專利名稱：抗凝劑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的抗凝劑化合物，含有所述化合物作為活性成分的藥物組合物，以及所述化合物用于制備藥物的用途。
急性心肌梗塞，局部缺血和中風(fēng)都是由動脈粥樣硬化冠狀動脈中形成閉塞血栓引起的。動脈血栓由血小板(凝血細胞)與(增加水平的)纖維蛋白原聚集而形成。該過程與其中纖維蛋白原裂解成纖維蛋白凝塊的凝結(jié)系統(tǒng)的激發(fā)態(tài)和失調(diào)有關(guān)。在(動脈)血栓形成治療中必需介入這些主要的和從屬的途徑之一。
絲氨酸蛋白酶是在血液凝固級聯(lián)中起著重要作用的酶。這組蛋白酶成員是例如凝血酶，胰蛋白酶，因子VIIa，IXa，Xa，XIa，XIIa，和蛋白質(zhì)C。凝血酶是凝固級聯(lián)中最后的絲氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是纖維蛋白原裂解產(chǎn)生纖維蛋白單體，其交聯(lián)形成不溶性凝膠。另外，凝血酶通過級聯(lián)早期激活因子V和VIII來調(diào)節(jié)其自身產(chǎn)生。它還有細胞水平的重要作用，它對特異性受體起作用，引起血小板聚集，內(nèi)皮細胞激活和成纖維細胞增殖。因此凝血酶在淤血和血栓形成中起著中心調(diào)節(jié)作用。因子Xa催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。因子Xa的抑制有效導(dǎo)致血液凝固的抑制。
幾種活化劑引發(fā)血小板聚集，不只是凝血酶，還有ADP，膠原和腎上腺素。所有情況下，導(dǎo)致血小板聚集的最后共同途徑是纖維蛋白原與其受體的結(jié)合，所述關(guān)鍵膜糖蛋白是復(fù)合體GPIIb/IIIa。因此，認為對纖維蛋白原與這種蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制是用于防止(動脈)血栓形成和治療血栓形成疾病的非常有效的抑制血小板聚集的途徑。
GPIIb/IIIa(αIIbβ3)是屬于整聯(lián)蛋白家族的表面受體。整聯(lián)蛋白由兩個鏈，一個α亞基和一個β亞基構(gòu)成，它們以鈣依賴方式通過一價鍵連接在一起。GPIIb組成有二價陽離子結(jié)合域的亞基(αIIb)，而GPIIIa是protypical亞基(β3)。已經(jīng)從全身細胞分離到了整聯(lián)蛋白，并且它是細胞-細胞和細胞-酶作用物粘著和傳導(dǎo)信號的中介體。GPIIb/IIIa上有三個結(jié)合位點，一個識別氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD結(jié)合位點)，另一個識別Lys-Gln-Ala-Gly-Asp(KQAGD結(jié)合位點)并且一個識別Lys-Gly-Asp(KGD結(jié)合位點)。
在每一個循環(huán)血小板上，有35,000至100,000GPIIb/IIIa復(fù)合體；大多分布相似血小板表面上，較小部分在內(nèi)部保留。GPIIb/IIIa復(fù)合體與其血漿配體不反應(yīng)，直到血小板被外源激動劑例如ADP或凝血酶激活。當(dāng)這發(fā)生時，產(chǎn)生內(nèi)-外信號，導(dǎo)致復(fù)合體胞外部分構(gòu)象改變，使得分子能結(jié)合纖維蛋白原和其他配體。
模擬纖維蛋白原的α-鏈(RGD)和γ-鏈(KQAGDV)片段的化合物可以以拮抗劑起作用。以前已經(jīng)描述過以肽模擬結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的多種有效GPIIb/IIIa拮抗劑。一些(非常)有效的例子是Ro 435054，珍米洛非班，RWJ 50042，替羅非班和拉米非班。但是，沒有進一步開發(fā)或在達到晚期臨床試驗之后保留的表現(xiàn)出極好的體外效力和藥物動力學(xué)曲線的大量GPIIb/IIIa拮抗劑，因為沒有堅持控制血小板聚集和部分由于化合物短半存留期引起的不明確的藥物學(xué)性狀。短半存留期導(dǎo)致自由藥物的血漿水平大的差異，并且可能是劑量響應(yīng)個體間差異性的原因(需要監(jiān)測治療)。H.Darius在Thromb Res.2001，103，S117-S124中還報道使用GPIIb/IIIa拮抗劑的所有大臨床試驗中治療效果較小，此外，還觀察到糖蛋白IIb/IIIa受體-拮抗劑治療的患者組(口服治療)死亡率升高。認為窄的治療窗口和有限的藥物生物可利用率，以及關(guān)于血小板纖維蛋白原受體調(diào)節(jié)的仍然非常有限的知識是這種治療失敗的原因。
結(jié)論是，需要具有可預(yù)測抗血栓形成作用，優(yōu)選有更長半存留期(實現(xiàn)血小板聚集的長久水平)的GPIIb/IIIa拮抗劑。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了新的化合物，它們是抑制劑，優(yōu)選通過抑制凝固級聯(lián)(因子Xa)和血小板聚集途徑(GpIIb/IIIa)中的兩個關(guān)鍵靶物而具有混合藥物動力學(xué)作用。
本發(fā)明的化合物具有結(jié)構(gòu)式A寡糖-間隔基-GpIIb/IIIa拮抗劑(A)，其中所述寡糖是帶負電荷的寡糖殘基，包括4-25個單糖單元，帶正電荷的抗衡離子補償電荷，其中寡糖殘基衍生自本身具有(AT-III介導(dǎo)的)抗-Xa活性的寡糖；間隔基是一個鍵或者基本上無藥學(xué)活性的連接殘基；GpIIb/IIIa拮抗劑是模擬纖維蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的殘基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于與另一個相距10-20埃的殘基中的堿性部分；或者其藥學(xué)可接受鹽或其前體藥物或溶劑合物。
通過對抗纖維蛋白原與其受體的結(jié)合通過對凝固因子Xa和對血小板聚集的ATIII-介導(dǎo)的抑制作用，本發(fā)明的化合物是有效的抗血栓形成劑。當(dāng)與本領(lǐng)域已知的聯(lián)合療法相比時，其中GpIIb/IIIa抑制劑與抗凝療法(例如描述于Expert Opin.Investig.Drugs(2003)12(9)，1567，和US 2003/0199457 A1)聯(lián)合，本發(fā)明的化合物的藥動學(xué)和藥效學(xué)曲線導(dǎo)致血小板凝固的更持久的控制，并導(dǎo)致較小的劑量響應(yīng)的個體間差異。本發(fā)明的化合物的另一個優(yōu)點是通過下面操作可以協(xié)調(diào)藥理學(xué)作用(a)通過改變影響與ATIII結(jié)合的寡糖的類型，分別導(dǎo)致Xa抑制活性的提高或降低，半存留期延長或縮短，(b)通過改變GpIIb/IIIa拮抗劑的類型，能增強或減弱血小板凝固的抑制，(c)通過改變間隔基長度，進一步調(diào)整各種化合物的各自藥理學(xué)作用是可能的。
有人報道過包括其他寡糖的其他偶聯(lián)物，是一個五糖和一個直接的凝血酶抑制劑的合成偶聯(lián)物(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9(14)，2013-8；WO99/65934；WO 01/42262)或者兩個寡糖的偶聯(lián)物，其中寡糖中的一個具有間接AT-E介導(dǎo)的抗-凝血酶活性，另外還有其他寡糖的AT-III介導(dǎo)的抗-Xa活性(EP 0,649,854)。雖然也是抗血栓形成化合物，那些化合物只對凝固級聯(lián)的因子起作用。另一方面，本發(fā)明的化合物對循環(huán)血小板表面上存在的GPIIb/IIIa受體也起作用。因此，作用機理明顯不同于各種其他類型的抗血栓形成偶聯(lián)物。利用本發(fā)明的化合物，在一個單一藥物中可獲得兩種互補的抗血栓形成療法。
本發(fā)明的化合物用于治療和(可能地)防止栓塞病。這包括其中凝固級聯(lián)被激活的多種血栓形成和血栓形成前狀態(tài)，包括但不限于，深靜脈血栓形成，肺栓塞，血栓靜脈炎，血栓形成或栓塞產(chǎn)生的動脈閉塞，血管成形術(shù)期間或之后的動脈再閉合，動脈損傷或侵入性心臟病手術(shù)之后的再狹窄，手術(shù)后靜脈血栓形成或栓塞，中風(fēng)和心肌梗塞。
在本發(fā)明的化合物中不能使用4-25個單糖單元的任何帶負電荷寡糖殘基。本發(fā)明合適的化合物是其中寡糖是硫酸化或磷酸化寡糖殘基的寡糖。優(yōu)選地，寡糖殘基衍生自本身具有(AT-III介導(dǎo)的)抗-Xa活性的寡糖，例如EP 0,454,220，EP 0,529,715，WO 97/47659，WO98/03554和WO 99/36443中描述的寡糖。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的化合物是其中寡糖殘基有4-16個單糖單元，最優(yōu)選是硫酸化五糖殘基的化合物。優(yōu)選五糖殘基具有結(jié)構(gòu)B 其中R1獨立地是OSO3-或(1-8C)烷氧基，并且?guī)д姾煽购怆x子補償電荷。
特別優(yōu)選的五糖具有結(jié)構(gòu)C 其中R1是OCH3或OSO3-。
帶正電荷抗衡離子補償電荷。在結(jié)構(gòu)C的最優(yōu)選五糖中，R1是OCH3。
間隔基是一個鍵或者基本上沒有藥學(xué)活性的連接殘基。在優(yōu)選實施方案中，間隔基是基本上沒有藥學(xué)活性的連接殘基，優(yōu)選有1-50個原子，不包括寡糖殘基的氧。間隔基的化學(xué)性質(zhì)對于本發(fā)明的化合物的抗血栓形成活性的重要性較小。但是，本發(fā)明的化合物的間隔基優(yōu)選是柔順的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計合適的間隔基。間隔基更優(yōu)選的長度是10-35個原子，特別是10-28個原子?？紤]到合成原因，認為較長間隔基更不合適，然而在本發(fā)明的化合物中仍然可以成功使用較長間隔基。優(yōu)選間隔基包含至少一個-(CH2CH2O)-單元。更優(yōu)選的間隔基包含多個，優(yōu)選6個-(CH2CH2O)-單元。最優(yōu)選的間隔基是*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-CH2O-(CH2CH2O)3-(CH2)2-，*指示的末端與寡糖殘基的氧連接。
間隔基與GpIIb/IIIa拮抗劑殘基的連接點基本上可以任意選擇，前提是GpIIb/IIIa拮抗劑活性沒有被破壞。因此，典型存在的羧酸酯部分(非必需酯化的)和堿性部分必須保持不受影響。
在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的化合物中，GpIIb/IIIa拮抗劑殘基選自衍生自Ro 435054，SC 54701(珍米洛非班)，RWJ 50042，sibrafiban(Ro443888)，拉米非班(Ro 449883)，GPI 562，F(xiàn)K 633，替羅非班(MK 383)，奧布非班(SC 57101)，表非替得(C6822)，roxifiban(XV 459)，elarofiban(RWJ53308)，SR121787，來達非班(BIBU 52)，lotrafiban(SB 214857)，gantofiban (YM028)，T-250，EF 5077，ZD 2486，TAK 029，TP 9201，L 703014，SR 121566(SR 121787的活性形式)的殘基。所述殘基的衍生物還包括化學(xué)修飾的殘基，其中保留了(非必需酯化的)羧酸酯部分和堿性部分(或保護的堿性部分)。
優(yōu)選的GpIIb/IIIa拮抗劑殘基具有結(jié)構(gòu)DY-N(H)-C(O)-X (D)，其中Y是N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)或N(H)-C(O)-C(R2)(CH2芳基)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，O-亞苯基-C(R2)2-C(R2)(COOH)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，O-亞苯基-C(R2)2-C(R2)(C(O)-R3-O-C(R2)2COOH)，其中R2獨立地是H或(1-4C)烷基；并且其中芳基是苯基，羥基苯基，苯硫基或吡啶基，并且R3是哌啶基；而X是芐脒，(CH2)2-N(H)-C(O)-芐脒，(CH2)2-C(O)-N(H)-芐脒或者 其中n是0，1，2或3。
本發(fā)明最優(yōu)選的化合物是實施例中描述的化合物II，V，VIII，X，XI，XII，XIII，XIV，XV和XVI，其中化合物XIII是最優(yōu)選的。
帶正電荷的抗衡離子是H+，Na+，K+，Ca2+，等。優(yōu)選的式(A)的化合物是它們的鈉鹽形式。
術(shù)語堿性部分意思是任何公知的堿性部分，例如胺，脒，胍，哌啶等。
兩個基團空間取向“彼此相距10-20埃的距離”的短語意思不僅是延著鍵測量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用測定該距離的立體技術(shù)(參見，例如J.Med.Chem.1994，37，2537-2551)。
術(shù)語(1-8C)烷基意思是具有1-8個碳原子的支化的或沒有支化的烷基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，己基和辛基。甲基和乙基是優(yōu)選的烷基。
術(shù)語“前體藥物”意思是在體內(nèi)代謝成活性化合物的化合物，例如其中式A的化合物的GpIIb/IIIa拮抗劑殘基中的堿性部分(例如氨基或苯甲酰氨基)被例如羥基，(1-6C)烷氧基或(1-6C)烷氧羰基保護。
根據(jù)本發(fā)明的溶劑合物包括水合物。
