專利名稱：二聚的小分子細胞凋亡增強劑的制作方法
發(fā)明人Patrick G.Harran，Xiaodong Wang，JefK.De Brabander，Lin Li，Ranny MathewThomas，以及Hidetaka Suzuki，所有人均來自Dallas，TX。
受讓人Texas System大學董事會。
本工作受美國健康研究所資助，題目號P01 CA9547101，美國政府在本專利申請書所涉及的所有專利中可享有權(quán)利。
本專利申請書對于2004年3月1日申請的US 60/549,520要求優(yōu)先權(quán)。
引言發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明領(lǐng)域為二聚的小分子細胞凋亡增強劑。
背景技術(shù)：
在所有多細胞組織的發(fā)育和自體調(diào)節(jié)中，細胞凋亡起到關(guān)鍵性作用。細胞凋亡受到不正常抑制是癌癥以及自身免疫性疾病發(fā)生的標志，而細胞凋亡的過度活化則暗示著神經(jīng)退行性疾病如阿耳茨海默氏病的出現(xiàn)。促細胞凋亡的化療藥物是一種新的臨床上克服抗藥性的手段，例如參見Makin等人，Cell Tissue Res 2000 Jul；301(1)143-52(“Apoptosis and cancer chemotherapy(細胞凋亡與腫瘤的化學治療)”)。
細胞凋亡機制在物種間是保守的，由一連串被稱為caspase的蛋白酶順序活化所執(zhí)行。這些caspase一旦被活化就開始對目標細胞進行廣譜的酶解，最終導致細胞死亡。IAP(凋亡抑制劑蛋白)通過抑制caspase調(diào)節(jié)細胞凋亡，被稱為Smac(secondmitochondria-derived activator of caspases)的蛋白結(jié)合IAP并抑制其活性，由此促進了caspase的活化。由Smac的N-端衍生出的多肽及模擬肽也表現(xiàn)出類似的IAP抑制活性，并能夠促進caspase活化。IAP是TNFR(腫瘤壞死因子受體)的成分，因此IAP抑制劑可以改變TNFR信號傳導，將NfkB介導的促炎癥信號轉(zhuǎn)變成為抗炎癥凋亡信號。
相關(guān)文獻Liu等人，Structural basis for binding of Smac/DIABLO to the XIAP BIR3 domain；Nature 2000 Dec 21-28；408(6815)1004-8.
Wu等人，Structural basisof IAP recognition by Smac/DIABLO；Nature 2000 Dec21-28；408(6815)1008-12.
Fesik等人，Peptides derived from smac(DIABLO)and methods of using them toscreen for apoptosis modulating compounds；WO 2002030959.
McLendon等人，IAP binding peptides and assays for identifying compounds thatbind IAP；WO 2002096930.
Shi，Compositions and methods for regulating apoptosis；WO 2002026775.
Debatin等人，Smac-peptides as therapeutics against cancer and autoimmune diseasesby sensitizing for TRAIL-or anticancer drug-induced apoptosis；WO 2003086470.
Alnemri，Conserved sequence of XIAP-binding motif in human caspase-9 andSmac/DIABLO and therapeutic uses for screening modulators of apoptosis；WO2003010184.
Arnt等人，Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects ofchemotherapeutic agents by binding XIAP and cIAP1 in situ；J Biol Chem.2002 Novl5；277(46)44236-43.Epub 2002 Sep 05.
IAP binding peptide or polypeptide and methods of using the same；第20020132786號美國專利申請公開.
第20020160975號美國專利申請公開，Conserved XIAP-interaction motif incaspase-9 and Smac/DIABLO for mediating apoptosis.
第20020177557號美國專利申請公開，Compositions and method for regulatingapoptosis.
第6,608,026號美國專利，Wang等人，Apoptotic Compounds；Li等人，Targeting and amplification of immune killing of tumor cells bypro-Smac，Int J Cancer.2004 Mar 10；109(1)85-94.
發(fā)明簡述我們偶然發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有的單體相比，二聚體形式的Smac肽以及模擬肽的促細胞凋亡活性得到明顯的改善。這些二聚體類似地結(jié)合胞質(zhì)IAP，并且減弱它們的caspase抑制作用，但是在此方面具有超常的效力。我們認為它們與IAP蛋白內(nèi)的BIR(桿狀病毒抑制性重復序列)結(jié)構(gòu)域的鄰近重復序列結(jié)合，而且這種雙向識別對其活性具有決定性作用相應的單體在細胞提取液中活性明顯偏低(即活性低10000倍)。事實上我們的實驗數(shù)據(jù)證明這些二聚體的作用是催化性的，將未結(jié)合的IAP導入泛素/蛋白酶體降解途徑中。這些二聚體與TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體)協(xié)同作用，誘導培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生細胞凋亡，其典型作用濃度為pmol級。這些化合物為癌癥，特別是通過IAP蛋白過度表達對抗程序性細胞死亡的腫瘤，提供了新的輔助化療藥物。
如優(yōu)選實施方案所述，我們開發(fā)出了一系列新型的二聚型分子，這些化合物模擬了Smac的內(nèi)源性功能，而且活性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的Smac模擬肽。這些化合物是穩(wěn)定的，耐受蛋白酶的，并且能夠自由地透過細胞膜，這些分子沒有細胞毒性。此前尚無類似化合物被描述。雖然有人試圖將Smac衍生肽以及肽-載體構(gòu)建體(peptide-carrier construct)用于類似用途，由于其生理化學性質(zhì)的原因，這些現(xiàn)有技術(shù)中的化合物被嚴格限制，而且其效力比本發(fā)明的化合物低，呈數(shù)量級差異。
因此，本發(fā)明提出了促進病變細胞發(fā)生細胞凋亡的方法和組合物，在這些方法和組合物中采用了促細胞凋亡的二聚Smac模擬肽。通用的方法包括以下步驟將細胞與有效量的，具有活性的二聚Smac模擬肽接觸，典型地，此后直接、間接或推論性地檢測所出現(xiàn)的目標細胞凋亡增加。二聚體的活性可以由IAP結(jié)合力、procaspase-3活化作用或凋亡促進效果等指標加以確定。
在優(yōu)選的實施方案中，細胞原位存在于一個個體中，對該個體給藥包含治療有效劑量的所述模擬肽的組合物，由此實現(xiàn)接觸步驟，其中該個體可能與此同時或之前接受用于治療新增殖性(neoproliferative)疾病的射線或化學治療。在一個具體的實施方案中，病變細胞是腫瘤細胞，例如，選自以下組中的腫瘤惡性膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、腎癌、肝細胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤和肉瘤。在其它實施方案中，目標細胞是促炎癥細胞或炎癥和/或自體免疫疾病組織的細胞。多種疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、哮喘、狼瘡、炎性腸疾病(克羅恩氏病及相關(guān)疾病)、多發(fā)性硬化病、慢性阻塞性肺疾病、炎性腸和骨盆疾病、過敏性鼻炎(花粉熱)、心血管疾病等，均能提供致病性目標炎癥。
本發(fā)明的組合物包含藥用組合物，其中含有單劑量形式的，治療有效量的活性二聚Smac模擬肽以及藥學可接受的載體。在一些實施方案中，除模擬肽以外，這些組合物還包含其它治療藥物，如抗新增殖性疾病的化療藥物。
本發(fā)明還提供制備和篩選活性二聚Smac模擬肽的方法。例如，通用的篩選試驗以下步驟由單體模擬肽生成二聚Smac模擬肽，以單體前體作比較，通過如IAP結(jié)合力、procaspase-3活化作用或凋亡促進效果等指標檢測所得二聚體的活性提高。
本發(fā)明的模擬肽包括多種具有活性的二聚Smac模擬肽，其通式為M1-L-M2，其中片斷M1和M2為Smac模擬肽單體，L為使活性二聚體中的M1和M2共價連接的連接基團。M1和M2分別為Smac模擬肽單體，特別是促細胞凋亡的模擬肽，尤其是AVP型和AV型類肽(peptoid)的模擬肽，例如參見WO 2002030959；WO2002096930；WO 2002026775；WO 2003086470；WO 2003010184；第20020177557、20020132786、20020160975號美國專利申請公開；第6,608,026號美國專利等，并且包括這些專利所公開的或所引用的各種不同的模擬肽結(jié)構(gòu)。
連接基團L用于共價偶聯(lián)二聚體結(jié)構(gòu)中的M1和M2，與未偶聯(lián)的單體相比，使得促細胞凋亡的活性提高，同時連接基團L也與本發(fā)明所公開的二聚體用途相適應(如生理學相容性和穩(wěn)定性)。可以采用多種連接基團，具體的連接基團根據(jù)經(jīng)驗易于分析。連接基團L通常是一個連續(xù)的鏈，其中含有2至200個原子，優(yōu)選含有4至100個原子，更優(yōu)選含有4至25個原子，其分子量(MW)在20至2KD之間，優(yōu)選為40至1KD，更優(yōu)選為56至1KD。L可以是左右對稱的或非對稱的，可以連接不同的、異構(gòu)的或相同的M1和M2，典型地，其跨度大約在3至3KA之間，優(yōu)選為約6至2000A，更優(yōu)選為約12至1000A。示例性的，非界定性的適用連接基團將在下文中作進一步描述。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提出了一種由式II所代表的二聚化合物或其藥學可接受的鹽 式II其中R1和R1’選自氫原子，任選取代的甲基，和羥基；R2和R2’選自任選取代的甲基和任選取代的乙基；R3和R3’選自CH2，NH，O和S；R4和R4’選自CH和N；R5-R8以及R5’-R8’選自氫原子，任選雜的、任選取代的烷基，任選雜的、任選取代的烯基，任選雜的、任選取代的炔基，任選雜的、任選取代的芳基，L為將R2、R5、R6或R7和R2’、R5’、R6’或R7’共價連接的連接基團。
在多種具體的實施方案中包含了各種組合，其中R1和R1’選自氫原子和甲基；R2和R2’選自甲基和乙基；R3和R3’為NH；R4和R4’為CH；R5和R5’為C1-C3烷基；以及R6/R6’和R7/R7’或者R7/R7’或R8/R8’相互連接構(gòu)成5至8元環(huán)；更具體地，R1和R1’選自氫原子和甲基；R2和R2’選自甲基和乙基；R3和R3’為NH；R4和R4’為CH；R5和R5’為C1-C3烷基；L將R5、R6或R7與R5’、R6’或R7’共價連接。
在更為具體的實施方案中包含了各種組合，其中R1/R1’和R2/R2’連接構(gòu)成4元環(huán)(吖啶環(huán))；R7和R8連接構(gòu)成5或6元環(huán)；R6和R7連接構(gòu)成5或6元環(huán)，特別地，R6和R7連接構(gòu)成5元環(huán)；L將該環(huán)與R2’、R5’、R6’或R7’共價連接；R8包含5或6元環(huán)，特別地，R8包含5元環(huán)，其中包含至少一個雜原子、至少一個取代基、以及至少一個不飽和基團。
在具體的實施方案中，L是一個連續(xù)的鏈，其中含有4至100個原子，其分子量在40至1KD之間，是一個任選雜的、任選取代的二炔基。在具體的實施方案中，連接基團相對于連接基團左右對稱；在具體的實施方案中，二聚體本身左右對稱。
本發(fā)明還提供藥用組合物，其包含本發(fā)明的化合物和藥學可接受的賦形劑，特別地，這些組合物包含單位劑量的本發(fā)明化合物，特別地，這些組合物與使用說明書共同包裝，該說明書描述了所述組合物在治療在多種腫瘤和炎癥中所見的與IAP活性偏高和/或caspase或細胞凋亡活性偏低有關(guān)的疾病中的使用方法。
因此，本發(fā)明提供治療與caspase活性異常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括以下步驟給藥有效劑量的本發(fā)明化合物和組合物，可以隨后檢測用藥所致的，與疾病有關(guān)的病理學改善，還可以在給藥步驟之前診斷所述疾病和/或開具所述組合物的處方。適用的疾病包括腫瘤或炎癥。
本發(fā)明還提供抑制caspase活性的方法，該方法包括以下步驟將一種含有caspase的組合物和有效量的本發(fā)明的化合物和組合物進行接觸，可以隨后檢測所得的caspase活性改的變。
具體實施方案以下有關(guān)具體實施方案和實施例的描述均為示例性的，本身不具有界定性質(zhì)。除表述不當或另有說明外，在這些描述以及整個專利說明書中，術(shù)語“a”或“an”指一個或多個，術(shù)語“or”指和/或，多聚核苷酸序列被理解為也包括其反鏈以及本專利所描述的其它骨架。
本發(fā)明中“雜原子”包含氧(O)原子、氮(N)原子、硫(S)原子和硅(Si)原子。
除另有說明外，不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“烷基”指完全飽和的，具有指定碳原子數(shù)目(即C1-C8指含1至8個碳原子)的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基。烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、第二丁基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、環(huán)丙基甲基及其高級同系物或異構(gòu)體，如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。
不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“烯基”指不飽和或多不飽和的，具有指定碳原子數(shù)目(即C2-C8指含2至8個碳原子)和一個或多個雙鍵的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基。烯基的實例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯)基、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯)基及其高級同系物或異構(gòu)體。
不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“炔基”指不飽和或多不飽和的，具有指定碳原子數(shù)目(即C2-C8指含2至8個碳原子)和一個或多個三鍵的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基。炔基的實例包括乙炔基、1-或3-丙炔基、3-丁炔基及其高級同系物或異構(gòu)體。
不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“亞烷基”指源自烷基的二價基團，其實例有-CH2-CH2-CH2-CH2-。典型地，本發(fā)明中烷基(或亞烷基)具有1至24個碳原子，優(yōu)選為具有10個或更少的碳原子。“低級烷基”或“低級亞烷基”指較短的烷基或亞烷基，通常含有8個或更少的碳原子。
本發(fā)明中“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基(硫代烷氧基)”與常規(guī)概念相同，指分別通過氧原子、氨基或硫原子與分子的其它部分連接的烷基。
除另有說明外，不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“雜烷基”指直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基，其中含有指定數(shù)目的碳原子和1至3個選自O(shè)、N、Si和S的雜原子。其中N和S原子可任選被氧化，N原子可以被任選季銨化。雜原子O、N和S可以位于雜烷基內(nèi)部的任何位置。雜原子Si可位于雜烷基任何位置，包括烷基與分子其它部分進行連接的位點。其實例包括-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。兩個雜原子可以相鄰，如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
