專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療癌癥的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療某些腫瘤的、包含多元酚例如矢車(chē)菊苷配質(zhì)(procyanidins)及其衍生物的組合物及其使用方法，更通常地說(shuō)，是在腫瘤細(xì)胞中引起超磷酸化(hyperphosphorylation)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用，其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
原花青素類(lèi)(proanthocyanidins)由于其廣泛的生物學(xué)活性在醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域非常引人注目(例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,638,971)。目前申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)矢車(chē)菊苷配質(zhì)及其衍生物的特異性抗癌特性和它們對(duì)涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)的影響。這樣的蛋白質(zhì)的實(shí)例為Cdc2、AKT、分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor)、p53和pRb。
Cdc2是控制細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡兩者中的重要的蛋白激酶[Konishi，Y.et al.，Molec.Cell，91005-1016，2002]。Cdc2 Tyr15殘基的磷酸化作用抑制其功能并產(chǎn)生對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的紫杉醇(Taxol)的耐藥性[Tan，M.et al.，Molec.Cell，9993-1004，2002]。
由已知的致癌基因編碼的AKT，也稱(chēng)為蛋白激酶B，是在促進(jìn)廣泛的細(xì)胞類(lèi)型的存活中起核心作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶[Khwaja，A.，Nature，pp.33-34(1990)]。AKT的抑制作用引起人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，證明AKT可能是用于癌癥治療和其它增殖性疾患的重要目標(biāo)[Zang，Q.Y.，et al.，Oncogene，19(2000)]。實(shí)際上，AKT通常用作卵巢癌和乳腺癌的標(biāo)志。AKT通過(guò)使分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)在氨基酸位置Ser256上磷酸化(導(dǎo)致對(duì)FKHR功能的抑制)促進(jìn)細(xì)胞存活[Brunet，A.，et al.，Cell，96857-868(1999)]。AKT介導(dǎo)的FKHR的Ser256的磷酸化通過(guò)減低FKHR控制的Fas配體的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡[Jackson，J.G.et al.，Oncogene，1984574-4581，2000；Nakamura，N.et al.，Mol.Cell.Biol.，208969-8982，2000；Rena，G.et al.，EMBO J.，212263-2271，2002]。
與惡性化有關(guān)的早期基因變化涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程的基因并且由于視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(pRb)和p53細(xì)胞周期通路的缺陷，這些變化常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中的G1關(guān)卡的丟失[Lomazzi，M.et al.，NatGenet.，31190-194，2002]。這些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后的修飾似乎是它們功能調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。
例如，p53的Ser392的磷酸化作用通過(guò)使p53四聚物形成穩(wěn)定而激活特異性的DNA結(jié)合功能[Keller，D.M.et al.，Molec.Cell，7283-292，2001；Fiscella，M.，et al.，Oncogene，93249-3257，1994]。有報(bào)道幾種應(yīng)激刺激也使Ser392(小鼠中的Ser389)磷酸化。另外，最近的對(duì)人腫瘤中的p53磷酸化的分析顯示在被分析的10個(gè)位點(diǎn)中，Ser15、Ser81和Ser392殘基的超磷酸化和乙?；饔么嬖谟谧畛Ｒ?jiàn)的修飾中[Minamoto，T.K.，et al.，Oncogene，203341-3347，2001]。人腫瘤中的p53在Ser392的增強(qiáng)的磷酸化作用是經(jīng)常發(fā)生的[Furihata，M.et al.，J.Pathos.，19782-88，2002]。
pRb的絲氨酸殘基也關(guān)鍵地涉及到G1/S轉(zhuǎn)換中。已知細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D-Cdk4使pRb在Ser780和可能在Ser795磷酸化[Kitagawa，M.，et al.，EMBO J.，157060-7069，1996；Panigone，S.et al.，Oncogene，194035-4041，2002]。已有報(bào)道，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和視黃酸兩者通過(guò)使pRb在Ser780、Ser795和Ser807/811脫磷酸化引起G1細(xì)胞周期停留[Hu，X.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，276930-939，2000；Dimbert，A.et al.，Blood，992199-2206，2002]。
因此，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是用于腫瘤治療有用的標(biāo)靶。目前，在本領(lǐng)域中需要能夠靶向使這些蛋白質(zhì)超磷酸化和/或過(guò)度表達(dá)以預(yù)防和/或治療增殖性生長(zhǎng)的化合物?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物及其組合物對(duì)于這些應(yīng)用是有效的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于治療某些腫瘤，特別是某些癌癥的組合物、產(chǎn)品和方法，更通常地說(shuō)，涉及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用。
一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明化合物例如矢車(chē)菊苷配質(zhì)或其衍生物的組合物，例如藥物、食物、食物添加劑或膳食補(bǔ)充劑。所述組合物可任選包含另外的化學(xué)治療劑，或可與另外的化學(xué)治療劑聯(lián)合給予。包含以上所提到的組合物的包裝產(chǎn)品以及用于治療腫瘤的標(biāo)簽和/或說(shuō)明書(shū)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，例如Cdc2、FKHR、p53和pRb的脫磷酸化的方法，其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使轉(zhuǎn)化。
在又一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)給予哺乳動(dòng)物，例如人或脊椎動(dòng)物，有效量的矢車(chē)菊苷配質(zhì)或其衍生物治療腫瘤(其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用)的方法?？傊景l(fā)明涉及通過(guò)給予有效量的本發(fā)明化合物治療哺乳動(dòng)物，例如人或脊椎動(dòng)物的腫瘤的方法。癌癥的非限制性的實(shí)例為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和胰腺癌。
在再一方面，本發(fā)明涉及一種方法，該方法包括(i)繪制(profiling)患者的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，例如Cdc2、AKT、FKHR、p53、細(xì)胞周期蛋白D1和pRb的過(guò)度表達(dá)和/或超磷酸化狀態(tài)，和(ii)通過(guò)給予有效量的本發(fā)明化合物治療表現(xiàn)為這些蛋白質(zhì)的超磷酸化和/或過(guò)度表達(dá)的患者。
圖的簡(jiǎn)述

圖1A-C表示經(jīng)五聚物處理的人乳腺癌細(xì)胞的LPS(分層蛋白掃描)多孔板和免疫印跡分析的結(jié)果。A)以100μg/mL的五聚物(T)處理48和72小時(shí)的MDA MB-231細(xì)胞和以DMSO(C)處理的對(duì)照細(xì)胞的LPS斑點(diǎn)印跡(LPS dot blot)；B)與在A)中相同樣本的蛋白質(zhì)印跡；C)從它們的磷酸化狀態(tài)以抗體獨(dú)立檢定的Cdc2、FKHR、p53和pRb的再探測(cè)膜(reprobed membranes)的蛋白質(zhì)印跡。為了測(cè)試荷載(loading)的相等性，印跡以GAPDH再探測(cè)。結(jié)果為使用相同的蛋白質(zhì)樣本的兩個(gè)獨(dú)立的免疫印跡分析的代表。
