專利名稱：治療msrv/herv－w相關(guān)病理學(xué)的組合物的制作方法
幾年來，許多研究已證明，在糖尿病[1]、多發(fā)性硬化(MS)[2]和精神分裂癥(SCZ)[3]的病理學(xué)過程中存在各種逆轉(zhuǎn)錄病毒特別是內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV)的有影響的表達。HERV與已知的動物逆轉(zhuǎn)錄病毒具有同源性，并可能來源于它們向人類種系的整合。在人類基因組中，這些HERV的序列通常是不完全的，雖然已經(jīng)鑒定了全部的原病毒序列。
已經(jīng)從MS患者的軟腦脊膜細胞培養(yǎng)物中分離了逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒[4]。對這些顆粒的研究顯示，它們是具有同源于人DNA的基因序列，但定義為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(HERV-W)的一個新的家族[2、5、6]。不同的研究小組已經(jīng)證實了患者血清和/或腦脊液(CSF)中存在有MSRV(7-9)，并且證明了病毒負載與疾病演變相關(guān)[10]。其后又證明，MSRV和其包膜蛋白具有超抗原(SAg)型的、T淋巴細胞介導(dǎo)的促炎特性[11]。已建立了確認這些顆粒的體內(nèi)免疫病理原性，特別是它們誘導(dǎo)T淋巴細胞介導(dǎo)的促炎因子分泌能力的動物模型(人源化SCID小鼠)[12]。
在后文的描述中，將MSRV/HERV-W家族的病毒無差別地稱為MSRV或MSRV/HERV-W。
如MS，其他病理學(xué)則展示一個以存在大量白介素-6(IL-6)為特征的免疫系統(tǒng)活化譜。其中，精神分裂癥(SCZ)—一種與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)的神經(jīng)精神疾病—根據(jù)病例，其血清IL-6水平大大高于正常人[13]。另外，在SCZ患者中，已鑒定了與MSRV序列相似的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列[3]。再者，最近證明，新確診的SCZ患者表現(xiàn)與循環(huán)顆粒有關(guān)的MSRV/HERV-W家族的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列[14]。
這樣的表達與MSRV/HERV-W的各種神經(jīng)病理學(xué)中的作用是相匹配的，該作用借助于其包膜蛋白的促炎作用和涉及的活化途徑。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒元件(其本身處于活化輔因子的控制之下)及其相關(guān)作用全都與炎性脫髓鞘疾病有關(guān)[15]。在精神分裂癥的情況下，這種通過IL-6的過表達在系統(tǒng)水平上表現(xiàn)的炎癥，在腦灰質(zhì)的局部水平上，與已知的由腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨嗜細胞介導(dǎo)的炎性神經(jīng)毒性和興奮毒性作用也是相關(guān)的[16-30]。
也已報道了精神分裂癥患者，包括特別是狂郁精神病(偶極紊亂)的前皮質(zhì)組織中MSRV/HERV-W RNA序列的差異表達(不在正常人中表達)[31]。另外，已在具有抵觸性精神分裂癥的純合雙胞胎的血液中證明了這種“MSRV/HERV-W”逆轉(zhuǎn)錄病毒差異的系統(tǒng)反射，這樣便確證“系統(tǒng)性”復(fù)制物的存在，該復(fù)制物可在以前報道的循環(huán)IL-6的高度表達中起作用[3]。
精神分裂癥患者的皮質(zhì)、皮質(zhì)下、神經(jīng)毒性和/或興奮毒性信號的產(chǎn)生中，在特異性炎性因子的作用水平上，MSRV/HERV-W包膜蛋白的作用是精神分裂癥病原級聯(lián)反應(yīng)的一部分。
此時，來自不同小組的出版物均顯示，MSRV/HERV-W家族成員與諸如MS、SCZ的病理學(xué)相關(guān)，但其他疾病也證明參與其中。
本發(fā)明人現(xiàn)已不可預(yù)見地顯示，MSRV/HERV-W的包膜蛋白具有獨立于T淋巴細胞介導(dǎo)的另一種促炎活性，這種新的促炎活性有T細胞以外的細胞和T細胞受體(TCR)以外的受體參與，而且導(dǎo)致超級抗原活化TCR以外的促炎途徑的活化。因此，這種新的促炎活性在定義上不同于涉及結(jié)合T淋巴細胞TCR的、由超抗原功能引起的促炎活化。發(fā)明人已明確地發(fā)現(xiàn)，MSRV/HERV-W包膜蛋白可溶性部分的區(qū)域(Env-SU)負責這些由抗原呈遞細胞(巨嗜細胞、單核細胞(monocyte)、樹突狀細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞)介導(dǎo)的新的促炎作用，以及迄今沒有鑒定的其作用是激發(fā)MSRV/HERV-W Env-SU介導(dǎo)的促炎作用的受體。因此，天然存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒表面上的Env-SU以抗原呈遞細胞為靶標，激活它們并誘導(dǎo)大量TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。已在MS患者身上研究了這些促炎效應(yīng)，然后與供體中得到的結(jié)果進行比較。因此發(fā)明人顯示，MS患者體內(nèi)Env-SU誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生增加，而且與他們的臨床記分(EDSS)有關(guān)。推測MS患者血清IL-6、SCF和損傷的增加[32-37]在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中觀察到的損傷的發(fā)展和持續(xù)中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，參與這些新的促炎作用的Env-SU受體是TLR4(Toll樣受體4)蛋白。編碼TLR4的基因定位于染色體9(9q32-q33)。該蛋白質(zhì)由839個氨基酸組成，分子量為95679道爾頓(Da)。已知TLR4與另一種稱為MD-2的分子并與CD14一起協(xié)同作用，這種復(fù)合物參與識別細菌脂多糖(LPSs)，在細胞因子分泌和炎性反應(yīng)中導(dǎo)致NK-κ-B因子的活化，但在本發(fā)明之前尚不清楚MSRV/HERV-W包膜蛋白之可溶性部分(Env-SU)的受體的作用。因為T淋巴細胞上沒有TLR4蛋白的表達，所以T淋巴細胞并不是本文中用TLR4受體證明的作用的主要靶標。發(fā)明人的研究還顯示，無論什么逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制，與在患者生物液中檢測到的循環(huán)RNA有關(guān)的MSRV逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒都是該新的、有存在于諸如巨嗜細胞、單核細胞、樹突狀細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的抗原呈遞細胞上的TLR4受體參與的早期促炎活化途徑的誘導(dǎo)劑。為此，他們失活了從生產(chǎn)培養(yǎng)物上清中純化的MSRV病毒顆粒[4]，并試驗了它們的與MSRV/HERV-W包膜蛋白有關(guān)的活性。實驗部分給出的結(jié)果證實，TLR4受體使先天免疫失活的早期途徑是被可溶形式的包膜蛋白Env-SU和MSRV病毒顆粒表面上膜結(jié)合形式的包膜蛋白靶向的。
因此，本發(fā)明所得到的結(jié)果使之有可能在病理學(xué)特別是如MS和SCZ中的神經(jīng)病理學(xué)建立免疫治療策略，特別是有可能鑒定出能夠穿過血腦屏障運輸一種或多種治療劑的載體(vector)。在治療上，本發(fā)明所得結(jié)果的基本方面是它們有可能依靠鑒定參與早期炎性信號產(chǎn)生的“MSRV/HERV-W Env-SU和TLR4”配體/受體系統(tǒng)，靶向該區(qū)域中有獨特特異性的、與腦小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨嗜細胞的活化有關(guān)的炎性成分，該早期信號例如當它們來源于白質(zhì)(MS)中的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨嗜細胞時便啟動脫髓鞘級聯(lián)反應(yīng)，或者當它們是由灰質(zhì)(SCZ)中的同樣細胞產(chǎn)生時，則啟動興奮毒性/神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的主題是治療表現(xiàn)有與MSRV/HERV-W的存在有關(guān)的病理學(xué)的個體的方法，該方法包括對該個體給予治療組合物或藥物，該治療組合物或藥物包括至少一種抗體，其選自組(i)能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶性部分特異性結(jié)合的抗MSRV/HERV-WEnv-SU抗體，或者組(ii)能夠與MSRV/HERV-W Env-SU蛋白的可溶部分中的TLR4受體特異性結(jié)合的抗體，從而抑制因MSRV/HERV-W活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)，以及還包括賦形劑(carrier)，必要時加上醫(yī)藥上可接受的載體(vector)。所述的抗體抑制通過MSRV/HERV-W Env-SU活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)。所述的方法特別適用于治療MS和SCZ，但也能用于治療與MSRV/HERV-W的促炎蛋白的表達有關(guān)其他疾病，其中所述的MSRV/HERV-W的促炎蛋白啟動病理學(xué)級聯(lián)。
所述的抗Env-SU抗體能夠與對應(yīng)于SEQ ID NO1中鑒定之序列的氨基酸122-131(包括在內(nèi))的區(qū)域結(jié)合，和/或與對應(yīng)于氨基酸312-316(包括在內(nèi))，和/或與對應(yīng)于氨基酸181-186(包括在內(nèi))的區(qū)域結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以給予患者包括至少一種抗MSRV/HERV-WEnv-SU抗體或至少一種抗TLR4抗體的組合物或藥物。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，給予患者包括至少一種抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體和至少一種抗TLR4抗體的組合物或藥物。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，抗Env-SU抗體選自下列抗體抗MSRV/HERV-W Env-SU單克隆抗體(抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10(bioMérieux))，且抗TLR4抗體是抗人TLR4抗體HTA125(由eBioscience公司出售)。本說明書下文中描述了得到bioMérieux單克隆抗體的方法。最近在抗原呈遞細胞上用TLR4受體證明，上述抗體具有原始的、迄今未知的中和促炎活性的特征。
借助相關(guān)的醫(yī)藥上可接受的賦形劑，或必要時借助醫(yī)藥上可接受的載體，來通過血腦屏障(BBB)運輸，給予患者抗TLR4或抗Env-SU抗體。對于MS病例來說，如果在病理學(xué)的某些階段血腦屏障是開放的，就不必使用這樣的載體；但當血腦屏障沒有開放時，例如SCZ病例中，則必須使用這樣的載體。這些載體是已知的[38-45]。治療途徑靶向與腦的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨嗜細胞的活化有關(guān)的炎性成分，其在該區(qū)域中具有獨特的特異性。這種特異性與參與早期炎性信號產(chǎn)生的“MSRV Env-SU和TLR4”配體/受體系統(tǒng)的鑒定有關(guān)，該早期炎性信號例如當所述的其來源于白質(zhì)(MS)中的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨嗜細胞時，便啟動脫髓鞘級聯(lián)反應(yīng)；或者當它們是由灰質(zhì)(SCZ)中的同樣細胞產(chǎn)生時，則啟動興奮毒性/神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)。
在與MSRV/HERV-W的病理學(xué)表達有關(guān)的各種疾病中，抗MSRVEnv-SU和抗TLR4抗體的使用價值是，在來源上阻斷因MSRV/HERV-W(根據(jù)病理學(xué)過程的不同，其本身可以是被皰疹病毒型感染性輔因子、激素信號或特異性細胞因子誘導(dǎo)的)的表達所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)。
因此，本發(fā)明的主題是用于治療目的的組合物，其包括至少一種選自能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特異結(jié)合或與MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受體特異結(jié)合的組(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體或組(ii)抗TLR4抗體，以及醫(yī)藥上可接受的賦形劑，必要時，所述的組合物還包括醫(yī)藥上可接受的載體；所述的抗體能夠抑制因MSRV/HERV-W Env-SU活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)。優(yōu)選地，該組合物包括至少一種抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體和至少一種抗TLR4抗體。所述組合物中優(yōu)選的抗體是抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體(3B2H4、13H5A5和3H10F10)和抗TLR4抗體HTA125。上述抗體是“中和”最近通過TLR4受體在抗原呈遞細胞上證明的促炎活性的單克隆抗體。
所述的抗Env-SU抗體特別能夠與對應(yīng)于SEQ ID NO1中鑒定之序列的氨基酸122-131(包括在內(nèi)的)的區(qū)域結(jié)合，和/或與對應(yīng)于氨基酸312-316(包括在內(nèi)的)，和/或與對應(yīng)于氨基酸181-186(包括在內(nèi)的)的區(qū)域結(jié)合。
本發(fā)明的主題也是至少一種選自能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特異結(jié)合或與MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受體特異結(jié)合的組(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體或組(ii)抗TLR4抗體在藥物制備中的用途；所述的抗體抑制因MSRV/HERV-W Env-SU活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)。特別是，使用至少一種抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體和至少一種抗TLR4抗體。所述抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體選自抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10，并且所述抗TLR4抗體是抗體HTA125。這種用途是用于治療與MSRV/HERV-W有關(guān)的病理過程，例如多發(fā)性硬化和精神分裂癥。
所述的抗Env-SU抗體特別能夠與SEQ ID NO1中鑒定之序列中對應(yīng)于氨基酸122-131(包括在內(nèi)的)的區(qū)域結(jié)合，和/或與對應(yīng)于氨基酸312-316(包括在內(nèi)的)和/或與對應(yīng)于氨基酸181-186(包括在內(nèi)的)的區(qū)域結(jié)合。
