol.Chem.27518594-18601(2000)；Kono等人，J.Biol.Chem.27129366-29371(1996)；Greiner等人，Infect.Immun.724249-4260(2004)；和Jones等人，J.Biol.Chem.27714598-14611(2002)。
用于要求保護(hù)的方法的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的例子是ST3Gal III，它也稱為α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6)。此酶催化唾液酸到類別Galβ1，3GlcNAc或類別Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)，如Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))。仍然進(jìn)一步的唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括從空腸彎曲桿菌分離的那些，包括α(2，3)。參見(jiàn)如W099/49051。
優(yōu)選，本發(fā)明的化合物是酶的底物，該酶轉(zhuǎn)移改性唾液酸到序列Galβ1，4GlcNAc-，在完全唾液酸化碳水化合物結(jié)構(gòu)上在末端唾液酸下面的最通常的次末級(jí)序列。
b)GalNAc轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明的選擇的化合物是N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶的底物。例示的N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶包括，但不限于α(1，3)N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶，β(1，4)N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol.Chem.26915162(1994)和多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.26812609(1993))。
c)糖苷酶本發(fā)明也包括對(duì)于野生型和突變體糖苷酶的底物。突變體β-半乳糖苷酶已顯示為催化通過(guò)α-糖基氟化物到半乳糖基受體分子的偶合形成二糖。(Withers，U.S.Pat.No.6284494；2001年9月4日)。適用于本發(fā)明的其它糖苷酶包括，例如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰葡萄糖胺酶、β-N-乙酰半乳糖胺酶、β-木糖苷酶、β-巖藻糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、淀粉酶、葡萄糖胺酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰葡萄糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、α-木糖苷酶、α-巖藻糖苷酶、和神經(jīng)氨酸酶/唾液酸酶、內(nèi)切神經(jīng)酰胺糖苷酶。
具體實(shí)施例方式
提供了如下實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明的選擇性實(shí)施方案但不應(yīng)解釋為限制它的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1制備UDP-GalNAc-6′-CHO將UDP-GalNAc(200mg，0.30mmol)溶于1mM CuSO4溶液(20mL)和25mM NaH2PO4溶液(pH 6.0；20mL)。然后加入半乳糖氧化酶(240U；240μL)和過(guò)氧化氫酶(13000U；130μL)，將裝備有氣室的反應(yīng)系統(tǒng)用氧氣填充并在室溫下攪拌幾天。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物(旋轉(zhuǎn)盒；MWCO 5K)并將濾液(～40mL)在4℃下貯存直到需要時(shí)。TLC(二氧化硅；EtOH/水(7/2)；Rf＝0.77；采用茴香醛染色顯現(xiàn))。
實(shí)施例2制備UDP-Gal NAc-6′-NH2)將乙酸銨(15mg，0.194mmol)和NaBH3CN(1M THF溶液；0.17mL，0.17mmol)在0℃下加入上面得到的UDP-Ga lNAc-6′-CHO溶液(2mL或～20mg)并允許升溫到室溫過(guò)夜。將反應(yīng)通過(guò)G-10柱過(guò)濾并收集水和產(chǎn)物。將適當(dāng)?shù)募?jí)分冷凍干燥和冷凍貯存。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.72；采用寧海德林試劑顯現(xiàn))。
實(shí)施例3制備UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1 KDa)。
將半乳糖胺基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045毫摩爾)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)。然后加入U(xiǎn)MP-嗎啉酸酯(60mg，0.15毫摩爾)，將獲得的混合物在70℃下攪拌48h。通過(guò)反應(yīng)混合物鼓氮?dú)饷摮軇?，由反相色譜精制殘余物(C-18二氧化硅，步驟梯度10-80％，甲醇/水)。收集所需的級(jí)分并在減壓下干燥以得到白色固體。TLC(二氧化硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀測(cè)值，1485，1529，1618，1706。
實(shí)施例4制備半胱氨酸-PEG2(2)