圖2A-B表示以五聚物處理的人乳腺癌細(xì)胞中的p53的高分辨圖。A)以五聚物處理48和72小時(shí)的MDA-MB-231細(xì)胞和相應(yīng)的以DMSO處理的對(duì)照組的LPS免疫印跡；B)在從A)的單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中以五聚物和DMSO處理72小時(shí)的MDA MB-231、MDA MB-468和MCF-7細(xì)胞的LPS免疫印跡。為了測(cè)試荷載的相等性，印跡以GAPDH探測(cè)。數(shù)據(jù)為使用相同的蛋白質(zhì)樣本的兩個(gè)獨(dú)立的免疫印跡分析的代表。
圖3表示以五聚物處理的人乳腺癌細(xì)胞中的pRb(使用LPS-免疫印跡技術(shù))的高分辨圖。為了測(cè)試荷載的相等性，印跡以GAPDH探測(cè)。數(shù)據(jù)為使用相同的蛋白質(zhì)樣本的兩個(gè)獨(dú)立的免疫印跡分析的代表。
詳細(xì)描述所有的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和在申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合于本文。如果有任何矛盾，以本公開(kāi)內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及包含有效量的具有下式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)的組合物
其中n是從2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如通過(guò)酯鍵，被酚的部分任選取代。
上式中的單體單元可經(jīng)由4→6和4→8鍵結(jié)合。糖可選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖優(yōu)選單糖或二糖。酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羥基苯甲酸和芥子酸。衍生物的實(shí)例包括苷、五倍子酸酯、酯、化合物An的氧化產(chǎn)物等。氧化產(chǎn)物可如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,554,645(其相應(yīng)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文)中公開(kāi)的那樣制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)
其中n是從2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6和C-8上；和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
上式中的單體單元可經(jīng)由4→6和4→8鍵結(jié)合。糖可選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖優(yōu)選單糖或二糖。酚的部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羥基苯甲酸和芥子酸。衍生物的實(shí)例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化產(chǎn)物等。
對(duì)產(chǎn)品和在本發(fā)明的方法中有用的化合物實(shí)例包括其中整數(shù)n是3-18；2-12；3-12；2-5；4-12；5-12；4-10或5-10的化合物。在一些實(shí)施方案中，化合物是矢車(chē)菊苷配質(zhì)四聚物或五聚物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合體化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)具有下式 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6和C-8上；和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；所述糖在任何位置上，例如通過(guò)酯鍵，被酚的部分任選取代。
上式中的單體單元可經(jīng)由4→6和4→8鍵結(jié)合。糖可選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖優(yōu)選單糖或二糖。酚的部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羥基苯甲酸和芥子酸。衍生物的實(shí)例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化產(chǎn)物等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合體化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)具有下式 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6和C-8上；和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
上式中的單體單元可經(jīng)由4→6和4→8鍵結(jié)合。糖可選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖優(yōu)選單糖或二糖。酚的部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羥基苯甲酸和芥子酸。衍生物的實(shí)例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化產(chǎn)物等。
五聚物的實(shí)例可為[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表兒茶素和C是兒茶素。
在一個(gè)實(shí)施例中，五聚物具有下式 可以使用純化的單個(gè)的五聚物和五聚物混合物。純度可以例如至少約為50％，或至少約為60％，或至少約為70％，或至少約為80％，或至少約為90％，或至少約為92％，或至少約為95％，或至少約為98％，或至少約為99％?？梢允褂靡陨霞兌鹊娜魏问紸n的化合物、其鹽和衍生物。
使用方法本發(fā)明涉及用于某些腫瘤，特別是某些癌癥的治療的方法，更通常地說(shuō)，涉及誘導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用。依據(jù)在此描述的方法所要治療的癌癥的非限制性的實(shí)例為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和胰腺癌。在本申請(qǐng)中描述的任何化合物可被用于實(shí)施在此描述的方法。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)、促進(jìn)或刺激腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用(其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使轉(zhuǎn)化)的方法，該方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)接觸 其中n是從2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如通過(guò)酯鍵，被酚的部分任選取代。
例如，上述方法可涉及化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)的應(yīng)用，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Z和Y是氫。在上述方法的一些實(shí)施方案中，式An中的糖優(yōu)選單糖或二糖。適合的糖的實(shí)例為葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。酚的部分的實(shí)例如上所述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)、促進(jìn)或刺激腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用(其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使轉(zhuǎn)化)的方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)接觸 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6和C-8上；和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
五聚物的實(shí)例可為[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表兒茶素和C是兒茶素。
在一個(gè)實(shí)施例中，五聚物具有下式