本發(fā)明的主題也是選自能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特異結(jié)合或與MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受體特異結(jié)合的、抑制因MSRV/HERV活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)的抗MSRV/HERV-WEnv-SU和抗TLR4抗體，特別是抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10。但生產(chǎn)和選擇其他抗體，在下述實驗部分所述的體外試驗中選擇能夠抑制Env-SU的促炎作用的抗體的條件，應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、重組抗體以及所述抗體的片段，特征是對MSRV/HERV-W包膜蛋白的可溶部分具有高親和力，并且沒有或只有很弱毒性。具體而言，優(yōu)選使用那些可變區(qū)和/或恒定區(qū)對待給藥個體免疫原性很弱的抗體。本發(fā)明抗體的特征是它們能夠治療那些表現(xiàn)出與MSRV/HERV-W有關(guān)的病理學(xué)的患者，同時沒有或只有很弱的毒性。這些抗體的微弱免疫原性和高親和性使之有可能達到預(yù)期的治療效果。
術(shù)語“抗體片段”是指天然抗體的F(ab)2、Fab、Fab′和sFv片段(Blazaret al.，1997，Jiurnal of Immunology 159；5821-5833和Bird et al.，1988，Science 242；423-426)，而術(shù)語”嵌合抗體”是指天然抗體的嵌合衍生物(例如參見Arakawa et al.，1996，J.Biochem.120657-662和Chaudray et al.，1989，Nature 339394-397)。
生產(chǎn)單克隆抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識。例如參見Kǒhler G.andMilstein C.(1975)Continuous culture of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity(分泌預(yù)定特異性抗體的融合細胞的連續(xù)培養(yǎng))，Nature，266522-550。免疫原可以與用作免疫支持物的鑰孔戚血藍素(KLH肽)或血清白蛋白(SA肽)偶聯(lián)。給動物注射加有弗氏完全佐劑的免疫原。使用常規(guī)技術(shù)，例如ELISA和Western免疫印跡法分析被免疫動物的血清和雜交瘤培養(yǎng)物上清的特異性和選擇性。選擇產(chǎn)生最大特異性和最大敏感性的抗體的雜交瘤。也可以使用雜交瘤細胞培養(yǎng)物，或從腹腔內(nèi)注射了雜交瘤的小鼠腹水液在體外生產(chǎn)單克隆抗體。不管是使用上清液還是腹水生產(chǎn)的單克隆抗體，抗體都要進行純化。所使用的純化方法主要是離子交換凝膠過濾和排阻層析或親和層析(蛋白A或G)。用功能性實驗篩選方法選擇出最有效的抗體。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的遺傳工程方法體外生產(chǎn)抗體、抗體片段或嵌合抗體。舉例來說，可以克隆從編碼抗體可變區(qū)片段(scFv)的RNA得到的cDNA，以生產(chǎn)抗體。非人類抗體、例如鼠抗體的“人源化”形式是包括衍生于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的絕大部分是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中受體的超可變區(qū)殘基被具有所期望特異性、親合性和結(jié)合能力的非人類供體例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的超可變區(qū)殘基所取代。在某些情況下，人免疫球蛋白Fv區(qū)的殘基(FR)被相應(yīng)的非人類殘基所取代。另外，人源化的抗體可包括未見于接受抗體或供體抗體中的殘基。這些修飾可以改善抗體的效能?？偟卣f來，人源化抗體包括至少一個，最好兩個可變區(qū)，其中所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的超可變環(huán)相當于非人免疫球蛋白，所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白區(qū)域。人源化抗體也可任選地至少包括免疫球蛋白如人免疫球蛋白恒定區(qū)的一個部分。一般說來，可變區(qū)衍生于非人哺乳動物抗體，而恒定區(qū)則衍生于人免疫球蛋白。優(yōu)選地，所選的可變區(qū)有弱免疫原性，并且是與也表現(xiàn)有弱免疫原性的恒定區(qū)結(jié)合的。
這些抗體優(yōu)選下列“中和”抗體—抗MSRV/HERV-W Env-SU單克隆抗體抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10(bioMérieux)，—抗TLR4抗體抗人TLR4單克隆抗體HTA125(由eBioscience公司出售)。
根據(jù)下述方法生產(chǎn)所述的抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體。
抗體3B2H4的生產(chǎn)按照下述程序免疫小鼠第0天，于不完全弗氏佐劑存在下，腹腔注射20μg由先前描述的[11]純化的重組MSRV/Env蛋白組成的免疫原。第14天和第18天，在不完全弗氏佐劑存在下，進一步腹腔注射同樣量的免疫原。融合前第4、3和2天，腹腔注射100μg在生理鹽水中稀釋的免疫原。
用間接ELISA技術(shù)篩選400份上清液。用溶于0.05M碳酸氫鹽緩沖液(1μg/ml，pH 9.6)的100μl抗原包被平板。將包被的平板在18-22℃下孵育過夜。用200μl PBS-1％奶飽和平板，并于37±2℃下孵育1小時。加入100μl在PBS緩沖液-0.05％吐溫20中稀釋的上清液或腹水液，并于37±2℃將平板孵育1小時。加入在PBS緩沖液-1％BSA中1/2000稀釋的、與堿性磷酸酶(AP)(Jackson Immunoresearch，115-055-062)結(jié)合的100μl羊抗小鼠Ig(H+L)多克隆抗體，然后將平板于37±2℃保溫1小時。加入溶于DEA-HCl(BioMérieux，60002989)(pH＝9.8)中的濃度為2mg/ml的100μl PNPP(bioMérieux，60002990)。然后于37±2℃保溫培養(yǎng)板30分鐘。加入100μl 1N NaOH阻斷反應(yīng)。每步驟之間用300μl的PBS-0.05％吐溫20洗3次。加入PNPP之前，在蒸餾水中加洗一次。
間接ELISA發(fā)現(xiàn)22份上清為OD值大于0.2的陽性，相當與本底噪音的4倍。特異性試驗后，即得到所要的單一抗體。
抗體13H5A5和3H10F10的生產(chǎn)按照下述程序免疫小鼠第0天，于不完全弗氏佐劑存在下，腹腔注射40μg由先前描述的[11]純化的重組MSRV/Env蛋白組成的免疫原。第14、28和第78天，在不完全弗氏佐劑存在下，進一步腹腔注射同樣量的免疫原。融合前第4、3和2天，腹腔注射50μg在生理鹽水中稀釋的免疫原。
用上述間接ELISA技術(shù)篩選1350份上清液。
間接ELISA發(fā)現(xiàn)39份上清為OD值大于0.4的陽性，相當與本底噪音的4倍。特異性試驗后，即得到所要的兩種抗體。
使用上述抗Env-SU和抗TLR4抗體制備用于治療與上述MSRV/HERV-W有關(guān)的病理學(xué)的藥物或治療組合物。在用于治療目的的本發(fā)明組合物中，將抗體或活性成分與醫(yī)藥上可接受的賦形劑，以及任選的載體結(jié)合。根據(jù)所選擇的給藥方法和醫(yī)藥領(lǐng)域的標準實踐來確定和選擇醫(yī)藥上可接受的賦形劑。因為口服給藥時蛋白質(zhì)會受到消化，所以通常選擇諸如靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)的胃腸道外途徑給藥，以利于最大吸收。例如Remington′s Pharmaceutical Science(雷明頓制藥學(xué)，第16版，Mark出版公司)已描述了醫(yī)藥上可接受的賦形劑?？梢詫?.5％(重量)的活性成分溶解到0.9％的氯化鈉溶液中，制備適于注射給藥的組合物。將抗體與能使抗體通過血腦屏障(BBB)的載體結(jié)合可能是必要的。因此可以將不可運輸?shù)目贵w與可運輸?shù)妮d體例如陽離子化白蛋白、運鐵蛋白、胰島素或胰島素樣生長因子，或所述蛋白質(zhì)的片段偶聯(lián)。特別是已經(jīng)顯示，將不能運輸?shù)膯慰寺】贵w(IgG3)連接到運輸載體例如運鐵蛋白或胰島素樣生長因子上，不僅能夠通過BBB，而且可以保留這些抗體的功能特性。其他研究已經(jīng)顯示，神經(jīng)藥物可以通過脂質(zhì)體傳輸?shù)侥X內(nèi)。這一方法是是重要的，因為它提出了一個任何能被包裹在脂質(zhì)體中的分子都可以被導(dǎo)入腦內(nèi)的機制。
抗體可以作為單獨的治療劑使用，或者與其他治療劑聯(lián)合使用以提高和改善治療效果。劑量將依據(jù)諸如特殊治療劑的藥物動力學(xué)性質(zhì)和其給藥途徑，以及患者年齡、體重、給藥頻率和預(yù)期的治療效果的已知因素而定。通常情況下，活性成分的每日劑量為0.01-100微克/公斤體重。一般為1-40微克/公斤體重/天，每天一次或分多次給予所述的有效劑量。
本發(fā)明也涉及MSRV/HERV-W Env-SU在通過檢測選自IL-6、IL-12-p40和TNF-α的細胞因子，確定多發(fā)性硬化或精神分裂癥患者血液單個核細胞(mononuclear cell)的反應(yīng)性狀態(tài)的用途。
附1代表Env-Pv14包膜、信號肽和Env-SU包膜的可溶部分的結(jié)構(gòu)，以及信號肽和Env-SU包膜可溶部分的氨基酸序列。

圖1(a)相當于Env-Pv14(MSRV的完整包膜蛋白)的結(jié)構(gòu)，信號肽的結(jié)構(gòu)和Env-SU包膜之可溶部分的結(jié)構(gòu)。包膜的可溶部分(Env-SU)相當于在完整Env-Pv14蛋白的位置K316處切割的可溶性細胞外單元的287個氨基酸部分。圖1(b)代表信號肽和Env-SU的氨基酸序列。在圖1(b)中，信號肽的序列被框起來，而包膜的可溶部分(Env-SU)則以黑體字母顯示。Env-SU的序列顯示為SEQ ID NO1的序列號。Env-Pv14包膜的完整序列可在GenBank中查到，其登錄為AF331500。參考圖1(a)，Env-Pv14蛋白的不同部分一般限定如下—信號肽在氨基酸1處開始，并在氨基酸29(包括在內(nèi))處終止，
—Env-SU在氨基酸30處開始，并在氨基酸316(包括在內(nèi))處終止，—跨膜區(qū)在氨基酸317處開始，并在氨基酸542(包括在內(nèi))處終止。
計算的Env-SU的平均分子量等于32061.59。估計的pI等于9.61。
其氨基酸組成如下非極性氨基酸數(shù)目 百分比A 9 3.14V 165.57L 258.71I 134.53P 217.32M 7 2.44F 113.83W 6 2.09極性氨基酸；數(shù)目 百分比G 165.57S 3110.80T 3411.85C 124.18Y 103.48N 186.27Q 9 3.14酸性氨基酸數(shù)目 百分比D 4 1.39E 10 3.48
堿性氨基酸數(shù)目 百分比K 93.14R 12 4.18H 14 4.88圖2在人PBMC(單個核細胞)的培養(yǎng)物中，Env-SU誘導(dǎo)促炎細胞因子產(chǎn)生。圖2A代表用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)分析用漸增劑量的Env-SU刺激24小時的正常供體PBMC培養(yǎng)物上清中測得的TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。結(jié)果相當于3次獨立的實驗。X軸是Env-SU的劑量(μg/ml)。Y軸相當于細胞因子的量(ng/ml)。曲線中，符號■相當于IL-6的分泌，符號●相當于IL-1β的分泌，符號▲相當于TNF-α的分泌。圖1B中，用1μg/ml自體對照物、Env-SU、LPS或SEB刺激PBMC并保溫24、48和72小時，然后用ELISA方法分析細胞因子分泌。X軸相當于時間(小時)，Y軸相當于細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，圖1B(a)和1B(c)中的IFN-γ和IL-6的濃度單位為ng/ml，而圖1B(b)和1B(d)中的TNF-α和IL-1β的濃度單位為pg/ml。該圖中，—●—相當于Env-SU，---x---相當于LPS，—▲—相當于自體對照物，----■----相當于SEB。
圖3Env-SU的細胞因子刺激活性并不是由于內(nèi)毒素污染。用自體對照物(Mock)、Env-SU、LPS或SEB刺激PBMS 24小時。當提示時，于刺激前用10μg/ml多粘菌素(pdyB)處理細胞(圖中用黑色代表)。平行地，細胞也與蛋白質(zhì)和煮沸的(100℃)毒素一起孵育30分鐘(圖中以灰色代表)。收獲培養(yǎng)物上清液并用ELISA方法檢測TNF-α的釋放。該圖中顯示的結(jié)果相當于三次實驗的平均數(shù)。Y軸相當于所釋放的TNF-α的量，單位為pg/ml。
圖4抗Env-SU單克隆抗體(13H5A5)阻斷Env-SU的細胞因子刺激活性。用自體對照物CK2、Env-SU和LPS刺激PBMS 24小時，并用30μg/ml抗Env-SU單克隆抗體和抗Gag單克隆抗體(3H1H6)預(yù)孵育或不孵育。收獲培養(yǎng)物上清并檢測TNF-α的分泌。該圖中顯示的結(jié)果相當于三次實驗的平均數(shù)。Y軸相當于所釋放的TNF-α的量，單位為pg/ml。
圖5Env-SU直接活化純化的人單核細胞。從人PBMC中純化人單核細胞(純度大于95％)，然后用濃度為1μg/ml的自體對照物(Mock)、Env-SU或LPS刺激24小時。圖5a顯示以流式細胞術(shù)分析的活化標志物CD80(左圖)和CD86(右圖)的表達。沿著X軸是計數(shù)的細胞數(shù)，沿著Y軸是每個細胞的熒光強度(“計數(shù)”)。所得到的結(jié)果代表每個熒光強度所計數(shù)的細胞數(shù)。曲線所限定的面積代表實驗的每個條件下的細胞總數(shù)。曲線的外貌顯示細胞分布是熒光強度的函數(shù)。白色面積代表對照物(Mock)所得到的結(jié)果，用細線勾畫的陰影面積代表Env-SU所得到的結(jié)果，用粗線勾畫的陰影面積代表LPS所得到的結(jié)果。圖5b代表用ELISA方法分析的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p40的分泌。白色面積代表用自體對照物刺激后所得到的結(jié)果，黑和灰柱分別代表Env-SU和LPS刺激后所得到的結(jié)果。Y軸相當于細胞因子的分泌量，單位為ng/ml。結(jié)果是三次實驗的平均數(shù)。
圖6Env-SU活化的單核細胞(monocyte)衍生的樹突細胞(MDDCs)。從純化的單核細胞中產(chǎn)生MDDCs，然后用濃度為1μg/ml的自體對照物(Mock)、Env-SU或LPS刺激24小時。圖6a代表用流式細胞儀分析的活化標志物CD80、CD86、CD40和HLA-DR的表達。X軸是計數(shù)的細胞數(shù)，Y軸是每個細胞的熒光強度(“計數(shù)”)。上方左影象代表CD80的分析結(jié)果，上方右影象代表CD86的分析結(jié)果，下方左影象代表CD40的分析結(jié)果，下方右影象代表HLA-DR的分析結(jié)果。所得到的數(shù)值代表每個熒光強度下所計數(shù)的細胞數(shù)。曲線所限定的面積表示每個實驗條件下的總細胞數(shù)。曲線的外貌顯示細胞分布是熒光強度的函數(shù)。左側(cè)白色面積代表對照物(Mock)所得到的結(jié)果，粗線勾劃的右側(cè)白色面積代表用Env-SU得到的結(jié)果，陰影面積代表用LPS得到的結(jié)果。圖6b代表以ELISA分析培養(yǎng)物上清中的TNF-α、IL-6、IL-12p40和IL-12p70的分泌。Y軸相當于所分泌的細胞因子的量(ng/ml)。在圖6b所代表的直方圖中，Mock相當于用自體對照物刺激后得到的結(jié)果，Env-SU(黑體)相當于用Env-SU刺激后得到的結(jié)果，LPS相當于用LPS(灰色)刺激后得到的結(jié)果。圖6c表示用Env-SU—■—、LPS--▲--、對照物CK2—●—刺激的樹突細胞誘導(dǎo)的異源T細胞增殖。X軸代表樹突細胞數(shù)(分別為0、1000、5000和10000)。Y軸代表摻入了3H-胸苷的細胞發(fā)射的每分鐘計數(shù)。
圖7CD14和TLR4參與Env-SU的促炎作用。在有或沒有濃度為20μg/ml和5μg/ml的抗CD14(rhCD14，貨號AB383，R&D Systems-UK)(圖7a)及抗TLR4(圖7b)中和抗體存在的情況下，將PBMCs預(yù)孵育1小時。然后用濃度為1μg/ml的CK2對照物、Env-SU(ENV1)、LPS和SEB刺激PBMS 24小時。用ELISA方法分析培養(yǎng)物上清中的TNF-α釋放。結(jié)果顯示在直方圖7a和7b中。Y軸相當于所釋放的TNF-α的量(ng/ml)。黑色直方條相當于沒有加入抗體得到的結(jié)果，白色直方條相當于在濃度為20μg/m的抗CD14和抗TLR4抗體存在下得到的結(jié)果，灰色直方條相當于在濃度為5μg/m的抗CD14和抗TLR4抗體存在下得到的結(jié)果。結(jié)果為三次實驗的平均數(shù)。