利用本領(lǐng)域公知的方法，通過非必須地修飾先前描述的例如衍生自Ro 435054，RWJ 50042或SC 54701(珍米洛非班的藥物活性成分)，替羅非班，拉米非班，或者氨基酸的類似物，肽模擬物或者另外的官能團(例如，-COOH，-NH2，-SH，-OH等)的GPIIb/IIIa拮抗劑，能制備本發(fā)明的化合物。合成這樣的修飾的RGD-類似物的例子描述于Bioorganic Chemistry 29，357-379(2001)，其中化合物是靶向藥物送遞的有效載體。根據(jù)本發(fā)明，非必須地修飾的GPIIb/IIIa拮抗劑部分是(a)直接與寡糖偶聯(lián)或者(b)與寡糖-間隔基殘基偶聯(lián)或者(c)與間隔基偶聯(lián)，其接著與寡糖-間隔基-殘基偶聯(lián)(例如通過從WO99/65934；WO 01/42262公知的辦法)。為此目的可以使用任何合適的寡糖，例如文獻中已知的寡糖(例如從EP 0,454,220和EP 0,529,715已知的，但是不限于這些來源)或者商業(yè)上可獲得的寡糖。通過本領(lǐng)域公知的，例如Buijsman，R.等(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2013-2018)描述的方法，可以及時在合適的點將寡糖磷酸化。
例如通過利用EP 0,649,854中描述的方法能實現(xiàn)間隔基與寡糖的偶聯(lián)。
用作本發(fā)明的化合物的GpIIb/IIIa拮抗劑(基礎(chǔ))的已知GpIIb/IIIa拮抗劑的其他例子(不限于這些例子)化合物Ro 43 8857(J.Med.Chem.35，4393(1992))，Ro 48 3657，BIBL 12，F(xiàn)K 633，GR 144053，EMD76 334，SR 121566，SB 208651，SC 54684，SC 52012，DMP 754，F(xiàn)R158999，GR 200976，XV 788，MK 383(替羅非班)，RWJ 53308，ZD2486，L709780，RGD 891，T 250，C 6822，BIBU 104，SB 214857，SC 57101，G 7453，TAK 029，XV 454，XV 459，L 734217，DMP 802，SR 121787，TP 9201，DMP 757，SC 52012，RPR 109891，YM 68128，ME 3229，ME 3230，CT 50352，MK 852，S 1197，DMP 728，SC 57345，L 738167，GR 233548，RO438857，TA 993，YM 337，BIBW 194，BIBU 129，BIBW 98，tetrafibricin，L 703014，BIBU 251，GR 91669，RG 13965，G 7446，PS 028，XR 300，NSL 9403，L 756568，S 1762，L 746223，L 767685，NSL 95301，G 4120，SB 207043，GR 83895，P246，L 739758，XR 299，SV 873，RWJ 50228，XQ 870，EF 5154，AR 0510，G 7570，G 7442，G 7464，RWJ 52656，TAK 024，MS 180，MS 28168，XU 063，XU 065，L 734115，SM 20302，TS 943，NSL 96184，UR 12947，XU 057，L 750034，UR 3216，UR 2922，CP 4632，AR 0598，SC 79992，SC 4992，RGD 039，ME 3277，T 250，SC 57099B，SKF106760，SKF 107260，RWJ 52654，PSA 0613，CGH 400，NSL 95317，XT 111，RWJ 27755，L 736622，SC 46749，SM 20302，YM 570029，CY 311176和EP 0,529,858中描述的化合物，WO 96/20172，EP0,496,378，EP 0,530,505，Bioorg.Med.Chem.3，539(1995)，WO93/08174，J.Am.Chem.Soc.115，8861(1993)，J.Med.Chem.43，3453(2000)，Bioorg.Med.Chem.3，337(1995)，US 5,239,113，US5,344,957，US5,973,003，US 5,703,125，WO 96/37464，WO 93/07867，US 5,378,712，EP 445,796，US 5,273,982，US 5,770,575，WO 01/602813，EP 656,348，US 5,726,185，EP 505,868，EP 560,730，US 5,561,112，EP 513,675，US 5,574,016，WO 94/09030，EP 478,363，US 5,292,756，US 5,206,373，WO 93/16994，US 5,312,923，EP 743,302，US 5,658,929，US 5,880,136，US 5,814,643和US 6,040,317。
本發(fā)明還包括新設(shè)計的模擬纖維蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的GpIIb/IIIa拮抗劑殘基，典型地包括非必需地酯化的羧酸酯和位于彼此相距10-20埃距離的殘基中的堿性部分的化合物。
上述制備本發(fā)明的化合物的方法中的操作步驟，肽偶聯(lián)，能例如通過疊氮化物方法，混合酸酐方法，活化酯方法，碳化二亞胺方法這樣的肽片段偶聯(lián)或縮合的本領(lǐng)域公知的方法來實現(xiàn)，或者，優(yōu)選地，在銨/uronium鹽象TBTU的影響下，特別是加入催化和外消旋作用清除化合物象N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基苯并三唑。E.Gross和J.Meienhofer編著的The Peptides，Anal Synthesis.Biology，Vol 3，(Academic Press，New York，1981)給出了綜述。
在合成過程中用N-保護基團可以包括化合物中存在的胺官能團，這指α-氨基保護的肽化學(xué)中通常使用的基團，象叔丁氧羰基(Boc)基團，芐氧羰基(Z)基團，9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團或鄰苯二甲酰(Phth)基團，或者可以通過屏蔽疊氮化物部分導(dǎo)入。上文提到的ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol 3中給出了氨基保護基和它們的去除方法的綜述。
脒官能團，如果存在，能在偶聯(lián)步驟中去保護，或者能使用氨基甲酸酯，例如烯丙氧羰基或芐氧羰基來保護。優(yōu)選在溫和條件下使用1，2，4-二唑啉-5-酮部分作為母體導(dǎo)入脒官能團。
用于保護α-羧酸基團的肽化學(xué)中通常使用的基團可以保護羧酸基團，例如叔丁酯。修飾的GPIIb/IIIa拮抗劑的羧酸基團優(yōu)選被保護成芐基酯。保護基團能通過不同途徑去除，取決于那些保護基團的性質(zhì)。通常在酸性條件下，在清除劑存在下或還原條件下進行去保護，例如催化氫化。
GPIIb/IIIa拮抗劑與寡糖偶聯(lián)的先決條件是在正交反應(yīng)結(jié)合基團的存在下，例如羧酸酯基團，它能直接偶聯(lián)于寡糖殘基或寡糖-間隔基衍生物或者通過間隔基與寡糖-間隔基衍生物偶聯(lián)。為了在大多數(shù)情況下允許這樣的偶聯(lián)，GPIIb/IIIa拮抗劑的另外的修飾是必需的。
利用本領(lǐng)域公知的方法以各種各樣的途徑能實現(xiàn)式I的化合物的間隔基-衍生的構(gòu)件的構(gòu)建，或者通過一步一步導(dǎo)入氨基酸，它們的衍生物或肽模擬物的線性方式，或者以通過中間構(gòu)建物的構(gòu)件偶聯(lián)的集合方式。
可以從反應(yīng)混合物分離藥學(xué)可接受鹽形式的本發(fā)明的化合物。通過用下面的有機酸或無機酸處理式(I)的游離堿也可以獲得藥學(xué)可接受鹽例如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸，乙酸，丙酸，羥基乙酸，馬來酸，丙二酸，甲磺酸，富馬酸，琥珀酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，抗壞血酸等。
本發(fā)明的化合物可以具有手性碳原子，因此可以獲得純對映體，或?qū)τ丑w的混合物，或者是含有非對映體的混合物。獲得純旋光對映體的方法是本領(lǐng)域公知的，例如將從旋光活性酸和外消旋混合物獲得的鹽結(jié)晶，或者使用手性柱的色譜法。對于非對映體，可以使用正相或反相柱。
本發(fā)明的化合物可以口服或腸胃外給藥。這些化合物和其組合物的精確劑量和給藥方案必須根據(jù)要給之藥物的個體的需要，病痛或需要的程度或者醫(yī)師的判斷。一般情況下，腸胃外給藥要求比其他給藥方法更低的劑量，更取決于吸收。然而，給人的日劑量優(yōu)選是每千克體重0.0001-10毫克，更優(yōu)選每千克體重0.001-1毫克。
用本發(fā)明的化合物制備的藥物也可以作為(急性)抗凝血治療的輔藥來使用。在這樣的情況下，藥物和用于這樣疾病的其他化合物一起給藥，例如阿司匹林，氯吡格雷或斯特汀。
與例如標(biāo)準參考書，Gennaro等，Remington′s PharmaceuticalSciences，(第18版，Mack Publishing Company，1990，具體參見Part8Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture)中描述的藥學(xué)上合適的輔助劑混合，化合物可以被壓制成固體劑量單位，例如丸劑，片劑，或者被加工成膠囊或栓劑。利用藥學(xué)上合適的液體，化合物可以以溶液，混懸劑，乳劑的形式應(yīng)用，例如用作注射制劑，或者用作噴霧劑，例如用作鼻用噴霧劑。
為了制備單位劑量，例如，片劑，考慮到使用常規(guī)添加劑，例如填充劑，著色劑，聚合物粘合劑等等。一般情況下，可以使用不干擾活性化合物功能的任何藥學(xué)可接受添加劑。
施用組合物的合適的載體包括乳糖，淀粉，纖維素衍生物等等，或者它們的混合物，以合適量使用。
通過下面的實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
實施例使用的縮寫Aq.＝水溶液
Ala＝丙氨酸Alloc＝烯丙氧羰基Asp＝(L)-天冬氨酸ATE＝抗凝血酶IIIBn＝芐基Boc＝叔丁氧羰基Bt＝苯并三唑t-Bu＝叔丁基DCM＝二氯甲烷DiPEA＝N，N-二異丙基乙胺DMAP＝N，N-二甲基氨基吡啶DMF＝N，N-二甲基甲酰胺EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽Et＝乙基ESI＝電霧化電離HPLC＝高效液相色譜HOBt＝N-羥基苯并三唑NMM＝N-甲基嗎啉Me＝甲基MS＝質(zhì)譜Phe＝(L)-苯丙氨酸sat.＝飽和RT＝室溫TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽TEA＝三乙胺TFA＝三氟乙酸THF＝四氫呋喃Tos＝甲苯-4-磺酰基TRAP＝凝血酶受體激動劑肽Tyr＝L-酪氨酸Z＝芐氧羰基方案1N-(4-氰基-苯甲?；?-β-丙氨酸乙酯(2)RT下將DCM(30毫升)中β-丙氨酸.HCl(2.81克，18.3毫摩爾)和4-氰基-苯甲酰氯(3.03克，18.0毫摩爾)懸浮液攪拌過夜?；旌衔镉肊tOAc稀釋，用檸檬酸水溶液(3％)，飽和NaHCO3水溶液和H2O洗滌。干燥(MgSO4)并蒸發(fā)溶劑，得到化合物2(2.52克，56％)。
N-(4-[1，2，4-氧雜二唑-5-啉基]-苯甲?；?-β-丙氨酸乙酯(3)將化合物2(2.50克，10.2毫摩爾)溶解于EtOH(70毫升)。加入羥胺.HCl(0.99克，14.3毫摩爾)和Et3N(2.49毫升，17.3毫摩爾)并且將混合物在RT攪拌過夜?；亓?.5小時之后反應(yīng)完成。冷卻沉淀出產(chǎn)物并濃縮(～10毫升)，過濾，用EtOH洗滌并真空干燥。
通過與吡啶(3×15毫升)共同蒸發(fā)，從羥基苯甲脒粗產(chǎn)物(2.8g，10毫摩爾)去除微量H2O，然后將其溶解于吡啶(100毫升)。加入氯甲酸乙酯(1.43毫升，15.0毫摩爾)，并且在回流溫度下將混合物攪拌18小時。將反應(yīng)物倒入H2O(200毫升)中止反應(yīng)，接著用EtOAc(3×75毫升)萃取。將有機層干燥(MgSO4)并濃縮。用甲苯蒸發(fā)去除殘留吡啶。重結(jié)晶(EtOAc/己烷)得到稍微帶粉色的固體(2.48克，81％)。
N-(4-[1，2，4-氧雜二唑-5-啉基]-苯甲?；?-β-丙氨酸(4)化合物3(0.60克，2.0毫摩爾)溶解于1，4-二烷/H2O(10毫升，1/1，v/v)的混合物中。加入NaOH水溶液(2.0毫升，2N)并且在RT下將混合物攪拌3小時。用Dowex H+中和反應(yīng)混合物并過濾。減壓濃縮濾液，并且在真空下干燥得到的白色固體。產(chǎn)率0.51克(93％)。
1-疊氮基-1-去氧-四甘醇(5)將四甘醇(90克，0.46摩爾)冷卻至0℃，并且加入10毫升水中氫氧化鈉(3.0克，75毫摩爾)溶液，接著加入100毫升THF。將混合物劇烈攪拌30分鐘。0℃下劇烈攪拌下緩慢加入50毫升THF中對-甲苯磺酰氯(8.8克，46毫摩爾)溶液以保持混合物均勻。
攪拌5小時之后，將混合物倒入400毫升水中。用DCM(4×20毫升)萃取溶液。合并的有機層用H2O(20毫升)和鹽水(20毫升)洗滌并干燥(MgSO4)。過濾后減壓去除溶劑，得到一甲苯磺酸酯油狀物。
將粗產(chǎn)物溶解于EtOH(120毫升)和H2O(18毫升)的混合物。加入疊氮化鈉(3.25克，50毫摩爾)并且將混合物在60℃下攪拌過夜。真空蒸發(fā)EtOH(50毫巴，50℃)并且加入150毫升EtOAc。溶液用鹽水(20毫升)洗滌并且用MgSO4干燥。過濾之后減壓去除溶劑(50毫巴，50℃)，得到疊氮化物5，為油狀物(6.25克，兩步產(chǎn)率62％)。
15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(6)將化合物5(1.15克，5.25毫摩爾)溶解于甲苯(10毫升)。向溶液中加入50％氫氧化鈉水溶液(12.5N，5毫升)，四丁基銨硫酸氫鹽(0.34克，1.05毫摩爾)和溴乙酸叔丁酯(4.27毫升，26.3毫摩爾)。RT下劇烈攪拌懸浮液。3小時之后，混合物用EtOAc(10毫升)稀釋，鹽水(10毫升)，鹽酸(2N，5毫升)和H2O(5毫升)洗滌。用EtOAc萃取含水層，然后將合并的有機層干燥(MgSO4)。濃縮之后，通過硅膠(20克)柱色譜法(洗脫劑庚烷-EtOAc，1/0-0/1)純化粗產(chǎn)物。將合適的級分濃縮，得到疊氮化物，為淺黃色油狀物(1.25克，71％)。Rf 0.8(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