如在此所使用的，“細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白”為或者直接或者間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)。直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白質(zhì)的實(shí)例為Cdc2、p53和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白(pRb)，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)的實(shí)例為分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)。因此，在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)、促進(jìn)或刺激腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用的方法將會(huì)涉及Cdc2、p53、pRb和/或FKHR。更具體地說(shuō)，該方法涉及誘導(dǎo)、促進(jìn)或刺激在氨基酸位置Tyr15的超磷酸化Cdc2、在氨基酸位置Ser392的超磷酸化p53、在氨基酸位置Ser256的超磷酸化FKHR和在氨基酸位置Ser780、Ser795和Ser807/811中至少一個(gè)超磷酸化pRb的脫磷酸作用。
詞組“超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白”指的是那些磷酸化狀態(tài)是異常的(即不像在正常功能的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那樣)引起蛋白質(zhì)功能改變和細(xì)胞周期變化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。應(yīng)該理解“超磷酸化”促使正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即它是導(dǎo)致腫瘤生成和細(xì)胞的腫瘤表型的起主要作用的因子。
本發(fā)明還涉及治療其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤的方法，包括給予罹患所述腫瘤的人或脊椎動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物) 其中n是從2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如通過(guò)酯鍵，被酚的部分任選取代。
例如，上述方法可涉及給予化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Z和Y是氫。在上述方法的一些實(shí)施方案中，式An中的糖優(yōu)選單糖或二糖。適合的糖的實(shí)例為葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。酚部分的實(shí)例如上所述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤的方法，該方法包括給予罹患所述腫瘤人或脊椎動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物) 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6和C-8上；和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
五聚物的實(shí)例可為[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表兒茶素和C是兒茶素。
在一個(gè)實(shí)施例中，五聚物具有下式
如在此所使用的，“治療”意為例如通過(guò)減緩疾病進(jìn)程、延長(zhǎng)存活時(shí)間、降低死亡風(fēng)險(xiǎn)和/或誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化狀態(tài)可量化的減少，改善現(xiàn)有的病癥，例如，其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤。
以上的治療方法涉及，例如治療其中Cdc2、p53、pRb和/或FKHR的超磷酸化促使腫瘤表型的腫瘤。更具體地，該方法可涉及其中在氨基酸位置Tyr15的超磷酸化Cdc2、在氨基酸位置Ser392的超磷酸化p53、在氨基酸位置Ser256的超磷酸化的FKHR和/或在氨基酸位置Ser780、Ser795和Ser807/811中至少一個(gè)上超磷酸化的pRb促使腫瘤表型的腫瘤的治療。所要治療的腫瘤的實(shí)例為乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌。
詞組“其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤“指的是在其發(fā)展中超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白至少是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的因素之一的腫瘤。
本發(fā)明還包括在罹患至少在氨基酸位置Ser392上超磷酸化的過(guò)度表達(dá)p53的腫瘤的人中，治療腫瘤，特別是癌癥的方法。這樣的癌癥的實(shí)例為乳腺癌和結(jié)腸癌。
還提供治療人或脊椎動(dòng)物中過(guò)度表達(dá)AKT激酶的癌癥的方法。這樣的癌癥的實(shí)例為過(guò)度表達(dá)AKT的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌或結(jié)腸直腸癌。過(guò)度表達(dá)AKT激酶的患者適于用本發(fā)明化合物治療，因?yàn)樽鳛榘┌Y預(yù)兆性標(biāo)志之一的AKT，使在氨基酸位置Ser256的FKHR磷酸化并抑制之，因而阻止細(xì)胞走向細(xì)胞凋亡。本發(fā)明化合物還適于和AKT抑制劑一起的聯(lián)合療法。AKT抑制劑的實(shí)例包括SRI國(guó)際實(shí)驗(yàn)藥物SR13668。
還提供治療人或脊椎動(dòng)物的過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的腫瘤，特別是癌癥的方法。這樣的癌癥的實(shí)例為過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的乳腺癌；這樣的過(guò)度表達(dá)發(fā)生在約50％的乳腺癌患者中。細(xì)胞周期蛋白D1在腫瘤發(fā)生和分化中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期蛋白D1基因編碼使腫瘤抑制蛋白質(zhì)pRb磷酸化和失活的全酶的調(diào)節(jié)亞單位。因此，過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的患者適合用本發(fā)明化合物治療。本發(fā)明化合物還適于和靶向細(xì)胞周期蛋白D1的化學(xué)治療劑一起的聯(lián)合療法。這樣的藥物的實(shí)例為抑制細(xì)胞周期蛋白D1的視黃醛衍生物、維生素A的天然的和合成的衍生物。參見(jiàn)Petty et al.，Lung Cancer，2003 Aug；41 Suppl 1S155-61，其臨床前和臨床研究的描述通過(guò)引用結(jié)合于本文。
在罹患對(duì)紫杉醇(Taxol)的治療產(chǎn)生耐藥的癌癥的人或脊椎動(dòng)物中治療腫瘤，特別是癌癥的方法也在本發(fā)明的范圍中。通過(guò)ErbB2使Cdc2的Tyr15磷酸化將抑制Cdc2的激活并產(chǎn)生對(duì)紫杉醇(paclitaxel)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的抵抗。因?yàn)楸景l(fā)明化合物可使在Tyr15的Cdc2脫磷酸化，因此可治療對(duì)紫杉醇耐藥的患者。本發(fā)明化合物可單獨(dú)給予或在與紫杉醇聯(lián)合療法中一起給予。
可使用本發(fā)明化合物和至少一種另外的化學(xué)治療劑實(shí)施以上任何方法。除了以上所提到的化學(xué)治療劑，也可使用例如AKT和細(xì)胞周期蛋白D1抑制劑，生長(zhǎng)因子抑制劑。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、胰島素生長(zhǎng)因子受體(IGFR)和Her-2的抑制劑是典型范例。這樣的藥物的實(shí)例為酪氨酸激酶受體的抑制劑，例如C225，一種抗EGFR單克隆抗體(Overholser et al.，Cancer 2000 Jul 1；89(1)74-82)和曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin，Genentech)，一種有效的和給過(guò)度表達(dá)該受體的乳腺癌患者的抗ErbB2受體的單克隆抗體處方藥；結(jié)合位點(diǎn)在酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶上的三磷酸腺苷的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，例如ZD1839(還已知為吉非替尼(gefitinib)或易瑞沙(Iressa)，參見(jiàn)www.clinicaltrials.gov)；OSI-774(TarcevaTM；參見(jiàn)Prados et al.，9thASCO Annual Meeting，Chicago，IL，Msy 31-June 3，2003(ClinicalStudy，Abstract No.394)；CI-1033，ErbB2抑制劑(參見(jiàn)clinicaltrials.gov)，以上的參考資料通過(guò)引用結(jié)合于本文。
在一些實(shí)施方案中，可給予本發(fā)明化合物，以提高化學(xué)治療劑和/或方法的應(yīng)答。為了此目的，也可使用非藥物的劑型，例如膳食補(bǔ)充劑和食物。
本發(fā)明還包括在具有發(fā)展腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的患者(其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用)中，通過(guò)給予本發(fā)明化合物，引起超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用預(yù)防(化學(xué)預(yù)防)腫瘤，特別是癌癥的方法。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”意為降低與發(fā)展疾病有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，包括減少疾病的發(fā)生。