類似地，不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“雜亞烷基”指源自雜烷基的二價基團，如-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。在雜亞烷基中，雜原子可占據(jù)基團的一端互兩端(如亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷氨基、亞烷二氨基等)。此外，作為連接基團的亞烷基和雜亞烷基是沒有取向性的。
除另有說明外，不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”指環(huán)狀“烷基”和“雜烷基”。因此，環(huán)烷基含有指定數(shù)目的碳原子(即C3-C8指3至8個碳原子)，也可以含有一個或二個雙鍵。雜環(huán)烷基含有指定數(shù)目的碳原子和1至3個選自O(shè)、N、Si和S的雜原子。其中N和S原子可任選被氧化，N原子可以被任選季銨化。此外，在雜環(huán)烷基中，雜原子可以占據(jù)雜環(huán)烷基與分子其它部分進行連接的位點。環(huán)烷基的實例有環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實例有1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除另有說明外，不論指其本身或作為其它取代基的一部分，“鹵代”或“鹵素”指氟、氯、溴或碘原子。此外，“鹵代烷基”指被鹵原子取代的烷基，鹵原子可以相同或不同，數(shù)目為1至(2m′+1)個，其中m′為烷基的總碳原子數(shù)。例如，“(C1-C4)鹵代烷基”包括三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。因此，“鹵代烷基”包括單鹵代烷基(被一個鹵原子取代的烷基)和多鹵代烷基(被2至(2m′+1)個鹵原子取代的烷基，其中m′為烷基的總碳原子數(shù))。
除另有說明外，全鹵代烷基指被(2m′+1)個鹵原子取代的烷基，其中m′為烷基的總碳原子數(shù)。例如，“(C1-C4)全鹵代烷基”包括三氟甲基、五氯乙基、1，1，1-三氟-2-溴-2-氯乙基等。
“?；敝笇⒂袡C酸中的羥基去除所衍生出的基團。因此，舉例而言，?；ㄒ阴；?、丙酰基、丁?；?、癸?；?、新戊?；?、苯甲?；?。
除另有說明外，“芳基”指多不飽和的，典型具有芳香性的烴基，可以為單環(huán)或多環(huán)(多達三個環(huán))，環(huán)之間可以是稠合的或共價連接的。芳基的非界定性的實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、以及1，2，3，4-四氫萘基。
“雜芳基”指含有0至4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或芳環(huán))，其中N和S原子可任選被氧化，N原子可以被任選季銨化。雜芳基可以通過雜原子與分子的其它部分相連接。雜芳基的非界定性實例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基。
為簡明起見，當與其它術(shù)語聯(lián)合使用時(如芳氧基、硫代芳氧基、芳烷基)，“芳基”包括以上定義的芳基和雜芳基。因此，“芳烷基”指芳基與烷基連接的基團(如芐基、苯乙基、吡啶甲基等)，其中烷基部分的碳原子(如亞甲基)可以被氧原子等取代(如苯氧甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
以上術(shù)語(如“烷基”、“雜烷基”、“芳基”和“雜芳基”)包括指定基團的取代和未取代形式。各類型基團的優(yōu)選取代基列舉如下。
烷基和雜烷基(以及亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基)的取代基可廣泛地選自-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、鹵素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR′-SO2NR、-NR″CO2R′、-NH-C(NH2)＝NH、-NR′C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR′、-S(O)R′、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、-CN和-NO2，取代基的數(shù)目為0至3個，優(yōu)選的取代基數(shù)目為0、1或2個。R′、R″和R相互獨立地為氫原子，未取代的C1-C8烷基和雜烷基，未取代的芳基，由1至3個鹵原子取代的芳基，未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基-C1-C4烷基。當R′和R″與相同氮原子相連時，它們可相互連接，與氮原子一起構(gòu)成五、六或七元環(huán)。例如，-NR′R″包括1-吡咯烷基和4-嗎啉基。典型地，烷基或雜烷基具有0至3個取代基，優(yōu)選為具有2個或更少的取代基。更優(yōu)選地，烷基或雜烷基為未取代的或單取代的。最優(yōu)選地，烷基或雜烷基為未取代的。通過以上關(guān)于取代基的討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當認識到術(shù)語“烷基”的含義包含帶有取代基的基團，如鹵原子三取代的烷基(如-CF3和-CH2CF3)。
優(yōu)選的烷基或雜烷基的取代基選自O(shè)R′、＝O、-NR′R″、-SR′、鹵素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″CO2R′、-NR′-SO2NR″R、-S(O)R′、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、-CN和-NO2，其中R′和R″如上所述。更為優(yōu)選的取代基選自-OR′、＝O、-NR′R″、鹵素、-OC(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″CO2R′、-NR′-SO2NR″R、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、-CN和-NO2。
類似地，優(yōu)選的芳基或雜芳基的取代基品種多樣，選自鹵素、-OR′、-OC(O)R′、-NR′R″、-SR′、-R′、-CN、-NO2、-CO2R′、-CONR′R″、-C(O)R′、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR″CO2R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR′-SO2NR″R、-NH-C(NH2)＝NH、-NR′C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR′、-S(O)R′、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、-N3、-CH(Ph)2、全氟代C1-C4烷氧基、全氟代C1-C4烷基、取代基的數(shù)目為0至芳環(huán)中未取代位點的總和，其中R′、R″和R相互獨立地為氫原子、未取代的C1-C8烷基和雜烷基、未取代的芳基和雜芳基、(未取代的芳基)取代的C1-C4烷基和未取代的芳氧基)取代的C1-C4烷基。當芳基為1，2，3，4-四氫萘時，它可以被取代或未取代的C3-C7螺環(huán)烷基取代。C3-C7螺環(huán)烷基可以按本發(fā)明“環(huán)烷基”中所定義的取代方式進行取代。典型地，芳基或雜芳基具有0至3個取代基，優(yōu)選為具有2個或更少的取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，芳基或雜芳基是未取代的或單取代的。在另一個實施方案中，芳基或雜芳基是未取代。
優(yōu)選的芳基或雜芳基的取代基選自鹵素、-OR′、-OC(O)R′、-NR′R″、-SR′、-R′、-CN、-NO2、-CO2R′、-CONR′R″、-C(O)R′、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-S(O)R′、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、-N3、-CH(Ph)2、全氟代C1-C4烷氧基和全氟代C1-C4烷基。其中R′和R″與上述相同。更優(yōu)選的取代基選自鹵素、-OR′、-OC(O)R′、-NR′R″、-R′、-CN、-NO2、-CO2R′、-CONR′R″、-NR″C(O)R′、-SO2R′、-SO2NR′R″、-NR″SO2R、全氟代C1-C4烷氧基和全氟代C1-C4烷基。
本發(fā)明的取代基-CO2H包括其生物電子等排體，例如參見The Practice ofMedicinal Chemistry；Wennuth，C.G.，Ed.；Academic PressNew York，1996；p.203。
芳基或雜芳基環(huán)中相鄰原子上的兩個取代基可被基團-T-C(O)-(CH2)q-U-任選取代，其中T和U各自獨立地分別為-NH-、-O-、-CH2-或單鍵，q為選自0至2的整數(shù)。此外，芳基或雜芳基環(huán)中相鄰原子上的兩個取代基可被基團-A-(CH2)r-B-取代，其中A和B各自獨立地分別為-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或單鍵，r為選自1至3的整數(shù)。所構(gòu)成的新環(huán)中的一個單鍵可以被雙鍵任意替代。此外，芳基或雜芳基環(huán)中相鄰原子上的兩個取代基可被基團-(CH2)s-X-(CH2)t-取代，其中s和t各自獨立，分別為選自0至3的整數(shù)。X為-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR′-。-NR′-和-S(O)2NR′-中的取代基R′選自氫原子或未取代的C1-C6烷基。
術(shù)語“藥學可接受鹽”指依據(jù)本發(fā)明化合物中的取代基而定，采用相對無毒的酸或堿制備出的活性化合物的鹽。當本發(fā)明的化合物帶有相對酸性的官能團時，將游離形式的化合物與足夠用量的所需堿反應，構(gòu)成堿加成鹽，可以在適當惰性溶劑中或不使用溶劑進行反應。藥學可接受的堿加成鹽的實例包括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，銨鹽，有機胺鹽或鎂鹽等。當本發(fā)明的化合物帶有相對堿性的官能團時，將游離形式的化合物與足夠用量的所需酸反應，構(gòu)成酸加成鹽，藥學可接受的酸加成鹽的實例包括由無機酸衍生的鹽，如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硝酸鹽，碳酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，氫碘酸鹽，亞磷酸鹽等，以及由相對無毒的有機酸衍生的鹽，如乙酸鹽，丙酸鹽，異丁酸鹽，草酸鹽，馬來酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽，琥珀酸鹽，辛二酸鹽，富馬酸鹽，扁桃酸鹽，苯二甲酸鹽，苯磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽等。也可以是氨基酸，如精氨酸的鹽，或有機酸，如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見，如Berge等人(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。本發(fā)明的某些化合物同時具有堿性或酸性官能團，可以將這些化合物轉(zhuǎn)化成堿加成鹽或酸加成鹽。
可以將鹽與堿或酸反應，重新生成游離形式的化合物，并采用常規(guī)方法純化母體化合物。雖然母體化合物的某些物理性質(zhì)，如極性溶劑中的溶解度與鹽不同，但就本發(fā)明的目的而言，母體化合物和鹽是等價的。
除采取鹽的形式外，本發(fā)明提出了采取前藥形式的化合物。本發(fā)明化合物的前藥指在生理條件下容易發(fā)生化學轉(zhuǎn)化，生成本發(fā)明化合物的化合物。此外，在體外環(huán)境中，采用化學或生物化學的方法也可以將前藥轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。例如，在一個透皮給藥的藥貼儲庫中，通過適當?shù)拿富蚧瘜W藥劑將前藥緩慢轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。前藥常常被使用，這是因為在某些場合下，它們比母體藥物更易于給藥。例如，與母體藥物相比，其生物利用度更好。前藥也可以改進母體藥物在藥用組合物中的溶解度。本領(lǐng)域中已知有多種作為前藥的衍生物，如根據(jù)水解或氧化機理活化的前藥。此處不作界定，前藥的一個實例可以是這樣一種化合物，它采取酯的形式(前藥)，通過代謝途徑水解成羧酸并恢復全部活性。其它的實例包括本發(fā)明化合物的多肽衍生物。
本發(fā)明化合物可以采取未溶劑化的形式或溶劑化，包括水合的形式。一般而言，溶劑化的形式等價于未溶劑化的形式，并涵蓋在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。本發(fā)明化合物可以采取多晶或無定形的形式。一般地，對于本發(fā)明的用途而言，所有物理形式都是等價的，并涵蓋在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。
本發(fā)明的某些化合物具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵，其外消旋體，非對映異構(gòu)體，幾何異構(gòu)體和各個異構(gòu)體均涵蓋在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。
本發(fā)明化合物中的一個或多個原子可以具有非天然的同位素比例。例如，化合物被放射性同位素，如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)所標記。本發(fā)明化合物的所有同位素變化，不論其是否具有放射性，均涵蓋在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。
術(shù)語“治療有效量”指本發(fā)明化合物在組織、系統(tǒng)、動物或人體內(nèi)引發(fā)生物學或藥物反應所需的用量，可以由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其它臨床工作者加以確定。術(shù)語“治療有效量”包括這樣一些用量，當給藥化合物時，足以防止所治療疾病的一種或多種癥狀發(fā)展，或緩解至某種程度所需的用量。治療有效量依賴于化合物、疾病以及患病程度、所治療哺乳動物的年齡、體重等因素而定。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提出了一種二聚化合物M1-L-M2，其中M1和M2相互獨立地分別為式I所示的片斷，二者間由連接基團L通過R2、R5、R6或R7共價連接 式I該具體實施方案的特征還在于一種式II所示的二聚化合物， 式II包括所有的組合或其藥學可接受的鹽，其中R1和R1’選自氫原子，任選取代的甲基，和羥基；R2和R2’選自任選取代的甲基和任選取代的乙基；R3和R3’選自CH2，NH，O和S；R4和R4’選自CH和N；R5-R8以及R5’-R8’選自氫原子，任選雜的、任選取代的烷基，任選雜的、任選取代的鏈烯基，任選雜的、任選取代的炔基，任選雜的、任選取代的芳基，以及L為將R2、R5、R6或R7和R2’、R5’、R6’或R7’共價連接的連接基團。
一個或多個相應的R和R’基團可以相同或不同。多種具體的實施方案包括所有的組合，其中
R1和R1’選自氫原子和甲基；R2和R2’選自乙基和優(yōu)選的甲基；R3和R3’為選自CH2，O和優(yōu)選的NH；R4和R4’為CH；R5和R5’為C1-C3烷基；以及R6/R6’和R7/R7’或者R7/R7’或R8/R8’相互連接構(gòu)成5至8元環(huán)。
在更具體的實施方案中，R1和R1’選自氫原子和甲基；R2和R2’選自甲基和乙基；R3和R3’為NH；R4和R4’為CH；R5和R5’為C1-C3烷基；L將R5、R6或R7和R5’、R6’或R7’共價連接。
更為具體的實施方案包括所有的組合，其中R1/R1’和R2/R2’連接構(gòu)成4元環(huán)(吖啶環(huán))；R7和R8連接構(gòu)成5或6元環(huán)；R6和R7連接構(gòu)成5或6元環(huán)，特別地，R6和R7連接構(gòu)成5元環(huán)；L將該環(huán)與R2’、R5’、R6’或R7’共價連接；R8包含5或6元環(huán)，特別地，R8包含5元環(huán)，其中包含至少一個雜原子、至少一個取代基、和至少一個不飽和基團。