在含有乙酸(0.2毫升)的EtOH(30毫升)中用10％Pd/C(100毫克)氫化將疊氮化物還原。4小時之后經(jīng)兩層Whatman GF/A濾紙過濾去除催化劑。將濾液濃縮，溶解于DCM(25毫升)，并且用Argonaut MP碳酸酯樹脂去除乙酸。過濾去除樹脂并蒸發(fā)溶劑，得到化合物6，產(chǎn)率1.17克(100％)。
(N-芐氧羰基-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(7)化合物6(3.60克，11.7毫摩爾)和Z-Phe-OH(3.51克，11.7毫摩爾)溶解于DCM(30毫升)。依次加入HOBt(1.39克，11.7毫摩爾)，EDC(2.83克，14.0毫摩爾)和TEA(3.38毫升，23.4毫摩爾)，并且將溶液攪拌過夜。用EtOAc(30毫升)稀釋反應(yīng)混合物并且用飽和NaHCO3水溶液(2×10毫升)，5％檸檬酸水溶液(10毫升)和H2O(10毫升)洗滌。將有機相干燥(MgSO4)并減壓濃縮。用硅膠(75克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc-EtOAc/MeOH，95/5，v/v)純化，得到化合物7，為無色油狀物(4.95克，72％)。Rf 0.5(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(8)將化合物7(2.42克，4.11毫摩爾)溶解于含有乙酸(0.4毫升)的EtOH(100毫升)中，并且在10％Pd/C(0.1克)存在下在H2中攪拌。16小時之后，將混合物過濾并濃縮。反復(fù)在甲苯中濃縮產(chǎn)物來去除乙酸，并且在DCM(20毫升)中用Argonaut MP碳酸酯樹脂(1.3克)處理。將樹脂過濾并蒸發(fā)溶劑，得到化合物8，為無色油狀物(1.69克，90％)。Rf 0.05(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(N-叔丁氧羰基-O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(9)根據(jù)較早時對化合物7的合成所述，使用NMM(0.84毫升，7.4毫摩爾，pH 8.3)代替TEA，使化合物8(1.69克，3.71毫摩爾)與Boc-AspBn-OH(1.20克，3.71毫摩爾)偶聯(lián)。后處理之后，得到黃色油狀物。用硅膠(50克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc/庚烷，2/1→EtOAc/MeOH，95/5，v/v)純化，得到化合物9，為無色油狀物(2.30克，82％)。Rf 0.6(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
(O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(10)在EtOAc(10毫升)中用1.5N鹽酸溶液處理Boc-保護的化合物9(1.09克，1.43毫摩爾)。RT下攪拌100分鐘之后，將反應(yīng)混合物冷卻(0℃)，并且通過倒入飽和NaHCO3水溶液(15毫升)而中和。
用EtOAc(2×10毫升)萃取含水層，用H2O(10毫升)洗滌合并的有機層并干燥(MgSO4)。濃縮，得到粗產(chǎn)物10，其不用純化即可在下面的反應(yīng)中使用。Rf 0.2(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
({N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲?；?-β-丙氨酰}-O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(11)將羧酸4(0.12克，0.42毫摩爾)和胺10(粗產(chǎn)物，最多0.40毫摩爾)溶解于DMF(5毫升)。依次加入HOBt(50毫克，0.42毫摩爾)，EDC(94毫克，0.50毫摩爾)和NMM(88微升，0.61毫摩爾)，并且將溶液攪拌過夜。用EtOAc和2-丁醇(10毫升，1/1，v/v)的混合物稀釋棕色溶液，并且用3％檸檬酸(5毫升)，飽和NaHCO3(5毫升)和鹽水(5毫升)萃取。連續(xù)用EtOAc萃取含水相，并且用MgSO4干燥合并的有機層。去除溶劑，得到粗產(chǎn)物化合物11(0.27克，78％)，其不用純化即可在下面的反應(yīng)中使用。Rf 0.2(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
({N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酰基)-β-丙氨酰}-O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸(12)在DCM(5毫升)和TFA(3毫升)的混合物中攪拌化合物11(0.2克，粗產(chǎn)物，最多0.22毫摩爾)。2小時之后將溶液濃縮并且反復(fù)在甲苯(3×5毫升)中濃縮去除殘留的TFA。用制備HPLC-MS純化產(chǎn)物，得到純形式的化合物12(0.11克，自第9步的三個步驟的產(chǎn)率是56％)。
({N-(4-[1，2，4-脒基苯甲?；鵠-β-丙氨酰)-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰}-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(I) 將化合物11(65毫克，粗產(chǎn)物，最多71微摩爾)溶解于EtOH(10毫升)，H2O(2毫升)和乙酸(0.1毫升)的混合物。加入10％Pd/C(50毫克)并且在H2氣下將混合物攪拌過夜。通過兩層Whatman GF/A濾紙過濾去除催化劑，并濃縮濾液。通過利用制備HPLC-MS獲得純的產(chǎn)物并凍干。產(chǎn)率7.7毫克(14％。ESI-MS787[M+H]+。
間隔基-衍生的GPIIb/IIIa拮抗劑12，23，31，33，43，50，52，54，62與五糖63偶聯(lián)的常規(guī)方法，參見方案8和9
間隔基-衍生的羧酸(33微摩爾)(即化合物12，23，31，33，43，50，52，54或62)通過與DMF(2×2毫升)共蒸發(fā)而干燥，溶解于DMF(1毫升)，并在TBTU(10.5毫克，33微摩爾)和DiPEA(5.7微升，33微摩爾)存在下，在N2氣下攪拌。1小時之后，加入包含氨基間隔基的五糖63(56毫克，31微摩爾)。
RT下將反應(yīng)混合物攪拌過夜，并且通過離子交換(Mono-Q)和反相(LunaC18)色譜法進行分析。五糖被完全消耗完之后，將反應(yīng)混合物濃縮(＜50℃，15mmHg)。
用10％Pd/C(就粗產(chǎn)物來說加入等重量)將(粗)產(chǎn)物(10毫克/毫升，H2O)氫化去保護(H2)。16小時之后將溶液脫氣，經(jīng)0.45μM HPLC過濾器過濾并減壓濃縮(＜50℃，15mmHg)。通過離子交換色譜將偶聯(lián)物純化(Q-瓊脂糖凝膠，緩沖劑H2O→2M NACl)，接著用SephadexG25-柱(H2O)脫氧并凍干。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{({N-(4-脒基苯甲?；?-β-丙氨酰}-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸)-(15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酰)-(1-氮雜-4，7，10-三氧雜十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-0-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(II) 根據(jù)常規(guī)方法偶聯(lián)12(21.4毫克，24.8微摩爾)和五糖63(42.4毫克，23.6微摩爾)，純化并去保護，獲得產(chǎn)物，為白色固體，產(chǎn)率34毫克(42％，2步驟)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.38-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D5.36(d，1H，H1)，4.18(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.80(m，1H，H5)，3.47(m，1H，H3)，3.27(dd，1H，H2)；ring E4.59(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.62(m，1H，H5)，3.45(m，1H，H3)，3.15(m，1H，H2)；ring F5.27(d，1H，H1)，4.49(t，1H，H3)，4.33(d，1H，H6a)，4.20(m，1H，H2)，4.08(m，1H，H6b)，3.86(t，1H，H4)；ring G4.92(bs，1H，H1)，4.54(d，1H，H5)，4.07(m，1H，H4)，3.74(1H，dd，H3)，3.37(m，1H，H2)；ring H4.99(d，1H，H1)，4.25(m，1H，H2)，4.22(m，1H，H6a)，4.17(dd，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.66(t，1H，H4)，3.58(m，1H，H3)；間隔基3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.62-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.33-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.25(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.17(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽7.84(d，2H，Harom苯甲脒)，7.79(d，2H，Harom苯甲脒)，7.25(t，2H，HaromPhe)，7.20(t，1H，HaromPhe)，7.09(d，2H，HaromPhe)，4.51(dd，1H，CH Asp)，4.38(t，1H，CH Phe)，3.60(m，2H，CH2N β-Ala)，2.83(dAB，2H，CH2Phe)，2.52(t，2H，C(O)CH2β-Ala)，2.44(dAB，2H，CH2Asp)。ESI-MS計算值2511.4；實測值m/z 1267.9[M+H+Na]2+，1256.9[M+2H]2+，1245.9[M+2H-Na]2+，852.9[M+H+2Na]3+，845.5[M+2H+Na]3+，838.3[M+3H]3+，639.9[M+2H+2Na]4+，1232.8[M-2Na]2-，1221.7[M-3Na+H]2-，1210.8[M-4Na+2H]2-，1199.8[M-5Na+3H]2-，814.1[M-3Na]3-。
方案1.I和II的合成 方案24-(叔丁氧羰基氨基)-苯甲腈(14)75℃下，在THF(50毫升)和吡啶(4毫升)的混合物中攪拌4-氨基苯甲腈(13，2.95克，25毫摩爾)和二碳酸二叔丁酯(8.0毫升，35毫摩爾)。16小時之后，將紅色反應(yīng)混合物冷卻，用EtOAc(30毫升)稀釋，并且用鹽酸(1N，15毫升)，飽和NaHCO3水溶液(15毫升)和鹽水(15毫升)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并濃縮。通過硅膠(75克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc/庚烷，1/5→1/2，v/v)純化深棕色油狀物，得到化合物14，為橙色油狀物(3.25克，60％)，含有～30％雙-Boc保護產(chǎn)物。后者混合物不用進一步純化即可在下面的反應(yīng)中使用。
4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯胺(16)根據(jù)較早對化合物3的制備所描述的，將化合物14(3.25克，14.9毫摩爾)轉(zhuǎn)化為二唑啉15。在DCM(15毫升)和TFA(8毫升)的混合物中將得到的粗產(chǎn)物淺橘色固體攪拌5小時。減壓濃縮并與甲苯(2×10毫升)蒸發(fā)，得到棕色固體，其通過硅膠(40克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc)純化，得到化合物16(1.81克，經(jīng)三個步驟69％)。Rf 0.5(EtOAc)。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰胺酸(17)將苯胺衍生物16(0.89克，5.0毫摩爾)溶解于吡啶(25毫升)。和4-N，N，-二甲基氨基吡啶(63毫克，0.5毫摩爾)一起加入琥珀酸酐(0.75克，7.5毫摩爾)，并且在100℃下將混合物攪拌過夜。減壓濃縮溶液，淡棕色固體從EtOH/MeOH/H2O(60毫升，5/35/1，v/v/v)的混合物中重結(jié)晶。過濾之后，將母液濃縮至10毫升，得到羧酸17固體，其在50℃真空下干燥16小時。產(chǎn)率1.28克(92％)。Rf0.3(DCM/MeOH/AcOH，100/10/1，v/v/v)。
(N-叔丁氧羰基-O-芐基-L-天冬氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(18)將化合物6(0.94克，3.1毫摩爾)和Boc-AspBn-OH(0.99克，3.1毫摩爾)溶解于DCM(8毫升)。依次加入HOBt(0.36克，3.1毫摩爾)，EDC(0.74克，3.8毫摩爾)和NMM(0.34毫升，6.2毫摩爾)，并且將溶液攪拌過夜。用EtOAc(10毫升)稀釋反應(yīng)混合物并且用飽和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％檸檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗滌。將有機相干燥(MgSO4)并減壓濃縮。用硅膠(20克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc/庚烷，3/1→1/0，v/v)進行純化，得到化合物18，為無色油狀物(1.15克，61％)。Rf 0.7(EtOAc/MeOH，95/5，v/v)。