詞組“具有發(fā)展腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的患者”意為與其它健康的人群比較，具有在有發(fā)展腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)因子的人群中增加腫瘤的可能性特征的患者。風(fēng)險(xiǎn)因子可以是暴露于紫外射線或接觸化學(xué)劑。
以上的描述方法可用于人或脊椎動(dòng)物，例如狗、貓和馬。
因此，以下的應(yīng)用在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如上所定義的化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于引起在腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用(其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使轉(zhuǎn)化)的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品(nutraceutical)或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。如上所定義的化合物An，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于治療其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的實(shí)例為Cdc2、p53、FKHR和pRb。
以下的應(yīng)用為一些實(shí)施方案的代表。如在此定義的式An化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于治療過(guò)度表達(dá)至少在氨基酸位置Ser392上被超磷酸化的p53的腫瘤的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。如在此定義的式An化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于治療過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的腫瘤的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。如在此定義的式An化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于治療過(guò)度表達(dá)AKT的腫瘤的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。如在此定義的式An化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，在用于治療對(duì)以紫杉醇(Taxol)治療耐藥的癌癥的藥物、食物、營(yíng)養(yǎng)保健品或膳食補(bǔ)充劑的制備中的應(yīng)用。
以上描述的方法還可包括，通過(guò)例如測(cè)試其超磷酸化待治療的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化狀態(tài)，確定治療的有效性。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于它對(duì)腫瘤特別是癌癥的治療提供了個(gè)性化給藥方法。對(duì)于每位患者，可評(píng)價(jià)他/她的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)以及適合的可以應(yīng)用的本發(fā)明化合物和方法。因此，對(duì)患者的描圖和隨后對(duì)他們的治療的方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本領(lǐng)域內(nèi)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該理解，可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法和試劑測(cè)定被繪圖(profiled)的和/或待治療的患者的過(guò)度表達(dá)。例如，可采用適合的抗體(例如抗AKT或抗細(xì)胞周期蛋白D1抗體)，使用蛋白質(zhì)印跡法，或者，如果過(guò)度表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平，采用適合的核酸探針，使用DNA(Southern)和RNA(Northern)印跡法檢測(cè)過(guò)度表達(dá)?？墒褂米R(shí)別磷酸化的氨基酸殘基的抗體檢測(cè)超磷酸化作用。這些方法的實(shí)例也示于實(shí)施例3中。
通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員采用在此提供的指導(dǎo)原則和本領(lǐng)域內(nèi)的常識(shí)，可確定有效量。例如，有效量可以在例如哺乳動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到生理學(xué)上相關(guān)的濃度。這樣的生理學(xué)上相關(guān)的濃度可至少為20毫微摩爾(nM)，優(yōu)選至少約為100nM和更優(yōu)選至少約為500nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物例如人的血液中，至少達(dá)到約1毫摩爾。可給予從約50mg/天至約1000mg/天，優(yōu)選從約100-150mg/天至約900mg/天，和最優(yōu)選從約300mg/天至約500mg/天的如在此定義的式An化合物。然而，可使用高于以上提到的量。
作為給藥方案，治療/預(yù)防性給藥可連續(xù)進(jìn)行，即持續(xù)有效的時(shí)間，例如，每天、每月、每?jī)稍?、每半年、每年，或如需要，以如?zhuān)業(yè)的執(zhí)業(yè)醫(yī)師確定的某些其它的給藥方案所需的這樣的時(shí)間。給藥可連續(xù)進(jìn)行至少所需要的時(shí)間周期，以減少超磷酸化至治療相關(guān)的水平。優(yōu)選地，每天，最優(yōu)選每天兩或三次，例如早晨和晚上給予組合物，以維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)有效的化合物水平。為了獲得最有益的結(jié)果，可給予組合物至少約30天，或至少約60天。這些給藥方案可周期性地重復(fù)。
組合物和制劑本發(fā)明的化合物可由不同來(lái)源，源于天然(例如Theobroma屬、Herrania屬)或由合成方法制備。在某些實(shí)施方案中，該化合物源自可可，包括可可黃烷醇類(lèi)和/或可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物。除可可多元酚之外，或作為其替代，組合物可包含非可可來(lái)源的多元酚，其具有與可可多元酚相同或相似的結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“可可多元酚”(CP)指的是多元酚性(polyphenolic)物質(zhì)例如以可可豆類(lèi)為特征的黃烷醇類(lèi)和它們相關(guān)的低聚物。換言之，可可多元酚、可可黃烷醇或可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物可為不管其來(lái)源的任何這樣的多元酚、黃烷醇或矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物，其具有天然存在于可可中的多元酚、黃烷醇或矢車(chē)菊苷配質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些化合物可從可可豆類(lèi)或可可成分中提取。術(shù)語(yǔ)“黃烷醇”包括單體兒茶素和表兒茶素。兒茶素和表兒茶素的低聚物被稱(chēng)為矢車(chē)菊苷配質(zhì)。任何在此提到的多元酚應(yīng)該被理解為也一并和單獨(dú)應(yīng)用于黃烷醇類(lèi)和矢車(chē)菊苷配質(zhì)，反之亦然。
術(shù)語(yǔ)“可可成分”指的是包含可可固體，例如巧克力液體和部分或完全脫脂的可可固體(例如餅塊或粉末)的源于無(wú)殼的可可尖(nibs)的物質(zhì)。
用于本發(fā)明的多元酚可為天然來(lái)源的，例如，源于可可豆或另一種天然來(lái)源的多元酚，或通過(guò)合成制備的。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于可用性和成本可選擇天然的或合成的多元酚。多元酚可以以含有可可多元酚，例如，含在巧克力中的巧克力液體的可可成分的形式被包含在組合物中，或可以獨(dú)立于可可成分，例如，作為提取物、提取部分、分離的和純化的單一的化合物、合并的提取部分或由合成制備的化合物被加入。
矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物可具有從2至約18，優(yōu)選從2至約12和最優(yōu)選從2至約10個(gè)單體單元。作為選擇，低聚物可有從3-18，優(yōu)選3-12和更優(yōu)選3-10個(gè)單體單元；或從5-18，優(yōu)選5-12和更優(yōu)選5-10個(gè)單體單元。例如，低聚物可為二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物。在低聚物中，單體經(jīng)由(4→6)和/或(4→8)的內(nèi)黃烷(interflavan)鍵連接。具專(zhuān)有性的(exclusively)(4→8)鍵的低聚物是線性的；而至少一個(gè)(4→6)鍵的存在導(dǎo)致支鏈的低聚物。包含至少一個(gè)非天然的鍵(6→6)、(6→8)和(8→8)的低聚物也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種非天然存在的低聚物的合成在2000年10月19日作為WO 00/61547公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/08234中有描述，其相關(guān)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文。任何本發(fā)明化合物中的黃烷-3-醇(單體的)單元可為(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素和它們各自的差向異構(gòu)體(例如(-)-兒茶素和(+)-表兒茶素))。
可可多元酚可通過(guò)從可可豆類(lèi)、可可尖或可可成分例如巧克力液體、部分脫脂的可可固體和/或完全脫脂的可可固體提取制備。優(yōu)選地，從完全或部分脫脂的可可粉制備提取物?？墒褂脧娜魏蜹heobroma、Herrania種或其種間和種內(nèi)雜交的豆類(lèi)?？蓮陌l(fā)酵的、正在發(fā)酵的或未發(fā)酵的豆類(lèi)制備提取物，發(fā)酵的豆類(lèi)有最少量的可可多元酚而未發(fā)酵的有最多的可可多元酚。豆類(lèi)的選擇可基于豆類(lèi)發(fā)酵因子作出，例如，提取物可從具有發(fā)酵因子約275或更少的豆類(lèi)加工得到。通過(guò)如在作為WO 98/09533發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/15893中所述(其中相關(guān)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文)，控制發(fā)酵的程度，可使在可可成分和其提取物中的多元酚的水平最優(yōu)化。
可從可可成分中提取可可多元酚，所述的可可成分通過(guò)使用加工可可的傳統(tǒng)方法(例如，在Industrial Chocolate Manufacture and Use，ed.Beckett，S.T.，Blackie Acad.&Professional，New York，1997，例如在第1、5和6章中所描述的)或使用在Kealey等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,015,913中描述的與傳統(tǒng)方法對(duì)比保護(hù)可可成分中的多元酚(通過(guò)防止它們免受破壞)的改良的加工方法加工而得。改良的可可加工方法省略了傳統(tǒng)的焙燒步驟。因此，可通過(guò)采用以下步驟得到可可成分(a)以足夠的時(shí)間和溫度加熱可可豆以使可可殼變得松軟而不焙燒可可尖；(b)從可可殼中精選(winnowing)可可尖；(c)螺旋壓榨可可尖和(d)回收包含受保護(hù)水平的可可多元酚的可可脂和部分脫脂的可可固體。該方法比傳統(tǒng)加工方法保留了相當(dāng)高水平的矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物。通過(guò)該方法生產(chǎn)的可可固體可包含多于每克脫脂固體含20,000μg的總黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)；優(yōu)選多于25,000μg/g，更優(yōu)選多于28,000μg/g和最優(yōu)選多于30,000μg/g。作為本發(fā)明的目的，總黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)的量如在實(shí)施例2中所述確定。
多元酚可從以上指出的來(lái)源，或任何其它含多元酚或黃烷醇或矢車(chē)菊苷配質(zhì)的來(lái)源中，使用多元酚溶解于其中的溶劑提取。適合的溶劑包括水或有機(jī)溶劑例如甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和乙酸乙酯。也可使用溶劑的混合物。當(dāng)使用水作為溶劑時(shí)，可例如使用乙酸稍微酸化。一些溶劑的實(shí)例為水和有機(jī)溶劑的混合物，例如甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。有機(jī)溶劑的水溶液可包含，例如，從約50％至約95％的有機(jī)溶劑。因此，可使用約50％、約60％、約70％、約80％和約90％的有機(jī)溶劑的水溶液。溶劑還可包含少量的，例如，約0.5％至約1.0％的量的酸例如乙酸。提取物的組合物，矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物的表征(representation)(即低聚物的分布)和量將依賴(lài)于溶劑的選擇。例如，水提取物主要包含單體，乙酸乙酯提取物包含單體和低級(jí)低聚物，主要為二聚物和三聚物，而甲醇、乙醇或丙酮水溶液的提取物包含單體和一定范圍內(nèi)的較高級(jí)低聚物。用于單體以及較高級(jí)矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物提取的溶劑之一為約70％的丙酮。然而，任何包含多元酚的提取物在本發(fā)明中都是有用的?？煽啥嘣拥奶崛》椒樵诒绢I(lǐng)域內(nèi)已知的和在例如，Romanczyk等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,554,645和作為WO 97/36497發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/05693中有描述。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將可可豆類(lèi)細(xì)化為可可粉、使粉脫脂、提取可可多元酚和純化提取物制備可可提取物?？赏ㄟ^(guò)使可可豆類(lèi)和果肉冷凍干燥、去果肉和除去冷凍干燥可可豆類(lèi)的殼和碾磨去殼的豆類(lèi)制備可可粉。
可可多元酚提取物可以例如通過(guò)除去咖啡因和/或可可堿純化，和通過(guò)凝膠滲透色譜和/或高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步純化。對(duì)于高級(jí)矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物，可使用凝膠滲透色譜(例如在Sephadex LH-20上)濃縮提取物。例如，直到所選的低聚物開(kāi)始從柱中洗脫之后，才可收集包含單體和低級(jí)低聚物的洗出液。這樣的提取物的實(shí)例為本領(lǐng)域內(nèi)已知的和在作為WO 97/36497發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/05693的實(shí)施例5中描述，其中相關(guān)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文。通過(guò)使用制備型HPLC，例如，正相HPLC，提取物可被分餾為例如包含以重量計(jì)至少50％的單體或特別的低聚物的單體的和低聚物的餾份。當(dāng)特別的餾份包含單體或任何低級(jí)低聚物(例如二聚物、三聚物或四聚物餾份)，則該餾份包含以重量計(jì)約90-95％的特別的低聚物餾份。在分離之后，可匯合想要的餾份，以得到所選的低聚物例如包含低聚物3-10或5-10的組合。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員參考本說(shuō)明書(shū)中的指導(dǎo)、本領(lǐng)域內(nèi)的常識(shí)和例如在Romanczyk等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,554,645和作為WO 97/36497發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US97/05693中所教導(dǎo)的，可控制色譜的條件以獲得想要的矢車(chē)菊苷配質(zhì)分布圖。
單體餾份一般包含單體表兒茶素和兒茶素的混合物；以及低聚物餾份一般包含二聚物(在二聚物餾份中)、三聚物(在三聚物餾份中)、四聚物(在四聚物餾份中)等的混合物。單體和低聚物的混合物出現(xiàn)于分離的餾份中，因?yàn)榭煽砂鲉误w、二聚物等的多于一種的類(lèi)型。作為構(gòu)筑矢車(chē)菊苷配質(zhì)的嵌段(blocks)的兩個(gè)單體，表兒茶素和兒茶素，以及連接低聚物中單體的化學(xué)鍵的結(jié)果，出現(xiàn)低聚物的變異性。因此，可可二聚物主要為B2和B5，其中的每個(gè)包含兩個(gè)表兒茶素的單體?？墒褂梅聪郒PLC，例如采用C18柱，可得到各單體和低聚物。
可可多元酚可作為可可提取物，例如源于溶劑的提取物、可可餾份、分離的化合物或以包含有效量的可可黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)的可可成分或巧克力的形式用于本發(fā)明的組合物中。可使用傳統(tǒng)的可可加工方法制備，但是優(yōu)選使用在Kealey等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,015,913中描述的方法制備可可成分。作為選擇，為了提高可可多元酚的水平，可使用從具有約275或更少的發(fā)酵因子的可可豆類(lèi)制備的巧克力液體和可可固體。這些成分具有比用傳統(tǒng)可可加工方法(例如用焙燒法)和完全發(fā)酵的豆類(lèi)所可獲得的更高的可可多元酚含量。巧克力可使用常規(guī)技術(shù)從以上所述的成分制備或使用在巧克力制備過(guò)程中為了保留可可多元酚的改良的方法，如在作為WO 99/45788發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/05414中描述的方法(其通過(guò)引用結(jié)合于本文)制備。由以下的非傳統(tǒng)方法中的至少一種制備的巧克力在此指的是“具有保留量的可可多元酚的巧克力”(i)從正在發(fā)酵的或未發(fā)酵的可可豆類(lèi)制備可可成分；(ii)在可可成分制備過(guò)程中保留可可多元酚；和(iii)在巧克力制備過(guò)程中保留可可多元酚。