在具體的實施方案中，L是一個連續(xù)的鏈，其含有4至100個原子，其分子量在40至1KD之間，是一個任選雜的、任選取代的二炔基。在具體的實施方案中，該連接基團左右對稱；并且在更為具體的實施方案中，二聚體本身是對稱的，即連接基團左右對稱，而M1和M2是異構(gòu)體(相應的R和R′是相同的)。
在一個的實施方案中，L被氨基化片斷，特別是氨基酸，如賴氨酸或精氨酸或其biostere所取代，或者是一個含有氨基化片斷，特別是氨基酸，如賴氨酸或精氨酸或其biostere的連續(xù)鏈，其中所述氨基可以質(zhì)子化或烷基化，產(chǎn)生正電荷，使得化合物成為一個三胺，具有三個潛在的能夠與BIR結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的位點(例如參見示例性二聚體)。
本發(fā)明的這些以及其它實施方案可以在題目為“示例性二聚體”、“示例性單體”和“實驗過程”的段落中找到或被列舉。
本發(fā)明還提供藥用組合物，其包含本發(fā)明的化合物和藥學可接受的賦形劑，特別地，這些組合物包含單位劑量的本發(fā)明化合物，特別地，這些組合物與使用說明書共同包裝，說明書中描述了組合物在治療在多種腫瘤和炎癥中所見的與IAP活性偏高和/或caspase或細胞凋亡活性偏低有關(guān)的疾病中的使用方法。
因此，本發(fā)明提供治療與caspase活性異常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括以下步驟給藥有效劑量的本發(fā)明化合物和組合物，隨后可檢測用藥所致的與疾病有關(guān)的病理學改善，還可在給藥步驟之前診斷所述疾病和/或開具所述組合物之處方。適用的疾病包括腫瘤或炎癥。
本發(fā)明還提供抑制caspase活性的方法，該方法包括以下步驟將一種含有caspase的組合物和有效量的本發(fā)明的化合物和組合物進行接觸，隨后可檢測所得的caspase活性的改變。
示例性的模擬肽不具有界定作用。模擬肽化學是一個完善的研究領(lǐng)域，采用常規(guī)化學手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地制備出多種模擬肽(例如參見Liao等人(1998)J.Med.Chem 41，4767-4776；Andrade-Gordon et al.(1999)PNAS USA96，12257-12262；Boatman等人(1999)J.Med.Chem.42，1367-1375；Kasher等人(1999)J.Mol.Biol 292，421-429；US專利5,981,467等)，而且這些模擬肽開發(fā)的策略也適用于本發(fā)明，只要所得的模擬肽經(jīng)篩選后被確定具有本發(fā)明所需的活性即可。
模擬肽的合成方法在本領(lǐng)域中已為人所熟知。在Chemistry and Biochemistry of氨基Acids，Peptides and Proteins，A Survey of Recellt Developments，Weinstein，B.ed.，Marcell Deldcer，Inc.，publ.New York(1983)中列出了一些制備多肽、多肽類似物或衍生物的通用方法?？刹捎枚喾N已為人所熟知的方法合成模擬肽，例如參見R.Zuckermann等人的亞單體(submonomer)法，J.Am.Chem.Soc.(1992)011410646-7。US專利5,958,792中描述了有機雜環(huán)化合物的固相合成技術(shù)，其中采用N-取代的甘氨酸單體構(gòu)建骨架，對所得有機雜環(huán)化合物的混合物的組合庫進行篩選，按如下所述的方法評價其IAP抑制活性。將亞單體方法與強效溶液相化學相結(jié)合，可以在固相載體上合成高度取代的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在亞單體方法中，首先合成線性骨架，然后進行分子間或分子內(nèi)環(huán)合，由此構(gòu)成具有一個、二個、三個或更多個稠合環(huán)的環(huán)狀化合物，這種方法在US專利5,958,792中也有描述。示例性模擬肽的通用合成方法分類如下采用手性α-羥基酸作為構(gòu)建塊制備α-聚酯?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知化學合成方法制備α-聚酯結(jié)構(gòu)。反應細節(jié)參見Brewster，P.等人，Nature，(1990)166179。Chan，P.C.和Chong，J.M.，Tetrahedron Lett.(1990)1985中描述了另外一個制備類似結(jié)構(gòu)的方法。此外，該文獻所引用的參考文獻中描述了手性α-羥基酸的合成方法。
采用手性α-氨基酸作為構(gòu)建塊制備聚硫代酰胺?？梢圆捎肅lausen，K.等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I(1984)785和Tetrahedron Lett.(1990)3123中所描述的方法制備聚硫代酰胺結(jié)構(gòu)。
采用手性α-氨基酸作為構(gòu)建塊制備Poly羥基mate?？梢圆捎肒olasa，T.和Chimiak，A.，Tetrahedron(1977)333285中所描述的方法制備Poly羥基mate。該文獻所引用的參考文獻中描述了用于模擬肽合成的N-羥基氨基酸的合成。
采用手性β-羥基酸作為構(gòu)建塊制備β-聚酯?？梢圆捎肊lliott，J.D.等人，Tetrahedron Lett.(1985)262535和Tetrahedron Lett.(1974)151333中所描述的方法制備β-聚酯。
采用手性β-氨基磺酸作為構(gòu)建塊制備聚磺酰胺?？梢圆捎肬S專利6,075,121中所描述的方法制備聚磺酰胺。手性β-氨基酸在Kokotos，G.，Synthesis(1990)299中有描述。
采用手性β-氨基磺酸作為構(gòu)建塊制備N-烷基化聚磺酰胺。類似地，可以采用US專利6,075,121中所描述的方法制備這些聚磺酰胺。
采用手性β-氨基磺酸作為構(gòu)建塊制備聚脲。可以采用Shiori，T.等人，J.Am.Chem.Soc.(1972)946302和Scholtz，J.，and Bartlett，P.，Synthesis(1989)542中所描述的方法制備聚脲。
采用手性β-氨基醇作為構(gòu)建塊制備聚氨酯?？梢圆捎肬S專利6,075,121中所描述的方法制備聚氨酯。N-取代的甘氨酸類似物在本領(lǐng)域中已為人所熟知，可以采用已知方法進行合成，例如參見Sempuku等人，JP 58/150,562(Chem Abs(1984)10068019b)；Richard等人，U.S.專利4,684,483；Pulwer等人，EPO 187,130。
某些N-取代的甘氨酸類似物已有商品來源。例如N-芐基甘氨酸乙酯可以從Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，Wis.)購得。采用KOH/MeOH將該化合物水解，HCl酸化后可得N-芐基甘氨酸。在高pH(約為10)的條件下，在含水二氧六環(huán)中用Fmoc-Cl處理，由此進行Fmoc(芴甲氧羰基)保護。
可以采用簡單的化學方法合成其它的N-取代的甘氨酸。將過量2-甲基丙胺與鹵代乙酸反應合成N-異丁基甘氨酸。
將過量1，2-二氨基乙烷與鹵代乙酸反應制備N-(2-氨乙基)甘氨酸，此后采用乙酸作流動相洗脫在Dowex-l(OH型)上進行純化。在pH＝11.2條件下，采用常規(guī)方法對未保護的氨基作t-丁氧羰基(t-Boc)保護，此后用Fmoc對仲胺基進行保護。
將過量2-氨基乙醇與鹵代乙酸反應制備N-(2-羥基乙基)甘氨酸，此后采用乙酸作流動相洗脫在Dowex-l(OH型)上進行純化。然后將氨基的氮原子用Fmoc保護，此后在酸性條件下采用甲醇對羧基進行酯化。然后使甲酯與異丁烯反應生成叔丁醚。接下來在pH＝8.0的磷酸緩沖液中用豬肝酯酶水解該甲酯，得到適于模擬肽合成的經(jīng)保護的N-取代甘氨酸類似物。此外，還可以在DMF和咪唑中采用叔丁基二苯基氯硅烷處理Fmoc-羥乙基甘氨酸，得到硅烷基保護的醇。
在含水溶液中將甘氨酸叔丁酯與2-鹵代乙酸反應制備N-(羧甲基)甘氨酸，該產(chǎn)品可直接用Fmoc保護。此外，也可以在pH 6的條件下，于氫氣氛中將甘氨酸叔丁酯、乙醛酸和鈀碳混合制備N-(羧甲基)甘氨酸，然后采用常規(guī)方法對化合物進行Fmoc保護。
單體合成完成后，可以采用標準的多肽化學方法將該單體和其它單體和/或常規(guī)氨基酸偶聯(lián)構(gòu)成類似物。例如，在適當溶劑中，于堿性條件(如pH 9)下將Fmoc-保護的單體(N-取代甘氨酸或常規(guī)氨基酸)與苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)或碳二酰亞胺(如二環(huán)己基碳二酰亞胺)反應，將其固定于適當?shù)臉渲?如HMP)上。哌啶處理去除Fmoc保護基。此后采用BOP或碳二酰亞胺順序連接其它單體，直至全部序列被構(gòu)建。采用三氟乙酸(TFA)進行處理，將合成完成的分子鏈從樹脂上脫除并脫保護。
此外，可以將N-取代的甘氨酸類似物連接到通過其它方法如通過基因重組表達或天然提取制備的模擬肽的末端。此外，可以將模擬肽在所需位置上裂解，連接N-取代的甘氨酸類似物，然后再連接分子的其余部分或化學合成的替代片斷，由此將N-取代的甘氨酸類似物插入到這些模擬肽的序列中。
用于給藥的組合物可以采取散裝的液體溶液或混懸劑的形式。但是更為普遍的作法是將組合物制成單元劑量形式以方便精確給藥。術(shù)語“單元劑量形式”指適用于人或其它動物單次給藥的物理分隔的單元，各單元中含有預定用量的經(jīng)計算能夠達到所需治療效果的活性化合物，另外還含有適用的藥用賦形劑。典型的單元劑量形式包括適用于液體組合物的預先充填的、預先計量的安瓶或注射器，適用于固體組合物的丸劑、片劑、膠囊、錠劑等。在這些組合物中，模擬肽為少量成分(以重量為計，約0.1至50％，優(yōu)選為約1至40％)，其余成分為有助于構(gòu)成所需劑型的多種賦形劑、載體和加工助劑。
適用的賦形劑或載體以及藥用組合物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在文獻如Remington′s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Co，NJ(1991)中被更為具體地描述。此外，為有利起見，模擬肽可以和其它化學治療藥物聯(lián)合用藥，如乙烯雌酚或DES、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、α-干擾素、天冬酰胺酶、他莫昔芬、氟他胺等，以及Merck Manuel，16th edition 1992，Merck Research Laboratories，Rahway，NJ；Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，1996，McGraw-Hill，esp.Chabner等人，Antineoplastic Agents等所描述的，或其它本領(lǐng)域已知的化學治療藥物。因此，組合物按單位劑量可以單獨、聯(lián)合或組合給藥。在一個具體實施方案中，將模擬肽與抗新增殖性疾病的藥物或其它藥物共價結(jié)合構(gòu)成綴合物，實現(xiàn)組合給藥?？梢圆捎萌魏芜m用的綴合反應。
模擬肽的給藥量有賴于模擬肽配方、給藥途徑等因素，一般通過常規(guī)實驗按經(jīng)驗加以確定，依據(jù)作用靶點、宿主和給藥途徑可以作必要的調(diào)整。一般而言，單元制劑中活性化合物的用量可以根據(jù)具體用途作改變或調(diào)整，其范圍在約0.1mg至1000mg之間，優(yōu)選為1mg至300mg之間，更優(yōu)選為10mg至200mg之間。實際用量可以根據(jù)患者要求和所治療疾病的嚴重程度作調(diào)整。本領(lǐng)域技術(shù)水平能夠解決具體情況下的確定適用劑量的問題。一般而言，治療首先以低于最佳劑量的小劑量開始，此后逐漸小幅增加劑量，直至達到最佳治療效果。為方便起見，如果有必要，可以對日劑量分份，分次進行給藥。
以下為模擬肽膠囊配方的實例(配方1-4)。
表1 膠囊配方
固體溶液的制備將結(jié)晶性模擬肽(80g/批)和聚乙烯吡咯烷酮(NF K29/32，160g/批)溶解于二氯甲烷(5000mL)中。利用適當?shù)膰婌F干燥機對該溶液進行干燥，將所得殘余物研磨成細粉。粉末通過30目篩，X-射線分析證明為無定形的。
在適用的混合器中將該固體溶液、二氧化硅和硬脂酸鎂混合10分鐘。采用適用的滾筒壓縮機擠壓混合物并采用適用的磨研磨，使混合物通過30目篩。向研磨后的混合物中加入交聯(lián)羥甲纖維素鈉、Pluronic F68和二氧化硅并混合10分鐘。將硬脂酸鎂和等量的混合物構(gòu)成預混物，然后將預混物加到其余混合物中，混合5分鐘，將混合物裝入硬質(zhì)明膠膠囊中。
此處不作界定，可以采用多種方法實現(xiàn)模擬肽的給藥，如用于疾病預防和/或治療的腸胃外給藥，局部給藥，口服給藥或局部給藥，如氣霧劑或透皮給藥劑?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已為人所熟知的方法實施化療和/或放射治療。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然化療和/或放療可以根據(jù)所治療的疾病以及化療和/或放療對于該疾病的療效作調(diào)整。同時，依據(jù)訓練有素的臨床醫(yī)生的經(jīng)驗，治療方案(如劑量和給藥次數(shù))可以根據(jù)給藥(即抗腫瘤藥或射線)后患者的反應以及疾病對于治療藥物的反應作調(diào)整。
模擬肽、化療藥物和/或射線的選取有賴于主治醫(yī)生對于疾病的診斷以及對于病情和所采用的治療方案的評判。根據(jù)增殖性疾病的性質(zhì)、患者的病情、與模擬肽聯(lián)合給藥時化療藥物和/或射線的實際搭配情況(即處于單個治療方案中)，模擬肽、化療藥物和/或射線可以同時給藥(如同時，基本同時或結(jié)合在同一治療方案中)或順序給藥。類似地，模擬肽和化療藥物不必處于同一藥用組合物中，由于物理和化學性質(zhì)的不同，也可以采用不同的給藥途徑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括模擬肽的全身性或局部給藥。當需要全身性給藥時，例如，可以通過靜脈注射或口服進行給藥。本發(fā)明的一個實施方案中提供一種模擬肽的局部給藥方法，如在腫瘤上給藥。在模擬肽的局部給藥中，優(yōu)選的局部給藥方式是局部注射。根據(jù)腫瘤的性質(zhì)和位置，也可以通過導管或局部沉積實現(xiàn)局部給藥，如通過商標為Depofoam的腫瘤內(nèi)或腫瘤外周給藥器具，緩釋泵/藥物輸送裝置，可植入的或局部使用的凝膠或聚合物進行給藥。也可以通過基因治療的途徑實現(xiàn)本發(fā)明治療劑的給藥。
按照治療有效劑量和用量，遵照治療患者有效的治療方案，可以實現(xiàn)本發(fā)明治療劑的給藥。起始的和后續(xù)的給藥劑量依據(jù)患者年齡、體重、病情以及所治療疾病、病癥或體征而定。劑量和用藥方案根據(jù)治療劑作調(diào)整，劑量也與所選擇的給藥方法如局部或全身性給藥相關(guān)。就活性很高的模擬肽而言，微克/公斤體重的劑量水平可能就是足夠的，例如，劑量為約1μg/kg至500mg/kg，以及約100μg/kg至5mg/kg，以及約1μg/kg至50μg/kg，以及約10μg/kg。
一般而言，常規(guī)的臨床實驗可以確定達到最佳治療效果的具體劑量范圍，對于各種治療劑而言，給藥方案以及對具體病人的給藥將依據(jù)患者的病情以及對于初始給藥的響應作調(diào)整，使其落入有效且安全的范圍內(nèi)。最終給藥方案將根據(jù)主治醫(yī)生的判斷作調(diào)整，醫(yī)生做判斷時將考慮患者的年齡、狀態(tài)、體重以及模擬肽的活性、病情等因素。例如，為降低腫瘤的生長速度，模擬肽的給藥方案可以是口服10mg至2000mg/天，優(yōu)選為10mg至1000mg/天，更優(yōu)選為50mg至600mg/天，分2次至4次(優(yōu)選為2次)給藥。當模擬肽結(jié)構(gòu)特征為稠合的環(huán)狀苯并環(huán)庚吡啶時，該抑制劑的優(yōu)選劑量為口服50mg至600mg/天，更優(yōu)選為50mg至400mg/天，分2次給藥。也可以采用間歇式治療方案(如每3周用藥1周，每4周用藥3周)。