(O-芐基-L-天冬氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(19)根據(jù)較早時對化合物10的合成所描述的相同的反應(yīng)條件和處理步驟，在45分鐘內(nèi)處理化合物18(0.51克，0.83毫摩爾)。產(chǎn)物19不用進一步純化即可在下面的反應(yīng)中使用。
N-{[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-芐基-L-天冬氨酰)}-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(20)根據(jù)較早對11的合成所描述的，將化合物17(0.30毫摩爾)和19(0.30毫摩爾)偶聯(lián)。粗產(chǎn)物20(0.17克，75％)不用進一步純化即可在下面的反應(yīng)中使用。Rf 0.3(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-{(4-苯甲脒基)-琥珀酰氨酰}-L-天冬氨酰-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(III) 在EtOH/H2O/AcOH的混合物中將20(32毫克，41微摩爾)催化氫化。過濾，濃縮并通過制備HPLC-MS純化，得到間隔基衍生物III，為白色固體。產(chǎn)率20毫克(77％)。ESI-MS640[M+H]+。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(22)根據(jù)較早對化合物11的合成所描述的，將二唑啉17(24毫克，88微摩爾)和粗產(chǎn)物胺10最多58毫克，88微摩爾)偶聯(lián)。粗產(chǎn)物22不用進一步純化即可在下面的反應(yīng)中使用。Rf 0.6(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-[4-(1，2，4-二唑-5-啉基)-苯基]-琥珀酰氨酰-(O-芐基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(23)在DCM(1.0毫升)和TFA(1.0毫升)的混合物中攪拌粗產(chǎn)物化合物22(最多88微摩爾)。2小時之后，將溶液濃縮，并且通過制備HPLC將產(chǎn)物純化。將合適的級分濃縮得到化合物23，產(chǎn)率31毫克(最后三步的產(chǎn)率41％)。
N-{(4-苯甲脒基)-琥珀酰氨酰}-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(IV) 通過在EtOH(7毫升)和H2O(1毫升)的混合物中經(jīng)10％Pd/C(50毫克)催化氫化將粗產(chǎn)物化合物22(最多80毫克，87微摩爾)去保護。24小時之后，將混合物過濾并濃縮，并通過制備HPLC將粗產(chǎn)物純化。凍干后分離白色泡沫狀化合物IV，產(chǎn)率10.5毫克(15％)。ESI-MS787[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰]-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸}-(15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酰)-(1-氨基-4，7，10-三氧雜十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(V) 將羧酸23(30.0毫克，34.8微摩爾)與五糖63(59.4毫克，56.4微摩爾)偶聯(lián)，接著根據(jù)常規(guī)方法進行純化和去保護。獲得偶聯(lián)物V，為白色固體，產(chǎn)率37.5毫克(48％，2步驟)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D5.36(d，1H，H1)，4.21(m，1H，H6a)，4.05(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.48(m，1H，H3)，3.33(m，1H，H4)，3.20(dd，1H，H2)；ring E4.58(d，1H，H1)，3.79(m，1H，H4)，3.65(m，1H，H5)，3.48(m，1H，H3)，3.15(m，1H，H2)；ring F5.26(d，1H，H1)，4.48(t，1H，H3)，4.32(d，1H，H6a)，4.22(m，1H，H6b)，4.15(dd，1H，H2)，4.08(m，1H，H5)，3.84(t，1H，H4)；ring G4.98(bs，1H，H1)，4.55(d，1H，H5)，4.07(m，1H，H4)，3.73(1H，dd，H3)，3.37(m，1H，H2)；ring H4.98(d，1H，H1)，4.25(dd，1H，H2)，4.21(m，1H，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.66(t，1H，H4)，3.58(m，1H，H3)；間隔基3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.61-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.38-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.19(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.12(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽7.69(d，2H，Harom苯甲脒)，7.63(d，2H，Harom苯甲脒)，7.25(t，2H，HaromPhe)，7.20(t，1H，HaromPhe)，7.09(d，2H，HaromPhe)，4.44(dd，1H，CH Asp)，4.38(t，1H，CH Phe)，2.90(dAB，2H，CH2Phe)，2.75(m，2H，CH2琥珀酰)，2.55(m，2H，CH2琥珀酰)，2.43(dAB，2H，CH2Asp)。ESI-MS計算值2511.4；實測值m/z 1267.8[M+H+Na]2+，1256.8[M+2H]2+，1245.8[M+2H-Na]2+，852.8[M+H+2Na]3+，845.5[M+2H+Na]3+，838.2[M+3H]3+，639.9[M+2H+2Na]4+，1232.7[M-2Na]2-，1221.7[M-3Na+H]2-，1210.7[M-4Na+2H]2-，1199.7[M-5Na+3H]2-，814.1[M-3Na]3-。
方案2.III和IV的合成 方案3N-3-[4-(N-叔丁氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸乙酯(26)在DCM(20毫升)中將3-(N-Boc-哌啶基)-丙酸(24，1.00克，3.89毫摩爾)，TBTU(1.38克，4.28毫摩爾)和DiPEA(2.70毫升，15.6毫摩爾)的混合物攪拌5分鐘。接著，加入(R)-3-哌啶甲酸乙酯(L)-酒石酸鹽(25，0.61克，3.89毫摩爾)，并且將溶液攪拌2小時。反應(yīng)用5％NaHCO3水溶液中止(20毫升)，用3％檸檬酸水溶液(20毫升)和H2O(20毫升)洗滌。用DCM(3×10毫升)萃取含水相并且干燥合并的有機層(MgSO4)。得到化合物26(2.34克)，為棕-微黃色油狀物，其不用進一步純化即可在下面的反應(yīng)中使用。Rf 0.7(EtOAc/MeOH，93/7，v/v)。
N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰基]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸乙酯(28)在DCM(10毫升)和TFA(10毫升)的混合物中攪拌粗產(chǎn)物化合物26(最多3.89毫摩爾)。1小時之后，減壓濃縮溶液。在甲苯(3×10毫升)中反復(fù)濃縮去除痕量TFA。接著，將粗產(chǎn)物衍生物27溶解于DCM(10毫升)，接著加入DiPEA(2.02毫升，11.7毫摩爾)和(N)-芐氧羰基-琥珀酰亞胺(1.94克，7.79毫摩爾)。攪拌過夜之后，用EtOAc(20毫升)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和NaHCO3水溶液(10毫升)，3％檸檬酸水溶液和H2O(10毫升)洗滌。用MgSO4干燥有機層并濃縮，得到Z-保護的化合物28，為無色油狀物(1.37克，三個步驟的產(chǎn)率是82％)。Rf 0.5(EtOAc)。
N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰基]-(R)-(-)-3-哌啶甲酸(29)將1，4-二烷(20毫升)和0.5M NaOH(20毫升)中化合物28(0.35克，3.14毫摩爾)的溶液攪拌1小時。用Dowex 50WX4-H+離子交換中和，過濾并濃縮，得到羧酸衍生物29，為微黃色油狀物(1.27克，100％)。Rf 0.05(EtOAc)。
{N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-芐基-L-天冬氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(30)將化合物29(0.24克，0.60毫摩爾)和粗產(chǎn)物19(最多0.60毫摩爾)的混合物，與EDC(0.14克，0.72毫摩爾)和NMM(90微升，0.78毫摩爾)一起在DCM(5毫升)中攪拌5小時。用DCM(10毫升)稀釋溶液并且用飽和NaHCO3水溶液(10毫升)，3％檸檬酸水溶液和H2O(10毫升)洗滌。將有機相用MgSO4干燥并濃縮。粗產(chǎn)物30通過硅膠(5克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc/庚烷/MeOH，2/1/0→9/0/1，v/v/v)純化。產(chǎn)率0.29克(53％)。Rf 0.6(EtOAc/MeOH，7/1，v/v)。
{N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-芐基-L-天冬氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸(31)在DCM(5毫升)和TFA(5毫升)的混合物中攪拌化合物30(0.29克，0.32毫摩爾)。3小時之后，將混合物濃縮并反復(fù)用甲苯蒸發(fā)(3×10毫升)。通過制備HPLC純化產(chǎn)物，得到31，產(chǎn)率0.23克(86％)。
{N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-芐基-L-天冬氨酰)-L-苯丙氨酰-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(32)將化合物29(0.17克，0.42毫摩爾)和粗產(chǎn)物10(0.25克，最多0.38毫摩爾)溶解于DCM(5毫升)。依次加入HOBt(59毫克，0.46毫摩爾)，EDC(94毫克，0.49毫摩爾)和NMM(88微升，0.63毫摩爾)，并且將溶液攪拌過夜。用EtOAc(10毫升)稀釋反應(yīng)混合物并且用飽和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％檸檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并減壓濃縮。通過硅膠(5克)柱色譜法(洗脫劑DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)進行純化，得到化合物32，為無色油狀物(0.24克，60％)。Rf 0.3(DCM/MeOH，95/5，v/v)。
{N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-(O-芐基-L-天冬氨酰)-L-苯丙氨酰-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸(33)將化合物32(0.20克，0.19毫摩爾)去保護，并且根據(jù)較早對化合物31的合成所描述的進行純化。產(chǎn)率50毫克(30％)。
{N-3-[4-(N-芐氧羰基)-哌啶丙酰]-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-O-芐基-L-天冬氨酸叔丁酯(34)向DCM(5毫升)中化合物29(0.69克，1.72毫摩爾)和AspBa-O-t-Bu酯(0.54克，1.72毫摩爾)的攪拌的混合物加入TBTU(0.58克，1.80毫摩爾)和DiPEA(0.90毫升，5.4毫摩爾)。2小時之后，用EtOAc(10毫升)稀釋反應(yīng)混合物，并且用飽和NaHCO3水溶液(2×5毫升)，5％檸檬酸水溶液(5毫升)和H2O(5毫升)洗滌。將有機層用MgSO4干燥并減壓濃縮。通過硅膠(25克)柱色譜法(洗脫劑EtOAc/庚烷，1/2→1/0，v/v)進行純化，得到化合物34，為淺黃色油狀物(0.84克，73％)。Rf 0.6(EtOAc)。
N-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰]-L-天冬氨酰}-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(VII) 在EtOH(5毫升)和H2O(1毫升)的混合物中用10％Pd/C(30毫克)催化氫化，將化合物31(35毫克，39微摩爾)去保護。16小時之后，將混合物通過兩層Whatman GF/C濾紙過濾并濃縮。分離化合物VII，凍干后為白色泡沫狀物質(zhì)，產(chǎn)率24毫克(92％)。ESI-MS673[M+H]+。