圖8活化TLR4途徑后的免疫放大級聯(lián)反應(yīng)。給出該級聯(lián)反應(yīng)中治療靶的例子。
圖8示意性顯示由于MSRV/HERV-W包膜蛋白的病理表達所引起的活化級聯(lián)反應(yīng)。MSRV/HERV-W最初刺激TLR4受體，可能關(guān)聯(lián)到CD14共同受體。在此相互作用之前，只有激動劑MSRV/ENV蛋白。在此活化之后，先天免疫的細胞被活化，數(shù)十種分子效應(yīng)物(細胞因子、酶、脂質(zhì)、自由基或氧化還原化合物等)與活化的細胞混到了一起。在多發(fā)性硬化的情況下，破壞腦的白質(zhì)并向T淋巴細胞呈遞髓磷質(zhì)后，第二種成分，即與過繼性免疫的自體反應(yīng)性T細胞有關(guān)的自身免疫成分被活化。在這個階段，數(shù)百種甚至數(shù)千種不同的分子和細胞參與介導(dǎo)免疫病理學(xué)效應(yīng)。這就給出一個典型的免疫病理學(xué)放大級聯(lián)反應(yīng)，其可能與初始刺激物(MSRV/HERV-W ENV)不再有相似性。
在存在于放大級聯(lián)階段的許多其他激動劑中，迄今可利用或提出的治療只是靶向促炎或病理激動劑“下游”(給出的例子有抗TNF-α抗體、干擾素β和如阿魏酸的自由基清除分子)。在這里，它們不能抑制很大量的對它們的藥理學(xué)效應(yīng)不敏感的其他效應(yīng)物(分子或細胞)。這就解釋了目前在諸如MS的疾病的許多治療中的部分和相對效應(yīng)。
此外，這些治療并不能阻止表達病理學(xué)MSRV/HERV-W拷貝(在活性環(huán)境輔因子例如皰疹病毒的影響下)的其他細胞同時或不同時間(多灶損傷或復(fù)發(fā)/緩解的原則，其以大腦空間和疾病演變時間的方式定義MS)、在同一損傷部位或腦的另一部位產(chǎn)生促炎包膜。
因此，抑制級聯(lián)階段的初始效應(yīng)(并不產(chǎn)生可被蛋白-靶誘導(dǎo)的所有下游效應(yīng)物)的治療比在這些與該MSRV/HERV-W包膜蛋白的促炎效應(yīng)有關(guān)的病理學(xué)中通常設(shè)計和使用的途徑更相關(guān)，且更有效。事實上，即使級聯(lián)被激活，按照這種治療策略它也將是“干縮的”上游，而上游刺激將延續(xù)到其他“下游”治療手段。最后，在疾病緩解期間防止進一步復(fù)發(fā)的手段中，在“MSRV/HERV-W ENV”蛋白引發(fā)所述的級聯(lián)之前，這些抗體能夠中和“MSRV/HERV-W ENV”蛋白，而在該炎性級聯(lián)被激發(fā)之后，其他靶向“下游”分子或細胞的治療方法僅起到干擾作用。
圖9由“MSRV/HERV-W ENV”蛋白的促炎效應(yīng)引起兩種疾病的四個關(guān)鍵步驟(i)兩個共同的“上游”步驟I-TLR4受體活化，和II-局部炎癥，(ii)兩個不同的“下游”步驟III-神經(jīng)脫髓鞘或興奮毒性，和IV-多發(fā)性硬化和精神分裂癥。
包膜蛋白(Env)是在病理性活化中，由MSRV/HERV-W家族的逆轉(zhuǎn)錄病毒拷貝產(chǎn)生的，該活化例如，在被皰疹病毒家族的感染性輔因子[46-49]反式活化后，該活化由該輔因子的趨向性并由保藏有至少一個原病毒MSRV/HERV-W拷貝(該原病毒可被該輔因子活化，并且編碼包膜蛋白)的靶組織的細胞的存在來決定。
因此，所產(chǎn)生的該ENV蛋白與TLR4受體結(jié)合，并且根據(jù)上下文其也可與存在于產(chǎn)生MSRV/HERV-W ENV和/或MSRV病毒顆粒之細胞附近的大腦組織中的巨嗜細胞或小神經(jīng)膠質(zhì)細胞型細胞的TLR4共同受體如CD14結(jié)合。如果所述的細胞是巨嗜細胞或小神經(jīng)膠質(zhì)細胞，就有可能在相同細胞的TLR4受體上表現(xiàn)有自分泌效應(yīng)。
與TLR4受體相互作用的步驟之后，免疫病理放大級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生數(shù)十種促炎和介導(dǎo)組織破壞的分子，從而在MSRV/HERV-W再活化部位周圍的相關(guān)組織中發(fā)生局部炎癥。
這個階段之后，根據(jù)MSRV/HERV-W再活化輔因子和保藏這些“反應(yīng)物”原病毒的細胞是否已轉(zhuǎn)向在白質(zhì)或灰質(zhì)中表達，這種狀態(tài)會趨異。
在導(dǎo)致如精神分裂癥的病理學(xué)的病理途徑第一種情況中，前腦皮層神經(jīng)結(jié)構(gòu)附近誘導(dǎo)的MSRV/HERV-W元件的重新活化和過表達，誘導(dǎo)灰質(zhì)組織中的局部炎癥，將不允許主要前損傷活性和特異性免疫的復(fù)原。這種局部炎癥將不允許T淋巴細胞在這個水平上浸潤。另一方面，在負責智力和認知活性的神經(jīng)細胞附近產(chǎn)生的促炎介導(dǎo)物，引起局部神經(jīng)興奮毒性，該毒性決定受感染的大腦空間中相關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，并在此期間出現(xiàn)這種促炎效應(yīng)[17、20、22-26、29、50、51]。依據(jù)受感染的面積不同，由興奮毒性神經(jīng)活化所引起的“心理”條件通過幻覺和譫狂想象反射出來，后者體現(xiàn)了精神分裂癥的臨床病理學(xué)發(fā)作特征。最后，已知這種興奮毒性可導(dǎo)致細胞死亡，其具體表現(xiàn)為精神分裂癥患者大腦腦室的擴大(用MRI檢測)[52]。
在確定導(dǎo)致多發(fā)性硬化的病理途徑的第二種情況下，白質(zhì)中的髓磷脂對自由基和促炎因子特別敏感，致使其主要產(chǎn)生脫髓鞘作用，同時向在先炎癥募集的淋巴細胞呈遞自身抗原。
在這些條件下，淋巴細胞反應(yīng)性傾向是受預(yù)先由小神經(jīng)膠質(zhì)細胞/巨噬細胞型細胞(Th1傾向)分泌的細胞因子控制的。其足以在這些條件下對所呈遞的“自身”抗原產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。此外，也已顯示，完整的MSRV包膜蛋白或MSRV病毒顆?？梢栽赥淋巴細胞上發(fā)揮不同的活性，即以與“TCR”受體相互作用為特征的超級抗原活性。在此“下游”上下文中，所述的因為原發(fā)炎癥浸入組織所募集的T淋巴細胞，最后加入T淋巴細胞的多克隆活化，甚至可進一步促進針對原發(fā)炎癥預(yù)先損傷的組織中的髓磷脂，產(chǎn)生特異性自身免疫T淋巴細胞反應(yīng)。然后，隨著活化的T淋巴細胞介導(dǎo)自身免疫和炎癥，而發(fā)生次級免疫病理學(xué)反應(yīng)。
圖10ENV-SU誘導(dǎo)的多發(fā)性硬化患者和正常供體(ND)的PBMC上的細胞因子產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-10圖10代表多發(fā)性硬化患者(MS)和正常供體(ND)的體外處理回輸(exvivo)的血液單個核細胞(PBMCs)中由MSRV-SU蛋白誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生。ND或MS之后的“n＝”代表檢測細胞因子的各群體中被試個體的數(shù)目。
X軸代表被刺激的PBMC培養(yǎng)物上清中的細胞因子劑量(ng/ml)。各圖比較了點(圈)所代表的各群體(ND和MS)中每個被試個體的結(jié)果。三個圖從左到右分別是腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和白介素(IL)-10。就這三種細胞因子來說，ND和MS兩個群體之間并沒有明顯區(qū)別。用Student’s檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
圖11ENV-SU誘導(dǎo)的多發(fā)性硬化患者和正常供體(ND)PBMC上的細胞因子產(chǎn)生IL-12 p40和IL-6圖11代表多發(fā)性硬化患者(MS)，和正常供體(ND)的體外處理回輸?shù)膯蝹€核細胞(PBMC)中由MSRV ENV-SU蛋白誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生。ND或MS之后的“n＝”代表檢測細胞因子的各群體中被試個體的數(shù)目。
X軸代表被刺激的PBMC培養(yǎng)物上清中的細胞因子劑量(ng/ml)。各圖比較了由點(圈)所代表的各群體(ND和MS)中每個被試個體的結(jié)果。兩個圖從左到右分別是白介素(IL)-12 p40a和白介素(IL)-6的產(chǎn)生。計算比較ND和MS兩群體的結(jié)果，可見MS群體的這兩種細胞因子明顯地高于ND群體(IL-12 p40的p＝0.003，IL-6的p＝0.0006)。用Student’s檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
圖12細胞因子產(chǎn)生和患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性圖12代表所研究的MS人群(X軸)的臨床參數(shù)與其PBMCs受MSRV-SU ENV刺激后所產(chǎn)生的某些細胞因子含量(Y軸)之間的相關(guān)性。每個圖中的”r”值代表相對于相關(guān)曲線的點分布統(tǒng)計學(xué)計算結(jié)果?！皃”值代表隨機得到的這種相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)概率。所以，任何p值大于0.05就是“無顯著性”，而小于0.05則表明所分析的因子之間存在相關(guān)性。
上面的兩個圖顯示MS患者的臨床記分EDSS(以1到10的嚴重性等級測得的[53])與IL-6(左側(cè))或IL-12 p4(右側(cè))之間的顯著相關(guān)性的參數(shù)。
下面兩個圖顯示未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性的參數(shù)的例子疾病的持續(xù)時間和IL-6(左圖)，或γ-干擾素與臨床記分EDSS(右圖)。
圖13精神分裂癥患者(SCZ)和正常供體(ND)的PBMC中自發(fā)產(chǎn)生(a)或Env-SU誘導(dǎo)產(chǎn)生(b)細胞因子IL-10圖13表示Env-SU誘導(dǎo)的、體外處理再回輸?shù)?1)精神分裂癥患者(SCZ)，和(2)正常供體(ND)的血液單個核細胞(PBMC)中細胞因子的產(chǎn)生。
X軸代表受刺激的PBMC培養(yǎng)物上清中細胞因子的劑量(ng/ml)。各圖比較用點表示的各群體(ND和SCZ)的各受試者個體的結(jié)果。從左到右兩個圖分別表示培養(yǎng)物中白細胞介素(IL)-10的自發(fā)產(chǎn)生和Env-SU刺激后誘導(dǎo)的白細胞介素(IL)-10產(chǎn)生。
圖14在精神分裂癥患者(SCZ)和正常供體(ND)的PBMC中自發(fā)產(chǎn)生(a)或Env-SU誘導(dǎo)產(chǎn)生(b)并計算相對增加(c)的細胞因子IL-12p40。
圖14表示MSRV Env-SU蛋白誘導(dǎo)的，體外處理再回輸?shù)木穹至寻Y患者(SCZ)，和正常供體(ND)的血液單個核細胞(PBMCs)中細胞因子的產(chǎn)生。
X軸代表受刺激的PBMC培養(yǎng)物上清中細胞因子的劑量(ng/ml)。各圖比較用點表示的各群體(ND和SCZ)的各受試者個體的結(jié)果。從左到右三個圖分別表示a)培養(yǎng)物中白細胞介素(IL)-12p40的自發(fā)產(chǎn)生，b)用Env-SU刺激后誘導(dǎo)的白細胞介素(IL)-10的產(chǎn)生，c)按下列公式計算的IL-12p40產(chǎn)生的相對增加(Env-SU刺激后的量-自發(fā)產(chǎn)生量)/自發(fā)產(chǎn)生量。
圖15在來源于正常供體的人PBMC的培養(yǎng)物中，鑒定和選擇那些抑制Env-SU蛋白誘導(dǎo)的單核細胞-巨嗜細胞的促炎活化的抗MSRV/HERV-W ENV單克隆抗體。a)用兩種抗ENV抗體和對照抗體分析，b)校準特異性分析的條件，c)獨立實驗的例子，d)獨立實驗的其他例子圖15a顯示在正常供體PBMCs培養(yǎng)物中，“Mock”對照蛋白(1μg/ml)、Env-SU(1μg/ml)和LPS(1μg/ml)(X軸)誘導(dǎo)的TNF-α分泌(ng/ml)(Y軸)。各刺激條件從左到由是白色柱代表沒有抗體所得到的結(jié)果，黑色柱代表存在抗MSRV ENV抗體3B2H4(30μg/ml)的結(jié)果，斜線柱代表存在抗MSRV ENV抗體13H5A5(30μg/ml)的結(jié)果，陰影柱代表存在抗MSRVGAG抗體3H1H6(30μg/ml)的結(jié)果。
圖15b顯示在與15a相同的正常供體PBMC培養(yǎng)物中，“Mock”對照蛋白(1μg/ml)、Env-SU(1μg/ml)和LPS(1μg/ml)(Y軸)誘導(dǎo)的TNF-α分泌(ng/ml)(Y軸)。各刺激條件從左到由是白色柱代表沒有抗體所得到的結(jié)果，黑色柱代表存在多粘菌素B(25μg/ml)的結(jié)果，陰影柱代表用在加入到PBMC培養(yǎng)物中之前于100℃加熱30分鐘的Mock、Env-SU或LPS所得到的結(jié)果。
圖15c顯示在正常供體PBMC培養(yǎng)物中用下列物質(zhì)誘導(dǎo)的TNF-α分泌(pg/ml)(Y軸)白色柱為“Mock”對照蛋白(1μg/ml)，黑色柱為Env-SU(1μg/ml)，陰影柱為LPS(1μg/ml)。從左到右是各個刺激條件，X軸顯示各抗體給出的結(jié)果與3B2H4同型的抗弓形蟲抗體“X”(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗體3B2H4(30μg/ml)、抗MSRV ENV抗體13H5A5(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗體3H10F10(30μg/ml)、抗MSRV GAG抗體3H1H6(30μg/ml)。
圖15d顯示在正常供體PBMC培養(yǎng)物中用下列物質(zhì)誘導(dǎo)的TNF-α分泌(pg/ml)(Y軸)，白色柱為“Mock”對照蛋白(1μg/ml)，黑色柱為Env-SU(1μg/ml)。從左到右是各刺激條件，X軸顯示各抗體給出的結(jié)果與3B2H4同型的抗弓形蟲抗體“X”(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗體3B2H4(30μg/ml)、抗MSRV ENV抗體6A2B2(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗體3H10F10(30μg/ml)和抗MSRV ENV抗體13H5A5(30μg/ml)。
圖16PBMC中TNF-α產(chǎn)生的動力學(xué)用5□1緩沖液(帶虛線和圓圈的曲線)、1□g/ml Env-SU(帶方塊的粗線曲線)或1□g/ml LPS(帶三角的細線曲線)刺激正常供體的PBMC，并孵育2、24、或48小時(X軸)，然后用ELISA方法分析TNF-α的產(chǎn)生。
圖17Env-SU在人源化SCID小鼠中的促炎作用X軸顯示的是每只動物注射緩沖液、50□g的ENV-SU或50□g的LPS的體重約25g的SCID小鼠。還如每一型的接種物的X軸顯示，通過ELISA分析了在2h、24h和48h處死小鼠的血清或腹腔灌洗液(IP)。
左側(cè)圖代表TNF-α的劑量(pg/ml)。其中上邊一個代表鼠細胞因子的劑量，下邊一個代表人細胞因子的劑量。
右側(cè)圖代表IL-6的劑量(pg/ml)。其中上邊一個代表鼠細胞因子的劑量，下邊一個代表人細胞因子的劑量。
圖18用MSRV ENV蛋白誘導(dǎo)EAE圖18顯示在C57B16小鼠中用MSRV ENV蛋白誘導(dǎo)EAE的初步實驗結(jié)果。
X軸代表注射后的天數(shù)。Y軸代表所研究的動物的平均臨床記分。
帶方塊的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐劑(含結(jié)核分支桿菌的提取物)的動物。以此種方式在第18天完成該系列研究。
帶三角的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)及MSRV ENV蛋白的動物。該系列研究以此種方式持續(xù)至多25天。
帶菱形的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身家抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)的陰性對照動物。該系列研究以此種方式持續(xù)至多25天。
圖19用MSRV ENV蛋白對EAE誘導(dǎo)的再生圖19是證實在C57B16小鼠中用MSRV ENV蛋白誘導(dǎo)EAE的實驗結(jié)果。
X軸代表注射后的天數(shù)。Y軸代表所研究動物的平均臨床記分。
帶方塊的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐劑(含結(jié)核分支桿菌的提取物)的陽性對照動物。該系列研究21天完成。
帶三角的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)及MSRV ENV蛋白的動物。該系列研究以此種方式持續(xù)至多42天。