合成的矢車(chē)菊苷配質(zhì)也可應(yīng)用和通過(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法和如在例如作為WO 99/19319發(fā)表的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/21392中描述的方法(其中相關(guān)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文)制備。
黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)衍生物也可是有用的。這些包括單體和低聚物的酯例如五倍子酸酯(例如表兒茶素五倍子酸酯和兒茶素五倍子酸酯)；與糖部分例如單-或二糖部分(例如β-D-葡萄糖)，例如在以上式的X、Y和/或Z位置衍生的化合物；葡糖化(glycosylated)單體和低聚物和它們的混合物；矢車(chē)菊苷配質(zhì)單體和低聚物的代謝物，例如硫酸化的、葡萄糖醛酸化的和甲基化的形式，但不包括通過(guò)結(jié)腸微生物叢代謝產(chǎn)生的矢車(chē)菊苷配質(zhì)的酶裂解產(chǎn)物。所述衍生物可來(lái)自天然來(lái)源或經(jīng)合成制備。
本發(fā)明的組合物可用作藥物、食物、食物添加劑或膳食補(bǔ)充劑。組合物可包含載體、稀釋劑或賦形劑。根據(jù)預(yù)定的應(yīng)用，可選擇載體、稀釋劑或賦形劑以適合人或脊椎動(dòng)物的應(yīng)用，食物、添加劑、補(bǔ)充劑或藥物中的應(yīng)用。組合物可任選包含另外的癌癥治療劑。
在此使用的“食物”是基本上含有用于有機(jī)體維持生長(zhǎng)、修復(fù)和生命過(guò)程和提供能量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂肪的物質(zhì)。食物還可包含補(bǔ)充性物質(zhì)例如礦物質(zhì)、維生素和調(diào)味劑，參見(jiàn)Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，10th Edition，1993。術(shù)語(yǔ)食物包括適合于人或動(dòng)物消費(fèi)的飲料。在此使用的“食物添加劑”如由FDA(美國(guó)食品藥品管理局)在21C.F.R.170.3(e)(1)中所定義并且包括直接和間接的添加劑。在此使用的“藥物”為醫(yī)用藥品。參見(jiàn)Merriam-Webster′sCollegiate Dictionary，10th Edition，1993。藥物還可指藥劑。在此使用的“膳食補(bǔ)充劑”為意欲補(bǔ)充膳食的產(chǎn)品(除了煙草制品外)，其具備或包含一種或多種以下膳食成分維生素、礦物質(zhì)、草藥或其它的植物性藥材、氨基酸、用于由人通過(guò)增加每天總攝取補(bǔ)充到膳食的膳食物質(zhì)，或這些成分的濃縮物、代謝物、要素(constituent)、提取物或組合。
任何常規(guī)食物包括任何通過(guò)使之存在多元酚或其衍生物，例如甲基化的化合物或代謝的下游產(chǎn)物，和任選與另一種癌癥治療/化學(xué)預(yù)防劑聯(lián)合的已經(jīng)改良的飲料。還可存在其它化合物，例如L-精氨酸、鈣、鉀、鎂和抗氧化劑例如維生素E和維生素C，任何B族維生素、類(lèi)胡羅卜素、瓜耳膠和/或單或多不飽和脂肪酸(例如ω-3)。
所述改良或者(i)通過(guò)添加多元酚或其衍生物到不含可可多元酚的食物中，或者(ii)當(dāng)食物傳統(tǒng)上可含有可可多元酚，例如例如巧克力時(shí)，通過(guò)提高多元酚水平超過(guò)用傳統(tǒng)方法制備的食物的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種增進(jìn)可由下列方法實(shí)現(xiàn)，通過(guò)添加例如為提取物、餾份或從中分離的和純化的化合物的形式的另外的多元酚例如可可多元酚；通過(guò)加入與另一個(gè)含多元酚的成分(例如堅(jiān)果皮)組合的可可多元酚；通過(guò)控制如上所述的可可成分的加工和可可豆的選擇，以保留用于制備食品的可可成分中的可可多元酚；或通過(guò)控制如上所述的巧克力制備過(guò)程。因此，與相相對(duì)的常規(guī)食物(包括飲料)比較，這些食物(包括飲料)包含“提高了水平的多元酚”(包括可可矢車(chē)菊苷配質(zhì))。當(dāng)巧克力制備商將含有可可多元酚的可可提取物添加到其以前商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品中時(shí)，出現(xiàn)具有提高了的多元酚水平的巧克力的實(shí)例。食物還可被指為“高可可多元酚食物”，即它們含有比它們的傳統(tǒng)對(duì)應(yīng)品更高的多元酚水平。
含有可可多元酚，或任何在此描述的化合物，和任選另一種腫瘤/癌癥治療劑的食物可適合于人或脊椎動(dòng)物使用，并且包括寵物食物。食物可不同于糖食，然而，優(yōu)選的低膽固醇食物為糖食例如認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)(standard of identity(SOI))和非SOI巧克力，例如牛奶、甜和半甜巧克力包括黑巧克力、低脂巧克力和可為巧克力覆蓋糖果的糖果。其它的實(shí)例包括烘烤產(chǎn)品(例如核仁巧克力餅(brownie)、烘烤小吃、小甜點(diǎn)(cookie)、餅干)、調(diào)味品、格蘭諾拉麥片餅(granola bar)、太妃口嚼糖(toffee chew)、代餐玉蜀黍棒(meal replacement bar)、涂于面包、餅干上的食物(spread)、糖漿、混合粉末飲料(powder beveragemix)、可可或巧克力風(fēng)味的飲料、布丁、大米餅、什錦米飯(rice mix)、美味醬油等。如果想要，食物可為巧克力或可可風(fēng)味的。食品可為巧克力和糖果棒，例如含有堅(jiān)果(例如，花生、胡桃、杏仁、和榛子)的格蘭諾拉麥片。需要指出的是將帶皮的堅(jiān)果加入在此描述的食物中也可增加總多元酚含量，因?yàn)?，例如，花生皮含約17％的黃烷醇和矢車(chē)菊苷配質(zhì)和杏仁皮含約30％的黃烷醇和矢車(chē)菊苷配質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將堅(jiān)果皮加入巧克力糖果的奶油杏仁糖(nougat)中。
在某些實(shí)施方案中，無(wú)巧克力的食品含有從至少約5微克/g至約10mg/g，和例如至少5微克/g食品，優(yōu)選至少10微克/g，更優(yōu)選至少100微克/g的可可黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)低聚物。如果想要，非巧克力食品可包含比那些在以下描述的巧克力食品中發(fā)現(xiàn)的更高得多的水平的可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)。
巧克力糖食可為牛奶或黑巧克力。在某些實(shí)施方案中，巧克力包含，基于產(chǎn)品中的脫脂可可固體的總量計(jì)，每克巧克力至少3,600微克，優(yōu)選至少4,000微克，優(yōu)選至少4,500微克，更優(yōu)選至少5,000微克和最優(yōu)選至少5,500微克的本發(fā)明化合物(例如可可矢車(chē)菊苷配質(zhì))。在其它的實(shí)施方案中，基于產(chǎn)品中的脫脂可可固體的重量計(jì)，巧克力包含每克至少6,000微克，優(yōu)選至少6,500微克，更優(yōu)選至少7,000微克和最優(yōu)選至少8,000微克的可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)和尤其更優(yōu)選10,000微克/g。
牛奶巧克力糖食，基于牛奶巧克力產(chǎn)品中的脫脂可可固體的總量計(jì)，每克牛奶巧克力可包含至少1,000微克，優(yōu)選至少1,250微克，更優(yōu)選至少1,500微克和最優(yōu)選至少2,000微克的可可黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，牛奶巧克力包含，基于牛奶巧克力產(chǎn)品中的脫脂可可固體的總量計(jì)，每克牛奶巧克力至少2,500微克，優(yōu)選至少3,000微克，更優(yōu)選至少4,000微克和最優(yōu)選至少5,000微克可可黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)。
食品中的L-精氨酸的量可變化。具體地，可可包含每100克部分脫脂的可可固體中1-1.1克L-精氨酸。其范圍可從每100克可可中0.8至1.5。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的巧克力食品包含比天然地出現(xiàn)在可可成分中的更高的量的L-精氨酸。一旦已知在食品中使用的可可成分和L-精氨酸的量，本領(lǐng)域普通專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可易于確定最終產(chǎn)品中的L-精氨酸總量。食品將通常包含至少5微克/g，優(yōu)選至少30微克/g或至少60微克/g，尤其更優(yōu)選至少200微克/g食品。
可以單份食物(serving)提供本發(fā)明的多元酚例如黃烷醇類(lèi)和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)的每日有效量。因此，糖食(例如巧克力)可包含至少約100mg/份食物(例如150-200、200-400mg/份食物)可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)。