N-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰]-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰}-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(IX) 如較早對化合物VII的合成所描述的，將化合物32(45毫克，43微摩爾)去保護。經(jīng)制備HPLC和凍干，得到純IX，產(chǎn)率8.8毫克(26％)。ESI-MS820[M+H]+。
1-{N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰}-L-天冬氨酸(VI) 通過在DCM(5毫升)和TFA(5毫升)的混合物中攪拌，將化合物34(47毫克，71微摩爾)去保護。5小時之后將混合物濃縮并反復(fù)用甲苯(3×5毫升)蒸發(fā)。粗產(chǎn)物中間體在1，4-二烷(5毫升)和H2O(5毫升)的混合物中經(jīng)10％Pd/C(30毫克)催化氫化。3小時之后，混合物經(jīng)兩層Whatman GF/C濾紙過濾，接著用MeOH洗滌。濃縮濾液并通過制備HPLC純化，得到純化合物VI，凍干后為白色泡沫物，總產(chǎn)率9.8毫克(39％)。ESI-MS384[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰-(L)-天冬氨酰]-(15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酰)-(1-氮雜-4，7，10-三氧雜十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(VIII)
根據(jù)常規(guī)程序中描述的，將羧酸衍生物31(51毫克，59微摩爾)與五糖衍生物63(105毫克，56微摩爾)偶聯(lián)，接著將粗產(chǎn)物去保護并純化。凍干之后獲得純的化合物VIII。產(chǎn)率101毫克(兩步驟總的產(chǎn)率76％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物)δ5.39(d，1H，H-1ring D)，5.31(bs，1H，H-1ring F)，5.00(d，1H)，4.95(bs，1H)，4.61(bs，1H)，4.59(d，1H)，4.50(m，1H)，4.34(d，1H)，4.27-4.20(m，7H)，4.19-4.15(m，2H)，4.10-4.03(m，3H)，4.02(s，2H CH2Ac間隔基)，3.92(ddd，1H)，3.88(ddd，1H)，3.86-3.75(m，7H)，3.71(dd，1H)，3.69-3.52(m，38H)，3.49-3.43(m，14H)，3.40-3.30(m，12H)，3.26-3.11(m，4H)，2.96-2.89(m，3H)，2.77(m，1H)，2.68(m，1H)。
ESI-MS計算值2397.4；實測值m/z 1221.6[M+2Na]2+，1210.6[M+H+Na]2+，1199.6[M+2H]2+，822.1[M+3Na]3+，814.8[M+2H+Na]3+，807.4[M+H+2Na]3+，1175.7[M-2Na]2-，1164.7[M-3Na+H]2-，1153.8[M-4Na+2H]2-，776.2[M-3Na]3-，768.9[M-4Na+H]3-，761.5[M-3Na+H]3-，570.9[M-5Na+H]4-，576.4[M-4Na]2-，456.5[M-5Na]5-。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-{[N-3-(4-哌啶丙酰)-(R)-(-)-3-哌啶甲酰-(L)-天冬氨酰-(L)-苯丙氨酰]-(15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酰)-(1-氮雜-4，7，10-三氧雜十二烷基)}-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(X) 根據(jù)常規(guī)程序中描述的，將化合物33(32.4毫克，32.8微摩爾)與五糖衍生物63(56.0毫克，31.2微摩爾)偶聯(lián)，接著去保護并純化。獲得產(chǎn)物X，為白色粉末。產(chǎn)率49毫克(兩步驟總的產(chǎn)率62％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY，1∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物)δ7.32-7.19(m，5H，H-aromPhe)，5.39(d，1H，H-1ring D)，5.29(d，1H，H-1ring F)，4.99(d，1H)，4.93(bs，1H)，4.59(d，1H)，4.53(s，1H)，4.50-4.43(m，3H)，4.33(d，1H)，4.26-4.15(m，8H)，4.13-4.08(m，3H)，4.06-4.02(d，1H)，3.98(d，1H CH2Ac間隔基)，3.94-3.78(m，9H)，3.74(bs，1H)，3.68-3.52(m，38H)，3.50-3.42(m，14H)，3.38-3.30(m，12H)，3.27-2.85(m，6H)，2.80-2.70(m，2H)。ESI-MS計算值2546.4；實測值m/z 1273.2[M+2H]2+，1284.2[M+H+Na]2+，1295.2[M+2Na]2+，856.5[M+2H+Na]3+，863.8[M+H+2Na]3+，871.1[M+3Na]3+，1238.3[M+H-3Na]2-，1227.3[M+2H-4Na]2-，1216.3[M+3H-5Na]2-，825.2[M-3Na]3-，817.9[M-4Na+H]3-，810.5[M-5Na+2H]3+，803.2[M-6Na+3H]3-，613.1[M-4Na]4-，607.7[M-5Na+H]4-，485.9[M-5Na]5-，401.1[M-6Na]6-。
方案3.VI，VII和IX的合成 方案4N-(4-[1，2，4-戊二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰氨酰-O-芐基-L-天冬氨酸(36)N2氣下相攪拌的化合物17(1.0克)的DMF(35毫升)溶液加入，NMM(351微升)，接著加入氯甲酸異丁酯(440微升)。5分鐘之后加入Asp(Bn)(tBu)(1.12克)，接著加入DiPEA(586微升)和DMAP(7.8毫克)。1小時之后加入H2O，并且用EtOAc萃取混合物(兩次)。用飽和NaCl溶液洗滌有機層，用MgSO4干燥并減壓濃縮。加入甲苯，然后沉淀出產(chǎn)物35。加入庚烷并將產(chǎn)物過濾，產(chǎn)率55％。Rf＝0.5(DCM/MeOH/AcOH9∶1∶0，1)。
向35(843毫克)加入DCM和TFA(40毫升，1∶1，v/v)的混合物并且攪拌3小時。然后加入甲苯濃縮混合物，定量得到36。Rf 0.2(Tol/EtOH 8∶2，v/v)。
N-烯丙氧羰基-L-酪氨酸(38)經(jīng)20分鐘，向冰浴中冷卻的攪拌的4N氫氧化鈉水溶液(30毫升)中酪氨酸(10克)的溶液緩慢加入氯甲酸烯丙酯(6.4毫升)。加完10分鐘之后移去冰浴，并加入4N氫氧化鈉水溶液(30毫升)和H2O(5毫升)。RT下反應(yīng)2小時后加入MeOH(60毫升)。又反應(yīng)2小時后用Et2O萃取反應(yīng)混合物。在冰浴上將含水的混合物冷卻，用36-38％鹽酸酸化至pH 2-3，并用EtOAc萃取。
將有機萃取液干燥(Na2SO4)并減壓濃縮，得到AllocTyr-OH(38)油狀物(14.5克，88％)。Rf 0.35(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)。N-烯丙氧羰基-4-O-芐基-L-酪氨酸(39)將Alloc-Tyr-OH(38，5.5克)溶解于DMF(40毫升)，減壓下去除一半體積的DMF。N2氣下將殘余物冷卻至0℃并小批次加入氫化鈉(60％分散，1.9克)。0℃下將懸浮液攪拌1小時。然后加入芐基溴(1.88毫升)的DMF(5毫升)溶液。RT下1小時后加入2N鹽酸(7毫升)，減壓濃縮反應(yīng)混合物。向殘余物加入水H2O(50毫升)，用2N氫氧化鈉水溶液將pH調(diào)至9，用甲苯和EtOAc的混合物洗滌。加入EtOAc，并用2N鹽酸將混合物酸化至pH 3。分離有機層，干燥(Na2SO4)并濃縮。應(yīng)用硅膠柱色譜法(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)純化殘余物。將從柱中得到的產(chǎn)物溶解于EtOAc，用H2O洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮，得到化合物39(4.66克，77％)。Rf 0.5(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v/v)。
(N-烯丙氧羰基-4-O-芐基-L-酪氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜十五烷酸叔丁酯(40)向攪拌的alloc-Tyr(Bn)-OH(39，0.61克)和15-氨基-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(6)(0.54克)的THF(2毫升)溶液加入TBTU(0.7克)和NMM(0.38毫升)。16小時后加入15-氨基-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸叔丁酯(6)(0.18克)，TBTU(0.1克)，用NMM將pH調(diào)至7濕pH-試紙)。三天之后將反應(yīng)混合物過濾并減壓濃縮濾液。用硅膠柱色譜(EtOAc/庚烷/EtOH，65/33/2to50/0/1，v/v/v)純化殘余物，得到標(biāo)題化合物40(0.7克，67％)。Rf 0.25(EtOAc/庚烷/EtOH，66/33/1，v/v/v)。
15-N-(4-O-芐基-L-酪氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜十五烷酸叔丁酯(41)向攪拌的化合物40(0.43克)的DCM(15毫升)溶液加入H2O(75微升)，氫化三丁基錫(0.4毫升)和PdCl2(PPh3)2(12毫克)。通過TLC檢測反應(yīng)(EtOAc/乙醇，25/1，v/v)。反應(yīng)完成后將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，加入H2O(10毫升)，用2N鹽酸酸化至pH 4。分離有機層，干燥(Na2SO4)并減壓濃縮。用硅膠柱色譜法純化殘余物(梯度洗脫DCM/MeOH，95/5至DCM/MeOH/N-甲基嗎啉，450/50/3)，得到標(biāo)題化合物41(0.36克，78％)。Rf 0.4(DCM/MeOH，10/1，v/v)。
15-N-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-芐基-L-天冬氨酰)-(4-O-芐基-L-酪氨酰)}-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酸(43)將化合物41(360毫克，0.49毫摩爾)和36(241毫克，0.5毫摩爾)溶解于THF(5毫升)。向該混合物加入NMM(108微升，0.98毫摩爾)后加入TBTU。將混合物攪拌過夜。在PVDF(0.45微米)濾紙上過濾溶液。通過硅膠柱色譜法進行純化(洗脫劑DCM-4DCM/MeOH，95/5，v/v)，得到化合物42油狀物(560毫克，100％)。Rf 0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v)。根據(jù)對化合物12的制備所描述的進行化合物水解。通過硅膠柱色譜法進行純化(DCM/MeOH/AcOH，90/10/3，v/v/v)，得到化合物43(185毫克，39％)。
1H-NMR(MeOD，400MHz)7.70(AB，4H，Harom苯甲脒)，7.32(m，10H，Bn)，7.12(d，2H，Tyr)，6.88(d，2H，Tyr)，5.10(d，2H，CH2Bn)，5.00(s，2H，CH2芐基)，4.67(m，1H)，4.48(m，1H)，4.06(s，2H)，3.61(m，10H)，3.52(m，2H)，3.41(m，2H)，3.32(m，2H)，3.10-2.40(m，8H)。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜12-[15-{N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰-(L-天冬氨酰-L-酪氨酰)-15-氮雜-3，6，9，12-四氧雜-十五烷酰}]-12-氮雜-3，6，9-三氧雜十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(XI)根據(jù)常規(guī)程序中描述的，將化合物43(62.2毫克)與五糖衍生物63(110毫克)偶聯(lián)，接著去保護并純化。獲得產(chǎn)物22毫克(兩步驟總的產(chǎn)率14％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.54-3.30(8x s，34H，8xOMe)；ring D5.28(d，1H，H1)，4.14(m，1H，H6a)，3.97(m，1H，H6b)，3.72(m，1H，H5)，3.37(m，1H，H3)，3.24(m，1H，H4)，3.12(m，1H，H2)；ring E4.50(d，1H，H1)，3.73(m，3H，H3，4，5)，3.16(m，1H，H2)；ring F5.16(d，1H，H1)，4.39(m，2H，H3，4)，4.24(d，1H，H6a)，4.14(m，1H，H6b)，4.00(m，1H，H2)，3.97(m，1H，H5)；ring G4.84(bs，1H，H1)，3.97(m，1H，H4)，3.66(m，2H，H2，3)；ring H4.91(d，1H，H1)，4.14(m，2H，H2，6a)，4.08(m，1H，H6b)，3.84(m，1H，H5)，3.51(m，1H，H3)；間隔基3.88(s，2H，C(O)CH2O)，3.54-3.24(m，32H)肽7.59(d，2H，Harom苯甲脒)，7.53(d，2H，Harom苯甲脒)，6.84(d，2H，HaromTyr)，6.63(d，2H，HaromTyr)，4.38(dd，1H，CH Asp)，4.21(t，1H，CH Tyr)，2.70(m，2H，CH2Tyr)，2.47(m，1H，CH2Asp)，2.30(dd，1H，CH2Asp)，2.74-2.40(m，4H，琥珀酰)。