4.1合成化合物1在氬氣下將氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，作為粉末)加入L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在無(wú)水甲醇(20L)中的溶液。將混合物在室溫下攪拌30min，和然后分幾個(gè)部分在2小時(shí)內(nèi)加入分子量為20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)。將混合物在室溫下攪拌5天，和由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將殘余物采用水(30mL)稀釋，和在室溫下攪拌2小時(shí)以破壞任何過(guò)量的20千道爾頓mPEG-O-甲苯磺酸酯。將溶液然后采用乙酸中和，pH調(diào)節(jié)到pH 5.0，裝載到反相色譜(C-18二氧化硅)柱上。將柱采用甲醇/水的梯度洗脫(產(chǎn)物在約70％甲醇下洗脫)，產(chǎn)物洗脫由蒸發(fā)性光散射監(jiān)測(cè)，收集適當(dāng)?shù)募?jí)分并采用水(500mL)稀釋。將此溶液進(jìn)行色譜分析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300ml，氫氧化物形式；水對(duì)水/乙酸的梯度-0.75N)，將適當(dāng)級(jí)分的pH采用乙酸降低到6.0。然后將此溶液在反相柱(C-18二氧化硅)上捕集，采用上述甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級(jí)分匯集、濃縮、再溶于水并冷凍干燥以提供白色固體(1)。化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500 MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。產(chǎn)物的純度由SDS PAGE確認(rèn)。
4.2合成化合物2(半胱氨酸-PEG2)將三乙胺(～0.5mL)滴加到溶于無(wú)水CH2Cl2(30mL)的化合物1(440mg，22μmol)的溶液直到溶液為堿性。將20千道爾頓mPEG-O-對(duì)硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液分幾個(gè)部分在1小時(shí)內(nèi)在室溫下加入。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除溶劑，將殘余物溶于水(100mL)，采用1.0N NaOH調(diào)節(jié)pH到9.5。將堿性溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，然后采用乙酸中和到pH 7.0。然后將溶液裝載到反相色譜(C-18二氧化硅)柱上。將柱采用甲醇/水進(jìn)行梯度洗脫(產(chǎn)物在約70％甲醇下洗脫)，由蒸發(fā)性光散射監(jiān)測(cè)產(chǎn)物洗脫，收集適當(dāng)?shù)募?jí)分并采用水(500mL)稀釋。將此溶液進(jìn)行色譜分析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300ml，氫氧化物形式；水對(duì)水/乙酸的梯度-0.75N)，將適當(dāng)級(jí)分的pH采用乙酸降低到6.0。然后將此溶液在反相柱(C-18二氧化硅)上捕集并采用上述甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級(jí)分匯集、濃縮、再溶于水并冷凍干燥以提供白色固體(2)。化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ 2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。產(chǎn)物的純度由SDS PAGE確認(rèn)。
實(shí)施例5制備UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1 KDa)。
將半乳糖胺基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1千道爾頓)(58mg，0.045毫摩爾)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)。然后加入U(xiǎn)MP-嗎啉酸酯(60mg，0.15毫摩爾)，將獲得的混合物在70℃下攪拌48小時(shí)。通過(guò)反應(yīng)混合物鼓氮?dú)饷摮軇?，由反相色譜精制殘余物(C-18二氧化硅，步驟梯度10-80％，甲醇/水)。收集所需的級(jí)分，在減壓下干燥以得到白色固體。TLC(二氧化硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值，1485，1529，1618，1706。
SDS PAGE過(guò)程產(chǎn)物1和2的純度由SDS PAGE確認(rèn)。使用4-20％Tris-甘氨酸SDSPAGE凝膠(Invitrogen)。將樣品與SDS樣品緩沖劑1∶1混合，在Tris-甘氨酸運(yùn)行緩沖劑(LC2675-5)中在恒定電壓(125V)下運(yùn)行1小時(shí)50min。在電泳之后，將凝膠采用水(100mL)洗滌10min，隨后采用5％氯化鋇水溶液(100mL)洗滌10min。通過(guò)采用0.1N碘溶液(4.0mL)在室溫下染色凝膠顯現(xiàn)產(chǎn)物1或2，通過(guò)用水洗滌凝膠停止染色過(guò)程。將顯現(xiàn)的產(chǎn)物譜采用HP Scanjet 7400C掃描，采用HP Precision ScanProgram優(yōu)化凝膠的圖像。
盡管參考具體的實(shí)施方案公開(kāi)了本發(fā)明，顯然的是本發(fā)明的其它實(shí)施方案和變化形式可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)而不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。
在此申請(qǐng)中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和其它出版物在此對(duì)于所有的目的全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.通式為選自如下的成員的化合物 和 其中R1是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7表示H、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基；R2是選自如下的成員H、OH、活化基團(tuán)和包括核苷酸的部分；R3，R4，R5，R6和R6′獨(dú)立地選自H、取代或未取代的烷基、OR9、和NHC(O)R10其中R9和R10獨(dú)立地選自H、取代或未取代烷基或取代或未取代的雜烷基，而R3，R4，R5，R6和R6′的至少一個(gè)包括聚合物改性部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2具有如下通式 其中R8是核苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R8是選自胞嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷和胸苷的成員。