在一個胰腺癌聯(lián)合治療的實例中，模擬肽口服50mg至400mg/天，分2次給藥，采用連續(xù)給藥的方式，抗腫瘤藥為吉西他濱，劑量為每周750至1350mg/m2，治療期間每4周用藥3周。在另一個肺癌聯(lián)合治療的實例中，模擬肽口服50mg至400mg/天，分2次給藥，采用連續(xù)給藥的方式，抗腫瘤藥為紫杉醇，劑量為65至175mg/m2，每3周用藥1次。在另一個神經(jīng)膠質(zhì)瘤聯(lián)合治療的實例中，模擬肽口服50mg至400mg/天，分2次給藥，抗腫瘤藥為替莫唑胺，劑量為100至250mg/m2。在另一個聯(lián)合治療的實例中，模擬肽口服50mg至400mg/天，分2次給藥，采用連續(xù)給藥的方式，抗腫瘤藥為5-氟脲嘧啶(5-FU)，劑量為每周500mg/m2(每周1次)，或每日200至300mg/m2連續(xù)輸注5-FU。當采取每周注射5-FU的方式時，可以與葉酸激動劑如Leucovoran(劑量20mg/m2/周)聯(lián)合給藥。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案包括以腫瘤衰退為指標監(jiān)測模擬肽的治療效果，據(jù)此調(diào)整后續(xù)劑量。例如，乳腺癌患者可以接受藥物，如環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、5-FU(CMF)或他莫昔芬的局部治療或局部放射治療，同時給藥模擬肽。將乳房造影、超聲或物理檢查結(jié)果與治療前作對比，用于指導隨后的治療方案和用藥劑量。
在判斷所給劑量水平對治療是否有效時，主治醫(yī)生將考慮患者的總體恢復情況以及更為明確的信號，如與疾病相關(guān)的癥狀的緩解、腫瘤生長的抑制、腫瘤的萎縮或轉(zhuǎn)運的抑制?？衫脴藴史椒ǎ绶派浞y量腫瘤的大小，連續(xù)測量結(jié)果可用于判斷腫瘤生長是否被阻礙甚至被逆轉(zhuǎn)。與疾病相關(guān)的癥狀，如疼痛的緩解以及總體情況的改善也可用于判斷治療的效果。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中包括以腫瘤衰退為指標監(jiān)測給藥模擬肽后的治療效果，此處不作界定，監(jiān)測方法包括物理檢查、CT、MRI、乳房造影、胸片、骨掃描、超聲、氣管鏡、內(nèi)窺鏡、結(jié)腸鏡、腹腔鏡、腫瘤標志物，如PSA、CEA和CA125的分析。監(jiān)測方法的適用性由所治療癌癥的性質(zhì)所決定。
實施例以下實施例用于評價Smac模擬肽的活性，例如，通過IAP結(jié)合力、procaspase-3活化或細胞凋亡促進的測定評價Smac模擬肽的活性。這些試驗也可用于篩選增強模擬肽活性的藥物(如拮抗劑)。
實施例1體外IAP(BIR)結(jié)合/相互作用試驗采用GST介導的親合力色層分析法評價模擬肽和IAP的相互作用。將約0.4mg重組IAP片斷(XIAP的第二和第三BIR基元)結(jié)合到200ml谷胱甘肽樹脂上，作為一種GST融合蛋白，并在室溫下與0.5mg經(jīng)放射標記的模擬肽一起溫育。采用含有25mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl和2mM二硫蘇糖醇(DTT)的緩沖液充分清洗后，復合物用5mM還原谷胱甘肽洗脫，SDS-PAGE考馬斯染色。實驗結(jié)果證明模擬肽特異性結(jié)合IAP。
實施例2體外高通量熒光極化結(jié)合試驗傳感器羅丹明標記的模擬肽(終濃度＝1-5nM)受體谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/BIR2，3融合蛋白(終濃度＝100-200nM)緩沖液10mM HEPES，10mM NaCl，6mM MgCl2，pH 7.61.在一個96孔的微孔板中加入90μl模擬肽/BIR2，3混合物。
2.在各孔中加入10μl測試化合物。
3.振搖5分鐘，利用Fluorolite FPM-2熒光極化微滴定系統(tǒng)(DynatechLaboratories，Inc)在5分鐘內(nèi)測定熒光極化量。
所測試模擬肽明顯和特異性結(jié)合IAP BIR2，3結(jié)構(gòu)域。
實施例3高通量固相模擬肽-BIR2，3結(jié)合/結(jié)合-干擾試驗A.試劑-Neutralite抗生物素蛋白20μg/ml，溶劑PBS。
-封閉緩沖液5％BSA，0.5％Tween 20，溶劑PBS；室溫下1小時。
-試驗緩沖液100mM KCl，20mM HEPES pH 7.6，1mM MgCl2，1％甘油，0.5％NP-40，50mMβ-巰基乙醇，1mg/ml BSA，混合蛋白酶抑制劑。
-33P模擬肽10倍貯備液10-8-10-6M“冷(無放射性)”模擬肽中加入200,000-250,000cpm標記的模擬肽(Beckman計數(shù)器)。篩選期間置于4℃小冰箱中。
-混合蛋白酶抑制劑(1000倍)將10mg胰島素抑制劑(BMB#109894)，10mg抑酶肽(BMB#236624)，25mg芐脒(Sigma#B-6506)，25mg亮抑蛋白酶肽(BMB#1017128)，10mg APMSF(BMB#917575)，以及2mM NaVO3(Sigma#S-6508)置于10ml PBS中。
-BIR2，310-7-10-5M生物素BIR2，3結(jié)構(gòu)域(同前)，溶劑PBS。
B.測試板的制備-于4℃下每個孔中涂布N-抗生物素蛋白原液120μl，放置過夜。
-200μl PBS洗2次。
-加入150μl封閉緩沖液封閉。
-200μl PBS洗2次。
C.試驗-每孔中加入40μl試驗緩沖液。
-加入10μl化合物或萃取物。
-加入10μl33P模擬肽(20-25,000cpm/0.1-10pmoles/孔，終濃度相當于10-9-10-7M)，25℃下振搖15分鐘。
-于25℃下繼續(xù)溫育45分鐘。
-加入40μM生物素BIR2，3(0.1-10pmoles/40μl，溶劑為試驗緩沖液)，室溫下溫育1小時。
-200μl PBS洗4次終止反應。
-加入150μM閃爍雞尾酒。
-在Topcount中進行計數(shù)。
D.所以試驗的對照(每個板上均有)a.非特異性結(jié)合b.80％抑制時可溶解(非生物素BIR2，3)模擬肽明顯和特異性結(jié)合IAP BIR2，3結(jié)構(gòu)域。
實施例4HeLa細胞萃取物經(jīng)放射性標記的procaspase-3活化試驗將20mg HeLa細胞的S-100萃取物單獨溫育(對照)，或與模擬肽(50nM)一起溫育，或與30-1000mM不同長度的N-端Smac多肽溫育。加入1mM dATP、1mMMgCl2、0.2mg/ml馬心細胞色素c、以及1ml體外轉(zhuǎn)譯的35S-標記的caspase-3進行反應，反應終體積為20ml。30℃下將反應混合物溫育1小時，然后在15％PAGE凝膠上進行電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上并照像。模擬肽和Smac片斷明顯促進procaspase-3的活化，而陰性對照Smac-7R無促進作用。
實施例5HeLa細胞萃取物procaspase-3活化熒光分析在150mm的組織培養(yǎng)皿中，將人HeLa S3細胞置于DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco優(yōu)化的eagle′s培養(yǎng)基，其中包含100U/ml青霉素，100μg/m硫酸鏈霉素)中，加入10％(v/v)小牛血清，于37℃和5％CO2條件下進行培養(yǎng)，生成單層細胞。細胞融合達70％后，用1倍磷酸緩沖液(PBS)將細胞洗一遍，然后于4℃下離心(800xg)5分鐘進行收集。將細胞團塊重新懸浮于3倍體積的緩沖液A(20mM Hepes-KOH，pH7.5，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA鈉鹽，1mM EGTA鈉鹽，1mM DTT和0.1mM PMSF)中。將整個的或截短的，含有頭三個BIR結(jié)構(gòu)域，或第二或第三BIR結(jié)構(gòu)域的人c-IAP-1、c-IAP-2或XIAP加到HeLa細胞萃取物中，然后加入1mMdATP和300nM細胞色素c，由此開始caspase活化反應。采用MacFarlane等人描述的熒光分析法測量caspase活性(1997，J.Cell Biol.137，469-479)。按Liu等人所述制備S-100，每份8mg，進行96孔微量滴定，150ml的反應物中含有0.1mM Hepes，pH7.4，2mM DTT，0.1％(w/v)Chaps，和1％(w/v)蔗糖。加入caspase特異性熒光底物(Enzyme Systems，CA)開始反應，終濃度為20mM，反應于37℃下持續(xù)30分鐘。激發(fā)/發(fā)射波長為400/505nm，連續(xù)檢測底物中AFC的釋放。模擬肽和Smac片斷(7R除外)明顯促進procaspase-3的活化。
實施例6復原的，重組的經(jīng)放射標記的procaspase-3的活化試驗在1mM dATP，1mM MgCl2和1ml體外轉(zhuǎn)譯的35S-標記的caspase-3存在下，將模擬肽和N-端Smac肽(30-3000mM)與重組的人Apaf-1(40nM)、重組的人procaspase-9(2nM)、純化的馬心細胞色素c(nM)和小鼠XIAP(70nM)一起溫育，反應終體積為20ml。反應混合物于30℃下溫育1小時，然后在15％PAGE凝膠上進行電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上并照像。采用活性Smac(50nM)和無活性的Smac-7R(3000mM)作為對照。模擬肽和Smac片斷(7R除外)明顯促進procaspase-3的活化。
實施例7經(jīng)復原的重組procaspase-3活化熒光分析如上所述構(gòu)建經(jīng)復原的重組procaspase-3活化體系，只是人caspase-3如Liu等人(1997)所述(同前)通過細菌表達并且不作標記。采用上述MacFarlane等人描述的熒光分析法測量caspase-3活性(1997，J.Cell Biol.137，469-479)。按Liu等人所述制備S-100，每份8mg，進行96孔微量滴定，150ml的反應物中含有0.1mMHepes，PH 7.4，2mM DTT，0.1％(w/v)Chaps，和1％(w/v)蔗糖。加入caspase特異性熒光底物(Enzyme Systems，CA)開始反應，終濃度為20mM，反應于37℃下持續(xù)30分鐘。激發(fā)/發(fā)射波長為400/505nm，連續(xù)檢測底物中AFC的釋放。模擬肽和Smac片斷(7R除外)明顯促進procaspase-3的活化。
實施例8基于細胞的試驗Smac增強了培養(yǎng)HeLa細胞中因UV或依托泊苷所致的細胞凋亡將0.75×105HeLa-S細胞/孔置于48孔組織培養(yǎng)板中。細胞與1mM無活性的Smac肽，或1mM N-端4-氨基酸Smac肽，或模擬肽，或載體(對照)一起溫育12小時。然后利用交聯(lián)儀對細胞施加320,000μJ的UV照射或采用100mM依托泊苷處理細胞。在不同時間點采用1mg/ml Hoechst 33342對細胞染色，對凋亡細胞進行計數(shù)，這種細胞在熒光顯微鏡下細胞核染色體發(fā)生凝聚。模擬肽，包括多種類型的Smac肽在2、4和6小時(UV照射)以及10和20小時(依托泊苷處理)時明顯增加了細胞凋亡。
實施例9體內(nèi)轉(zhuǎn)移試驗將免疫抑制的小鼠(無胸腺的和無毛的/無毛的SCID雌性小鼠，來自HarlanSprague Dawley)置于帶有微型隔離蓋的、高溫滅菌的籠中飼養(yǎng)，將層流罩、手套和飼養(yǎng)籠用ABQ消毒劑擦洗，有關(guān)動物的全部操作均在層流罩中進行。小鼠飼喂經(jīng)滅菌的飼料(Pico Lab Chow，Purina)和滅菌的St.Louis自來水。將模擬肽加到經(jīng)滅菌的含有2％羧甲基纖維素的水中，每日利用滅菌的一次性動物給飼管(Poper&SonsCat#9921；20g×1.5″)灌胃，每周進行7天，時間在上午7:00至8:00。將化合物和對照(含有2％羧甲基纖維素的水)保存在-80℃下，以鋁箔包覆以避免光學所致的性質(zhì)改變，每天在使用前進行解凍。
以對照作比較，測量經(jīng)尾靜脈注射的，劑量為40至100mg/kg的化合物對于C8161細胞轉(zhuǎn)移的抑制活性。劑量為100mg/kg的化合物濃度約為40mg/kg劑量組的2.5倍，使得兩種情況下使用的體積基本相同，約為每只動物0.5mL。在第4天時開始試驗，每組9只動物。在第0天時，將處于冷的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中的2×105個C8161細胞通過胃靜脈接種經(jīng)靜脈注射入小鼠體內(nèi)。試驗進行24天，將動物處死并取出其肺臟，采用Bouins/福爾馬林(5∶1)固定。旋轉(zhuǎn)肺臟，對肺臟表面腫瘤進行計數(shù)，并通過6倍放大鏡對各個肺葉上的腫瘤進行計數(shù)。采用微軟公司的Microsoft′s Excel進行統(tǒng)計分析。
試驗評價了受試模擬肽在兩種濃度下對于C8161細胞轉(zhuǎn)移的抑制活性動物口服模擬肽明顯降低了SCID小鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
實施例10體內(nèi)聯(lián)合治療B.I.D.&Q.I.D采用5-6周齡的無胸腺的和無毛的/無毛的雌性小鼠評價模擬肽(20或80mpl/劑，p.o.or i.p.)和化療藥物紫杉醇(5或20mpk)、5-Fu(50mpk)、長春新堿(1mpk)或環(huán)磷酰胺(100mpk，BID，ip)聯(lián)合用藥對于HTB 177異體移植物(NCI-H460，一種人肺大細胞癌)，用藥為每日2至4次。在第0天時，將3×106個HTB177細胞s.c注射至220只小鼠的肋部，并將小鼠分為治療組和對照組將模擬肽溶解在20％羥丙基-β-環(huán)糊精(載體I)中，模擬肽溶液的給藥體積是0.2ml。將紫杉醇溶解在稀的乙醇/cremophor EL溶液(載體II)中，紫杉醇的i.p給藥體積為0.1ml，環(huán)磷酰胺、5-FU和長春新堿溶解在經(jīng)滅菌的水中。將17ml 20％HPBCD加到含有136mg模擬肽的50ml試管中配制80mpk模擬肽溶液。對混合物作超聲處理直至完全溶解。將2ml 80mpk溶液加到15ml試管中，加入6ml 20％HPBCD并振蕩混合，制備20mpk模擬肽溶液。
在第0天早晨將腫瘤細胞接種于小鼠體內(nèi)，對小鼠稱重，隨機分組并在耳朵上作標記。藥物治療開始于第4天早晨7:30。動物在早晨7:30和下午7:30給藥模擬肽或載體I。在第7和14天測量腫瘤體積，對腫瘤生長作定量。模擬肽和化療藥物均有抑制活性，聯(lián)合給藥的療效要優(yōu)于單獨給藥。
實施例11采用WAP-RAS轉(zhuǎn)基因模型評價療效在WAP-RAS轉(zhuǎn)基因模型中評價了模擬肽和紫杉醇聯(lián)合給藥的效果。在這種模型中，在小鼠體內(nèi)腫瘤發(fā)育完全后再進行治療。
將模擬肽(20mpk/劑，po)溶解于20％羥丙基-β-環(huán)糊精(載體I)中，模擬肽溶液的給藥體積為0.2ml。將紫杉醇溶解在稀的乙醇/cremophor EL溶液(載體II)中，紫杉醇的i.p給藥體積為0.1ml。
在第0天對小鼠稱重，隨機分組并在耳朵上作標記。在第1天給藥模擬肽和載體I，每12小時給藥一次并持續(xù)到第21天。在第4天給藥紫杉醇和載體II，并在第5、6和7天每天給藥。Wap-ras腫瘤對于紫杉醇無反應，但對于單獨給藥20mpk模擬肽有響應，聯(lián)合給藥效果更佳。
本專利說明書中所引用的所有文獻和專利及其參考文獻均作為本發(fā)明的參考文獻，這種情況相當于將這些文獻，專利及其參考文獻一一列出作為參考文獻。盡管為方便理解，以上通過說明和實例描述了本發(fā)明的一些細節(jié)，在本發(fā)明描述的啟發(fā)下，在不背離權(quán)利要求的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以輕易地作出某些改變和改良。
示例性二聚體 R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R7和R7’可相同或不同，包括芳基、雜芳基、芳甲基、雜芳甲基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；Q和Q’可相同或不同，包括O、S、NR1。
R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R7和R7’可相同或不同，包括芳基、雜芳基、芳甲基、雜芳甲基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；Q和Q’可相同或不同，包括O、S、NR1。

R4’可包括 R和R’可相同或不同，包括CH2；CHMe；CHEt；CMe2；1，1-二取代環(huán)丙基R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R3和R3’可相同或不同，包括H、Me、鹵素、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、和雜芳基)、OR5、NR5R6R4可選自R5和R4′R5和R6可包括H、Me、直鏈烷基或任意R7R7＝芳基、雜芳基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、和雜芳基)；R8＝CH2OR5、CH2OC(O)R5、CH2OC(O)NHR5、CO2R5、C(O)NR5R6R9＝H、OR5、NR5R6A、B和Z包括CH、N、C-R7Q＝CH2、CHMe、O、S、NR5X和X′可相同或不同，包括NH、O、CH2Y＝CH2、C(O)、C(S)、CHMeLINKER是一個連續(xù)的鏈，其可包含取代基、雜原子、不飽和(烯烴、炔烴)、環(huán)狀、芳香性和雜芳香性片斷。