含有本發(fā)明的化合物的藥物，任選與另一種癌癥治療劑聯(lián)合，可以多種途徑例如經(jīng)口、舌下、頰、鼻、直腸、靜脈、胃腸外和局部給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定適合的給藥模式以使式An化合物和任選的另一種癌癥治療劑最大地傳遞至腫瘤部位。因此，適合于每一種類(lèi)型給藥的劑型包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且包括固體、液體和半固體劑型，例如片劑、膠囊劑、明膠膠囊劑(gelcaps)、散裝(bulk)的或單位劑量粉末或顆粒劑、乳劑、混懸劑、貼劑、乳膏劑、凝膠劑、泡沫劑或膠漿劑(jellies)。緩釋劑型也在本發(fā)明范圍內(nèi)并且可如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,024,843；5,091,190；5,082,668；4,612,008和4,327,725中描述的(其中相關(guān)的部分通過(guò)引用結(jié)合于本文)那樣制備。適合的制藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑通常為本領(lǐng)域內(nèi)已知并且可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定。片劑，例如，可包含有效量的含多元酚的組合物和任選的載體，例如山梨醇、乳糖、纖維素或磷酸二鈣。
包含可可黃烷醇和/或矢車(chē)菊苷配質(zhì)和任選另一種癌癥治療劑的膳食補(bǔ)充劑可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備和可包含，例如，營(yíng)養(yǎng)素例如磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硝酸鈣、維生素和礦物質(zhì)。
還在本發(fā)明范圍之內(nèi)的是制成品(article)例如包含本發(fā)明的組合物(例如食物、膳食補(bǔ)充劑、藥物)的包裝產(chǎn)品和指示本發(fā)明的化合物的存在或增加了含量，或該組合物直接應(yīng)用于治療其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤(例如癌癥)的標(biāo)簽。該包裝產(chǎn)品可包含組合物和用于治療其中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤(例如癌癥)的說(shuō)明書(shū)。用于使用的標(biāo)簽和/或說(shuō)明書(shū)可指在本申請(qǐng)中描述的任何使用的方法，在某些實(shí)施方案中，使用的標(biāo)簽和/或說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)本發(fā)明化合物用于治療過(guò)度表達(dá)p53(其在至少氨基酸位置Ser392處超磷酸化)的腫瘤；過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的腫瘤；過(guò)度表達(dá)Akt的腫瘤；或?qū)ψ仙即?Taxol)的治療耐藥的腫瘤。
適合用于的聯(lián)合療法的制成品(例如包裝產(chǎn)品或藥盒)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其包括至少一個(gè)容器和至少一種本發(fā)明化合物(例如其中n是5的式An化合物；矢車(chē)菊苷配質(zhì)五聚物)。該制成品還包含至少一種另外的化學(xué)治療劑(即不同于式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物))，所述化學(xué)治療劑可作為分開(kāi)的組合物、在分開(kāi)的容器中提供，或與本發(fā)明化合物混合在一起提供。
在下列的非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1-提取和純化提取和純化可如在Romanczyk等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,670,390(其通過(guò)引用結(jié)合于本文)中描述的那樣進(jìn)行。下面重現(xiàn)某些相關(guān)的部分。
矢車(chē)菊苷配質(zhì)提取過(guò)程方法1使用由Jalal和Collin(′Polyphenols of Mature Plant，Seedling andTissue Cultures of Theobroma Cacoa，Phytochemistry，6，1377-1380，1977)描述的方法的改進(jìn)方法，從脫脂的、未發(fā)酵的、冷凍干燥的可可豆類(lèi)提取矢車(chē)菊苷配質(zhì)。從與2×400mL 70％丙酮/去離子水然后是400mL 70％甲醇/去離子水聚集的50克批次的脫脂可可中提取矢車(chē)菊苷配質(zhì)。匯集提取物并于45℃用保持在部分真空下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑。以去離子水稀釋得到的水相至1L和用400mLCHCl3提取2遍。丟棄溶劑相。然后水相用500mL乙酸乙酯提取4遍。將任何得到的乳狀液于10℃通過(guò)在2,000x的Sorvall RC 28S離心分離機(jī)上離心30min.破乳。向合并的乙酸乙酯提取物中加入100-200mL去離子水。于45℃用保持在部分真空下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器通過(guò)蒸發(fā)除去溶劑。使得到的水相于液N2下冷凍，隨后在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)上冷凍干燥。從不同的可可基因型得到的粗制矢車(chē)菊苷配質(zhì)的得率列于表1。
表1粗制矢車(chē)菊苷配質(zhì)得率
方法2作為選擇，用70％丙酮水溶液從脫脂的、未發(fā)酵的、冷凍干燥的可可豆類(lèi)提取矢車(chē)菊苷配質(zhì)。使10克的脫脂的原料與100mL溶劑勻漿5-10min。于4℃下使該淤漿以3000xg離心15分鐘，使上清液通過(guò)玻璃棉。使濾液于部分真空下經(jīng)歷蒸餾和使得到的水相于液N2下冷凍，隨后在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)上冷凍干燥。粗制矢車(chē)菊苷配質(zhì)的得率范圍為15-20％。
不希望受到任何特別的理論的限制，應(yīng)該相信粗品得率的不同反映所遇到的不同的基因型、地理來(lái)源、園藝品種和制備方法的差異。
可可矢車(chē)菊苷配質(zhì)的部分純化A.凝膠滲透色譜法使如上所述得到的矢車(chē)菊苷配質(zhì)通過(guò)液相色譜在Sephadex LH-20(28×2.5cm)上部分純化。借助從去離子水進(jìn)入甲醇的梯度分離。起先的梯度組合從15％甲醇的去離子水開(kāi)始，其后以每30min.的梯級(jí)方式，用25％甲醇的去離子水、35％甲醇的去離子水、70％甲醇的去離子水和最后100％甲醇的梯度液。收集黃嘌呤生物堿(咖啡因和可可堿)的洗脫后的流出液作為單個(gè)的餾份(fraction)。餾份產(chǎn)生無(wú)黃嘌呤生物堿的次餾份，其經(jīng)歷進(jìn)一步細(xì)分餾得到指定為MM2A直到MM2E的五個(gè)次餾份。于45℃用保持在部分真空下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器通過(guò)蒸發(fā)從每個(gè)次餾份中除去溶劑。使得到的水相于液N2下冷凍和在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)上冷凍干燥過(guò)夜。
大約有100mg的原料以這種方法細(xì)分餾。色譜條件柱；28×2.5cm Sephadex LH-20，流動(dòng)相甲醇/水梯度，15∶85、25∶75、35∶65、70∶30、100∶0每步1/2小時(shí)間隔，流速；1.5mL/min，檢測(cè)器；UV在λ1＝254nm和λ2＝365nm，繪圖速度0.5mm/min，柱荷載；120mg。
B.半制備型高效液相色譜(HPLC)方法1.反相分離如上所述得到的矢車(chē)菊苷配質(zhì)通過(guò)半制備型HPLC部分純化。Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)配備多種波長(zhǎng)檢測(cè)器，具有1mL注射回路的Rheodyne 7010注射閥裝備有Pharmacia FRAC-100餾份收集器。在與Phenomenex 10μO(píng)DS UltracarbTM(60×10mm)保護(hù)柱(guard column)連接的Phenomenex UltracarbTM10μO(píng)DS柱(250×22.5mm)上進(jìn)行分離。流動(dòng)相組成為A＝水；B＝甲醇，在以下線性梯度條件下使用[時(shí)間，％A]；(0，85)、(60，50)、(90，0)和(110，0)，流速為5mL/min?；衔锿ㄟ^(guò)UV于254nm檢測(cè)。通過(guò)餾份收集在定時(shí)的間隔或手動(dòng)收集各峰或選擇的色譜區(qū)域，用于進(jìn)一步純化和后續(xù)的評(píng)價(jià)。注射荷載范圍為從25-100mg的原料。
方法2.正相分離如上所述得到的矢車(chē)菊苷配質(zhì)提取物通過(guò)半制備型HPLC部分純化。Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)、設(shè)置于254nm的Millipore-Waters Model 480LC檢測(cè)器配備設(shè)置于峰模式的Pharmacia Frac-100餾份收集器。在與Supelco 5μm Supelguard LC-Si保護(hù)柱(20×4.6mm)連接的Supelco 5pm Supelcosil LC-Si柱(250×10mm)上進(jìn)行分離。矢車(chē)菊苷配質(zhì)通過(guò)在以下條件下經(jīng)線性梯度洗脫(時(shí)間，％A，％B)；(0，82，14)、(30，67.6，28.4)、(60，46，50)、(65，10，86)、(70，10，86)隨后10min的再平衡。流動(dòng)相組合為A＝二氯甲烷；B＝甲醇和C＝乙酸∶水(1∶1)。使用流速為3mL/min。通過(guò)UV于254nm檢測(cè)成分和記錄在Kipp&Zonan BD41記錄儀上。注射體積的范圍為溶解于0.25mL 70％丙酮水溶液的100-250μL的10mg的矢車(chē)菊苷配質(zhì)提取物。通過(guò)餾份收集在定時(shí)的間隔或手動(dòng)收集各峰或選擇色譜區(qū)域用于進(jìn)一步純化和后續(xù)的評(píng)價(jià)。