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3，R4，R5和R6的至少一個(gè)包括如下部分 其中R11是聚合物改性部分；L是選自鍵和連接基團(tuán)的成員；而w選自1-6的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中該連接基團(tuán)是選自取代或未取代的烷基和取代或未取代的雜烷基部分的成員。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中如下部分 具有通式 其中X2和X4獨(dú)立地選自連接片段；Xa是連接片段；R12和R13是獨(dú)立地選擇的聚合物臂；而c是1-20的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中該連接基團(tuán)具有如下通式 其中Xa和Xb是獨(dú)立地選擇的連接片段；而L1是選自鍵、取代或未取代的烷基或者是取代或未取代的雜烷基的成員。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，其中Xa和Xb是獨(dú)立地選自如下的連接片段S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中該連接基包括酰基部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中L-R11具有如下通式 其中s是0-20的整數(shù)；而R11是該聚合物改性部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該聚合物改性部分具有如下通式 其中X2和X4獨(dú)立地選自連接片段；X5是非反應(yīng)性基團(tuán)；而R12和R13獨(dú)立地是選擇的聚合物臂。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中X2和X4是獨(dú)立地選自如下的連接片段S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH和(CH2)gY″，其中g(shù)是1-50的整數(shù)；和Y″是選自O(shè)、S和NH的成員。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中X4是肽鍵；和R13是氨基酸殘基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有通式 其中D是選自-OH和(R11)w′-L-的成員；G表示選自H、(R11)w′-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成員；w′是2-6的整數(shù)，并且D和G的至少一個(gè)是(R11)w′-L-。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，具有通式 和 其中La是選自取代或未取代的烷基和取代或未取代的雜烷基的成員。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有通式 和 其中La是選自氨基酸殘基和含有2-4個(gè)氨基酸殘基的肽基殘基的成員；X2和X4獨(dú)立地選自連接片段；X5是非反應(yīng)性基團(tuán)；而R12和R13是獨(dú)立地選擇的聚合物臂。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的化合物，具有如下通式 其中X2和X4獨(dú)立地選自連接片段；Xa是連接片段；R12和R13是獨(dú)立地選擇的聚合物臂；和c是1-20的整數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有如下通式 其中AA-NH是氨基酸殘基；和P是聚合物改性基團(tuán)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中-AA-NH是-CH2NH。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物是酶底物，所述酶從選自活化糖、核苷酸糖及其組合的成員轉(zhuǎn)移糖部分到底物的受體部分。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的化合物，其中所述受體部分是選自糖基殘基，氨基酸殘基和苷元的成員。
22.一種制備胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)的方法，該方法包括(a)在適當(dāng)?shù)臈l件下使甘露糖胺與活化的N-保護(hù)的氨基酸接觸以在該甘露糖胺和N-保護(hù)的氨基酸之間形成酰胺結(jié)合物；(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下使該酰胺結(jié)合物與丙酮酸鹽和唾液酸醛縮酶接觸以轉(zhuǎn)化該酰胺結(jié)合物成唾液酸酰胺結(jié)合物；(c)在適當(dāng)?shù)臈l件下使該唾液酸酰胺結(jié)合物與胞苷三磷酸和合成酶接觸以形成胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物；(d)從該胞苷一磷酸唾液酸酰胺結(jié)合物脫除N-保護(hù)基團(tuán)，由此產(chǎn)生游離胺；和(e)使該游離胺與活化的PEG接觸，由此形成所述胞苷一磷酸唾液酸-聚(乙二醇)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該活化的N-保護(hù)的氨基酸具有如下結(jié)構(gòu)式
全文摘要
本發(fā)明提供了在它們的結(jié)構(gòu)中包括一個(gè)或多個(gè)聚合物改性部分的糖、核苷酸糖、活化糖。參考線性和支化聚合物，如水溶性聚合物聚(乙二醇)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了舉例說(shuō)明。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101087801SQ200580003264
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月26日
發(fā)明者S·德弗雷斯, C·鮑 申請(qǐng)人:尼奧斯技術(shù)有限公司