帶菱形的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)的陰性對照動物。該系列研究以此種方式持續(xù)至多42天。
帶十字花的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌提取物)和LPS的陰性對照動物。該系列研究以此種方式持續(xù)至多42天。
圖20在”EAE/MOG/ENV-SU”模型和沒有用ENV免疫的對照小鼠中，在24小時分析針對漸增量的MOG自身抗原的自身免疫反應(yīng)。
X軸代表按圖19所述程序取樣的小鼠PBMC接觸MOG自身抗原的濃度(μg/ml)。Y軸代表由與漸增量的MOG抗原接觸的PBMCs中的自身免疫T淋巴細胞體外分泌的INF-γ的劑量。
白色柱代表已經(jīng)體內(nèi)注射了(于圖19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含分支結(jié)核桿菌提取物)和ENV-SU蛋白的小鼠PBMC。
黑色柱代表已經(jīng)體內(nèi)注射了(于圖19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原和不完全弗氏佐劑(不含分支結(jié)核桿菌提取物)的對照小鼠的PBMC。
圖21在”EAE/MOG/ENV-SU”模型和沒有用ENV免疫的對照小鼠中，根據(jù)INF-γ的分泌所揭示的上述抗MOG自身免疫T淋巴細胞反應(yīng)的動力學(xué)。
X軸代表接種“MOG和佐劑”制劑后的時間(小時)，其中PBMCs樣品取自圖19所述系列的小鼠。Y軸代表由存在于PBMC的自身免疫T淋巴細胞體外分泌的INF-γ的劑量。
白色柱代表已經(jīng)體內(nèi)注射了(于圖19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含分支結(jié)核桿菌提取物)和ENV-SU蛋白的小鼠PBMC。
黑色柱代表已經(jīng)體內(nèi)注射了(于圖19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原和不完全弗氏佐劑(不含分支結(jié)核桿菌提取物)的對照小鼠的PBMC。
圖22如在開發(fā)的MS模型中所證實的并在本發(fā)明中驗證的，所選擇的抗MSRV/ENV抗體對ENV-SU的促炎活化的抑制作用的治療活性。
圖22代表在C57B16小鼠中，證實用MSRV/ENV蛋白誘導(dǎo)EAE的實驗結(jié)果，以及在ENV蛋白的可溶性片段ENV-SU誘導(dǎo)的由TLR4介導(dǎo)的促炎活性分析中，預(yù)先選擇的單克隆抗MSRV/HERV-W ENV抗體的抑制活性。
X軸代表注射后天數(shù)。Y軸代表動物的平均臨床記分。
帶方塊的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐劑(含結(jié)核分支桿菌的提取物)的陽性對照動物。在這種情況下，該系列研究于第28天完成。
帶三角的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)及MSRV ENV蛋白的動物。該系列研究持續(xù)的28天。
帶菱形的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)的陰性對照動物。這種情況下，該系列研究持續(xù)達28天。
帶十字花的虛線曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)和MSRVENV-SU蛋白的動物。這些動物還另外給予50μg/Kg(即1μg/20g體重的小鼠)抗MSRV GAG對照抗體3H1H6。這種情況下，該系列研究持續(xù)28天。
帶圓圈的曲線代表注射MOG(髓磷脂少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐劑(不含結(jié)核分支桿菌的提取物)和MSRV ENV-SU蛋白的動物。這些動物還另外給予50μg/Kg(即1μg/20g小鼠體重)抗MSRVENV對照抗體3B2H4。這種情況下，該系列研究持續(xù)28天。
圖23MSRV ENV蛋白(下行)和由HERV-W 7q拷貝編碼的ENV蛋白的氨基酸序列的比較；框起來的序列是相同的(保守區(qū)域)。
圖24Western印跡分析MSRV ENV蛋白和ENV蛋白(由普遍定位在7q染色體上的HERV-W拷貝的env orf(開放閱讀框)編碼)之間的抗原交叉反應(yīng)，V14＝由克隆MSRV pV14編碼的ENV重組蛋白，H74＝由克隆HERV-W7q pH74編碼的ENV重組蛋白。
3CID5用衍生于MSRV克隆的重組蛋白免疫后得到的單克隆抗體。
箭頭顯示所測得的帶的水平，60Kda是指示相應(yīng)的分子量水平。
圖25ENV-SU蛋白的抗原性質(zhì)分析Western印跡分析。
圖25a、b和c代表使用“Mac Vector”分析軟件，利用其附帶的“蛋白質(zhì)分析工具盒”功能，分析MSRV ENV-SU蛋白的氨基酸序列。根據(jù)一級和二級序列分析結(jié)果，被3個垂直矩形框起來的區(qū)域代表三個最可能的抗原區(qū)。
圖25a為用于說明“ENV-SU”區(qū)域的抗原性的三個圖。X軸上“0”上方陰影面積有陽性抗原性，而下方則沒有(陰性抗原性)。
圖25b上面兩個圖說明“ENV-SU”區(qū)域的親水性。Y軸上“0”上方陰影面積代表有陽性親水性，而下方則顯示有陰性親水性。
下面圖說明“ENV-SU”區(qū)域的柔性。Y軸上“0”上方陰影面積有陽性柔性，而下方則顯示為陰性柔性。
25c說明“ENV-SU”區(qū)域的表面概率。Y軸上“0”上方陰影面積有陽性概率，而下方則有陰性表面揉曲性。
實驗部分體外研究材料和方法蛋白質(zhì)和毒素MSRV包膜(Env-SU)的表面蛋白相當于總包膜蛋白的287氨基酸的蛋白序列(Env Pv14，GenBank AF331500)。圖1(a)和1(b)中分別顯示EnvPv14和ENV-SU的結(jié)構(gòu)及氨基酸序列。在大腸桿菌中表達重組MSRVEnv-SU蛋白并在FPLC柱上純化之。用質(zhì)譜法和Western印跡法進一步證實蛋白的質(zhì)量和純度。使用酪蛋白激酶作為自體陰性對照。按照如Env-SU的同樣條件生產(chǎn)和純化該對照蛋白。
由CleanCells公司(Bouffere，F(xiàn)rance)通過Limulis阿米巴細胞溶胞產(chǎn)物(LAL)試驗進行兩種蛋白中內(nèi)毒素的存在的檢測。所有部分均在5IU/ml檢測閾值以下。由Toxin Technology公司(Sarasota，F(xiàn)1，USA)得到葡萄球菌內(nèi)毒素，純度為95％。大腸桿菌菌株026B6的脂多糖得自SigmaAldrich公司。
培養(yǎng)基培養(yǎng)基是添加有下列物質(zhì)的RPMI 1640培養(yǎng)基1％L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)，1％青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich)，1％丙酮酸鈉(Sigma-Aldrich)，1％非必需氨基酸(Sigma-Aldrich)，和10％熱滅活的FCS(胎牛血清)(BioWest)。
T細胞增殖實驗中使用人AB血清(Sigma-Aldrich)代替FCS。
細胞的分離和制備用Ficoll Paque密度梯度離心方法從正常供體分離人外周血單個核細胞(PBMC)。使用購自Miltenyi Biotec公司的單核細胞分離試劑盒，除去T細胞、B細胞、樹突細胞、NK細胞和嗜堿細胞以純化PBMC中的單核細胞?？傊?，首先將PBMC與單克隆抗體和結(jié)合于半抗原并磁性標記的抗人免疫球蛋白(CD3、抗CD7、抗CD19、抗CD45RA、抗CD56和IgE)的混合物一起孵育，然后再與偶聯(lián)于抗半抗原單克隆抗體上的微球(MACs MicroBeads)孵育。最后將細胞保留在磁場中的柱上以除去磁標記的細胞。根據(jù)流式細胞儀分析的CD14的表達，所回收的單核細胞群體的純度總是大于95％。為了產(chǎn)生單核細胞衍生的樹突細胞(MDDC)，在含有IL-4(25ng/ml)和GM-CSF(50ng/ml)的2ml培養(yǎng)基中，在6孔平板上將純化的單核細胞培養(yǎng)5天。培養(yǎng)的第3天，向細胞中加入完全量的細胞因子。如形態(tài)學(xué)分析和流式細胞檢測所示，所得到的細胞制劑含有90％以上的CD1a陽性樹突細胞。
細胞刺激將濃度1×106細胞/孔，懸浮在1ml培養(yǎng)基中的細胞(PBMC，單核細胞或MDDC)加入24孔平板中，然后用Env-SU、LPS、SEB或自體對照物刺激。然后于37℃在5％CO2濕化氣氛中孵育。細胞刺激之前，將細胞與10μg/ml多粘菌素(Sigma-Aldrich)、20μg/ml和5μg/ml抗CD-14單克隆抗體、20μg/ml和5μg/ml抗TLR-4抗體(HTA125、eBioscience)或2a型IgG對照(IgG2a)(eBM2a、eBioscience)預(yù)孵育。在某些實驗中，進行細胞處理前，將Env-SU、自體對照物、LPS和SEB煮30分鐘。
為了檢測所得結(jié)果的特異性，將1μg Env-SU、LPS、SEB或自體對照物4℃與30μg/ml抗Env-SU單克隆抗體(13H5A5；IgG1；biomerueux)或抗GAG(3H1H6；IgG1，biomerueux)預(yù)保溫。
將細胞于37℃孵育24小時，然后收獲培養(yǎng)物上清，用ELISA方法分析TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。
T細胞增殖實驗使用被刺激的單核細胞和MDDC作為T細胞刺激物。在96孔圓底微量滴定板中，使用1×105細胞/孔異源T細胞作為“反應(yīng)者”細胞。以漸增量加入刺激細胞，并以200μl培養(yǎng)基的終體積，一式三份完成培養(yǎng)。37℃孵育5天后檢測摻入的放射活性，以估計T細胞增殖。為此目的，在最后的18小時孵育中，向各孔中加入1μCi的3H胸苷。然后將細胞回收到玻璃濾層上，以檢測所摻入的放射活性。
免疫熒光標記和流式細胞術(shù)收獲細胞，在PBS中洗滌，然后標記不同的表面標志物。使用下列單克隆抗體(Becton-Dickinson，San Jose，CA)抗CD1a異藻藍蛋白(HI149-APC)、抗異硫氰酸熒光素(MOP9-FITC)、抗CD40藻紅蛋白(5C3-PE)、CD80藻紅蛋白(L307.4-PE)、CD86藻紅蛋白(IT2，.2-PE)和HLA-DR Peridine chorophyll(L243-PerCP)抗體。
在添加2％FCS的冰冷PBS中利用制造商推薦濃度的各種抗體對細胞進行直接免疫熒光染色。4℃30分鐘后，洗細胞并使用FACS Calibure(商標名)和CellQuest軟件(商標名)(Becton-Dickinson)進行分析。
細胞因子生成實驗在分析細胞因子的分泌之前，收集培養(yǎng)物上清并于-20℃保存。按照制造商推薦的方法，使用OptEIA(商標名)ELISA試劑盒(Pharmigen)檢測IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p40和TNF-α的量。
結(jié)果Env-SU誘導(dǎo)從人PBMCs產(chǎn)生促炎細胞因子。
檢測重組Env-SU蛋白刺激PBMC培養(yǎng)物分泌細胞因子的能力。將得自正常供體的PBMC與漸增量的重組Env-SU蛋白孵育24小時，并用ELISA方法評價細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。將所分泌的細胞因子的量與使用自體對照物、SEB(一種已知性質(zhì)的細菌超級抗原)和LPS等已知對人PBMC具有促炎性質(zhì)的物質(zhì)得到的結(jié)果進行比較。所有蛋白和毒素的濃度均為1μg/ml(以劑量/反應(yīng)實驗測定誘導(dǎo)促炎細胞因子的最適濃度)。
結(jié)果顯示，Env-SU蛋白以劑量(即使是低至10ng/ml的劑量)依賴方式誘導(dǎo)三種細胞因子的分泌。如圖2所示，用Env-SU得到的細胞因子分泌動力學(xué)更接近于LPS，然后才是SEB。事實上，在本文建立和描述的體外分析條件下，用Env-SU刺激完全不同于以SEB抗原為代表的超級抗原刺激(i)沒有TNF-γ(其為在T細胞受體(TCR)水平上被超級抗原特異性識別的T細胞活化信號)的早期分泌，(ii)IL-6(由單核細胞-巨嗜細胞而不是T細胞分泌的)和TNF-α的基本和早期分泌(在我們使用超級抗原的體外實驗條件下，不能產(chǎn)生這些因子)。另外，通過其Env-SU區(qū)域MSRV/HERV-W Env蛋白對純化的單核細胞和樹突細胞的活性的例子證實，沒有不存在于這些細胞上的TCR的參與，因此本文所述的特異性促炎作用是不同于由超級抗原功能引起的促炎活化，按照定義，其中包括與TCR和T細胞的結(jié)合。本申請所要求保護的MSRV/HERV-W Env蛋白的促炎活化途徑涉及“Toll樣受體4”(TLR4)，任選地借助其共同受體CD14，該受體為如圖8所示的T細胞淋巴細胞活化的上游激活的。該促炎(TLR4)途徑帶動免疫系統(tǒng)的“天然”成分，即帶動T淋巴細胞相關(guān)免疫(獲得性免疫)的上游。在激活樹突細胞之后，該上游途徑可借助在對諸如TLR4天然免疫受體活化的反應(yīng)中分泌的細胞因子影響下游獲得性免疫(Th1或Th2)譜的活化狀態(tài)。除了天然免疫途徑(T淋巴細胞介導(dǎo)的獲得性免疫的上游)被活化這個事實外，后一種作用還顯示，所得到的對T淋巴細胞的下游作用并不涉及TCR受體。這就清楚地說明在這個水平上(TLR4)觀察到MSRV/HERV-W Env(Env-SU)蛋白的作用與涉及T淋巴細胞受體(TCR)的超級抗原(此例子中以SEB超級抗原為例)作用之間是不同的。在這個階段，TLR4途徑排除了T淋巴細胞的初級活化，并因此而涉及其他細胞(單核細胞-巨嗜細胞、樹突細胞、B淋巴細胞)。因此這里觀察到的活化途徑是超級抗原作用的上游，在本文所使用的細胞檢測中，進一步證實其動力學(xué)相當于“LPS”而不是“SEB”。
事實上，Env-SU和LPS能夠在24小時誘導(dǎo)大量TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，而SEB只是在孵育72小時后才誘導(dǎo)TNF-α的分泌。有趣的是，Env-SU和LPS誘導(dǎo)可達到它們的TNF-α分泌高峰，而SEB則只誘導(dǎo)TNF-α的恒定分泌。就IL-1β來說，Env-SU和LPS的誘導(dǎo)分泌譜與TNF-α相似，特征是在經(jīng)過一個恒定的降低后，于誘導(dǎo)的大約在孵育24小時達到分泌高峰。SEB(已知其可激活大量的攜帶同樣TCR Vβ特異性的T淋巴細胞群)并不誘導(dǎo)任何IL-1β。Env-SU和LPS(而不是SEB)刺激的PBMCs持續(xù)分泌IL-6。IL-6和IL-1β是優(yōu)先由活化的單核細胞/巨嗜細胞釋放的兩種細胞因子。這些數(shù)據(jù)顯示，Env-SU以與LPS相似的方式，以先天免疫系統(tǒng)的細胞如單核細胞和巨嗜細胞為靶標，以釋放促炎細胞因子，并且在這個活化水平上，T細胞并不是靶標。
為了排除Env-SU重組蛋白中內(nèi)毒素污染的可能性，刺激前用LPS抑制劑多粘菌素B(PB)處理PBMC，或者使之與煮沸的蛋白和毒素一起孵育。同時，平行地加入使用同樣反應(yīng)物和材料生產(chǎn)和純化的自體對照物酪蛋白激酶CK2。
孵育24小時后，收獲培養(yǎng)物上清并分析TNF-α分泌。如圖4所示，Env-SU和LPS誘導(dǎo)的TNF-α只受PB的部分抑制，而LPS的效應(yīng)則被完全消除。對照自體蛋白不誘導(dǎo)任何細胞因子的分泌。當將Env-SU蛋白煮沸30分鐘時，TNF-α的釋放也明顯受到抑制，而LPS活性則不受影響。這是與使用食品與藥品管理局批準的LAL實驗，對純化的Env-SU和自體對照蛋白進行的質(zhì)量控制分析中所得到的陰性結(jié)果一致的。
這些結(jié)果證明，早期所觀察到的促炎效應(yīng)并不是由于內(nèi)毒素的污染，而且引起這些效應(yīng)的成分確實是一種蛋白質(zhì)。
為了進一步證實Env-SU之促炎性質(zhì)的特異性，研究了單克隆抗體的作用。將自體對照物、Env-SU或LPS與抗Env-SU單克隆抗體或抗Gag單克隆抗體4℃預(yù)孵育1小時，然后再將PBMC與這些預(yù)孵育的自體對照物、Env-SU或LPS孵育24小時。用于發(fā)展這種單克隆抗體的Gag蛋白并沒有表現(xiàn)出任何促炎活性，所以可作為適當?shù)膶φ?。如圖4所示，抗Env-SU單克隆抗體特異地阻斷Env-SU介導(dǎo)的TNF-α分泌，但并不阻斷LPS介導(dǎo)的TNF-α分泌。細胞因子的分泌不受抗Gag單克隆抗體的影響。這些結(jié)果證明Env-SU在誘導(dǎo)細胞因子和細胞活化上的特異性。