此處不作界定，其實施例包括
不對稱連接基團的實例 (Ar可以是1，3或1，4連接的芳環(huán)或雜芳環(huán))O(CH2)nO (CH2)nn＝5-12 n＝6-12截短的連接基團的實例
R4’可包括 R和R’可相同或不同，包括CH2；CHMe；CHEt；CMe2；1，1-二取代環(huán)丙基R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R3和R3’可相同或不同，包括H、Me、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)R4可選自R5和R4′R5和R6可包括H、Me、直鏈烷基或任意R7R7＝芳基、雜芳基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；R8＝CH2OR5、CH2OC(O)R5、CH2OC(O)NHR5、CO2R5、C(O)NR5R6R9＝H、OR5、NR5R6A、B和Z包括CH、N、C-R7Q＝CH2、CHMe、O、S、NR5X和X′可相同或不同，包括NH、O、CH2Y＝CH2、C(O)、C(S)、CHMeLINKER是一個連續(xù)的鏈，其可包含取代基、雜原子、不飽和(烯烴、炔烴)、環(huán)狀、芳香性和雜芳香性片斷。
此處不作界定，其實施例包括
R4’可包括 R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R4可選自R5和R4′R5和R6可包括H、Me、直鏈烷基或任意R7R7＝芳基、雜芳基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；R8＝CH2OR5、CH2OC(O)R5、CH2OC(O)NHR5、CO2R5、C(O)NR5R6R9＝H、OR5、NR5R6A、B和Z包括CH、N、C-R7Q和Q’可相同或不同，包括CH2、CHMe、O、S、NR5X和X′可相同或不同，包括NH、O、CH2Y＝CH2、C(O)、C(S)、CHMeLINKER是一個連續(xù)的鏈，其可包含取代基、雜原子、不飽和(烯烴、炔烴)、環(huán)狀、芳香性和雜芳香性片斷。
此處不作界定，其實施例包括
R4’可包括 R和R’可相同或不同，包括CH2；CHMe；CHEt；CMe2；1，1-二取代環(huán)丙基R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R3和R3’可相同或不同，包括H、Me、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)R4可選自R5和R4′R5和R6可包括H、Me、直鏈烷基或任意R7R7＝芳基、雜芳基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；R8＝CH2OR5、CH2OC(O)R5、CH2OC(O)NHR5、CO2R5、C(O)NR5R6R9＝H、OR5、NR5R6A、B和Z包括CH、N、C-R7Q＝CH2、CHMe、O、S、NR5X和X′可相同或不同，包括NH、O、CH2Y＝CH2、C(O)、C(S)、CHMeLINKER是一個連續(xù)的鏈，其可包含取代基、雜原子、不飽和(烯烴、炔烴)、環(huán)狀、芳香性和雜芳香性片斷。
此處不作界定，其實施例包括
R4’可包括 R和R’可相同或不同，包括CH2；CH(O)；R1和R1’可相同或不同，包括H，Me；R2和R2’可相同或不同，包括Me和Et；R4可選自R5和R4′R5、R5’、R6’和R6可相同或不同，包括H、Me、直鏈烷基或任意R7R7＝芳基、雜芳基、支鏈烷基、環(huán)烷基、官能化的烷基或環(huán)烷基(官能化可包括不飽和、雜原子、芳基、雜芳基)；R8＝CH2OR5、CH2OC(O)R5、CH2OC(O)NHR5、CO2R5、C(O)NR5R6R9＝H、OR5、NR5R6A、B和Z包括CH、N、C-R7Q＝CH2、CHMe、O、S、NR5X和X′可相同或不同，包括NH、O、CH2Y＝CH2、C(O)、C(S)、CHMeLINKER是一個連續(xù)的鏈，其可包含取代基、雜原子、不飽和(烯烴、炔烴)、環(huán)狀、芳香性和雜芳香性片斷。
此處不作界定，其實施例包括 R＝H，烷基，支鏈烷基

示例性單體





實驗過程 (S)-Boc-2-[5-(甲苯-4-磺酰基)-四唑-1-基甲基]-吡咯烷)(1)將對甲苯磺酰氰(5.0g，22.1mmol)和(S)-Boc-2-疊氮基甲基吡咯烷酮3(4.0g，22.1mmol)置于一個密封的管中，混合物于80℃下攪拌反應40小時。利用硅膠閃柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到無色泡沫狀化合物1(7.6g，84％)。[α]D-11.7(c0.64，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CD3OD，-20℃，光學異構(gòu)體64)δ1.20&1.35(s，9H)，1.83&2.01(m，4H)，2.50(s，3H)，3.40&3.45(m，2H)，4.40&4.43(m，1H)，4.71&4.82(m，2H)，7.50&7.70(d，J＝8Hz，2H)，8.00&8.40(d，J＝8Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ22.0，23.7，28.4，46.5，52.1，56.1，76.9，80.6，129.4，134.4，147.4，154.4，154.8，155.5；IR(film)2976，1693，1392，815，704cm-1；MS(ESI)[M+1]+408.2。
(S)-Boc-2-(5-苯基硫烷基-四唑-1′-基甲基)-吡咯烷(2)室溫下將化合物1(6.0g，14.7mmol)、苯硫酚(6.5g，58.8mmol)和K2CO3(4.5g，41.1mmol)和CH3CN(74ml)所構(gòu)成的混合物攪拌反應2天。以硅藻土作助濾劑，將反應混合物過濾，減壓濃縮。利用硅膠柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到無色油狀化合物2(5.2g，97％)。[α]D-29.2(c 1.34，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CD3OD，-20℃，光學異構(gòu)體11)δ1.30&1.42(s，9H)，1.73&2.01(m，4H)，3.40&3.45(m，13.2Hz，2H)，4.23&4.25(m，1H)，4.38&4.58(m，2H)，7.42&7.46(m，3H)7.56&7.60(m，2H)；13CNMR(CDCl3，75MHz)δ21.2，23.6，28.5，46.5，49.7，50.4，56.7，60.5，80.7，128.1，129.9，133.1，153.5，154.9；IR(film)2975，1693，1391，1167，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+361.2(S)-2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷(3)室溫下采用50％TFA的CH2Cl2溶液(69ml)處理化合物2(5.0g，13.8mmol)，反應時間15分鐘。加入飽和NaHCO3中止反應，CH2Cl2萃取(3×20ml)。合并有機相，Na2SO4干燥，過濾，濃縮。利用硅膠閃柱純化粗產(chǎn)品(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝20∶0∶9∶1)得到化合物3(2.5g，69％)。[α]D+9.9(c 1.14，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(m，J＝2Hz，8.4Hz，1H)，1.80(m，2H)，1.95(m，1H)，2.5(bs，1H)，2.99(t，J＝1.6Hz，2H)，3.60(m，1H)，4.20(dd，J＝8.0Hz，13.0Hz，1H)，4.30(dd，J＝8.0Hz，13.0Hz 1H)，7.40(m，3H)，7.58(m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ23.5，28.6，46.1，47.8，58.2，127.2，130.0，130.2，133.1，153.4；IR(film)3350，2961，2871，1442，1389，746，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+262.2。
{1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-氨基甲酸烯丙基酯(4)向由化合物3(2.5g，9.5mmol)、N-Alloc-(炔丙基)蘇氨酸-(2S，3R)(2.7g，11.4mmol)和DMF(48ml)所構(gòu)成的冷溶液中加入DIPEA(3.3ml，19.0mmol)和HATU(5.4g，14.2mmol)。0℃下攪拌反應30分鐘后，加入Et2O稀釋反應液。加入飽和NaHCO3并分相。水相用Et2O萃取(3×30ml)。合并有機相，5％HCl(25ml)，H2O(25ml)，飽和NaHCO3(20ml)和飽和食鹽水(30ml)洗，MgSO4干燥，過濾，減壓濃縮。利用硅膠柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得油狀化合物4(3.2g，70％)。[α]D-12.2(c1.30，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.22(d，J＝6Hz，3H)，1.75-1.90(m，4H)，2.50(t，J＝2.4Hz，1H)，3.70(m，2H)，4.00(m，1H)，4.20(dq，J＝5.6Hz，18.4Hz，2H)，4.31(m，2H)，4.50(m，1H)，4.55(m，2H)，4.62(dd，J＝4.2Hz，1H)，5.20(d，J＝9.6Hz，1H)，5.23(d，J＝10.2Hz，1H)，5.50(d，J＝8Hz，1H)，5.90(m，1H)，7.40(m，3H)，7.60(m，2H)；13CNMR(75MHz，CDCl3)δ16.0，24.3，27.5，47.9，48.5，56.5，56.7，66.1，74.2，74.9，75.0，79.8，117.9，127.6，129.9，130.0，132.7，133.3，153.5，156.4，169.8；IR(film)3292，2979，1715，1644，1513，1442，1073，750，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+485.2。
1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-乙基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(5)向Fmoc-N(Me)L-Ala(6g，18.5mmol)和HOBt(2.5g，18.5mmol)和CH2Cl2(60ml)所構(gòu)成的溶液中加入EDCI(3.5g，18.5mmol)，0℃下攪拌1小時，此后轉(zhuǎn)為室溫繼續(xù)攪拌1小時。室溫下向該反應液中加入Pd(PPh3)4(3.6g，3.0mmol)、化合物4(3g，6.2mmol)的CH2Cl2(30ml)溶液和DABCO(3.7g，31mmol)，繼續(xù)攪拌15分鐘。減壓除去溶劑，利用硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得淺黃色泡沫狀化合物5(3.8g，89％)。[α]D-31.9(c 1.56，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20(d，J＝3.6Hz，3H)，1.41(d，J＝4.2Hz，3H)，1.75-1.98(bm，4H)，2.50(bs，1H)，2.95(s，3H)，3.60(bm，1H)，3.70(bm，1H)，4.01(bm，1H)，4.10(dq J＝5.6Hz，18.1Hz，2H)，4.20(bm，1H)，4.25(bm，1H)，4.28(bm，2H)，4.32(bm，1H)，4.40(bm，2H)，4.59(dd，J＝4.2，8.0Hz，1H)，6.81(bd，1H)，7.28(bm，2H)，7.34(bm，5H)，7.52(br m，4H)，7.72(d，J＝7.6Hz，m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.1，24.3，27.5，47.4，48.5，55.3，56.4，68.2，74.0，75.0，79.8，120.1，125.2，125.3，127.2，127.6，127.9，128.6，129.9，130.1，132.2，132.4，133.3，141.5，153.5，169.3，171.4；IR(film)3297，2978，1693，1650，1442，1400，1312，1157，10948，758，742cm-1；MS(ESI)[M+1]+708.2。
{1-[2-二-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-乙基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(6)化合物5(3.5g，4.9mmol)和Cu(OAc)2(6.2g，34.3mmol)在CH3CN中回流30分鐘。除去有機溶劑，通過硅膠短柱過濾(CH2Cl2/MeOH 9∶1)除去Cu(II)鹽，濾液蒸干后等淺黃色泡沫狀粗品6(3.3g，94％)。取少量粗品精制，供光譜分析使用。[α]D-13.8(c 1.41，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.14(d，J＝6Hz，6H)，1.34(d，J＝7.2Hz，6H)，1.74-1.98(bm，8H)，2.84(s，6H)，3.60(bm，4H)，3.87(bm，2H)，4.09(ABq，J＝16.8Hz，4H)，4.20(bm，2H)，4.24(m，2H)，4.31(bm，4H)，4.36(m，4H)，4.60(dd，J＝4.2Hz，2H)，4.69(dd，J＝4，8.8Hz，2H)，6.80(bm，2H)，7.28(bm，4H)，7.34(bm，10H)，7.52(bm，8H)，7.72(d，J＝7.6Hz，m，4H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.3，24.3，27.5，47.4，48.5，55.3，56.4，68.2，74.0，75.0，79.8，120.1，125.2，125.3，127.2，127.6，127.9，128.6，129.9，130.1，132.2，132.4，133.3，141.5，153.5，169.3，171.4；IR(film)2920，2850，1687，1643，1441，1311，1155，1083，741cm-1；MS(ESI)[M+1]+1412。
二-2-甲基氨基-N-(1-{1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-丙酰胺(7)采用20％CH2Cl2-哌啶(21ml)處理化合物6(3g，2.1mmol)的溶液，時間為5分鐘。減壓濃縮，硅膠柱純化(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝8∶2∶0.5)，得粘性泡沫狀化合物7(1.4g 70％)。[α]D-7.4(c 0.23，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.19(d，J＝6.4Hz，6H)，1.28(d，J＝7.2Hz 6H)，1.78(m，4H)，1.90(m，4H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝7.2Hz，2H)，3.60(bm，2H)，3.70(m，2H)，4.01(m，2H)，4.20(ABq，J＝18.4Hz，4H)，4.43(dd，J＝4.0Hz&13.6Hz，2H)，4.50(m，2H)，4.70(dd，J＝4Hz&13.6Hz，2H)，4.75(dd，J＝4，8.8Hz，2H)，7.40(m，6H)，7.60(m，4H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.2，19.6，22.8，24.4，27.5，31.8，35.2，47.8，48.5，54.6，56.3，56.9，60.4，70.4，74.4，76.1，76.8，127.7，129.9，130.0，133.3，153.6，169.5，175.4；IR(film)3339，2975，1644，1513，1428，1086，751，667cm-1；MS(ESI)[M+1]+969.4。
參考文獻1.Lumma，W.C.；Wohl，Ronald A.Eur.Pat.Appl.1985，EP 134424 A12.Bejjani，J；Chemla，F(xiàn)；Audouin，M.J.Org.Chem，2003，68，9747-9752.