方案4.XI的合成 方案515-羥基-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(44)向攪拌的四甘醇(40毫升)和THF(15毫升)的混合物加入叔丁醇鉀(2.8克)。將反應(yīng)混合物加熱至40-50℃，直到獲得澄清溶液。將該溶液冷卻至0℃，一次加入溴乙酸叔丁酯(4毫升，246毫摩爾)。移去冷卻浴并在RT下將反應(yīng)混合物攪拌2小時。用EtOAc稀釋并用鹽水洗滌兩次。用EtOAc將兩次得到的鹽水層萃取兩次。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并減壓濃縮，得到化合物44(4.66克)。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ4.03(s，2H)，3.60-3.76(m，16H)，1.47(s，9H).。
14-(甲苯-4-磺?；?-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(45)0℃下，向攪拌的化合物44(4.66克)的DCM(30毫升)溶液加入NMM(2毫升)和對甲苯磺酰氯(3.2克)。移開冷卻浴，在RT下將反應(yīng)混合物攪拌18小時。加入鹽水，用DCM萃取混合物三次。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并減壓濃縮，得到油狀物(7.4克)，該油狀物仍然含有起始物。將該油狀物再次溶解于DCM(30毫升)和NMM(2毫升)并加入對甲苯磺酰氯(3.2g克)，0℃下攪拌溶液。室溫下反應(yīng)2天之后加入鹽水，用DCM萃取混合物三次。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并減壓濃縮。用硅膠柱色譜法(EtOAc/庚烷，1/1，v/v)純化粗產(chǎn)物，得到化合物45(4.6克，66％)。Rf 0.15(EtOAc/庚烷1/1，v/v)。
14-[4-O-(N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸苯甲酯)]-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(47)N2氣下在70℃下加熱攪拌的Boc-Tyr-OBn(46，0.6克)，化合物45(1.0克)，碳酸銫(0.82克)和碘化鈉(0.12克)在DMF(30毫升)中的混合物。20小時之后將反應(yīng)混合物冷卻至RT并加入鹽水。用EtOAc萃取混合物(四次)。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并減壓濃縮。用硅膠色譜柱法純化粗產(chǎn)物(EtOAc/甲苯，梯度1/2至1/1，v/v)，得到化合物47(0.92克，80％)。Rf 0.15(EtOAc/庚烷，1/1，v/v)。
14-＜4-O-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-芐基-L-天冬氨酰)-L-酪氨酸芐酯}＞-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(49)0℃下，向攪拌的乙酸叔丁酯(4毫升)中化合物47(0.42克)的混合物中加入4N鹽酸二烷(2毫升)溶液。2小時之后加入硫酸(0.04毫升)，半小時后加入另一部分硫酸(0.04毫升)。又半小時后，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，并用EtOAc萃取混合物四次。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并減壓濃縮，得到化合物48(0.14克)。將該化合物溶解于THE(2毫升)，并向該攪拌的溶液加入化合物36(0.11克)，TBTU(84毫克)和30微升NMM。2小時后將反應(yīng)混合物減壓濃縮。用硅膠色譜法純化殘余物(EtOAc/EtOH，梯度1/0至9/1，v/v)，得到化合物49(90毫克，36％)。Rf 0.5(EtOAc/EtOH 9/1，v/v)。
14-＜4-O-{4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯基-琥珀酰胺酰-(O-芐基-L-天冬氨酰)-O-芐基-L-酪氨酸芐酯}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸(50)將化合物49(90毫克)溶解于二烷并減壓濃縮。將殘余物溶解于DCM(1毫升)并加入TFA(1毫升)。2小時之后加入二烷(5毫升)，并減壓濃縮混合物。殘余物溶解于乙腈并減壓濃縮。用HPLC純化殘余物柱子LUNA 10u C18(2)250×50毫米，流速50毫升/分鐘，梯度3％0.1N TFA的H2O水溶液，47％乙腈和50％H2O/乙腈(10/1，v/v)至3％0.1N TFA的H2O溶液，90％乙腈和7％H2O/乙腈(10/1v/v)，30分鐘內(nèi)，得到化合物50(73毫克，85％)。MS(EI)m/z 970[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜12-[14-{N-(4-苯甲酰氨基)-琥珀酰胺酰-(L-天冬氨酰-4-O-L-酪氨酰)-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酰}]-12-氮雜-3，6，9-三氧雜十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(XII)根據(jù)常規(guī)程序，將化合物50(40.3毫克，41.5微摩爾)與五糖衍生物63(71.1毫克，39.5微摩爾)偶聯(lián)，接著純化并去保護，獲得產(chǎn)物，為白色蓬松狀固體，產(chǎn)率63.5毫克(兩步驟總的產(chǎn)率60％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D5.36(d，1H，H1)，4.21(m，1H，H6a)，4.05(d，1H，H6b)，3.77(m，1H，H5)，3.44(m，1H，H3)，3.31(m，1H，H4)，3.19(dd，1H，H2)；ring E；4.58(d，1H，H1)，3.79(m，1H，H4)，3.67(m，1H，H5)，3.44(m，1H，H3)，3.16(m，1H，H2)；ring F5.28(d，1H，H1)，4.48(m，1H，H3)，4.32(d，1H，H6a)，4.18(m，1H，H2)，4.15(m，1H，H6b)，4.07(m，1H，H5)，3.86(t，1H，H4)；ring G4.92(bs，1H，H1)，4.07(m，1H，H4)，3.91(dd，1H，H3)，3.31(m，1H，H2)，3.18(m，1H，H5)；ring H4.98(d，1H，H1)，4.23(dd，1H，H2)，4.22(m，1H，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.93(ddd，1H，H5)，3.59(m，1H，H4)，3.57(m，1H，H3)；間隔基3.96(s，2H，C(O)CH2O)，3.61-3.51(m，26H，13x CH2O)，3.38-3.30(m，4H，OCH2CH2NHCH(O)CH2，OCH2CH2NHC(O)-Phe)，3.19(m，1H，OCH2aCH2NHC(O)-Phe)，3.12(m，1H，OCH2bCH2NHC(O)-Phe)；肽7.70(d，2H，Harom苯甲脒)，7.62(d，2H，Harom苯甲脒)，7.01(d，2H，HaromTyr)，6.77(d，2H，HaromTyr)，4.57(dd，1H，CH Asp)，4.28(dd，1H，CH Tyr)，2.87(dAB，2H，CH2Tyr，2.50(t，2H，CH2琥珀酰)，2.48(t，2H，CH2琥珀酰)，2.48(dAB，2H，CH2Asp)。
方案5.XII的合成
方案6N-(3-羧基苯磺酰)-4-O-{4-(N-芐氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸芐酯(52)將化合物51(123毫克，根據(jù)Bioorg.Med.Chem.2001，29，357-379所述制備)溶解于乙腈和水的混合物(10毫升，6/4，v/v)。加入碳酸鉀(381毫克)并將溶液冷卻至0℃。15分鐘內(nèi)分批加入3-羧基苯磺酰氯，并且在0℃將混合物攪拌30分鐘，在RT攪拌1小時。再將溶液冷卻至0℃，又加入一部分3-羧基苯磺酰氯(102毫克)。30分鐘后，將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂罵T并攪拌過夜。用1N鹽酸將混合物酸化至pH1，減壓濃縮，粗產(chǎn)物溶解于EtOAc。用1N鹽酸，飽和NaCl溶液洗滌有機層，干燥(MgSO4)并濃縮，得到化合物52(0.11克，73％)。Rf0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v)。MS(ESI)M+＝729。
N-＜3-{[14-N-(14-氮雜-1-羧基-2，5，8，11-四氧雜-十四烷酸)]-酮基}-苯磺酰＞-4-O-{4-(N-芐氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸芐酯(54)將粗產(chǎn)物化合物52(216毫克)和化合物6(49毫克)溶解于DCM(5毫升)。加入TBTU(145毫克)和NMM(82微升)，并將混合物在RT下攪拌過夜。用EtOAc稀釋混合物，用飽和NaHCO3水溶液，檸檬酸和飽和NaCl洗滌。用乙酸乙酯萃取合并的含水相，然后用MgSO4干燥合并的有機相并濃縮，得到0.31克68，為棕色油狀物。接著，在DCM(5毫升)和TFA(2.5毫升)的混合物中攪拌粗產(chǎn)物化合物53。4小時之后將混合物濃縮。通過制備LC/MS純化產(chǎn)物(C18，乙腈/H2O，0.01％TFA)，得到84毫克化合物54。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜12-N-<3-{[14-N-(4-氮雜-1-羰基-2，5，8，11-四氧雜-十四烷基)]-酮基}-苯磺酰＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸＞-12-氮雜-3，6，9-三氧雜-十二烷基＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(XIII)根據(jù)常規(guī)程序，將羧酸54(53毫克)與五糖63(95毫克)偶聯(lián)，接著純化并去保護，獲得偶聯(lián)物XIII，為白色泡沫，產(chǎn)率77毫克(兩步驟總的產(chǎn)率58％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D5.39(d，1H，H1)，4.22(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.46(m，1H，H3)，3.34(m，1H，H4)，3.24(dd，1H，H2)；ring E4.59(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.66(m，1H，H5)，3.52(m，1H，H3)，3.20(m，1H，H2)；ring F5.28(d，1H，H1)，4.48(t，1H，H3)，4.34(d，1H，H6a)，4.22(m，1H，H2)，4.09(m，1H，H5)，3.85(m，1H，H4)；ring G4.92(bs，1H，H1)，4.52(bs，1H，H5)，4.09(m，1H，H4)，3.75(1H，m，H3)，3.35(dd，1H，H2)；ring H4.99(d，1H，H1)，4.22(m，2H，H2，H6a)，4.16(m，1H，H6b)，3.91(ddd，1H，H5)，3.68(m，1H，H4)，3.60(m，1H，H3)；間隔基3.91(s，2H，C(O)CH2O)，3.66-3.32(m，32H，16x CH2).肽7.85(dt，1H，Harom)，7.75(t，1H，Harom)，7.62(dt，1H，Harom)，7.43(t，1H，Harom)，6.83(d，2H，HaromTyr)，6.48(d，2H，HaromTyr)，3.86(m，2H，CH2O)，3.65(m，1H，H-1Tyr)，3.36(m，2H，CH2N)，2.91(m，2H，CH2N)，1.91(m，2H，CH2哌啶基)，1.72(m，2H，CH2丁基)，1.59(m，1H，CH哌啶基)，1.44(m，2H，CH2丁基)，1.36(m，4H)。