Env-SU具有在PBMC培養(yǎng)物中誘導(dǎo)促炎細胞因子的能力。繼后證實，Env-SU能夠直接激活純化的單核細胞。用自體對照物、Env-SU或LPS刺激純化的單核細胞24小時，然后以流式細胞術(shù)評價各種活化標志物，如CD80和CD86。與自體對照物相比較，Env-SU誘導(dǎo)兩種標志物的上游調(diào)節(jié)作用，并且所得到的表達水平相似于用LPS得到的結(jié)果(圖5a)。在對Env-SU的反應(yīng)中產(chǎn)生了大量的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p40(圖5b)。這些結(jié)果顯示，Env-SU可誘導(dǎo)與促炎細胞因子產(chǎn)生有關(guān)的快速直接的單核細胞活化。
樹突細胞是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的抗原呈遞細胞，其具有控制幼稚T細胞活化的獨特能力。研究了Env-SU直接激活單核細胞衍生的樹突細胞(MDDC)的能力。體外用自體對照物、Env-SU或LPS刺激了24小時的高度純化的單核細胞產(chǎn)生樹突細胞。Env-SU能夠顯著地增加CD80、CD86、CD40和HLA-DR標志物的活化(圖6a)。促炎細胞因子IL-6、TNF-α、IL-12p40和IL-12p70以較高水平分泌。其顯示，Env-SU刺激的MDDC能夠誘導(dǎo)T細胞的異源增殖，甚至當刺激細胞的數(shù)目很低時也能比使用自體對照物產(chǎn)生更大的增殖(圖6c)。因此，與LPS相似，Env-SU能夠誘導(dǎo)分泌IL-2的樹突細胞的成熟，并因此能夠誘導(dǎo)原發(fā)性特異免疫反應(yīng)。
為了確定Env-SU是否與LPS使用同樣的活化途徑，檢測了在用或不用抗CD14或抗TLR4中和抗體預(yù)孵育、刺激后的PBMCs分泌的TNF-α水平。圖7a中給出的結(jié)果顯示，阻斷CD14導(dǎo)致Env-SU、以及LPS介導(dǎo)的TNF-α分泌的明顯劑量依賴性抑制(用20μg抗CD14抗體分別抑制83％和56％)。已知通過T細胞受體和HLA-DR活化T細胞和抗原呈遞細胞的SEB沒有被抑制。用20μg抗TLR4抗體阻斷TLR4，導(dǎo)致Env-SU效應(yīng)的37％抑制和LPS效應(yīng)的43％抑制(圖7b)。兩個實驗中，沒有觀察到對照抗體的抑制作用。因此，可以認為CD14和TLR4受體參與了Env-SU介導(dǎo)的促炎性質(zhì)。
總之，MSRV/HERV-W包膜蛋白的可溶性部分通過CD14和TLR4識別受體刺激先天免疫反應(yīng)，本發(fā)明中顯示，可以通過給予含有至少一種選自抗Env-SU和/或抗TLR4抗體的治療組合物或藥物，使導(dǎo)致炎性損傷的免疫病理學(xué)級聯(lián)反應(yīng)在很早階段即被阻斷。
因此，本發(fā)明試驗了bioMérieux生產(chǎn)的抗MSRV/HERV-W包膜蛋白的各種單克隆抗體，建立并開發(fā)的細胞分析有可能鑒定這些具有抑制因激活TLR4途徑而顯示促炎作用的抑制性抗體，并選擇抑制能力接近100％的抗體。在這些抗體中，優(yōu)選的是3B2H4和12H5A5。
因此有可能在病理級聯(lián)反應(yīng)的的長途上游水平上，鑒定參與諸如MS和SCZ的病理過程的炎癥早期階段的抑制性質(zhì)，所述的病理級聯(lián)在這兩種疾病過程的更下游發(fā)生偏離(如圖8和9所示)。
相應(yīng)于上面給出的定義，這些抗體可用于制備醫(yī)藥組合物或藥物，因為它們有可能在長途上游阻斷諸如MS和SCZ的病理學(xué)的病理過程級聯(lián)反應(yīng)。它們的優(yōu)點也可以通過在與TLR4受體相互作用之前發(fā)揮的抑制作用得到證明，因為抑制作用等同于用于其早期活化研究的同一細胞試驗中用抗TLR4抗體得到的作用。因此，這種T淋巴細胞活化上游的作用使之能夠在這個階段阻斷諸如MS的自身免疫病理學(xué)和諸如SCZ的非自身免疫病理學(xué)中常見的病理性激動劑(參見圖9)。因此，本發(fā)明的抗體有可能阻斷如MS和SCZ的上游病理級聯(lián)反應(yīng)，其下游病理過程不同。圖8顯示，本發(fā)明的抗體所針對的靶在MS級聯(lián)中。該級聯(lián)預(yù)測了現(xiàn)有治療劑針對的所有靶。事實上，在本發(fā)明的抗體干預(yù)階段，只有一種激動劑(MSRV/HERV-W Env)和一種受體(TLR4)，而當受體活化后，則可有數(shù)百種生物活性分子形式(細胞因子、酶、自由基等)的激動劑參與炎性過程，然后例如在MS的情況下，在自身免疫T淋巴細胞克隆激活階段之后，更有數(shù)千種分子和細胞激動劑的參與。在精神分裂癥(SCZ)的情況下，不是在自身免疫途徑中被激活的T淋巴細胞而是TLR4途徑活化后在腦灰質(zhì)細胞中產(chǎn)生的促炎介質(zhì)，于相鄰神經(jīng)元水平上引起興奮毒性。已充分描述了由促炎分子誘導(dǎo)的這些興奮毒性現(xiàn)象，其在患者的前皮質(zhì)中引起神經(jīng)介質(zhì)的異常釋放，出現(xiàn)幻覺現(xiàn)象。更嚴重的是，這些興奮毒性現(xiàn)象常常導(dǎo)致通過神經(jīng)元死亡反映出來的神經(jīng)毒性。現(xiàn)在已經(jīng)知道，SCZ中的這種神經(jīng)元死亡現(xiàn)象通常是通過MRI影象所看到的晚期患者的腦室擴大表現(xiàn)出來的。事實上，這些患者腦神經(jīng)元的進行性丟失是從腦室體積的增加得到補償，其在疾病發(fā)展到某個階段后，可用MRI影象技術(shù)檢測到。因此圖8和9清楚地說明這樣一個事實，即借助本發(fā)明建立的細胞分析方法鑒定并選擇的抗Env抗體，確實能夠在激活MSRV/HERV-W家族的一個或幾個病原拷貝后，阻斷該級聯(lián)最上游的“原始”刺激物。
為了證實MSRV/HERV-W逆轉(zhuǎn)錄病毒家族包膜蛋白(Env)的表達與MS和SCZ病理學(xué)之間的相關(guān)性，使用本發(fā)明中描述的先天免疫活化方法進行研究，來尋找與正常對照組相比MS或SCZ患者免疫激活的傾向性。
體外處理回輸研究多發(fā)性硬化(MS)患者的體外處理回輸研究在取自MS患者的體外處理回輸(ex vivo)的血單個核細胞中，Env-SU誘導(dǎo)的IL-6分泌增加，并且與他們的臨床記分相關(guān)本研究中，比較了得自MS患者和正常供體的PBMC的Env-SU反應(yīng)性。包括32個患者，根據(jù)MRI分析結(jié)果，其中20個處在急性期，12個處在穩(wěn)定期。也按照EDSS(擴展的殘疾記分)標準確定了他們的殘疾水平。同時試驗了19個正常供體。簡單地說，將1×106個PBMC與Env-SU或Mock對照物一起孵育24小時，然后分析培養(yǎng)物上清中諸如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的細胞因子的分泌。首先比較組間所得到的結(jié)果(Env-SU與Mock)。觀察到兩組間的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10沒有明顯不同(圖10)。但另一方面，IL-6和IL-12p40卻顯著不同，患者的這兩種細胞因子均有增加(圖11)。另外，觀察到IL-6或IL-12p40的分泌水平與患者的臨床記分之間成陽性相關(guān)(圖12)。其他細胞因子或臨床數(shù)據(jù)(年齡、性別、治療)則沒有得出其他相關(guān)性。圖12中，誘導(dǎo)的IL-6和疾病持續(xù)時間之間沒有相關(guān)性，而且作為例子給出的干擾素-γ和EDSS之間也沒有相關(guān)性。
談到由T淋巴細胞專門分泌的干擾素-γ，很有趣的是，與單核細胞/巨嗜細胞分泌的先天免疫相關(guān)細胞因子相反，該因子與臨床記分(EDSS)并沒有關(guān)聯(lián)。這就清楚地表明，如體外細胞分析所證明的，體外處理回輸所揭示的效應(yīng)與這個階段由T淋巴細胞介導(dǎo)的效應(yīng)無關(guān)，因此與超級抗原效應(yīng)無關(guān)。
這些結(jié)果表明，表現(xiàn)有最晚期臨床信號(高EDSS)的MS患者對諸如Env-SU的逆轉(zhuǎn)錄病毒因子是“超敏感的”，而且可能還表明Env-SU通過促炎細胞因子和IL-6在MS的發(fā)病機理中發(fā)揮作用。
這就進一步證實了在Sotgiu等人研究中用MSRV病毒負載MS患者的CSF所得到的結(jié)果，他們的實驗顯示，MSRV病毒負載隨疾病的惡化程度逐漸增加。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果，MSRV包膜蛋白誘導(dǎo)的反應(yīng)以相互關(guān)聯(lián)方式，隨用EDSS檢測的疾病嚴重程度而加強。在MS患者身上以不同方法(首先是用RT-PCR方法檢測MSRV核酸，其次是檢測對MSRV包膜蛋白的免疫反應(yīng))完成的兩個獨立研究證實了疾病本身的進程與MSRV逆轉(zhuǎn)錄病毒之間存在相關(guān)性。
精神分裂癥(SCZ)患者的體外處理回輸研究取自SCZ患者的體外處理回輸?shù)膯蝹€核細胞中Env-SU誘導(dǎo)的IL-12p40分泌增加，使之有可能在最高水平上鑒別出有抗心理治療耐受性和/或具有精神分裂癥的特殊演化形式的患者亞群。
在該項研究中，比較了SCZ患者和正常供體之PBMC的Env-SU反應(yīng)性。研究對象包括25個患者。平行地，按照以前對MS患者使用的同樣方法試驗了15個正常供體。
分析培養(yǎng)物上清中諸如TNF-α、IL-12p40、IL-1β、IL-6和IL-10的細胞因子的分泌。該研究中，觀察到某些SCZ患者和所有對照之間多種細胞因子的顯著差異。表1中給出的是正常供體的結(jié)果，第一欄各行指出的是編號，欄的頂部指出的是所檢測的不同細胞因子的量(ng/ml)，而它們各自所占欄下行中指出的是兩種條件(Mock和Env-SU刺激)。表2給出的是不同MS患者的結(jié)果，第一欄各行指出的是編號，欄的頂部指出的是所檢測的不同細胞因子的量(ng/ml)，而它們各自所占欄下行中指出的則是兩種條件(Mock和Env-SU刺激)。在表1和2中，各欄底下兩行(mean和St Dev)指出的是所測數(shù)據(jù)的平均數(shù)和標準差。
表1 表2 與以前研究的MS人群相比較，在某些患者的培養(yǎng)物中已經(jīng)自然地看出了差異(如圖13和14所示的IL-10和IL-12p40的示例說明)。這就證明一個不可預(yù)見的事實，即雖然SCZ不是全身性炎性疾病，甚至也不太是自身免疫病，但某些SCZ患者的PBMCs卻表現(xiàn)有一定程度的自發(fā)性免疫活化，在同樣條件下，其程度超過正常對照和MS患者。這就在這些患者的系統(tǒng)性免疫活化中引入了一個重要證據(jù)，并因此而進一步證實這種促炎免疫成分在該疾病中存在的真實性。
總地說來，在SCZ患者系列中，對Env-SU刺激的反應(yīng)進一步增加，并且某些患者的細胞因子分泌水平明顯大于正常對照的平均數(shù)，甚至有時大于對照組系列中觀察到的最大值(見圖13和14中就IL-10和IL-12p40所作的舉例說明)。這也證實，在某些SCZ患者中，對Env-SU的反映顯著增加，并因此證明在某些臨床狀態(tài)相符的患者中，Env-SU能夠揭示那些涉及可通過TLR4途徑激活的先天免疫成分的免疫傾向。
然而，這些患者中Env-SU刺激后涉及到的自發(fā)細胞因子水平(刺激水平—自發(fā)水平/自發(fā)水平)的增加，在SCZ患者中總地是比正常對照組?。簧踔罞NV-1誘導(dǎo)的分泌水平也超過所有正常對照的情況下(見圖14b和14c中就IL-12p40所作的舉例說明)。相對諸如MS的病理學(xué)的上述描述中，這就在MSRV/HERV-W家族逆轉(zhuǎn)錄病毒成分的發(fā)病機理作用中引入了一個新的因素。事實上，獨立的研究小組[3、14、31、54]用不同的方法已證明并進一步證實該MSRV/HERV-W家族逆轉(zhuǎn)錄病毒成分在SCZ發(fā)病中的作用。但是SCZ并不是一種有象MS那樣的借助自身免疫病理成分的疾病。因此，用Env-SU在SCZ患者的PBMC上得到的結(jié)果顯示，雖然涉及T淋巴細胞的免疫活化下游不同于MS，但涉及TLR4受體(其不T淋巴細胞中)的先天免疫的早期活化途徑可能仍在兩種疾病和MSRV/HERV-W逆轉(zhuǎn)錄病毒家族之間構(gòu)成初始病原學(xué)途徑。
如以前提到的，根據(jù)患者血單個核細胞(PBMCs)對Env-SU蛋白的特異性免疫反應(yīng)性，已漸漸明確了MSRV/HERV-W包膜蛋白在這些患者中的作用。
就SCZ患者的臨床數(shù)據(jù)來說，在研究的這個階段觀察到IL12p40最具優(yōu)越性和最相關(guān)差異。
事實上，已證明表現(xiàn)一個最高水平Env-SU誘導(dǎo)的IL12p40(大于400ng/ml，因此為該系列中試驗的對照組的最大水平)的患者包括所有對試驗系列的抗心理治療有耐受性的患者，并且表現(xiàn)有精神分裂癥的特殊演化形式。
有不同于以前得自MS患者的特征這一點說明，至少存在有一個不同演化形式和/或?qū)σ延兄委熡心褪苄缘男问降幕颊邅喨海@可以根據(jù)Env-SU誘導(dǎo)的IL12p40分泌大于平均值得以鑒定和表征。
在SCZ患者的PBMC中，至少Env-SU活化所誘導(dǎo)的IL12p40在演化形式和/或抗目前治療方法方面中為最大這一事實證明，除了演化標準與疾病的嚴重性之間的關(guān)聯(lián)外，這些患者的新的治療靶即MSRV/HERV-W Env蛋白還與患者的這種免疫傾向有關(guān)。
如在MS模型中所證明的，能夠在TLR4受體介導(dǎo)的“上游”途徑的參與之前抑制免疫系統(tǒng)活化的抗體具有治療意義，而且它們的靶在新近認識到的臨床生物學(xué)方面也是很有宜處的。
與MS相反，當這些效應(yīng)的后繼結(jié)果是靶向髓磷脂抗原成分的自身免疫反應(yīng)性時，先天免疫的這個早期階段(TLR4)產(chǎn)生的介質(zhì)具有高于MS的體外處理回輸自發(fā)水平，并且對皮質(zhì)神經(jīng)元具有刺激毒性潛能[17、21、23-25、29、50、51、55]。
因此，由不同輔因子活化的MSRV/HERV-W原病毒可激活腦細胞中MSRV/HERV-W Env蛋白質(zhì)的表達[56]，并且根據(jù)輔因子和環(huán)境性質(zhì)的不同，是靶向腦中不同的區(qū)域。在這些條件下，前皮質(zhì)區(qū)域的活化可引起神經(jīng)元興奮毒性，其依賴受影響之區(qū)域的不同幻覺來反映出來。
在(有髓鞘的)白質(zhì)活化的情況下，在巨嗜細胞和/或小膠質(zhì)細胞水平上由Env蛋白產(chǎn)生的早期炎癥能夠刺激髓磷脂降解，并因此在來自T淋巴細胞的貢獻后能夠誘導(dǎo)抗髓磷脂自身抗原的自身免疫反應(yīng)。
圖9中舉例說明了所揭示的這些概念。該圖顯示，其可在精神分裂癥患者中確定的臨床生物學(xué)中，用于抑制與該疾病的癥狀明顯相關(guān)的該神經(jīng)毒性炎性成分。
此外，也如圖8所說明的，這些抑制Env-SU蛋白的生物學(xué)效應(yīng)的抗體水平明顯是所有病理學(xué)介質(zhì)的上游，而病理學(xué)介質(zhì)則是下游產(chǎn)生的，并且是常規(guī)抗炎治療的常用靶(細胞因子、自由基、氧化還原化合物、酶、前列腺素、促炎蛋白和脂質(zhì)、激活的T細胞等等)。在這個階段，僅有的激動劑是MSRV/HERV-W Env蛋白本身，并且阻止其活化的TLR4受體阻斷不同的免疫級聯(lián)反應(yīng)由此進入下游的初始途徑(參見圖8和9)。
進行下列的臨床前研究是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知的范圍—按照用于諸如抗TNF-αREMICADE的已知治療抗體的方法完成單克隆抗體的人源化。治療抗體的大腦內(nèi)傳代的優(yōu)化是按照許多科學(xué)和醫(yī)學(xué)出版物例如Merlo等人或Pranzatelli描述的已知技術(shù)進行的[57、58]；—用本發(fā)明中描述的Env-SU蛋白對PBMC的促炎活化實驗證實這些人源化的或修飾的抗體的抑制活性；—用證明腦中MSRV/HERV-W Env蛋白異常表達[59]的行為效應(yīng)的動物模型證實抗體的治療作用。
因此，本發(fā)明的要素是—在先天免疫的細胞水平上證明MSRV/HERV-W包膜蛋白的“TLR4”受體為“上游”促炎活化的進入途徑，—使之有可能確定和檢測這些效應(yīng)的細胞分析，—能夠抑制此蛋白質(zhì)之效應(yīng)的抗Env單克隆抗體，—這些效應(yīng)在精神分裂癥患者體外處理回輸?shù)难庖呒毎缴系纳飳W(xué)證據(jù)，—這些效應(yīng)有關(guān)的生物學(xué)證據(jù)使得本領(lǐng)域技術(shù)人員用迄今已知的知識、技術(shù)和動物模型，來完成臨床前開發(fā)步驟，并在適當條件下進行人的臨床研究。另外，本發(fā)明中描述的生物學(xué)試驗允許在治療之前、期間和之后，借助簡單的血液樣品對這些治療性抗體所針對的參數(shù)進行體外處理回輸生物學(xué)研究。
這些治療指南為在某時或某亞群中定義適合于進行治療的患者是很有價值的，并使之有可能根據(jù)生物學(xué)研究結(jié)果調(diào)整治療劑量和頻率。
動物模型生產(chǎn)用于研究治療性抗體和對照的藥代動力學(xué)分布和毒物學(xué)，動物模型。
抗體1、抗體的性質(zhì)為防止在肝中過快和過度的降解，使用按照已知技術(shù)得到的單克隆抗體的Fab′或Fab2型片段[60]。抑制由TLR4介導(dǎo)的促炎效應(yīng)的抗MSRV/HERV-W Env抗體是抗體13H5A5和3B2H4?？筂SRV/HERV-WGag對照抗體是抗體3H1H6。