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合成路線1 (S)-(Boc-2-[5-(甲苯-4-磺?；?-四唑-1-基甲基]-吡咯烷)(2)將對甲苯磺酰氰(5.0g，22.1mmol)和(S)-Boc-2-疊氮基甲基吡咯烷酮[Black，J.；Brown，A.D.；Erizabet C.L.；Smith，J.D.；Mckelloy，A.B.2000 JP2000063380](4.0g，22.1mmol)置于一個密封的管中，混合物于80℃下攪拌反應40小時。利用硅膠閃柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到無色泡沫狀化合物1(7.6g，84％)。[α]D-11.7(c0.64，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CD3OD，-20℃，光學異構(gòu)體64)δ1.20&1.35(s，9H)，1.83&2.01(m，4H)，2.50(s，3H)，3.40&3.45(m，2H)，4.40&4.43(m，1H)，4.71&4.82(m，2H)，7.50&7.70(d，J＝8Hz，2H)，8.00&8.40(d，J＝8Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ22.0，23.7，28.4，46.5，52.1，56.1，76.9，80.6，129.4，134.4，147.4，154.4，154.8，155.5；IR(film)2976，1693，1392，815，704cm-1；MS(ESI)[M+1]+408.2。
(S)-Boc-2-(5-苯基硫烷基-四唑-1′-基甲基)-吡咯烷(3a)室溫下將化合物2(6.0g，14.7mmol)，苯硫酚(6.5g，58.8mmol)和K2CO3(4.5g，41.1mmol)和CH3CN(74ml)所構(gòu)成的混合物攪拌反應2天。以硅藻土作助濾劑，將反應混合物過濾，減壓濃縮。利用硅膠柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得到無色油狀化合物2(5.2g，97％)。[α]D-29.2(c 1.34，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CD3OD，-20℃，rotamers 11)δ1.30&1.42(s，9H)，1.73&2.01(m，4H)，3.40&3.45(m，13.2Hz，2H)，4.23&4.25(m，1H)，4.38&4.58(m，2H)，7.42&7.46(m，3H)7.56&7.60(m，2H)；13CNMR(CDCl3，75MHz)δ21.2，23.6，28.5，46.5，49.7，50.4，56.7，60.5，80.7，128.1，129.9，133.1，153.5，154.9；IR(film)2975，1693，1391，1167，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+361.2(S)-2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷(4a)室溫下采用50％TFA的CH2Cl2溶液(69ml)處理化合物3a(5.0g，13.8mmol)，反應時間15分鐘。加入飽和NaHCO3中止反應，CH2Cl2萃取(3×20ml)。合并有機相，Na2SO4干燥，過濾，濃縮。利用硅膠閃柱純化粗產(chǎn)品(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝20∶0∶9∶1)得到化合物3(2.5g，69％)。[α]D+9.9(c 1.14，CHCl3)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(m，J＝2Hz，8.4Hz，1H)，1.80(m，2H)，1.95(m，1H)，2.5(bs，1H)，2.99(t，J＝1.6Hz，2H)，3.60(m，1H)，4.20(dd，J＝8.0Hz，13.0Hz，1H)，4.30(dd，J＝8.0Hz，13.0Hz1H)，7.40(m，3H)，7.58(m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ23.5，28.6，46.1，47.8，58.2，127.2，130.0，130.2，133.1，153.4；IR(film)3350，2961，2871，1442，1389，746，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+262.2。
{1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-氨基甲酸烯丙基酯(5a)向由化合物4a(2.5g，9.5mmol)、化合物9(2.7g，11.4mmol)和DMF(48ml)所構(gòu)成的冷溶液中加入DIPEA(3.3ml，19.0mmol)和HATU(5.4g，14.2mmol)。0℃下攪拌反應30分鐘后，加入Et2O稀釋反應液。加入飽和NaHCO3并分相。水相用Et2O萃取(3×30ml)。合并有機相，用5％HCl(25ml)、H2O(25ml)、飽和NaHCO3(20ml)和飽和食鹽水(30ml)洗滌，MgSO4干燥，過濾，減壓濃縮。利用硅膠柱純化粗產(chǎn)品(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得油狀化合物4(3.2g，70％)。[α]D-12.2(c 1.30，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.22(d，J＝6Hz，3H)，1.75-1.90(m，4H)，2.50(t，J＝2.4Hz，1H)，3.70(m，2H)，4.00(m，1H)，4.20(dq，J＝5.6Hz，18.4Hz，2H)，4.31(m，2H)，4.50(m，1H)，4.55(m，2H)，4.62(dd，J＝4.2Hz，1H)，5.20(d，J＝9.6Hz，1H)，5.23(d，J＝10.2Hz，1H)，5.50(d，J＝8Hz，1H)，5.90(m，1H)，7.40(m，3H)，7.60(m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.0，24.3，27.5，47.9，48.5，56.5，56.7，66.1，74.2，74.9，75.0，79.8，117.9，127.6，129.9，130.0，132.7，133.3，153.5，156.4，169.8；IR(film)3292，2979，1715，1644，1513，1442，1073，750，688cm-1；MS(ESI)[M+1]+485.2。
{1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基--丙基}-乙基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(6a)向Fmoc-N(Me)L-Ala(6g，18.5mmol)和HOBt(2.5g，18.5mmol)和CH2Cl2(60ml)所構(gòu)成的溶液中加入EDCI(3.5g，18.5mmol)，0℃下攪拌1小時，此后轉(zhuǎn)為室溫繼續(xù)攪拌1小時。室溫下向該反應液中加入Pd(PPh3)4(3.6g，3.0mmol)、化合物4(3g，6.2mmol)的CH2Cl2(30ml)溶液和DABCO(3.7g，31mmol)，繼續(xù)攪拌15分鐘。減壓除去溶劑，利用硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得淺黃色泡沫狀化合物5(3.8g，89％)。[α]D-31.9(c 1.56，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20(d，J＝3.6Hz，3H)，1.41(d，J＝4.2Hz，3H)，1.75-1.98(bm，4H)，2.50(bs，1H)，2.95(s，3H)，3.60(bm，1H)，3.70(bm，1H)，4.01(bm，1H)，4.10(dq J＝5.6Hz，18.1Hz，2H)，4.20(bm，1H)，4.25(bm，1H)，4.28(bm，2H)，4.32(bm，1H)，4.40(bm，2H)，4.59(dd，J＝4.2，8.0Hz，1H)，6.81(bd，1H)，7.28(bm，2H)，7.34(bm，5H)，7.52(br m，4H)，7.72(d，J＝7.6Hz，m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.1，24.3，27.5，47.4，48.5，55.3，56.4，68.2，74.0，75.0，79.8，120.1，125.2，125.3，127.2，127.6，127.9，128.6，129.9，130.1，132.2，132.4，133.3，141.5，153.5，169.3，171.4；IR(film)3297，2978，1693，1650，1442，1400，1312，1157，10948，758，742cm-1；MS(ESI)[M+1]+708.2。
{1-[2-二-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-乙基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(7a)化合物6a(3.5g，4.9mmol)和Cu(OAc)2(6.2g，34.3mmol)在CH3CN中回流30分鐘。除去有機溶劑，通過硅膠短柱過濾(CH2Cl2/MeOH 9∶1)除去Cu(II)鹽，濾液蒸干后等淺黃色泡沫狀粗品6(3.3g，94％)。取少量粗品精制，供光譜分析使用。[α]D-13.8(c 1.41，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.14(d，J＝6Hz，6H)，1.34(d，J＝7.2Hz，6H)，1.74-1.98(bm，8H)，2.84(s，6H)，3.60(bm，4H)，3.87(bm，2H)，4.09(ABq，J＝16.8Hz，4H)，4.20(bm，2H)，4.24(m，2H)，4.31(bm，4H)，4.36(m，4H)，4.60(dd，J＝4.2Hz，2H)，4.69(dd，J＝4，8.8Hz，2H)，6.80(bm，2H)，7.28(bm，4H)，7.34(bm，10H)，7.52(bm，8H)，7.72(d，J＝7.6Hz，m，4H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.3，24.3，27.5，47.4，48.5，55.3，56.4，68.2，74.0，75.0，79.8，120.1，125.2，125.3，127.2，127.6，127.9，128.6，129.9，130.1，132.2，132.4，133.3，141.5，153.5，169.3，171.4；IR(film)2920，2850，1687，1643，1441，1311，1155，1083，741cm-1；MS(ESI)[M+1]+1412。
二-2-甲基氨基-N(1-{1-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-炔基氧基-丙基}-丙酰胺(8a)采用20％CH2Cl2-哌啶(21ml)處理化合物7a(3g，2.1mmol)的溶液，時間為5分鐘。減壓濃縮，硅膠柱純化(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝8∶2∶0.5)，得粘性泡沫狀化合物7(1.4g 70％)。[α]D-7.4(c 0.23，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.19(d，J＝6.4Hz，6H)，1.28(d，J＝7.2Hz 6H)，1.78(m，4H)，1.90(m，4H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝7.2Hz，2H)，3.60(bm，2H)，3.70(m，2H)，4.01(m，2H)，4.20(ABq，J＝18.4Hz，4H)，4.43(dd，J＝4.0Hz&13.6Hz，2H)，4.50(m，2H)，4.70(dd，J＝4Hz&13.6Hz，2H)，4.75(dd，J＝4，8.8Hz，2H)，7.40(m，6H)，7.60(m，4H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.2，19.6，22.8，24.4，27.5，31.8，35.2，47.8，48.5，54.6，56.3，56.9，60.4，70.4，74.4，76.1，76.8，127.7，129.9，130.0，133.3，153.6，169.5，175.4；IR(film)3339，2975，1644，1513，1428，1086，751，667cm-1；MS(ESI)[M+1]+969.4。
合成路線2 2-甲氨基-N-{2-(6-{1-甲基-2-(2-甲氨基-丙酰基氨基)-3-氧代-3-[2-(5-苯氧基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-基]-丙氧基}-己-2，4-二炔基氧基)-1-[2-(5-苯氧基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基-丙基]-丙酰胺(8b)。
根據(jù)合成路線2進行8b的合成。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20(d，J＝6.4Hz，6H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)，1.65-2.15(m，8H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝6.8Hz，2H)，3.59(m，2H)，3.75(m，2H)，4.03(m，2H)，4.20(ABq，J＝11.6，16.4Hz，4H)，4.39(m，2H)，4.60(m，4H)，4.67(dd，J＝4.4Hz，8.4Hz，2H)，7.20(m，2H)，7.40(m，8H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)；MS(ESI)[M+1]+937.5。
合成路線3 N-(1-[2-(5-芐氧基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-{6-[3-[2-(5-芐氧基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-基]-1-甲基-2-(2-甲基氨基-丙?；被?-3-氧代-丙氧基]-己-2，4-二炔基氧基}-丙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(8c)。
根據(jù)合成路線3進行8c的合成。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20(d，J＝6.4Hz，6H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)，1.60(m，4H)，1.81(m，4H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝6.8Hz，2H)，3.51(m，4H)，3.68(m，4H)，4.03(m，2H)，4.16(m，6H)，4.36(dd，J＝4.4，14.4Hz 2H)，4.47(m，2H)，4.67(dd，J＝4.4，8.4Hz，2H)，5.52(ABq，J＝11.6，16.4Hz，4H)，7.37(m，6H)，7.48(m，4H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)；MS(ESI)[M/2]+482.4。
合成路線4 N-(1-[2-(5-芐基氨基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-羰基]-2-{6-[3-[2-(5-芐基氨基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-基]-1-甲基-2-(2-甲基氨基-丙?；被?-3-氧代-丙氧基]-己-2，4-二炔基氧基}-丙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(8d)。
根據(jù)合成路線4進行8d的合成。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.15(d，J＝6.4Hz，6H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)，1.85-2.20(m，8H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝6.8Hz，2H)，3.60(bm，2H)，3.79(m，2H)，3.96-4.40(m，14H)，4.64(dd，J＝8.8，14.8Hz，2H)，4.73(dd，J＝3.2，8.8Hz，2H)，6.81(t，J＝6.0Hz，2H)，7.22(m，6H)，7.39(m，4H)，7.84(d，J＝8.8Hz，2H)；MS(ESI)[M/2+Na]+485.4。
合成路線5 二-N-(1-{2-[5-芐基甲基氨基]-四唑-1-基甲基}-吡咯烷-1-羰基)-2-丙-2-炔基氧基-丙基)-2-甲基氨基-丙酰胺(8e)。