ESI-MSm/z 1272.3[M+2TEA-2H]2-，814.5[M+TEA-3H]3-，799.1[M-3H]3-，585.0[M-4H]4-。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜12-N-＜N-(3-酮基-苯磺酰)-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸＞-12-氮雜-3，6，9-三氧雜-十二烷基＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(XIV)根據(jù)常規(guī)程序，將羧酸52(22.5毫克)與五糖63(52.6毫克)偶聯(lián)，接著純化并去保護，獲得偶聯(lián)物XIV，為白色泡沫，產(chǎn)率38.4毫克(兩步驟總的產(chǎn)率58％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)δ3.43-3.32(8x s，34H，8x OMe)；ring D5.39(d，1H，H1)，4.22(m，1H，H6a)，4.04(d，1H，H6b)，3.79(m，1H，H5)，3.46(m，1H，H3)，3.34(m，1H，H4)，3.20(dd，1H，H2)；ring E4.58(d，1H，H1)，3.82(m，1H，H4)，3.66(m，1H，H5)，3.52(m，1H，H3)，3.18(m，1H，H2)；ring F5.28(d，1H，H1)，4.49(t，1H，H3)，4.34(d，1H，H6a)，4.20(m，1H，H2)，4.08(m，1H，H5)，3.85(m，1H，H4)；ring G4.94(bs，1H，H1)，4.54(bs，1H，H5)，4.08(m，1H，H4)，3.75(1H，m，H3)，3.35(dd，1H，H2)；ring H4.98(d，1H，H1)，4.22(m，2H，H2，H6a)，4.17(m，1H，H6b)，3.92(ddd，1H，H5)，3.68(m，1H，H4)，3.60(m，1H，H3)；間隔基3.62-3.38(m，16H，8x CH2).肽7.83(dt，1H，Harom)，7.71(t，1H，Harom)，7.62(dt，1H，Harom)，7.42(t，1H，Harom)，6.81(d，2H，HaromTyr)，6.46(d，2H，HaromTyr)，3.84(m，2H，CH2O)，3.66(m，1H，H-1 Tyr)，3.33(m，2H，CH2N)，2.90(m，2H，CH2N)，1.93(m，2H，CH2哌啶基)，1.72(m，2H，CH2丁基)，1.59(m，1H，CH哌啶基)，1.44(m，2H，CH2丁基)，1.34(m，4H)。ESI-MSm/z 1155.2[M+2TEA-2H]2-，736.3[M+TEA-3H]3-，702.6[M-3H]3-。
方案6.XIII和XIV的合成 方案714-[4-O-(N-烯丙氧羰基-L-酪氨酰)]-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(55)
將化合物38(1.0克)溶解于DMF(50毫升)并減壓去除10毫升DMF。N2氣下將殘余物冷卻至0℃，并小批量加入氫化鈉(60％分散度，0.34克)。0℃下將懸浮液攪拌1小時。然后加入化合物45(1.3克)的DMF(4毫升)溶液。RT下反應(yīng)24小時后，減壓濃縮反應(yīng)混合物。向殘余物加水(50EtOAc洗滌混合物。加入EtOAc固體氯化鈉，并用2N鹽酸水溶液將混合物酸化至pH 3。分離有機層，干燥(Na2SO4)并濃縮。用硅膠色譜法純化殘余物(DCM/MeOH/AcOH，949/50/1，v/v/v)。將從柱子得到的產(chǎn)物溶解于EtOAc，用H2O洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮，得到化合物55(0.6克，37％)。Rf 0.4(EtOAc/吡啶/AcOH/H2O270/16/9/4，v/v/v/v)。
2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯(57)根據(jù)先前J.Med.Chem.1992，35，4393-4407中描述的制備2-[(4-哌啶基)氧]乙酸叔丁酯(56)。向化合物56(4.3克，20毫摩爾)加50毫升的DCM/TFA(1∶1)，并將溶液攪拌大約30分鐘。減壓濃縮混合物。將粗產(chǎn)物溶解于EtOH(40毫升)和NMM(7毫升)的混合物，向其中加入二碳酸二叔丁酯(4.8克，22毫摩爾)。將混合物攪拌大約55小時。接著，減壓濃縮反應(yīng)混合物。向殘余物加4M NaOH(250毫升)和Et2O，萃取后分離有機層。用2N鹽酸將水層酸化至pH 3，接著用EtOAc萃取三次。將合并的有機層干燥(硫酸鎂)并濃縮，得到2-[4-(N-Boc-哌啶基)氧]乙酸酯(2.1克，40％)。
后者粗產(chǎn)物溶解于丙酮(25毫升)和三乙胺(3.4毫升)。加入芐基溴(965微升，8.1毫摩爾)，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。
加入冰水(200毫升)和EtOAc。用2N鹽酸將混合物酸化至pH3。用飽和NaHCO3和鹽水洗滌有機層，干燥(Na2SO4)并濃縮，得到760毫克粗產(chǎn)物。用硅膠柱色譜法純化產(chǎn)物(庚烷/EtOAc，1/1，v/v)，得到418毫克(15％)純產(chǎn)物。Rf 0.47(庚烷/EtOAc，1/1，v/v)。后者產(chǎn)物溶解于DCM/TFA(10毫升，1/1，v/v)并攪拌1小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物并加入甲苯(5毫升)。溶解于EtOAc(50毫升)并用飽和NaHCO3洗滌。用EtOAc萃取含水層兩次。將合并的有機層干燥(Na2SO4)并濃縮，得到331毫克(100％)標(biāo)題化合物57。1H-NMR(MeOD，400MHz，HH)δ7.37(m，5H，Ar)，6.00(s，2H)，4.17(s，2H)，3.56(m，1H)，3.16(m，1H)，2.76(m，1H)，1.98(m，1H)1.63(m，1H)。
14-{[4-O-(N-烯丙氧羰基-L-酪氨酰)]-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(58)根據(jù)較早對化合物64描述的，將化合物(55)(400毫克，0.72毫摩爾)和(57)(215毫克，0.86毫摩爾)偶聯(lián)。通過硅膠色譜法純化產(chǎn)物(DCM→DCM/MeOH，95/5，v/v)，得到587毫克(91％)標(biāo)題化合物58。Rf 0.65(DCM/MeOH/AcOH，95/5/0.3，v/v/v)。
14-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(59)向化合物58(587毫克，0.66毫摩爾)的DCM(15毫升)溶液依次加入H2O(75微升)，嗎啉(115微升，1.32毫摩爾)和PdCl2(PPh3)2。3小時之后將反應(yīng)混合物倒入H2O/鹽水混合物(1/1，v/v)中，用DCM萃取。將有機層干燥(Na2SO4)并濃縮。通過硅膠柱色譜法純化殘余物(DCM/MeOH，9/1，v/v)，得到433毫克(89％)的標(biāo)題化合物59。Rf0.66(DCM/MeOH，9/1，v/v)。
N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲酸(60)根據(jù)對化合物3的合成所描述的，將對-氰基苯甲酸甲酯(5.0克，31毫摩爾)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二唑啉酮。將粗產(chǎn)物(4.6克，20.9毫摩爾)溶解于THF(50毫升)和MeOH(50毫升)的混合物。加入H2O(50毫升)，得到懸浮液，接著加入4N NaOH水溶液(10毫升)。6小時之后減壓蒸餾去除有機溶劑。用EtOAc/甲苯萃取含水層(1/2，v/v)，用2N鹽酸酸化并過濾沉淀物。40℃下減壓干燥粗產(chǎn)物，得到4.2克(97％)化合物60。ESI-MS207[M+H]+。
14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲?；鶀-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯}}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸叔丁酯(61)向化合物59(433毫克，0.59毫摩爾)和60(134毫克，0.65毫摩爾)的DMF(6毫升)溶液加入TBTU(227毫克，0.71毫摩爾)和NMM(130微升，1.18毫摩爾)。RT下攪拌16小時后減壓濃縮反應(yīng)混合物。加入EtOAc并用鹽水洗滌有機層，干燥(Na2SO4)并濃縮。通過HPLC(C18，ACN/H2O)純化產(chǎn)物，得到337毫克(64％)的化合物61。ESI-MS891[M+H]+，913[M+Na]+，835[M-tBu+H]+。
14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲?；鶀-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯}}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酸(62)根據(jù)先前對于化合物12的合成所描述的進行叔丁酯的水解。通過HPLC(C18，ACN/H2O/3％0.1N TFA(水溶液))純化產(chǎn)物，得到181毫克(57％)期望的化合物62。
1H-NMR(MeOD，400MHz)7.91(AB，4H，Harom苯甲脒)，7.35(m，5H，Bn)，7.19(d，2H，Tyr)，6.88(dd，2H，Tyr)，5.24(m，1H，CH Tyr)，5.18(d，2H，CH2Bn)，4.17(d，2H)，4.10(s，2H)，4.08(m，2H)，3.80(m，2H)，3.65(m，14H)，3.58(m，1H)，3.32(m，2H)，3.07(m，2H)，1.82-1.01(m，4H).ESI-MS835[M+H]+。
O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜[1-氨基-4，7，10-三氧雜十二烷基]-14-{{N-(4-[1，2，4-二唑-5-啉基]-苯甲?；鶀-{4-O-L-酪氨酰-2-[(4-哌啶基)氧]乙酸芐酯}}-3，6，9，12-四氧雜-十四烷酰＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-glucopyranuronosyl-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-idopyranuronosyl-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷甲酯八鈉鹽(XV)根據(jù)常規(guī)程序，將化合物62(51.7毫克)與五糖63(106毫克)偶聯(lián)，接著去保護并純化，產(chǎn)率127毫克(兩步驟總的產(chǎn)率87％)。
方案7.XV的合成
方案8.II，V，VIII，X-XIII，XV，XVI的合成
方案8(續(xù)) 能類似地制備，XVI 方案9.XIV的合成
方案10.參考化合物 藥理學(xué)數(shù)據(jù)I.a.ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集抑制作用體外試驗導(dǎo)入向體外人血小板富集血漿(PRP)加入二磷酸腺苷(ADP)，誘導(dǎo)血小板聚集。通過測定PRP的光密度(OD)來評價聚集作用。利用這里描述的體外試驗來測定試驗化合物對ADP-誘導(dǎo)的人血小板聚集的抑制活性。用微量滴定板讀數(shù)器同時測定幾種化合物的活性。
試驗媒體健康人志愿者的血小板，所述志愿者在前十天沒有用任何藥物。
參照化合物在該項試驗中，替羅非班(AGGRASTAT(MSD)，購買的用于靜脈內(nèi)灌注的0.25毫克/毫升濃縮液)抑制5μM ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集，濃度30-60nM時抑制50％(IC50)。
賦形劑試驗化合物應(yīng)該優(yōu)選溶解于MQ H2O，濃度是1mM。另一種可選擇的賦形劑是MQ H2O中的0.9％NaCl?；衔锶芤?或者在MQH2O中或者是MQ H2O中的0.9％NaCl)進一步在MQ H2O中的0.9％NaCl中稀釋。
技術(shù)試劑1.血小板富集血漿(PRP)從健康志愿者獲得自由流動的血液(至少100毫升)并收集在0.1體積的3.8％檸檬酸鈉.2H2O的蒸餾水溶液中(w/v)。最后的濃度是0.38％檸檬酸鈉。
RT下以1,600N/kg將檸檬酸處理的血液離心(160克)。15分鐘之后，停止轉(zhuǎn)動停止離心，收集上清液(＝PRP)。
2.ADP(Kordia/Chrono-par#384)。使用之前，制備50μM0.9％NaCl溶液。
裝備1.KX-21型Sysmex血細胞計數(shù)器。
2.帶有620nm濾器的Labsystems iEMS讀數(shù)器MF，軌道振動器設(shè)置在1,000rpm并保持37℃恒溫。用Labsystems iEMS程序測定吸收。
3.帶有針頭的血液收集系統(tǒng)600毫升，art P4203(NPBI)。
4.96孔平底微量滴定板(Greiner Labortechnik)。
程序使用Sysmex血細胞計數(shù)器對上清液(PRP)中的血小板計數(shù)，并用PPP稀釋上清液，得到含有400,000±50,000plt/μL的PRP。PRP在RT下應(yīng)該穩(wěn)定至少20分鐘但是不長過3小時。
ADP-誘導(dǎo)的聚集用吸移管將150微升PRP移到微量滴定板的孔中。加入一定濃度范圍(每種化合物7個濃度)的30微升化合物或者賦形劑，并將微量滴定板放在37℃的Labsystems iEMS讀數(shù)器MF中。然后測定620nm的光密度(OD620)。在讀數(shù)器中搖動2分鐘之后(1,000rpm)，第二次測定OD。這證實了血小板的穩(wěn)定性(不存在自發(fā)的血小板聚集)。
然后，加入20微升50μM ADP溶液，并且每14分鐘即時測定620nm的OD(

圖1)。兩次測定之間，以1,000rpm搖動平板40秒。在至少兩個使用不同志愿者的PRP的實驗中研究每種試驗化合物。通常，試驗化合物的最高的最終濃度在1E-6和1E-7M之間，化合物濃度以倍數(shù)2降低，直到實現(xiàn)小于25％的血小板聚集抑制。
響應(yīng)ADP-誘導(dǎo)的聚集作用的評價在t＝0分鐘和t＝10分鐘，計算每種化合物濃度(包括賦形劑)的平均OD。利用下面的公式計算各種濃度下的抑制百分率100％-(ODt＝0分鐘的化合物-ODt＝10分鐘的化合物)×100％/(ODt＝0分鐘的賦形劑-ODt＝10分鐘的賦形劑)試驗化合物的IC50是ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集作用被減小50％的試驗化合物的濃度。為此，以抑制百分率值對化合物濃度做圖。然后，利用Graphpad Prism 3.0(可變斜率)計算試驗化合物的IC50，nH(Hill斜率)和效力。
需要的量2毫克。
參考Salmon，D.M.(1996)Thrombosis Research 84，213-216.
表1.ADP-誘導(dǎo)的(5μM)人血小板聚集作用的抑制(IC50)
na＝試驗次數(shù)；b根據(jù)Caron等，(2002)J.Cardiovasc.