2、抗體標記方法首先稀釋這些抗體片段。因此制備100μl濃度為1μg/μl的溶液，然后與吸附到小珠(Iodobeads No.28665 Pierce Rockford，Illinois，USA)上的碘化鈉(NaI125NEN，5mCr/50μl)接觸。
孵育10分鐘后，除去溶液并轉(zhuǎn)移到無小珠的管內(nèi)。這種方法使之可以終止反應(yīng)并因此避免抗體活性位點的氧化導(dǎo)致的功能喪失。
然后用10μl焦硫酸鈉(Fluka)溶液(4mg/ml)中和樣品。最后，使用10μl劑量濃度為250nM/ml的導(dǎo)引劑導(dǎo)引碘化鈉。
3、純化用陰離子交換柱分離技術(shù)進行純化。該方法使用陰離子交換柱結(jié)合游離碘。最后，用2ml 0.9％NaCl溶液(Aguettant)、遷移緩沖液活化之。分4次完成純化，用0.5ml 0.9％NaCl導(dǎo)引。然后計數(shù)四個管中的放射活性。
4、產(chǎn)率結(jié)果示于表3中，其代表純化后各抗體的百分回收率。
孵育10分鐘后校正標記產(chǎn)率。一段時間內(nèi)產(chǎn)率沒有增加。獲得的所有片段的百分率均在70％-80％之間。
離子交換純化使標記的抗體有良好的回收率。對于3B2H4 Fab2片段，該比例只有50％。
生物分布的評價1、小鼠用于實驗的動物是由Charles River Laboratories(Wilmington，NorthCarolina，USA)提供的7周齡BALB/c小鼠。供應(yīng)商保證動物是健康的。
實驗前，動物一直被喂養(yǎng)在循環(huán)光照的溫和條件的裝置中。
2、方法每個片段試驗3只7周齡BALB/c小白鼠。
第一步，用戊巴比妥或2％Ketamine-xylamine混合物(10g/ml，V/V)麻醉動物(1μl/g體重)，給藥劑量為1μg/g重量。
然后靜脈內(nèi)注射0.15mg用700μCi/mg標記的抗體(小鼠接種所試驗的三種抗體(3B2H4、13H5A5和3H1H6)之一的片段)。
注射后10、45、90和210分鐘進行讀數(shù)。
210分鐘后，殺死小鼠并分離下列組織脾臟、腎臟、腦、心臟、肺臟和血液。尾部也保留以便調(diào)整所得到的值。
3、結(jié)果沒有觀察到與這些抗體相關(guān)的、引發(fā)急性毒性的組織病理學(xué)改變。
表4中總結(jié)了抗體生物分布分析的結(jié)果，其代表靜脈內(nèi)注射后210分鐘，標記的抗體劑量在不同器官中的分布。
表4所是結(jié)果證明所試驗的片段在組織中均沒有異常結(jié)合。
這些結(jié)果證明，抗體沒有急性毒性，能夠在生物液和組織中檢測到，并且它們的分布與本領(lǐng)域技術(shù)人員所期望的對應(yīng)。
因此，可以根據(jù)同樣或等同的方法，參照其藥代動力學(xué)和毒理學(xué)，評價這些抗體分布的最佳化和/或它們修飾后的這些常數(shù)的任意鑒定。
表3用碘125標記期間抗體片段的百分回收率
表4在BALB/c小鼠注射后210分鐘見于不同器官中的抗體劑量的平均數(shù)
與患者的直接研究平行地制備動物模型，有可能以其進一步證實—在體內(nèi)清楚地觀察到相當于活化途徑“單一先天免疫”(模型SCID-hu和Env-SU蛋白)或“先天免疫和對T淋巴細胞的超級抗原作用”(模型SCID-hu和病毒顆粒)的“促炎”病理學(xué)，并可借助客觀標準進行分析。途徑“先天免疫/TLR4+/-CD14活化途徑”是本發(fā)明的主題，并且具有阻斷促炎級聯(lián)反應(yīng)上游的優(yōu)點。
—用MSRV/HERV-W Env蛋白明確地獲得如MS中的針對髓磷質(zhì)自身抗原的自身免疫病理學(xué)，并可對其進行分析。
—使用根據(jù)其抑制性質(zhì)選擇的抗Env單克隆抗體及其攜帶免疫學(xué)識別特異性的片段，是與在動物(模型BALB/c，放射標記的抗體)體內(nèi)具有可檢測的器官分布、并且沒有器官毒性的治療組合物相容的。
在TLR4/先天免疫途徑的“細胞”活化實驗中，借助先前對抗Env單克隆的選擇獲得抗Env抗體的治療應(yīng)用。在Env誘導(dǎo)的“MOG”(髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白)自身抗原存在下，在模型如“EAE”(實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎)中舉例說明了這種應(yīng)用，并使之有可能抑制除本文已充分描述的促炎活化期外，還可抑制更下游的病理學(xué)后果(參見抗Env抗體在EAE-MOG模型中的抑制作用)。
此外，在借助本發(fā)明中描述的體外細胞實驗選擇了抑制促炎效應(yīng)的抗Env抗體后，可利用動物模型從此首先的選擇中進一步選擇既具有治療用途又沒有副作用的治療性抗體。事實上，如在“EAE-MOG”中可能會增加神經(jīng)損傷的抗體所顯示的，某些抗體可能證明不適用于治療，而不管其特異性如何，并且即使它們抑制病理靶，這些副作用也必然使之被排除或者在將其用于治療前被修飾。因此本發(fā)明期間發(fā)展的工具使之有可能在病理學(xué)應(yīng)用方面鑒定這些可能的有害作用，并因此可以以原始和適當?shù)姆绞?，貢獻于選擇和證明適用的治療性抗體。
細胞和動物炎性模型材料和方法蛋白質(zhì)和毒素大腸桿菌菌株O26:B6的脂多糖(LPS)得自Sigma(St Louis，Mi)。重組Env-SU蛋白是整個MSRV包膜蛋白ENV pV14的一部分，分子量大約33KDa，287個氨基酸。在大腸桿菌中產(chǎn)生Env-SU，層析純化并用Western印跡方法(Protein Expert，Grenoble)分析。進行LAL試驗(鰲變形細胞溶解物試驗、Clean Cell，Bouffere，F(xiàn)rance)，以檢測可能存在的內(nèi)毒素。結(jié)果為陰性，低于檢測閾5IU/ml。實驗中使用用來保存蛋白質(zhì)的緩沖液作為陰性對照。該緩沖液由50mM Tris(pH 8)、0.3M NaCl、1mM β-巰基乙醇、2％蔗糖、2％甘油和5.3mM尿素組成。
細胞培養(yǎng)PBMCs的制備用Ficoll(Amersham Biosciences，F(xiàn)reiburg，Germany)密度梯度離心法從正常供體的枸櫞酸化新鮮全血(枸櫞酸化新鮮全血袋，Centre deTranfusion Sanguine[血庫]，Valence，F(xiàn)rance)中制備PBMCs。用10ml的PBS-2％FCS(胎牛血清)稀釋的25ml血液，小心加在15ml Ficoll上，室溫(AT)下以2400rpm離心20分鐘?；厥蘸毎膸?，并用50ml PBS-2％FCS洗細胞三次(圖11)。用臺盼藍染色并計數(shù)后，在90％dFCS-10％DMSO混合物中于-80℃凍存細胞，并直接用于細胞檢測的培養(yǎng)或用于給小鼠注射。
鼠脾細胞懸液的制備斷頸處死小鼠后，除去脾臟并在RPMI中于金屬過濾器上研碎。4℃下以1200rpm離心10分鐘。然后在大約4ml生理鹽水或dFCS中懸浮細胞沉淀物(分別用于給C57B16小鼠注射或冷凍)。臺盼籃計數(shù)后調(diào)整細胞濃度。然后冷凍細胞或用于動物模型。為了給小鼠注射，加入濃度為0.2mg/ml的慶大霉素。最后，取500μl(即50×106個細胞)給每只C57B16小鼠腹腔內(nèi)注射(IP)。
細胞的凍融在50ml PBS(bioMérieux，F(xiàn)rance)中4℃洗細胞懸液一次，并于4℃下以1400rpm離心7分鐘。然后將細胞重新懸浮在少量FCS中并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度到20×106/ml。將500μl該溶液放在冷凍試管中，然后加入500μl冷凍溶液(80％dFCS-20％DMSO(Sigma))。細胞被保存在1ml90％FCS-10％DMSO溶液中。將冷凍管放在含有異丙醇的冷凍盤中，使溫度慢慢降低，并于-80℃下保存。
于37℃，將細胞懸浮液在水域中融化。在將該冷凍管打開之前，用乙醇洗之。將細胞快速地轉(zhuǎn)移如50ml RPMIc-10％dFCS中并在4℃，1400rpm離心7分鐘，隨后用RPMIc-10％FCS另外洗兩次。
培養(yǎng)物維持在含5％CO2的濕氣環(huán)境下37℃孵育細胞(PBMC)培養(yǎng)物。所使用的培養(yǎng)基由添加1％L-谷氨酸、1％青霉素-鏈霉素、1％丙酮酸鈉、1％非必需氨基酸(Sigma)和1％加熱(56℃，30分鐘)去補體的胎牛血清(dFCS)(Biowest，Nuaille，F(xiàn)rance)的RPMI1640(Gibco Rocville，MD)組成。
細胞刺激融化細胞懸液(PBMCs或脾細胞)并進行臺盼籃計數(shù)將細胞濃度調(diào)整到1×106細胞/ml。在48孔(每孔500μl細胞懸液)或24孔(每孔1ml細胞懸液)平板中加入該培養(yǎng)物。然后加入各種待測物質(zhì)并孵育不同時間。室溫下，將細胞懸液于6000rmp室溫離心10分鐘以收獲上清。然后在Eppendorf管中于-20℃冷凍。除特別指出外，用于細胞檢測的Env-SU和LPS濃度均為1μg/ml。對于某些實驗，Env-SU和LPS被煮沸30分鐘。多粘菌素B(PB)濃度為25g/ml，并在加入緩沖液、LPS或Env-SU之前于37℃與細胞預(yù)孵育45分鐘。對于需要使用抗體的實驗，需要于4℃或37℃將細胞與抗體、或者Env-SU、LPS或緩沖液與抗體預(yù)孵育不同的時間。分別用重組Env-SU或Gag蛋白免疫小鼠后，培養(yǎng)雜交瘤細胞以得到抗Env-SU(13H5A5和3B3H4)和抗Gag(3H1H6)IgG單克隆抗體(bioMérieux)。用ELISA方法證實抗Env-SU抗體的特異性。除特別指出外，用于細胞檢測的13H5A5、3B3H4和3H1H6的濃度均為30□g/ml。
動物模型小鼠的喂養(yǎng)購買5或6周齡的C57B16、BALB/c或SCID小鼠(Charles River， France)并于得到后喂養(yǎng)一周。將動物圈養(yǎng)在溫度為24℃的無菌過濾籠內(nèi)。所有操作均在層流下進行。
SCID小鼠的人源化和C57B16小鼠的準備適應(yīng)一周后，給SCID小鼠腹腔內(nèi)注射(IP)50×106個懸浮在添加了慶大霉素(0.25mg/ml)但沒有酚紅的2ml RPMI(Eurobio，Les Ulis，F(xiàn)rance)中的新鮮人PBMCs，然后再休息一周。為了保證良好的人源化，注射PBMCs之前兩天通過RO途徑注射50μg抗NK抗體(25μl純抗體稀釋在25μl生理鹽水中)。人源化后一周，通過RO途徑采集各小鼠的血液，并將血清于-80℃保存，以試驗小鼠的人源化程度。
適應(yīng)一周后，給C57B16小鼠腹腔內(nèi)注射(IP)50×106個懸浮在添加了慶大霉素(0.25mg/ml)但沒有酚紅的2ml RPMI中的新鮮鼠脾細胞，然后再休息一周。IP注射期間，如同在SCID小鼠中一樣，液體被迅速吸收，但也觀察到有部分丟失。
人源化SCID小鼠中人IgG的分析按照制造商的指導(dǎo)(結(jié)合位點，Birmingham，UK)，用放射免疫擴散方法檢測SCID小鼠血清中的人IgGs。血清在凝膠上沉淀后96小時，檢測沉淀物的直徑便可能借助標準曲線根據(jù)其面積估計所試樣品的IgG濃度。
不同物質(zhì)和小鼠樣品的注射第0天，給小鼠腹腔內(nèi)注射在1ml生理鹽水(Fresenius Kabi，BadHomburg，Germany)中稀釋到所需濃度的蛋白質(zhì)(Env-SU)、毒素(LPS)或緩沖液。為注射抗Env-SU或抗Gag抗體，預(yù)先將后者與Env-SU、LPS或緩沖液4℃孵育3小時。給予對照小鼠1ml生理鹽水。幾小時(1小時、2小時)或幾天(24、48、72小時)后取樣。用乙醚麻醉小鼠后，用Pasteur吸管通過后眼眶(RO)吸取最大量血液(大約1ml)。然后腹腔內(nèi)注射2ml生理鹽水，并在按摩腹部后排除最大量的液體(1-1.5ml)。最后，斷頸殺死小鼠并取出脾臟。圖12、13、和14中給出了所使用的各種方法。對小鼠進行臨床觀察，直到實驗結(jié)束。特別記錄了炎癥征象和神經(jīng)系統(tǒng)損傷征象。
小鼠樣品的處理將取出的脾分成兩部分。將其中一部分在RPMI中制成懸液。4℃下以1200rpm離心10分鐘后，將細胞重新懸浮在50ml(4℃)PBS中，然后離心并于冷凍管內(nèi)在1ml冷凍溶液(10％DMSO-90％FCS)中冷凍。在離心管(Effendorf)中-80℃冷凍另一部分脾臟。室溫下將腹腔內(nèi)抽出的液體在6000rpm離心10分鐘，以除去細胞沉淀物，并在離心管中-80℃冷凍。用PBS洗滌后，冷凍從腹腔內(nèi)取出的細胞。室溫下，將血液6000rpm離心10分鐘，以回收血清。然后于-80℃分別在離心管中冷凍血清和細胞沉淀物。
結(jié)果的處理細胞標記和流式細胞術(shù)融化細胞懸液，將細胞重新懸浮于50ml PBS-2％dFCS-1mM EDTA中并于4℃下以1400rpm離心7分鐘。進行臺盼籃計數(shù)并將細胞加于96孔板中(大約1×106細胞/孔)。4℃下以4000rpm離心1分鐘后，除去上清并在各孔中加入50μl表面標志抗體(PBS-2％dFCS-1mM EDTA中稀釋)的混合物。懸浮該細胞并于4℃孵育30分鐘。然后每孔加入100μlPBS-2％FCS-1mM EDTA洗細胞，并于4℃下以4000rpm離心1分鐘。除去上清并在每孔中加入200ml PBS-2％FCS-1mM EDTA。重新懸浮細胞并轉(zhuǎn)移到小管中以進行FACS分析(圖15)。對于需要鏈霉抗生物素蛋白-APC第二標記的抗體，再進行一次同樣的循環(huán)。用于標記鼠細胞的抗體(Pharmingen，San Diego，CA)和其稀釋度如下CD3-FITC(1/500)、CD4-PE(1/1000)、CD8-cy-chrome(1/600)、CD25-APC(1/1000)、CD69-APC(1/500，開始時即已生物素化)。使用各2□1下列抗體標記人細胞CD3-cy-chrome、CD4-APC、CD8-PE、CD25-PE、CD69-FITC。
細胞因子的分析將培養(yǎng)物上清、血清和得自腹腔內(nèi)的液體保存在-20℃，然后用ELISA方法檢測細胞因子。按照制造商(Pharmingen)的指導(dǎo)，使用ELISA方法檢測人或鼠細胞因子(TNF-α和IL-6)。
在先天免疫的細胞水平上抑制由MSRV包膜蛋白誘導(dǎo)的促炎效應(yīng)的抗包膜抗體的選擇在正常供體的血液單個核細胞(PBMCs)培養(yǎng)物中，試驗bioMérieux公司單克隆抗體實驗室生產(chǎn)的多種抗MSRV/HERV-W包膜蛋白抗體，其是在有或沒有Env-SU蛋白的情況下通過檢測細胞因子(IL-6和/或TNF-α)，按照本發(fā)明中描述的方法，特別是用雜交瘤3H10F10、13H5A5、6A2B2、2A12A5、3C1D5和3B3H4產(chǎn)生的抗體來進行的，以確定它們通過已證實的途徑即“TLR4”受體途徑對存在于培養(yǎng)物中的單核細胞/巨嗜細胞的活化效應(yīng)。
在這些檢測中某些抗Env抗體沒有可檢測的抑制活性(6A2B2和2A12A5)，或有輕度抑制(3C1D5)或有用不同供體的PBMC完成的實驗的不相等的活性(3H10F10)。圖15(15a、b、c和d)中顯示了這些檢測的例子，其中舉例說明了這些抗體在多個實驗中對Env-SU蛋白產(chǎn)生的促炎活化所發(fā)揮的效應(yīng)。
另外，由諸如雜交瘤2A12A5生產(chǎn)的抗體對Env-SU蛋白沒有抑制活性，可疑是在即使沒有Env-SU蛋白存在的檢測中產(chǎn)生了非特異性免疫刺激所致。
這些相同檢測中，對照抗體沒有顯示出任何特殊的抑制或刺激活性，特別是抗GAG抗體3H1H6。
就Env-SU蛋白對各正常人供體的PBMCs的效應(yīng)來說，由雜交瘤13H5A5和3B2H4產(chǎn)生的抗MSRV/HERV-W Env單克隆抗體被證明是有恒定抑制性的，在實現(xiàn)的條件下所完成的可檢測的不同的正常人供體的PBMCs之間沒有任何模棱兩可的抑制效應(yīng)或任何明顯的變異。
圖15a舉例顯示了抗體3B2H4和13H5A5具有抑制活性，并且抗MSRV GAG抗體3H1H6沒有效應(yīng)。抑制作用的特異性條件被證實是與這些抗體沒有作用的刺激該活化途徑的另一個配體有關(guān)(LPS)。圖15b顯示，在沒有同一條件下生產(chǎn)和純化的對照(Mock)蛋白的存在情況下，在已證實沒有污染、沒有使用Env-SU樣品的實驗中，用細菌LPS證明了Env-SU蛋白活化的特異性條件(100℃加熱使蛋白質(zhì)而不是LPS變性而產(chǎn)生抑制作用，抑制LPS效應(yīng)的多粘菌素則沒有抑制作用)。
因此，實驗了bioMérieux公司得到的抗MSRV/HERV-W包膜蛋白的多種單克隆抗體后，使用本發(fā)明中建立和開發(fā)的細胞分析便有可能從抑制性抗體中，鑒定出那些能夠激活TLR4途徑的抑制促炎效應(yīng)并且抑制潛力接近100％的抗體。這些抗體中，優(yōu)選的是3B2H4和13H5A5。因此進一步證實了上述用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)的這些和其他抗體的有用性。