根據(jù)合成路線5進行8e的合成。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.15(d，J＝6.4Hz，6H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)，1.79-2.15(m，8H)，2.50(s，6H)，3.05(q，J＝6.8Hz，2H)，3.15(s，6H)，3.60(bm，4H)，3.99(m，2H)，4.10(m，6H)，4.41(m，2H)，4.51(m，4H)，4.71(m 4H)，7.25(m，10H)，7.80(d，J＝8.8Hz，2H)；MS(ESI)[M+Na]+1013.5。
合成路線6 (2S，4R)-2-叔丁基-4-(3-氯-芐基)-噁唑烷-3，4-二羧酸3-叔丁基酯4-甲基酯(11)N2保護，于-78℃下向化合物10[1.Cagnon，J.；Bideau，F(xiàn).；Marchand-Brynaert，J.；Ghosez，L.Tetrahedron Lett.，1997，38，2291；2.Seebach，D.；Aebi，J.D.Tetrahedron Lett.1984，25(24)，2545-2548；3.Seebach，V.D.；Aebi，J.；Gander-Coquoz，M.；Naef，R.，Helvetica Chimica Acta，1987，70，1194-1216](1.0mmol)、3-氯芐溴(1.2mmol)和THF-HMPA(4∶1，10mL)所構(gòu)成的溶液中滴加LHMDS(1.2mmol)的THF溶液，耗時30分鐘。滴加完畢后于同一溫度(-78℃)下攪拌反應30分鐘。加入飽和NH4Cl(5mL)中止反應，反應液升溫至室溫。水相用Et2O萃取(3×20mL)，合并有機相，用H2O(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，MgSO4干燥，過濾，減壓濃縮?；衔?1的粗品不經(jīng)純化直接用于下一步反應。取少量粗品，硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝20∶1)，用于光譜分析。[α]D-67.3(c 1.02，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.74(d，J＝13.2Hz，1H)，3.05(d，J＝13.2Hz，1H)，3.57(dd，J＝1.5，10.8Hz，1H)，3.73(s，3H)，3.87(d，J＝10.8Hz，1H)，7.00(m，1H)，7.12(m，1H)，7.20-7.25(m，2H)；13C NMR(CDCl3，75MHz)δ26.8，28.3，38.5，39.5，52.6，69.4，73.8，81.5，97.6，127.1，128.4，129.5，130.4，134.0，138.1，153.0，172.0；IR(film)2976，1743，1711，1359，1136cm-1；Mass(ESI)412.19([MH]+)。
(R)-2-氨基-2-(3-氯-芐基)-3-羥基-丙酸甲基酯(12)N2保護，向化合物11的粗品(1mmol)和無水MeOH(5mL)所構(gòu)成的溶液中滴加濃HCl(2mL)，耗時1小時，此后攪拌反應過夜。除去溶劑后，0℃下用NaHCO3將殘余物堿化。CH2Cl2(5×20mL)萃取，合并有機相，MgSO4干燥，過濾并濃縮。硅膠柱純化.(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝500∶9∶1-100∶9∶1)，得化合物(95％，以化合物10為計)。[α]D-3.6(c 1.45，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.75(d，J＝13Hz，1H)，3.05(d，J＝13Hz，1H)，3.56(d，J＝10Hz，1H)，3.73(s，3H)，3.87(d，J＝10Hz，1H)，7.02(m，1H)，7.13(m，1H)，7.22-7.27(m，2H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ41.5，52.4，63.6，67.7，127.4，128.0，129.8，129.9，134.3，137.5，175.3；IR(film)3359，3300，3180，1736，1083cm-1；Mass(ESI)244.02([MH]+)。
(2S，1′R)1-Fmoc-2-[2′-(3″-氯-苯基)-1′-羥基甲基-1′-甲氧基羰基-乙基氨甲?；鵠-吡咯烷(13)N2保護，向Fmoc-Pro-OH(1.0mmol)、氨基醇12(1.0mmol)和CH3CN(10mL)所構(gòu)成的溶液中加入DMT-MM(1mmol)，攪拌反應3小時。將反應液濃縮至原體積的一半。殘余物用Et2O(30mL)稀釋，用5％HCl(20mL)、H2O(20mL)、5％NaOH(20mL)、H2O(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，MgSO4干燥，過濾并濃縮。殘余物不經(jīng)純化直接用于下一步反應。[α]D-41.8(c 1.75，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.82-1.94(m，2H)，2.06-2.30(m，2H)，3.02(d，J＝13.4Hz，1H)，3.44-3.58(m，3H)，3.64(d，J＝13.4Hz，1H)，3.77(s，3H)，3.84(t，J＝10.1Hz，1H)，4.18-4.49(m，5H)，6.89(d，J＝6.6Hz，1H)，7.05(s，2H)，7.16(m，2H)，7.30(t，J＝7.3Hz，2H)，7.39(t，J＝7.3Hz，2H)，7.56(d，J＝7.6Hz，2H)，7.75(d，J＝7.6Hz，2H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ24.4，29.3，36.2，46.9，52.9，62.0，64.0，67.6，68.0，119.9，124.9，125.0，127.0，127.5，127.7，129.4，129.7，133.9，137.5，141.1，141.2，143.4，143.8，156.1，171.4，172.0；IR(film)3392，1741，1682，1418，758cm-1；Mass(ESI)585.10([MNa]+)。
(4R，2′S-4-(3″-氯-芐基)-2-[1′-Fmoc-吡咯烷-2′-基]-4，5-二氫-噁唑-4-羧酸甲基酯(14)N2保護，向冷的(-78℃)化合物13(1.0mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中滴加DAST(1.2mmol)，耗時10分鐘，此后于-78℃下攪拌反應1小時。加入K2CO3(1.5mmol)，反應液升溫至室溫。反應液用飽和NaHCO3(10mL)稀釋，Et2O(3×20mL)萃取。合并有機相，H2O(10mL)飽和食鹽水(10mL)洗，過濾，減壓濃縮。硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝2∶1)，得白色產(chǎn)物14(72％，以化合物14為計)。[α]D-61.6(c 1.90，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，300MHz，光學異構(gòu)體的混合物)δ1.77-2.21(m，4H)，3.07和3.14(ABq，J＝13.7/13.7Hz，2H)，3.44-3.72(m，2H)，3.56和3.70(s，3H)，4.03-4.62(m，6H)，6.98-7.24(m，4H)，7.30(t，J＝7.3Hz，2H)，7.39(t，J＝7.3Hz，2H)，7.61(m，2H)，7.75(dd，J＝5.1，7.3Hz，2H)；13C NMR(CDCl3，75MHz，光學異構(gòu)體的混合物r)δ23.4和24.4，30.3和31.4，42.6和43.0，46.6和47.0，47.1和47.3，52.6和52.6，54.3和54.8，67.3和67.5，73.3和73.3，77.8和78.0，119.9，125.0和125.1，125.1和125.2，127.0和127.0，127.2和127.3，127.6，128.5，129.5和129.5，130.4和130.5，133.9和134.0，136.9和137.2，141.1和141.2，141.2，141.2，143.8和143.9，144.0和144.2，154.4和154.6，169.2和169.6，172.7和172.8；IR(film)2952，1735，1705，1417cm-1；Mass(ESI)567.15([MNa]+)。
(2S，3S)-1-Alloc-3-甲基-吖丙啶-2-羧酸甲基酯N2保護，0℃下向已知化合物(2S，3S)-3-甲基-1-三苯甲游基-吖丙啶-2-甲酸甲酯[1.Mckeever，B.；Pattenden，G.Tetrahedron，2003，59，2713-2727；2.Wipf，P.；Uto，Y.，J.Org.Chem.，2000，65，1037-1049](20g，56mmol)、CH2Cl2(100mL)和MeOH(2.3mL)所構(gòu)成的溶液中加入TFA(8.6mL，112mmol)，攪拌反應1小時。減壓除去溶劑，將固體殘余物溶于Et2O，再除去溶劑，重復操作2次，將TFA完全除去。將固體殘余物溶于Et2O，H2O萃取(5×30mL)。合并水相，0℃下分批小心加入NaHCO3，此后加入EtOAc(56mL)，0℃下滴加氯甲酸烯丙酯(8.9mL，84mmol)，此后于室溫下攪拌反應16小時。EtOAc(3×100mL)萃取，合并有機相，H2O(50mL)和飽和食鹽水(50mL)洗，MgSO4干燥，過濾并濃縮。柱色譜純化(己烷∶EtOAc＝10∶1)得產(chǎn)物(59％)。[α]D-81.7(c 1.02，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.36(d，J＝5.7Hz，3H)，2.83(dq，J＝5.7，6.7Hz，1H)，3.19(d，J＝6.7Hz，1H)，3.79(s，3H)，4.61(m，2H)，5.26(dd，J＝1.2，10.4Hz，1H)，5.33(dd，J＝1.5，17.2Hz，1H)，5.91(ddt，J＝5.7，10.4，17.2Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，75MHz)δ12.8，38.8，39.7，52.3，67.3，118.8，131.5，161.3，167.5；IR(film)1733，1296，1282，1204cm-1；Mass(ESI)200.10([MH]+)。
(2S，3R)-2-Alloc-氨基-3-丙-2′-炔基氧基-丁酸甲基酯N2保護，室溫下向上述產(chǎn)物(3.2g，16mmol)和炔丙醇(186mL)所構(gòu)成的溶液中加入BF3·Et2O(4.1mL，32mmol)，攪拌反應1小時。減壓濃縮，殘余物溶于水(50mL)中，Et2O(3×40mL)萃取。合并有機相，H2O(30mL)和飽和食鹽水(30mL)洗，MgSO4干燥，過濾并濃縮。柱色譜純化(己烷∶EtOAc＝10∶1)，得炔丙基蘇氨酸衍生物(95％)。[α]D6.9(c 1.53，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.24(d，J＝6.2Hz，3H)，2.41(t，J＝2.4Hz，1H)，3.77(s，3H)，4.12(qd，J＝2.4，16.1Hz，2H)，4.31(m，1H)，4.36(dd，J＝2.2，9.5Hz，1H)，4.60(d，J＝5.5Hz，2H)，5.22(dd，J＝1.1，10.4Hz，1H)，5.33(dd，J＝1.5，17.2Hz，1H)，5.43(br d，J＝9.3Hz，1H)，5.93(ddt，J＝5.5，10.8，17.2Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，75MHz)δ15.9，52.4，56.0，58.5，65.9，73.8，74.4，79.2，117.7，132.6，156.5，171.0；IR(film)3292，1750，1724，1517，1212，1075cm-1；Mass(ESI)256.17([MH]+)。
(2S，3R)-2-Alloc-1氨基-3-丙-2′-炔基氧基-丁酸(9)N2保護，將以上化合物(1g，3.9mmol)，0.26N HCl(15mL)和AcOH(45mL)所構(gòu)成的溶液回流20小時。將反應液濃縮，短柱分離(己烷∶EtOAc＝1∶1)，得產(chǎn)物9(95％)。[α]D-1.6(c 0.99，CHCl3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.27(d，J＝6.4Hz，3H)，2.45(t，J＝2.2Hz，1H)，4.17(qd，J＝2.2，15.9Hz，2H)，4.34(m，1H)，4.41(d，J＝9.2Hz，1H)，4.60(d，J＝5.5Hz，2H)，5.23(d，J＝10.7Hz，1H)，5.32(d，J＝17.2Hz，1H)，5.47(br d，J＝9.2Hz，1H)，5.92(ddt，J＝5.5，10.7，17.2Hz，1H)；13C NMR(CDCl3，75MHz)δ16.3，56.5，58.7，66.3，74.2，75.2，79.2，118.1，132.7，156.9，175.8；IR(film)3293，1717，1522，1076cm-1；Mass(ESI)242.04([MH]+)。
(4R，2′S)-2-[1′-Alloc-Thr(炔丙基)-吡咯烷-2′-基]-4-(3″-氯-芐基)-4，5-二氫-噁唑-4-羧酸甲基酯(15)采用20％哌啶-CH2Cl2(10mL)處理化合物14(634mg，1.16mmol)。將反應液濃縮，短柱分離(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝200∶9∶1)。產(chǎn)物溶于DMF，0℃下加入化合物9(309mg，1.28mmol)、DIPEA(404μL，2.32mmol)和HATU(487mg，1.28mmol)，攪拌反應30分鐘。反應液用Et2O稀釋，加入飽和NaHCO3。水相用Et2O萃取，合并有機相，H2O(30mL)和飽和食鹽水(30mL)洗，MgSO4干燥，過濾并濃縮。柱色譜純化(己烷∶EtOAc＝10∶1)，得化合物15(55％)。1H NMR(CDCl3，400MHz，光學異構(gòu)體的混合物)δ1.20和1.24(d，J＝6.2/6.2Hz，3H)，1.83-2.24(m，4H)，2.40和2.43(t，J＝2.4/2.4Hz，1H)，3.11和3.27(ABq，J＝13.7/13，9Hz，2H)，3.72-3.75(s，3H)，3.50-4.97(m，13H)，5.20-5.30(m，2H)，5.68和5.78(d，J＝8.2/8.4Hz，1H)，5.90(m，1H)，7.08(m，1H)，7.17-7.25(m，3H)；Mass(ESI)546.15([MH]+)，568.10([MNa]+)
(4R，2′S)-2-[1′-Fmoc-Ala-Thr(炔丙基)-吡咯烷-2′-基]-4-(3″-氯-芐基)-4，5-二氫-噁唑-4-羧酸甲基酯(16)N2保護，0℃下向Fmoc-Ala-OH(633mg，1.9mmol)，HOBt(305mg，1.9mmol)和CH2Cl2(40mL)所構(gòu)成的溶液中加入EDCI(369mg，1.9mmol)，0℃下攪拌反應1小時，此后轉(zhuǎn)為室溫攪拌反應1小時。向反應液中加入Pd(PPh3)4(295mg，0.26mmol)，化合物15(350mg，0.64mmol)的溶液和DABCO(359mg，3.2mmol)，攪拌反應20分鐘。減壓濃縮，硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝1∶1-1∶9)，得化合物16(99％)。1HNMR(CDCl3，400MHz，光學異構(gòu)體的混合物)δ1.17和1.22(d，J＝6.4/64Hz，3H)，1.40(br d，J＝7.7Hz，3H)，1.81-2.16(m，4H)，2.31and 2.38(t，J＝2.4/2.4Hz，1H)，3.10和3.24(ABq，J＝13.9/13.9Hz，2H)，3.72和3.74(s，3H)，3.70-5.00(m，9H)，5.36(m，1H)，6.75(d，J＝7.3Hz，1H)，7.05-7.70(m，10H)，7.76(d，J＝7.5Hz，2H)；Mass(ESI)755.15([MH]+)。
化合物17a氧氣氛下將化合物18(34mg，0.045mmol)，CuI(8.6mg，0.045mmol)，吡啶(11μL，0.135mmol)和THF(0.45mL)所構(gòu)成的混合物攪拌反應20小時。反應液用10％甘氨酸水溶液稀釋，CH2Cl2萃取(5×5mL)。合并有機相，MgSO4干燥，過濾并濃縮。殘余物用20％哌啶-DMF處理10分鐘。反應液濃縮，制備TLC純化(CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH＝100∶9∶1)，得化合物17a(46％，以化合物18為計)。1H NMR(CDCl3，400MHz，20具有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，僅顯示了主要的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)δ1.21(d，J＝6.2Hz，6H)，1.36(d，J＝7.0Hz，6H)，1.80-2.12(m，8H)，3.11(ABq，J＝13.7Hz，4H)，3.48-3.96(m)，4.15(d，J＝9.2Hz，2H)，4.30(q，J＝16.5Hz，4H)，4.58(d，J＝9.2Hz 2H)，4.61-4.93(m)，7.06-7.10 8(m，2H)，7.17-7.24(m，6H)，7.94(d，J＝8.4Hz，2H)；Mass(ESI)532.38([[M+/2]H]+)，1063.61([MH]+)。
按以上相同方法合成N-Me二聚體(R＝Me，17b)。