Pharmacol.40，296-306所述使用Chronolog聚集作用測定儀測定血小板聚集。
I.b.TRAP誘導(dǎo)的人血小板聚集抑制作用體外試驗導(dǎo)入體外向洗滌過的人血小板(WPL)加入trombin受體激動劑肽(TRAP)，誘導(dǎo)血小板聚集。通過測定WPL的光密度來評價聚集作用。利用這里描述的體外試驗來測定試驗化合物抑制TRAP-誘導(dǎo)的人血小板聚集的活性。用微量滴定板讀數(shù)器同時測定幾種化合物的活性。
試驗媒體健康人志愿者的血小板，所述志愿者在前十天沒有用任何藥物。
參照化合物在該項試驗中，替羅非班(AGGRASTAT(MSD)，購買的用于靜脈內(nèi)灌注的0.25毫克/毫升濃縮液)抑制5μM TRAP誘導(dǎo)的人血小板聚集，最終濃度30-60nM時抑制50％(IC50)。
賦形劑試驗化合物應(yīng)該優(yōu)選溶解于MQ H2O，濃度是1mM。另一種可選擇的賦形劑是MQ H2O中的0.9％NaCl?；衔锶芤?或者在MQH2O中或者是MQ H2O中的0.9％NaCl)進一步在MQ H2O中的0.9％NaCl中稀釋。
技術(shù)試劑1.血小板富集血漿(PRP)從健康志愿者獲得自由流動的血液(至少100毫升)并收集在0.1體積的3.8％檸檬酸鈉.2H2O的MQ H2O溶液中(w/v)。最后的濃度是0.38％檸檬酸鈉。RT下在HettichRotanta/AP離心機(750rpm)中以1,600N/kg將檸檬酸處理的血液離心(160克)。15分鐘之后，停止轉(zhuǎn)動停止離心，收集上清液(＝PRP)。
2.洗滌過的血小板(WPL)每毫升PRP加入新制備的1微升PGI2溶液后，在Hettich Rotanta/AP離心機(即，2,800rpm)，RT下，以13,500N/千克(1,350克)將懸浮液離心10分鐘。將沉淀重新溫和懸浮在相同體積的含有5ng/毫升PGI2的新鮮Watson緩沖液后，再次在RT下將懸浮液以1,350克(2,800rpm)離心10分鐘。最后的血小板沉淀重新懸浮于Watson緩沖液，達到大約400,000±50,000血小板/毫升。
3.Watson緩沖液MQ H2O中134mM NaCl，2.9mM KCl，12mM NaHCO3，0.34mMNa2HPO4.2H2O，1mM MgCl2.6H2O，5mM葡萄糖和5mM HEPES。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4。
4.前列腺素I2(Sigma，P6188粉末)
以100微升等份在-20℃貯存1M KOH中1毫克/毫升PGI2貯存液。僅在使用之前，制備MQ H2O中冰冷0.9％NaCl中的5微克/毫升溶液。
5.人纖維蛋白原(Kordia/ERL，art nrFIB 2粉末)0.5克纖維蛋白原粉末溶解于真空下的50毫升MQ H2O中。這種貯存液以1毫升等份貯存在-20℃。使用之前，制備0.5毫克/毫升鹽水溶液。
6.TRAP使用之前，制備MQ H2O中0.9％NaCl中的50μM TRAP溶液。對于每一次試驗，制備新鮮溶液。
裝備1.KX-21型Sysmex細胞計數(shù)器。
2.帶有405nm濾器的Labsystems iEMS讀數(shù)器MF，軌道振動器設(shè)置在1,000rpm并保持37℃恒溫。用Labsystems iEMS程序測定吸收。
3.帶有針頭的血液收集系統(tǒng)600毫升，art nr P4203(NPBI)。
4.96孔平底微量滴定板(Greiner Labortechnik)。
程序使用Sysmex血細胞計數(shù)器對WPL濃縮物計數(shù)，并用Watson緩沖液稀釋懸浮液，獲得400,000±50,000plt/μL的濃度。使用之前，讓W(xué)PL在室溫下穩(wěn)定至少20分鐘但是不長過3-4小時。
TRAP-誘導(dǎo)的聚集用吸移管將150微升WPL移到微量滴定板的孔中。加入15微升化合物或者賦形劑和15微升纖維蛋白原溶液，并將微量滴定板放在37℃微量滴定板讀數(shù)器中。然后測定405nm的光密度(OD)。在讀數(shù)器中搖動2分鐘之后，再次測定OD405。證實血小板的穩(wěn)定性(不存在自發(fā)的血小板聚集)。加入20微升50μM TRAP，并且每14分鐘即時測定405nm的OD405。兩次測定之間，以1,000rpm搖動平板40秒(圖1)。為了測定試驗化合物的IC50，在至少兩個使用不同志愿者的WPL的實驗中研究每種試驗化合物。通常，起始化合物在培養(yǎng)基質(zhì)中的濃度在1E-6M和1E-7M之間，化合物濃度以倍數(shù)2降低，直到實現(xiàn)小于25％的血小板聚集抑制。
響應(yīng)的評價在t＝0分鐘和t＝10分鐘，計算每種化合物濃度(包括賦形劑)的平均OD。利用下面的公式計算各種濃度下的抑制百分率100％-(ODt＝0分鐘的化合物-ODt＝10分鐘的化合物)×100％/(ODt＝0分鐘的賦形劑-ODt＝10分鐘的賦形劑)以化合物濃度對抑制百分率值做圖。利用Graphpad Prism 3.0(可變斜率)計算試驗化合物的IC50，nH(Hill斜率)和效力。試驗化合物的IC50是TRAP-誘導(dǎo)的血小板聚集作用被減小50％的試驗化合物的濃度。
需要的量2毫克。
參考Salmon，D.M.(1996)Thrombosis Research 84，213-216.
表2.TRAP(5μM)-誘導(dǎo)的人血小板聚集作用的抑制(IC50)
na＝試驗次數(shù)；b根據(jù)Caron等，(2002)J.Cardiovasc.
Pharmacol.40，296-306所述使用Chronolog聚集作用測定儀測定血小板聚集。
II.緩沖液中抗-因子Xa活性的測定(微量滴定板方法)導(dǎo)入激活的因子X(Xa)是血凝固級聯(lián)中的一個因子；抗凝血酶(AT-III)對其活性稍有抑制?？鼓獎┠苤苯右种芚a，或者象肝素一樣，通過加強AT-III的抑制活性。通過測定產(chǎn)色反應(yīng)物S-2222在AT-III存在下的水解速率能評價抗-Xa活性。應(yīng)用這項試驗來測定Kabi緩沖液中類肝素制劑的抗-Xa活性。
試驗介質(zhì)Kabi緩沖液參考化合物國際標(biāo)準肝素(11.4抗-XaU/毫克)。
技術(shù)試劑1.Kabi緩沖液緩沖液成分NaCl 10.17克(174毫摩爾)；乙二胺四乙酸二鈉二水合物3.26克(9.6毫摩爾)；tromethamine(Tris)6.11克(50.4毫摩爾)；用超純水補充至1升*。用鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至7.4(0.10摩爾/L)。
*對于所有的水溶液使用超純水(Milli-Q質(zhì)量)。
2.Xa溶液將牛因子Xa(Kabi Diagnostica，Stockholm，Sweden)溶解于Kabi緩沖液，得到含有1.5U/毫升(0.75nKat/毫升)的溶液。
3.S-2222溶液將S-2222(Kabi Diagnostica)溶解于超純水，得到含有0.375毫克/毫升(0.5毫摩爾/升)。
4.AT-III溶液將人AT-III(Kabi Diagnostica)溶解于Kabi緩沖液，得到含有0.25U/毫升的溶液。必須每天制備新鮮溶液。
5.校準樣品的標(biāo)準溶液將標(biāo)準肝素溶解于Kabi緩沖液，得到含有大約0.25抗-XaU/毫升的標(biāo)準溶液。
步驟試驗樣品的制備將每種制劑溶解于超純水并且用Kabi緩沖液稀釋至0.02-0.2抗-XaU/毫升范圍的必需濃度。
Xa活性的測定用吸移管將各種試驗樣品(0.05毫升)移到RT下的微量滴定板的孔中。向各樣品加入AT-E溶液(0.05毫升)，并使用Vari-搖動器搖動平板。
用吸移管將Xa溶液(0.05毫升)移到各孔10分鐘之后加入AT-III溶液并再次搖動平板，精確2分鐘之后加入Xa溶液，將0.1毫升S-2222溶液用吸移管移到各孔并再次搖動平板。所有的加入都使用12-管吸移管。
殘留量的Xa催化S-2222的水解，RT下分別培養(yǎng)2和22分鐘之后用光度測量法測定水解速度。使用310C型Microelisa讀數(shù)器(Organon Teknika，Oss，The Netherlands)在405nm測定各樣品吸光度，并計算吸光度的增加(ΔOD)。對每種試驗樣品都測定兩次。每10個樣品包括一個空白樣品(0.05毫升Kabi緩沖液)。
校準曲線從一等份校準樣品標(biāo)準溶液制備一定范圍的稀釋物(對于肝素樣品稀釋倍數(shù)是1,3)。得到的標(biāo)準樣品(大約15個樣品)應(yīng)該含有0,01-0,25抗-XaU/毫升。在各輪中，根據(jù)Xa活性的測定一節(jié)中所述，對0,05毫升的每一個標(biāo)準樣品測定至少三次。利用最小二乘方，通過將直線擬合下面的式子獲得校準曲線log[平均ΔOD(空白)-平均ΔOD(標(biāo)準樣品)]/平均ΔOD(標(biāo)準樣品)對log抗-Xa U/毫升值。
響應(yīng)評價對于每一個樣品，利用校準曲線測定平均抗-Xa活性，單位U/毫升。為了比較，也給出了自由五糖XXII的抗-Xa活性數(shù)據(jù)，XXII是偶聯(lián)物寡糖部分的“母體”。
表3.五糖偶聯(lián)物的抗-Xa活性
藥動學(xué)對豚鼠(DH)給與0.5微摩爾/千克(i.v.)抗凝劑。通過如上所述，在特定時間間隔對血漿抗-Xa活性進行來自體內(nèi)測定來間接獲得五糖XXII，偶聯(lián)物寡糖部分的“母體”，和偶聯(lián)物VIII的半存留期。利用LC-MS/MS，通過測定特定時間間隔的血漿濃度來測定參考GpIIb/IIIa拮抗劑XVII，XIX和XX(見方案10)的半存留期。
圖1豚鼠0.5摩爾/千克的動力學(xué)結(jié)論當(dāng)與參考GPIIb/IIIa拮抗劑比較時，部門的偶聯(lián)物VIII的半存留期顯著延長。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式A的化合物寡糖-間隔基-GpIIb/IIIa拮抗劑(A)，其中所述寡糖是帶負電荷的寡糖殘基，包括4-25個單糖單元，帶正電荷的抗衡離子補償電荷，并且其中寡糖殘基衍生自本身具有(AT-III介導(dǎo)的)抗-Xa活性的寡糖；間隔基是一個鍵或者基本上無藥學(xué)活性的連接殘基；GpIIb/IIIa拮抗劑是模擬纖維蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的殘基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于與另一個相距10-20埃的殘基中的堿性部分；或者其藥學(xué)可接受鹽或其前體藥物或溶劑合物。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述間隔基是基本上無藥學(xué)活性的連接殘基。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中所述間隔基有1-50個原子的長度。
4.權(quán)利要求1-3任一項的化合物，其中所述間隔基包括至少一個-(CH2CH2O)-單元。
5.權(quán)利要求1-4任一項的化合物，其中所述寡糖有4-16個單糖單元。
6.權(quán)利要求1-5任一項的化合物，其中所述寡糖是硫酸化五糖殘基。
7.權(quán)利要求5的化合物，其中所述五糖殘基有結(jié)構(gòu)B 其中R1獨立地是OSO3-或(1-8C)烷氧基，電荷被帶正電荷的抗衡離子補償。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中所述五糖殘基有結(jié)構(gòu)C 其中R1是OCH3或OSO3-，電荷被帶正電荷的抗衡離子補償。
9.權(quán)利要求1-8任一項的化合物，其中所述GpIIb/IIIa拮抗劑殘基選自衍生自Ro 435054，SC 54701(珍米洛非班)，RWJ 50042，sibrafiban(Ro 443888)，拉米非班(Ro 449883)，GPI 562，F(xiàn)K 633，替羅非班(MK 383)，奧布非班(SC 57101)，表非替得(C6822)，roxifiban(XV459)，elarofiban(RWJ53308)，SR121566(SR121787的活性形式)，來達非班(BIBU 52)，lotrafiban(SB 214857)，gantofiban(YM028)，T-250，EF 5077，ZD 2486，TAK 029，TP 9201，或L 703014的殘基。
10.權(quán)利要求1-8任一項的化合物，其中所述GpIIb/IIIa拮抗劑具有結(jié)構(gòu)DY-N(H)-C(O)-X(D)，其中Y是N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)或N(H)-C(O)-C(R2)(CH2芳基)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，O-亞苯基-C(R2)2-C(R2)(COOH)-N(H)-C(O)-C(R2)(C(R2)2COOH)，O-亞苯基-C(R2)2-C(R2)(C(O)-R3-O-C(R2)2COOH)，其中R2獨立地是H或(1-4C)烷基；并且其中芳基是苯基，羥基苯基，苯硫基或吡啶基，并且R3是哌啶基；而X是芐脒，(CH2)2-N(H)-C(O)-芐脒，(CH2)2-C(O)-N(H)-芐脒或者 其中n是0，1，2或3。
11.權(quán)利要求1的化合物，選自下面的化合物 和
12.結(jié)構(gòu)式A的化合物的制備方法，包括一個步驟，其中非必需修飾的GPIIb/IIIa拮抗劑殘基(a)與寡糖直接偶聯(lián)或者(b)與寡糖-間隔基殘基偶聯(lián)或者(c)與間隔基偶聯(lián)，其接著與寡糖-間隔基-殘基偶聯(lián)。
13.含有權(quán)利要求1-11任一項的化合物和藥學(xué)合適的輔助劑的藥物組合物。
14.權(quán)利要求1-11任一項的化合物在治療中的用途。
15.權(quán)利要求1-11任一項的化合物在制備用于治療或預(yù)防栓塞疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(A)的化合物，寡糖－間隔基－GpIIb/IIIa拮抗劑(A)，其中所述寡糖是帶負電荷的寡糖殘基，包括4－25個單糖單元，帶正電荷的抗衡離子補償電荷，并且其中寡糖殘基衍生自本身具有(AT－III介導(dǎo)的)抗－Xa活性的寡糖；間隔基是一個鍵或者基本上無藥學(xué)活性的連接殘基；GpIIb/IIIa拮抗劑是模擬纖維蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的殘基，典型地包括非必需酯化的羧酸酯部分和位于與另一個相距10－20埃的殘基中的堿性部分；或者其藥學(xué)可接受鹽或其前體藥物或溶劑合物。本發(fā)明的化合物具有抗凝活性，并且能用于治療或預(yù)防栓塞疾病。
文檔編號C07H15/04GK1930182SQ200580007002
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者R·C·布伊斯曼, M·德科特, D·G·莫伊勒曼, C·范貝克爾 申請人:賽諾菲-安萬特