在移植功能性人淋巴樣系統(tǒng)的動物模型中，MSRV Env蛋白對人免疫系統(tǒng)的作用小鼠的制備下列實驗包括17只6周齡雌性C57B16小鼠。第一步包括腹腔內(nèi)注射50×106個人PBLs。先照射小鼠然后給予注射抗NK抗體(Fircouzi et，al.，Journal of Neurovirology 2003)。使小鼠休息一周，以穩(wěn)定其免疫系統(tǒng)。
人PBLs的制備將細胞懸液集合在50ml試管中，并于4℃以1200rpm離心10分鐘。然后將細胞沉淀物加于大約4ml生理鹽水中。臺盼籃計數(shù)后調(diào)整細胞濃度。加入濃度為0.2mg/ml的慶大霉素。最后，每只動物腹腔內(nèi)注射500μl即50×106個細胞。接種批次的構(gòu)成如下將小鼠分成3或4組。按下述方式定名如此形成的各批—3*“C”給予ENV1緩沖液的陰性對照組。
—3*“LPS”炎性反應(yīng)陽性對照的LPS注射的組。
—3*“Env”注射MSRV病毒包膜蛋白溶液的組。
—4*“2GR412”注射經(jīng)56℃加熱30分鐘失活的MSRV病毒的組(在沒有病毒復(fù)制的情況下試驗病毒顆粒包膜蛋白的作用)。
—4*“GRE”將已被熱滅活的和在陰性對照中高度稀釋的GRE病毒感染的組(在輸入含病毒血癥供者衍生產(chǎn)物的血液混合物的情況下，用以評價有該病毒顆粒污染的生物學(xué)樣品的任何可能的影響)。
以單一腹腔內(nèi)給藥的方式用適當體積的溶液感染各組小鼠(LPS和Env的量與實驗中所使用的PBMCs濃度相對應(yīng))。以以下列方式滴定溶液“LPS”50μg/小鼠；“Env”50μg/小鼠(注射500μl)；“2GR412”和“GRE”100μl超離心沉淀物/小鼠。
用無菌生理鹽水制備所有必需的稀釋液。
觀察和樣品D+1小時/D+2小時/D+24小時/D3處死和樣品。
每組處死一只小鼠。腹腔注射2ml生理鹽水，腹腔穿刺并排除最大量液體(1-1.5ml最大量)。離心懸液(6000rpm/10分鐘/室溫)，以除去可能的細胞沉淀，并于-80℃在離心管內(nèi)冷凍。
通過后眼眶途徑用吸管采集最大量血液，并加入肝素小管中。室溫下以6000rpm離心10分鐘?；厥昭獫{和細胞沉淀物并在離心管內(nèi)分別于-80℃冷凍。
將切除的脾分成兩部分。其中一部分被制成懸液(以用FAC方法完成人和鼠表型分型)在大約10mlRPMI中，于篩網(wǎng)上研碎，4℃下以1200rpm離心10分鐘后，用約15ml PBS洗(4℃)細胞，然后離心。于冷凍管內(nèi)在1ml冷凍溶液(10％DMSO-90％FCS)中冷凍。在離心管中-80℃冷凍另一部分(用于可能的PCR)。
除非較早地出現(xiàn)臨床征象，均于24和48小時后完成該過程(死亡前監(jiān)測并回收小鼠)。為留下的兩只“2GR412”和“GRE”組的小鼠，于15-20天后殺死它們或在其較早出現(xiàn)的死亡后立即回收。
樣品的這一分別使我們有可能涵蓋立即(2小時)、較早(24小時)和延遲(10-15天)免疫反應(yīng)。
用ELISA方法和細胞培養(yǎng)物的生物分析檢測生物體液樣品中的人和鼠細胞因子(IL-6和TNF-α)，并檢測“Env”蛋白和/或病毒滴度。
這些分析使評價免疫反應(yīng)成為可能炎癥(細胞因子)和細胞分布(FACS)，并篩查任何的病毒復(fù)制(ELISA，生物分析)。
臨床觀察實驗結(jié)束前，對所有小鼠進行臨床觀察。特別是記錄動物的炎癥征象和神經(jīng)損傷征象。
結(jié)果此部分的目的是對人源化SCID模型進行體內(nèi)研究，借助此前完成的可行性研究所確定的參數(shù)來研究Env-SU的特性。
Env-SU對PBMCs培養(yǎng)物的促炎效應(yīng)首先，我們研究了人PBMCs培養(yǎng)物中由Env-SU和LPS誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的動力學(xué)。所使用的蛋白質(zhì)和毒素的濃度為1μg/ml(圖16)。我們可以觀察到，注射后2小時細胞因子的產(chǎn)生達到峰值，然后逐漸降低并在48小時后變?yōu)榱?。Env-SU注射后檢測TNF-α是很有意義的。特別是，細胞與緩沖液孵育只產(chǎn)生很小量的TNF-α，2小時很少達到30pg/ml。用Env-SU刺激后2小時、24小時和48小時分別產(chǎn)生550、350和160pg/ml。LPS的作用稍微大些，于2小時、24小時和48小時分別產(chǎn)生650、180和50pg/ml。如已經(jīng)顯示的，這些研究進一步證實Env-SU蛋白對PBMCs的促炎特性。也觀察到TNF-α的產(chǎn)生于注射后2小時達到最大。這些數(shù)據(jù)有可能限定適于研究SCID模型的采樣動力學(xué)，即2小時、24小時和48小時。
Env-SU對人源化SCID小鼠(SCID-hu)體內(nèi)的促炎作用在觀察了Env-SU蛋白對多種人和鼠細胞培養(yǎng)物的促炎效應(yīng)后，我們進一步在體評價了這些物質(zhì)對SCID-hu小鼠的致病性。
一組16只小鼠在通過后眼眶途徑給予50μl抗NK抗體后，移植(IP)50×106個人PBMCs。一周后，采集各小鼠血并分析其血清中的人IgGs，借以證實小鼠的人源化。通過放射免疫擴散實驗，我們能夠確定所有SCID-hu小鼠血清中人IgG的濃度遠高于4.5mg/l。IgG在SCID-hu小鼠體內(nèi)的半壽期為12天。因此我們可以確認，在我們的實驗條件下，小鼠的人源化是成功的。
然后將小鼠分為五組，每組包括分別注射了0.2ml緩沖液、在2ml生理鹽水中稀釋的50μg Env-SU或50μg LPS的三只小鼠。注射后2、24和48小時分別殺死每組一只小鼠。處死之前，所有小鼠都是活的，并且未見神經(jīng)系統(tǒng)被感染的外在征象。
用ELISA方法分析人和鼠的TNF-α和IL-6細胞因子。圖17所示的結(jié)果表明，人或鼠細胞因子的產(chǎn)生遵循同樣的趨勢注射后2小時急升，然后幾天逐漸變?yōu)榱?。總之，這些動力學(xué)與體外觀察到的PBMCs的動力學(xué)特征相同。注射緩沖液的小鼠未見明顯的細胞因子產(chǎn)生。小鼠TNF-α的分析顯示只有一個大的峰已給予LPS的小鼠血清中的TNF-α水平大于1000pg/ml。至于小鼠IL-6的分析結(jié)果，可見注射Env或LPS的小鼠腹腔內(nèi)液體中IL-6水平約達到20,000pg/ml。發(fā)現(xiàn)這些小鼠血清中的TNF-α和IL-6濃度分別達到6200pg/ml和高于20,000pg/ml。
對人細胞因子的分析顯示，腹水液中的細胞因子水平高于血清。這是因為，在蛋白質(zhì)和毒素給藥之前，小鼠移植細胞只有十天左右，PBMCs向脾和次級淋巴樣器官遷移并克隆的時間較短(遷移細胞的數(shù)量相對較少)。此外，Env-SU主要靶向單核細胞，并且其在組織中迅速分化為巨嗜細胞。這些細胞的黏附性很強，并且將優(yōu)先粘著于腹腔內(nèi)而不是克隆在次級淋巴樣器官。因此，在移植細胞的部位即腹腔內(nèi)(IP)發(fā)現(xiàn)有更多細胞因子產(chǎn)生，應(yīng)是符合邏輯的。
人TNF-α分析揭示，注射Env-SU的小鼠腹腔內(nèi)TNF-α濃度達到1400pg/ml，并且注射LPS的小鼠腹腔內(nèi)TNF-α達到3000pg/ml，血清中也達到1200pg/ml。IL-6檢測也顯示同樣的趨勢，注射Env-SU的小鼠腹腔內(nèi)IL-6濃度為1700pg/ml，并且注射LPS的小鼠腹腔和血清內(nèi)IL-6分別達到9600pg/ml和1400pg/ml。
決定分析SCID-hu小鼠體內(nèi)的鼠細胞因子似乎是難以想象的，因為前者缺乏T和B細胞。然而，單核細胞/巨嗜細胞群體仍是有活性的，并能夠在這些小鼠體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α和IL-6。因此顯示，所測得的鼠IL-6濃度總是大于人IL-6濃度，不過TNF-α則不是這樣。這全面地說明，體內(nèi)，在不存在功能性淋巴細胞的SCID模型(小鼠成分)中，MSRV包膜對先天免疫成分是有直接作用的。
在提供了人PBMCs的體外實驗證據(jù)后，本研究的目的則是評價與重組包膜蛋白Env-SU有關(guān)的體內(nèi)致病性。Env-SU蛋白和LPS促炎作用的特征是在SCID-hu小鼠體內(nèi)觀察到TNF-α和/或IL-6的大量和獨立產(chǎn)生(注射后2小時)。得到這些結(jié)果后，在對C57B16小鼠進行的現(xiàn)有“技術(shù)”可行性研究中，有可能證明采樣和分析細胞因子(在血清中和通過腹腔)的實驗方法能夠用于在鼠模型上建立的人源化SCID小鼠。
EAE模型EAE模型是一種多發(fā)性硬化的動物模型，該模型是基于外周誘導(dǎo)的針對髓磷脂決定基的自身免疫而建立的。
該模型是迄今用于證明多發(fā)性硬化之治療劑的有效性的參考模型。
此模型的特征是存在自身反應(yīng)性T淋巴細胞和由于脫髓鞘所導(dǎo)致的嚴重的神經(jīng)損傷。
其開發(fā)通常是基于給C57B16小鼠注射偶聯(lián)于適當佐劑(完全弗氏佐劑)上的髓磷脂肽(與注射百日咳有關(guān)的)。
含有失活的分支桿菌的佐劑可打破對髓磷脂的耐受性并促進自身活性T淋巴細胞的發(fā)育。
百日咳毒素促進血-腦屏障的開放，而且也在打破耐受中其作用。
其顯示，Env-SU通過TLR4受體激活先天免疫系統(tǒng)，并且能夠誘導(dǎo)Th1型淋巴細胞反應(yīng)的發(fā)展。因此Env-SU能夠為激發(fā)自身免疫機制和與MS相關(guān)的脫髓鞘發(fā)揮佐劑作用。在EAE模型中研究這種潛在作用。
進行三個不同的實驗。
1-初步實驗材料和方法用MSRV包膜蛋白的Env-SU取代常用于多發(fā)性硬化模型“EAE”的不完全弗氏佐劑的活性成分(滅活的分支桿菌)。
材料八只C57B16小鼠(Charles River)。
髓磷脂肽MOG(髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白)(35-55免疫級，得自Neosystem公司)。
完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma)。
不完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma)。
百日咳毒素(無百日咳桿菌鹽)(Calbiochem)。
Env-SU(Protein Expert)。
方法皮下注射200μl-陽性對照150μg MOG+CFA試驗了3只小鼠。
-陰性對照150μg MOG+IFA試驗了2只小鼠。
-Env-SU150μg MOG+IFA+Env-SU(50μg)試驗了3只小鼠。
然后于第0天和第2天注射200μl(IV)百日咳毒素(200ng)。
然后每天檢測神經(jīng)學(xué)征象。根據(jù)所觀察到的神經(jīng)學(xué)征象，將各不同期的征象羅列如下。
0期沒有表現(xiàn)神經(jīng)學(xué)征象，1期表現(xiàn)軟尾現(xiàn)象，2期表現(xiàn)行走問題，3期表現(xiàn)后肢部分癱瘓，4期表現(xiàn)后肢總體癱瘓，5期表現(xiàn)后肢癱瘓和前肢部分癱瘓，6期表現(xiàn)動物瀕死或死亡。
結(jié)果—MOG(150μg)+CFA3只動物中2只得病(4期)。
—MOG(150μg)+IFA沒有征象。
—MOG(150μg)+Env-SU(50μg)3只動物中3只得病(1-6期)。
圖18中顯示了初步研究的結(jié)果。
初步研究顯示，可使用通過TLR4受體激活免疫系統(tǒng)的Env-SU可作為發(fā)展MS模型、EAE的佐劑。
以使用“常規(guī)”佐劑(CFA)的陽性對照來證實實驗。沒有誘導(dǎo)自身免疫潛力的利用不完全佐劑(IFA)的陰性對照證實，需要按照特殊途徑刺激免疫系統(tǒng)，以誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。
因此，從這個初步階段可明顯看出，MSRV/HERV-W逆轉(zhuǎn)錄病毒的Env蛋白能夠象目前用于EAE模型的“實驗”佐劑一樣，借助其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響明顯地能夠引起自身免疫致敏。
與CFA(其活性成分是分支結(jié)核桿菌的溶胞產(chǎn)物)的主要不同是，該細菌與人的多發(fā)性硬化無關(guān)，而MSRV逆轉(zhuǎn)錄病毒和其HERV-W家族的遺傳類似物則顯然與人的多發(fā)性硬化有關(guān)[2、7、8、10、61-63]。此外，攜帶該包膜蛋白之病毒顆粒的生物體液中的表達和循環(huán)與疾病的進展有關(guān)[10]。
因此，正是從這個初步階段可以明顯看出的，任何能夠抑制該逆轉(zhuǎn)錄病毒家族Env包膜蛋白的有“自身免疫-誘導(dǎo)”免疫潛能的治療劑都是特別優(yōu)越的，而且如果它是用體外細胞分析根據(jù)其與本發(fā)明所述的抗炎效應(yīng)有關(guān)的抑制活性選擇的，則將更有利。事實上，當MSRV/HERV-W Env蛋白在病毒顆粒表面表達時(可在MS患者中檢測到)，抗MSRV/HERV-WEnv蛋白的單克隆抗體即是這些蛋白質(zhì)的“自身免疫誘導(dǎo)”作用的抑制劑[8、10、62]。它們在人體治療中的應(yīng)用是顯而易見的，并且根據(jù)已知目前批準并銷售的用于人治療的治療性抗體的已知方法，生產(chǎn)技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如已被特別用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的商品名為REMICADE的抗TNF-α抗體。另外，令人感興趣并且應(yīng)提到的是，這種可購得的治療性抗體是針對促炎級聯(lián)的“下游”產(chǎn)物的，而根據(jù)本發(fā)明，治療靶在誘導(dǎo)TNF-α之前特別是通過TLR4已被抑制。
也應(yīng)特別提到的是，目前推薦的MS治療劑(皮質(zhì)類固醇、β-干擾素等)只是作用于啟動免疫病理學(xué)級聯(lián)后產(chǎn)生的促炎成分的有限部分，這就解釋了它們在治療患者中的部分和相對效力。
另一方面，在活化TLR4受體途徑進而活化參與該啟始階段的先天免疫之前，通過抑制MSRV/HERV-W Env蛋白的原發(fā)效應(yīng)，使存在于這個階段的僅有的免疫病理激動劑受到抑制，這就不再是該途徑原發(fā)活化后分泌的多種促炎產(chǎn)物的情況(圖8)。這一“生物學(xué)”優(yōu)點為在患者體內(nèi)的效力提供了獨特的潛力，所有這些都是因為它是針對MS發(fā)病機理中的“關(guān)鍵”因子的，而不是活化過程中的任何一種副產(chǎn)物，可在對人MS沒有作用的結(jié)核病原因子(加在完全弗氏佐劑中的結(jié)核分支桿菌)誘導(dǎo)的EAE模型中檢測其效力。
2-實驗2完成同樣類型的實驗，以證實所觀察到的初步結(jié)果。
方法皮下注射200μl-MOG(150μg)+CFA試驗了4只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA試驗了3只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)試驗了4只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+LPS(20μg)試驗了4只小鼠。
然后于第0和第2天注射200μl(IV)百日咳毒素(200ng)。
臨床征象的檢測然后回收所有小鼠的脾臟并冷凍細胞懸液。
收集2只小鼠的腦并在灌注4％PFA后冷凍之(一只是3期Env小鼠的腦；一只是0期LPS小鼠的腦)。
組織學(xué)觀察顯示，在已給予Env蛋白的小鼠腦中可見特征性炎性損傷，已注射LPS的小鼠腦中則沒有。
結(jié)果監(jiān)測神經(jīng)征象-MOG(150μg)+CFA4只小鼠中4只得病(2-6期)。
-MOG(150μg)+IFA沒有觀察到神經(jīng)征象。
-MOG(150μg)+Env-SU(50μg)4只小鼠中4只得病(1-5期)。
-MOG(150μg)+LPS(20μg)沒有觀察到神經(jīng)征象。
結(jié)果如圖19所示。
這些結(jié)果證明，Env-SU能夠在由EAE代表的MS模型發(fā)展中所觀察到的神經(jīng)征象的誘導(dǎo)中發(fā)揮佐劑的作用。
除使用上述對照外，利用LPS(細菌脂多糖)，因為它刺激抗原呈遞細胞表面如MSRV Env蛋白的同樣受體TLR4。在這些條件下沒有LPS的自身免疫-誘導(dǎo)效應(yīng)表明，Env蛋白的免疫潛能比其他TLR4配體大得多，并且從邏輯上說，針對該蛋白質(zhì)的抑制劑將是比非特異性抑制該蛋白活化的某些途徑的分子更好的治療工具。
功能性研究融化脾組織，然后再次用MOG肽體外刺激脾細胞，并檢測IFN-g的產(chǎn)生(動力學(xué)和劑量反應(yīng))。
2×106個脾細胞/ml c-RPMI+10％FCS。
給出3只Env小鼠和2只IFA與LPS小鼠的平均值。