1H NMR(CDCl3，400MHz，17b含有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)δ1.19和1.22(d，J＝6.2/6.4Hz，6H)，1.29和1.31(d，J＝6.6/6.8Hz，6H)，1.80-2.12(m，8H)，2.40和2.42(s，6H)，3.10和3.28(ABq，J＝13.6/13.8Hz，4H)，3.72和3.74(s，6H)，3.71-3.96(m，6H)，4.14和4.28(ABq中的A，J＝9.2/9.0Hz，2H)，4.31(ABq，J＝16.3Hz，2H)，4.58和4.62(ABq中的B，J＝9.2/9.0Hz，2H)，4.66-4.94(m，2H)，7.06-7.10(m，2H)，7.18-7.25(m，6H)，7.80(d，J＝8.4Hz，2H)；Mass(ESI)546.85([[M+/2]H]+)，1113.35([MNa]+)。
合成路線7 [5-(3，5-二碘-苯基氨甲?；?-戊基]-氨基甲酸-2-三甲基硅烷基-乙基酯(21)向3，5-二碘苯胺[Dininno，F(xiàn).；Guthikonda，R.N.；Schmitt，S.M.1994 US5292879 A](1g，2.90mmol)，6-(2-三甲硅基乙氧羰基氨基)-己酸(1g，3.77mmol)和DMF(12ml)所構(gòu)成的反應液中加入DIPEA(0.9ml，5.8mmol)和HATU(1.65g，4.35mmol)。室溫攪拌反應過夜。反應液用Et2O稀釋，加入飽和NaHCO3，分相，水相用Et2O萃取(3×40ml)。合并有機相，5％HCl(30ml)，H2O(50ml)，飽和NaHCO3(30ml)和飽和食鹽水(30ml)洗，MgSO4干燥，過濾并減壓濃縮。硅膠柱純化(己烷∶EtOAc＝6∶4)，得化合物21(1g，59％)，為無色粉末狀物。1H NMR(300MHz，(CD3)2SO)δ0.09(S，9H)，0.84(t，J＝2.1Hz，2H)，1.34(m，2H)，1.40(m，2H)，1.50(m，2H)，2.41(t，J＝1.8Hz，2H)，2.47(m，2H)，2.89(m，2H)，4.01(t，2H)，6.92(bt，1H)，7.68(m，1H)，7.99(m，2H)；13C NMR(75MHz，(CD3)2SO)δ-0.72，18.0，25.2，26.4，29.9，36.9，61.9，96.4，127.0，139.0，142.3，156.9，172.2；IR(film)3326，2853，2361，1687，1541，1450，1249，837cm-1；MS(ESI))[M+Na]+624.96.咪唑-6-基]-丁酰基氨基)-己酸(3，5-二碘-苯基)-酰胺(22a)用50％TFA-CH2Cl2(4ml)處理化合物21(0.37g，0.61mmol)，反應1小時。除去溶劑得粗產(chǎn)品，不經(jīng)分離直接用于下一步反應。
向這種鹽(0.34g，0.59mmol)、(+)-生物素(0.18g，0.76mmol)和DMF(4ml)所構(gòu)成的反應液中加入DIPEA(0.3ml，1.7mmol)和HATU(0.33g，0.88mmol)。室溫攪拌反應過夜。減壓濃縮，硅膠柱純化(MeOH∶CHCl3∶NH4OH＝1∶9∶0.1)，得到片狀化合物22a(0.3g，84％)。[α]D+16(c 1，DMF).1H NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ1.25-1.60(m，12H)，1.95(t，J＝1.8Hz，2H)，2.27(m，2H)，2.89(m，2H)，3.01(m，2H)，3.15(m，4H)，3.61(m，2H)，4.15(m，1H)，4.25(m，1H)，6.40(d，1H)，7.60(s，1H)，8.00(s，2H)；13C NMR(75MHz，(CD3)2SO)25.2，26.0，26.6，28.6，28.8，29.6，35.8，36.9，38.7，42.4，54.0，56.1，59.7，96.4，126.9，139.0，142.2；IR(film)3296，2930，1675，1571，1201，719cm-1；MS(ESI)[M+Na]+707。
6-[4-(2-氧代-六氫-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-丁?；被鵠-己酸(3，5-二-(3-{1-甲基-2-(1-甲基氨基-乙基氨基)-3-氧代-3-[2-(5-苯基硫烷基-四唑-1-基甲基)-吡咯烷-1-基]-丙氧基}-丙-1-炔基)-苯基)-酰胺(24a)向22a(0.026g，0.039mmol)和23a(0.038g，0.078mmol)的DMF溶液中加入PdCl2(PPh3)2(2.7mg，10mol％)、Cul(1.1mg，16mol％)和Et3N(27μl，0.19mmol)。室溫攪拌反應5小時。除去溶劑，制備TLC純化(CHCl3∶MeOH∶NH4OH＝8∶2∶0.4)，得目標化合物24a，產(chǎn)率60％。[α]D+10(c 1，CHCl3).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.09(d，J＝8.4Hz，6H)，1.11(d，J＝6.8Hz，6H)，1.45-1.81(m，20H)，1.97(t，J＝7.6Hz，2H)，2.13(dd，J＝4.4，12Hz，2H)，2.21(s，6H)，2.53(d，J＝12.8Hz，1H)，2.89(m，5H)，3.40(m，2H)，3.42-3.60(m，4H)，3.95(m，2H)，4.15(m，2H)，4.19(ABq，J＝19.0Hz，4H)，4.37(m，2H)，4.45(dd，J＝4.8，14Hz，2H)，4.57(bd，2H)，6.95(s，1H)，7.22(m，6H)，7.38(m，4H)，7.78(s，2H)；13CNMR(75MHz，CDCl3)16.1，19.6，24.3，24.9，25.5，26.2，27.5，27.7，29.1，35.2，37.1，39.2，40.9，47.8，48.8，54.9，55.7，56.2，56.8，60.3，61.9，73.5，84.8，85.9，93.8，122.1，127.6，128.8，130.0，133.5，135.1，139.8，163.9，169.7，173.4，185.6；I.R3307，2931，1651，1430，1087，667cm-1；MS(ESI)[M+1]+1399.9。
合成路線8 化合物33a根據(jù)合成路線8合成33a。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.18(d，J＝6.2Hz，3H)，1.23(d，J＝6.3Hz，3H)，1.31(d，J＝7.0Hz，3H)，1.32(d，J＝7.0Hz，3H)，1.75-2.00(m，8H)，2.40(s，3H)，2.43(s，3H)，3.07(q，J＝7.0Hz，1H)，3.12(q，J＝7.0Hz，1H)，3.40-3.78(m，7H)，3，97(dq，J＝4.8，6.2Hz，1H)，4.06(dq，J＝4.4，6.2Hz，1H)，4.21-4.48(m，5H)，4.68(dd，J＝4.0，13.4Hz，1H)，4.75(dd，J＝4.4，8.8Hz，1H)，7.40(m，3H)，7.62(m，2H)，7.81(bd，J＝8.6Hz，1H)，7.88(bd，J＝8.6Hz，1H)；Mass(ESI)[MNa]+801.35。
合成路線9 aR1＝Me，R2＝H，Z＝SPh kR1＝H，R2＝Me，Z＝SPhbR1＝Me，R2＝H，Z＝OPh lR1＝H，R2＝Me，Z＝OPhcR1＝Me，R2＝H，Z＝OBn mR1＝H，R2＝Me，Z＝OBndR1＝Me，R2＝H，Z＝NHBn nR1＝H，R2＝Me，Z＝NHBneR1＝Me，R2＝H，Z＝NMeBn oR1＝H，R2＝Me，Z＝NMeBnfR1＝H，R2＝H，Z＝SPh pR1＝Me，R2＝Me，Z＝SPhgR1＝H，R2＝H，Z＝OPh qR1＝Me，R2＝Me，Z＝OPhhR1＝H，R2＝H，Z＝OBn rR1＝Me，R2＝Me，Z＝OBniR1＝H，R2＝H，Z＝NHBn sR1＝Me，R2＝Me，Z＝NHBnjR1＝H，R2＝H，Z＝NMeBntR1＝Me，R2＝Me，Z＝NMeBn按6a-e相同方法合成6f-t。
合成路線10 bRI＝Me，R2＝H，X＝m-Cl kR1＝H，R2＝Me，X＝m-ClfR1＝Me，R2＝H，X＝o-Cl lR1＝H，R2＝Me，X＝o-ClcR1＝Me，R2＝H，X＝o-Cl mR1＝H，R2＝Me，X＝p-CldR1＝Me，R2＝H，X＝H nR1＝H，R2＝Me，X＝HeR1＝Me，R2＝H，X＝p-F oR1＝H，R2＝Me，X＝p-FaR1＝H，R2＝H，X＝m-Cl pR1＝Me，R2＝Me，X＝m-ClgR1＝H，R2＝H，X＝o-Cl qR1＝Me，R2＝Me，X＝o-ClhR1＝H，R2＝H，X＝p-Cl rR1＝Me，R2＝Me，X＝p-CliR1＝H，R2＝H，X＝HsR1＝Me，R2＝Me，X＝HjR1＝H，R2＝H，X＝p-F tR1＝Me，R2＝Me，X＝p-F按16a，b相同方法合成16c-t。
合成路線11 按31a相同方法合成31b-d。
合成路線12 6a-t或16a-t和6a-t或16a-t或31a-d所構(gòu)成的所有均二聚體和交叉二聚體均包括在內(nèi)。
按8a-e相同方法合成18。
合成路線13 6′a-t或16′a-t和6′a-t或16′a-t或31′a-d所構(gòu)成的所有均二聚體和交叉二聚體均包括在內(nèi)。
6′a-t、16′a-t和31′a-d是由6a-t或16a-t或31a-d通過哌啶處理制得的。
按24a相同方法合成19。
合成路線14 化合物40[Freskos，J.N.Synthotic Communications(1994).24(4).557-63] 42a-t和42a-t所構(gòu)成的所有均二聚體和交叉二聚體均包括在內(nèi)。
以Et2O作溶劑，在Ag2O存在下將42a-t與炔丙基二溴反應，由此制備化合物60。
合成路線15 aR1＝Me，R2＝H，Z＝SPh kR1＝H，R2＝Me，Z＝SPhbR1＝Me，R2＝H，Z＝OPh lR1＝H，R2＝Me，Z＝OPhcR1＝Me，R2＝H，Z＝OBn mR1＝H，R2＝Me，Z＝OBndR1＝Me，R2＝H，Z＝NHBn nR1＝H，R2＝Me，Z＝NHBnoR1＝Me，R2＝H，Z＝NMeBn oR1＝H，R2＝Me，Z＝NMeBnfR1＝H，R2＝H，Z＝SPh pR1＝Me，R2＝Me，Z＝SPhgR1＝H，R2＝H，Z＝OPh qR1＝Me，R2＝Me，Z＝OPhhR1＝H，R2＝H，Z＝OBn rR1＝Me，R2＝Me，Z＝OBniR1＝H．R2＝H，Z＝NHBn sR1＝Me，R2＝Me，Z＝NHBnjR1＝H．R2＝H，Z＝NMeBntR1＝Me，R2＝Me，Z＝NMeBn按化合物60相同方法，以Et2O作溶劑，在Ag2O存在下與炔丙基溴反應，經(jīng)標準后處理后制備化合物43a-t。
合成路線16 R1，R2，R1′，R2′＝H or MeZ，Z′＝SPh，NHBn，NMeBn，Oph，OBn43a-t和43a-t所構(gòu)成的所有均二聚體和交叉二聚體均包括在內(nèi)。按上述化合物18相同方法，采用Cu(OAc)2和CH3CN合成化合物61。
合成路線17 43a-t和6a-t或16a-t或31a-d所構(gòu)成的所有均二聚體和交叉二聚體均包括在內(nèi)。
按上述化合物18相同方法，采用Cu(OAc)2在CH3CN中合成化合物62。
權(quán)利要求
1.一種由式II所代表的二聚化合物或其藥學可接受的鹽 式II其中R1和R1’選自氫原子，任選取代的甲基，和羥基；R2和R2’選自任選取代的甲基和任選取代的乙基；R3和R3’選自CH2、NH、O和S；R4和R4’選自CH和N；R5-R8以及R5’-R8’選自氫原子，任選雜的、任選取代的烷基，任選雜的、任選取代的鏈烯基，任選雜的、任選取代的炔基，任選雜的、任選取代的芳基，以及L為將R2、R5、R6或R7和R2’、R5’、R6’或R7’共價連接的連接基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1和R1’選自氫原子和甲基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2和R2’選自甲基和乙基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R3和R3’為NH。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4和R4’為CH。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R5和R5’為C1-C3烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1和R1’選自氫原子和甲基；R2和R2’選自甲基和乙基；R3和R3’為NH；R4為CH；R5和R5’為C1-C3烷基；以及L將R5、R6或R7與R5’、R6’或R7’共價連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R6/R6’和R7/R7’或者R7/R7’或R8/R8’相互連接構(gòu)成5至8元環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R7和R8連接構(gòu)成5或6元環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R6和R7連接構(gòu)成5或6元環(huán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R6和R7連接構(gòu)成5元環(huán)；而L將該環(huán)與R2’、R5’、R6’或R7’共價連接。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R8包含5或6元環(huán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R8包含5元環(huán)，其中包含至少一個雜原子、至少一個取代基、以及至少一個不飽和基團。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1/R1’和R2/R2’連接構(gòu)成5元環(huán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中L是一個連續(xù)的鏈，其中含有4至100個原子，分子量在40至1kD之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中L是一個任選雜的、任選取代的二炔基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中L被質(zhì)子化或烷基化的胺基取代，其中該化合物是一種三胺。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述二聚體相對于所述連接基團是對稱的。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述二聚體是對稱的。
20.一種藥用組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物以及藥學可接受的賦形劑。
21.一種藥用組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物、藥學可接受的賦形劑、以及共同包裝的描述了該組合物在治療與caspase活性異常有關(guān)的疾病中的使用說明。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥用組合物，其包含單位劑量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物。
23.一種治療與caspase活性異常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括以下步驟給藥有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，以及檢測由此所致的與所述疾病有關(guān)的病理學的改善。
24.一種治療與caspase活性異常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括以下步驟給藥有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，以及檢測由此所致的與所述疾病有關(guān)的病理學的改善，其中所述疾病為炎癥或新增殖性疾病。
25.一種抑制caspase的方法，該方法包括以下步驟將含有caspase的組合物和有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物進行接觸，以及檢測所得的caspase活性降低。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性的二聚Smac模擬肽，其通式為M1－L－M2，其中片斷M1和M2為Smac模擬肽單體，L為使活性二聚體中的M1和M2共價連接的連接基團，該二聚模擬肽可促進Caspase活性和凋亡。目標癌癥或者炎癥細胞與有效量的所述活性二聚Smac模擬肽接觸，并檢測到目標細胞的凋亡增加。該接觸步驟可通過給藥包含治療有效量的所述二聚模擬肽的藥物組合物來實施，其中患者可同時或者在此之前接受放射或者化療以治療新增殖性疾病。
文檔編號C07D263/08GK1926118SQ200580006695
公開日2007年3月7日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者帕特里克·G.·哈蘭, 王曉東, 耶夫·K.·德布拉班德爾, 李林, 拉恩尼·馬修·托馬斯, 鈴木秀孝 申請人:德克薩斯大學董事會