圖20是在特異性自身抗原存在下，借助T淋巴細胞活化信號的干擾素-γ，舉例說明了作為MOG劑量函數(shù)的反應(yīng)(劑量效應(yīng))，其清楚地顯示，真正的自身免疫反應(yīng)是在這些條件下使用特異性刺激TLR4途徑的Env-SU片段，由MSRV/HERV-W Env蛋白在該模型中誘導(dǎo)的。在這個MS模型中，T淋巴細胞反應(yīng)并不是由于如在超級抗原的情況下那樣由MSRV/HERV-W Env例如通過T受體(TCR)直接活化的，而是如本發(fā)明的許多數(shù)據(jù)所顯示的，是由于在先天免疫的細胞(單核細胞/巨嗜細胞，樹突細胞等)水平上更遠的上游活化的結(jié)果(在并不包括任何功能性鼠淋巴細胞的SCID模型中，沒有干擾素-γ的分泌、純化的單核細胞和樹突細胞的刺激和鼠巨嗜細胞細胞因子的刺激，IL-6動力學(xué)與使用LPS得到的結(jié)果平行，沒有IL-6和TNF-α，但顯然存在由參考超級抗原-SEB-等的同樣條件下誘導(dǎo)的干擾素-γ)。
自身免疫T淋巴細胞反應(yīng)的動力學(xué)研究在一段時間上進一步證實了這一點，該反應(yīng)是針對用于檢測脾細胞的加入到培養(yǎng)基中的髓磷脂抗原MOG(10μg/ml)，所述的脾細胞得自“EAE/MOG/Env-SU”動物和“無Env”含不完全弗氏佐劑(IFA，沒有結(jié)核桿菌提取物)和MOG的對照動物。圖21顯示，只有給予了Env-SU的小鼠一段時間后才見有抗MOG自身免疫反應(yīng)的明顯進展。
因此這些結(jié)果清楚地顯示，用與自身抗原有關(guān)聯(lián)的Env-SU刺激，可在抗原呈遞細胞的TLR4受體水平上，使Env-SU引發(fā)的級聯(lián)的下游、自身反應(yīng)性T淋巴細胞發(fā)育，后者單獨引起干擾素-γ(IFN-g)的大量釋放(見附圖)，并因此導(dǎo)致由這些體內(nèi)T淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫。
3-實驗3完成同樣類型的實驗以證實所觀察到的初步結(jié)果，但也進行抗Env-SU抗體的治療效果(在模型中檢測到的臨床結(jié)果)實驗，同時用同一類型但沒有同樣特異性的抗體(以抗GAG單克隆抗體3H1H6為代表的)完成平行的觀察。
方法皮下注射200μl濃度為5μg/ml的抗體，即每約20克小鼠體重1μg抗體，即每公斤體重50μg抗體-MOG(150μg)+CFA試驗了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA試驗了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)試驗了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)試驗了5只小鼠。這些小鼠也接受1mg的Ab 3B2H4，靜脈注射(200μl)。
然后在第0和2天注射200μl(IP)百日咳毒素(200ng)。
結(jié)果所得到的結(jié)果如圖22所示。
為了實驗更接近于如在MS患者中的進行性自身免疫發(fā)展的條件，結(jié)果是在比以前更“溫和”的條件下得到的，因為毒素是腹腔內(nèi)注射的而不是象以前那樣靜脈注射的。
“MOG+CFA”陽性對照在這里相當于五只小鼠中的四只有臨床征象，“MOG+IFA”陰性對照相當于五只小鼠中的零只受影響。
與以前的條件相比，用Env蛋白與“MOG+CFA”陽性對照一樣，其平均臨床記分有所降低。如在被治療小鼠中觀察到的最小損傷所說明的，在抗Env抗體存在下，這種蛋白的病原作用顯示為凈減少。
因此注意到，“抗Gag”抗體對Env誘導(dǎo)的免疫病理效應(yīng)沒有抑制作用，或即使因其存僅有輕微的作用，而抗體3B2H4則具有很清晰的抑制作用，其引起所觀察到的曲線向“MOG+CFA”陰性對照方向移動。因此EAE型“T淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫誘導(dǎo)”效應(yīng)的體內(nèi)抑制作用是通過3B2H4與抗MSRV/HERV-W Env抗體的存在相聯(lián)系的。
在多發(fā)性硬化模型“EAE”中，檢測到臨床效應(yīng)(神經(jīng)損傷)且不僅僅是相關(guān)的生物學(xué)參數(shù)。因此所研究的效應(yīng)不再僅僅是如上描述的生物學(xué)效應(yīng)，而是所指出的病理模型的臨床翻譯。因此，所檢測的效應(yīng)確實是一種治療效應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)已很清楚，這些是對人治療的“臨床前”治療性驗證的定性界限，因為任何后繼的對人類疾病治療驗證都是必須是基于動物模型中所獲得的標準在人身上開展。
一旦因此，所得到這些數(shù)據(jù)是必要的，并且足以最后得以臨床前驗證并發(fā)展到人體治療試驗。
此外，對MSRV ENV和HERV-W7q ENV(syncitin)蛋白氨基酸序列分析顯示，MSRV/HERV-W家族中的氨基酸基序(motif)具有強的同源性和保守性(圖23)。這反映在抗ENV單克隆抗體之間的交叉反應(yīng)性上(圖24)。
序列分析(參見圖25)使用于評價由SEQ ID NO1表示的ENV-SU蛋白序列中的相當于氨基酸122-131(包括在內(nèi))和/或312-316(包括在內(nèi))和/或181-186(包括在內(nèi))的感興趣的抗原區(qū)域成為可能。
因此，在該MS動物模型中證實，根據(jù)其在細胞分析實驗中表現(xiàn)的尤其對TLR4受體啟動的促炎途徑的抑制特性選擇的抗MSRV/HERV-W家族特別是其原型成員MSRV逆轉(zhuǎn)錄病毒的單克隆抗體，構(gòu)成了能夠抑制這種免疫病理學(xué)潛能特別是抑制該逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的ENV包膜蛋白的“自身免疫誘導(dǎo)性”免疫病理學(xué)潛能的治療劑。
因此現(xiàn)已證明1)在多發(fā)性硬化患者體內(nèi)檢測到有包膜的MSRV病毒顆粒[4、8、10、62、64]。
2)它們的表達與疾病的演化有關(guān)[10]。
3)對MSRV Env蛋白的免疫反應(yīng)與疾病的進展和嚴重程度有關(guān)[65]。
4)MSRV病毒顆粒具有編碼MSRV Env蛋白的RNA[66]。
5)MSRV/HERV-W家族的Env蛋白在氨基酸序列水平和編碼它們的基因水平上具有很強的同源性[2、5、66]。
6)MSRV Env蛋白和由人染色體7q21-22區(qū)域(HERV-W7q)中的HERV-W拷貝編碼的Env蛋白具有體內(nèi)和體外促炎特性(參見本申請的實例和[11、12、59])。
7)MSRV Env蛋白能夠在衍生于髓磷脂的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗原(髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白，MOG，本專利申請的例子)的存在下再現(xiàn)已知的多發(fā)性硬化(MS)模型，即實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)。
8)該實驗性模型是用與人類多發(fā)性硬化的病原無學(xué)關(guān)的分支結(jié)核桿菌的抗原提取物(結(jié)核病原因子)人為常規(guī)啟動的。用屬于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒家族HERV-W之MSRV逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白得到的該模型，其與疾病相關(guān)的表達可以病毒顆粒形式、或以在MS的脫髓鞘損傷中特異性表達的Env蛋白形式[59、67]檢測到，該模型構(gòu)成一種新的和獨特的動物模型，這使研究以參與疾病的免疫病理的逆轉(zhuǎn)錄病毒因子為靶目標的治療劑成為可能。
9)如根據(jù)干擾素γ的產(chǎn)生分析所證實的，與人T淋巴細胞活化有關(guān)聯(lián)的促炎效應(yīng)也在用MSRV Env蛋白誘導(dǎo)的EAE模型的鼠T淋巴細胞水平上被明確地發(fā)現(xiàn)(例子見本專利申請)。
10)MSRV Env蛋白的促炎效應(yīng)是由淋巴樣細胞和抗原呈遞細胞介導(dǎo)的，因此也是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的(見本專利申請的例子，[11、12])。
11)抗MSRV Env單克隆抗體(3B2H4和13H5A5)能夠特異性地抑制MSRV Env蛋白對人血淋巴樣細胞(淋巴細胞和單核細胞)的促炎效應(yīng)(本專利申請的例子)。
12)抗MSRV Env蛋白單克隆抗體(3B2H4)的“特異性抑制”作用在MSRV Env誘導(dǎo)的EAE動物模型中得到證實。這種效應(yīng)反映在與未治療的或用同型無關(guān)抗體治療的動物相比，其顯著地改善了臨床表現(xiàn)(本專利申請的例子)。
因此，抗MSRV/HERV-W Env單克隆抗體對炎癥、自身免疫和與疾病有關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒因子的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的神經(jīng)學(xué)臨床問題有抑制作用。
因此顯而易見的是，已在體內(nèi)和體外證實了特性的抗體，以其未修飾形式或以生物學(xué)技術(shù)特別是遺傳工程技術(shù)修飾的形式構(gòu)成人類疾病、多發(fā)性硬化的新的治療劑。
本文描述了適于對這些治療性抗體進行臨床前評估的細胞分析和動物模型，從而使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在人體治療試驗前完成所需的驗證步驟，并使他們能夠調(diào)節(jié)與MSRV/HERV-W逆轉(zhuǎn)錄病毒家族有關(guān)的各種病理學(xué)。
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序列表<110>拜奧默里克斯公司國家健康與醫(yī)學(xué)研究院<120>治療MSRV/HERV-W相關(guān)病理學(xué)的組合物<130>TLR4<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>287<212>PRT<213>MSRV/HERV-W病毒<400>1Ser Ser Ser Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Thr Arg Leu Pro Gly1 5 10 15Asn Ile Asp Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Asn Ser Thr20 25 30Phe Thr Ala His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr Asn Ser Ala Thr35 40 45Leu Cys Met His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn50 55 60Pro Ser Cys Pro Gly Gly Leu Gly Ala Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe65 70 75 80Thr His Thr Ser Met Ser Asp Gly Gly Gly Ile Gln Gly Gln Ala Arg85 90 95Glu Lys Gln Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Leu Thr Arg Gly His Ser100 105 110Thr Pro Ser Pro Tyr Lys Gly Leu Val Leu Ser Lys Leu His Glu Thr115 120 125Leu Arg Thr His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr130 135 140Arg Leu His Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Met Cys145 150 155 160Leu Pro Leu His Phe Arg Pro Tyr Ile Ser Ile Pro Val Pro Glu Gln165 170 175Trp Asn Asn Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly180 185 190Pro Leu Val Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys195 200 205Val Lys Phe Ser Asn Thr Ile Asp Thr Thr Ser Ser Gln Cys Ile Arg210 215 220
Trp Val Thr Pro Pro Thr Arg Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe225 230 235 240Phe Val Cys Gly Thr Ser Ala Tyr His Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu245 250 255Ser Met Cys Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr260 265 270Glu Gln Asp Leu Tyr Asn His Val Val Pro Lys Pro His Asn Lys275 280 28權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于包括能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分或MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分的TLR4受體特異結(jié)合的、選自組(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體或組(ii)抗TLR4抗體的至少一種抗體，以及醫(yī)藥上可接受的賦形劑；所述的抗體抑制因MSRV/HERV-W活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于還包括醫(yī)藥上可接受的載體。
3.如權(quán)利要求1和2所述的組合物，其特征在于包括組(i)的至少一種抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體和組(ii)的至少一種抗TLR4抗體。
4.如權(quán)利要求1至3中的任一項所述的組合物，其特征在于所述組(i)的抗HERV-W Env-SU抗體選自抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10，且所述組(ii)的抗TLR4抗體是抗體HTA125。
5.能夠與MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分或MSRV/HERV-WEnv蛋白的TLR4受體特異結(jié)合的、選自組(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體或組(ii)抗TLR4抗體的至少一種抗體在制備藥物中的用途；所述的抗體抑制因MSRV/HERV-W活化所誘導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其為組(i)的至少一種抗MSRV/HERV-W Env-SU抗體和組(ii)的至少一種抗TLR4抗體的用途。
7.如權(quán)利要求5或6所述的用途，其中組(i)的抗HERV-W Env-SU抗體選自抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10，且(ii)的抗TLR4抗體是抗體HTA125。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，用于治療與MSRV/HERV-W相關(guān)的病理學(xué)。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述病理學(xué)是多發(fā)性硬化或精神分裂癥。
10.選自抗體3B2H4、13H5A5和3H10F10的抗體。
11.MSRV/HERV-W Env-SU在通過檢測選自IL-6、IL12-p40和TNF-α的細胞因子來確定多發(fā)性硬化或精神分裂癥患者血液單個核細胞的反應(yīng)性狀態(tài)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明的組合物包括選自與MSRV/HERV－W的Env蛋白的可溶部分特異結(jié)合的或與MSRV/HERV－W Env蛋白包膜蛋白可溶部分的TLR4受體特異結(jié)合的抗Env－SU MSRV/HERV－W抗體組(i)，或者抗TLR4抗體組的至少一種類型的抗體。
文檔編號C07K16/10GK1926153SQ200580006462
公開日2007年3月7日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者帕特斯·瑪什, 亞歷山大·羅蘭, 伊芙琳·茹婉-瑪什, 埃爾維·貝鴻 申請人:拜奧默里克斯公司, 國家健康與醫(yī)學(xué)研究院