HPLC條件250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)半制備型柱；20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保護(hù)柱；檢測(cè)器Waters LC；分光光度計(jì)型號(hào)480@254nm；流速3mL/min；柱溫室溫；注射250μL的70％丙酮水溶液提取物。
梯度
得到如下餾份餾份 類(lèi)型1二聚物2三聚物3四聚物4五聚物5六聚物6七聚物7八聚物8九聚物9十聚物10 十一聚物11 十二聚物12 高級(jí)低聚物實(shí)施例2黃烷醇/矢車(chē)菊苷配質(zhì)的測(cè)定矢車(chē)菊苷配質(zhì)如下述定量使用商業(yè)上可獲得的(-)-表兒茶素，和通過(guò)在Hammerstone，J.F.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496；Lazarus，S.A.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(9)；3693-3701和Adamson，G.E.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188中描述的方法得到的純態(tài)的二聚物至十聚物制得組合的標(biāo)準(zhǔn)物。使用在之前引用的Adamson文獻(xiàn)中所描述的正相HPLC方法，采用熒光在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為276nm和316nm檢測(cè)分析使用這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。聚合所得的峰和它們的總面積以包括從所有在任何一類(lèi)低聚物之內(nèi)的異構(gòu)體發(fā)揮作用的因素和使用二次方程式擬合產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。單體和較小的低聚物具有幾乎線性的圖，其與之前采用的線性回歸一致，以產(chǎn)生基于單體的和基于二聚物的校準(zhǔn)曲線。
然后將這些校準(zhǔn)曲線用于計(jì)算在如下制備的樣本中的矢車(chē)菊苷配質(zhì)的水平首先，使用三份正己烷提取物(每份45mL)使可可或巧克力樣本(約8克)脫脂。接著，用5mL的丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)提取1克的脫脂的原料。然后通過(guò)比較從由如上所述(使用純化的低聚物)得到的具有校準(zhǔn)曲線的樣本的HPLC數(shù)據(jù)，測(cè)定在脫脂的原料中的矢車(chē)菊苷配質(zhì)的量。使用Association of Official AnalyticalChemists(AOAC Official Method 920.177)的標(biāo)準(zhǔn)化方法測(cè)定樣本(對(duì)于巧克力使用1克樣本規(guī)格或?qū)τ谝后w使用半克樣本規(guī)格)的脂肪的百分比。然后計(jì)算在原始樣本(具有脂肪)中的總矢車(chē)菊苷配質(zhì)水平的量。在每個(gè)樣本被測(cè)試之前進(jìn)行校準(zhǔn)以避免柱-柱差異。
實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231、MDA MB-436、MD MB-468、SKBR-3和MCF-7從Lombardi Comprehensive Cancer Center(LCC)Tissue Culture Shared Resource獲得。MDA MB-231、MDA MB-436、MD MB-468和SKBR-3為p53-變異的雌激素受體(ER)-陰性細(xì)胞。MDA MB-231在K-ras致癌基因中還包含突變種。MCF-7細(xì)胞系為ER-陽(yáng)性和對(duì)p53不變異的。將細(xì)胞在包含補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)(Quality Biological，Gaithersburg，MD)的DMEM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。另外，用于MCF-7的培養(yǎng)基包含非必需氨基酸(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。
無(wú)限增殖化(immortalized)人乳腺上皮細(xì)胞(HMECs)、MCF-10A、184A1N4和184B5、在8通道的正常的、有限壽命的(finite-life-span)HMECs(1001-8，CC-2551)，最初源于乳房成形術(shù)的乳腺組織，從Clonetics-Bio Whittaker，Inc.(Waskersville，MD)購(gòu)得。也可使用由通過(guò)將c-MYC、ErbB2和RAS致癌基因?qū)隡CF-10A細(xì)胞(MCF-10A-ErbB2/Ras細(xì)胞和MCF-10A-c-Myc)生成的細(xì)胞系。
將MCF-10A細(xì)胞系(伴有非變異的p53的自然地?zé)o限增殖化的、非腫瘤發(fā)生的人乳腺上皮細(xì)胞系)維持于補(bǔ)充了5％馬血清(Gibco)、20ng/mL EGF(Upstate Biotechnology Incorporated，Lake Placid，NY)、10μg/mL胰島素(Biofluids，Rockyille，MD)和500ng/mL氫化可的松的F-12/DMEM培養(yǎng)基中。同樣的培養(yǎng)基用于MCF-10A-ErbB2/Ras細(xì)胞(Ciardiello，F(xiàn).et al.，Mol Carcinog,643-52.1992)和MCF-10A-c-Myc細(xì)胞(Sheen，J-H.et al.，Mol.Cell.Biol.，221819-1833，2002)。
184A1N4細(xì)胞系(在此后為″A1N4″)是源于HM Cs的原代培養(yǎng)的非腫瘤發(fā)生的細(xì)胞系和以苯并芘(由Dr.M.R.Stampfer，University ofCalifornia，Berkley，CA提供)(Stampfer，M.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822394-2398，1985)獲得終身免疫的。將這些細(xì)胞維持于含有0.5％FBS、0.5μg/mL的氫化可的松(Biofluids)、5μg/mL胰島素和10ng/mL的EGF的IMEM培養(yǎng)基中。
184B5系是無(wú)限增殖化的、源于由用苯并芘(由Dr.M.R.Stampfer提供)獲得無(wú)限增殖化HMECs的原代培養(yǎng)的非腫瘤發(fā)生的細(xì)胞系和維持于Clonetics乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(MEGM)中。
依據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)，將正常人HMECs維持于補(bǔ)充有每ml 52μg的牛垂體提取物、10ng/mL的人EGF、5μg/mL的胰島素和0.5μg/mL的氫化可的松的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CC-3152)(Clonetics)中并使之于37℃在伴有低濃度(0.1-0.2％)CO2設(shè)置的孵育器中生長(zhǎng)。
試劑和抗體HPLC-純化的低聚五聚物的矢車(chē)菊苷配質(zhì)如在實(shí)施例1中所述制備。五聚物矢車(chē)菊苷配質(zhì)約為92-95％純。通過(guò)首先將五聚物溶解于20μL DMSO中，隨后以完全培養(yǎng)基稀釋至2mL制備五聚物的儲(chǔ)備液。取無(wú)菌過(guò)濾的等分試樣，使終濃度為100μg/mL。
兔多克隆聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(H-250)從Santa CruzBiotechnology Inc.，(Santa Cruz，CA)獲得。α-微管蛋白抗體從Neomarkers，F(xiàn)remont，CA獲得。所有用于蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)分析的抗體從Cell Signaling(Beverly，MA)、Upstate Biotechnology(LakePlacid，NY)、Neomarkers(Fremont，CA)和Santa Cruz(Santa Cruz，CA)獲得(表2)。參考表2，指定為“小鼠”的Abs為單克隆Abs和指定為“兔”的Abs為多克隆Abs。ECL檢測(cè)試劑從Amersham(Arlington Heights，IL)獲得。
通過(guò)結(jié)晶紫試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖的評(píng)價(jià)將每孔一份1×103細(xì)胞置于96孔盤(pán)(Corning Costar，Cambridge，MA)中。于兩種不同細(xì)胞密度(每孔放置1×103和2×103)評(píng)價(jià)HMECs、A1N4和184B5細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。細(xì)胞附著細(xì)胞24小時(shí)后，以濃度為100μg/mL的五聚物處理孔中的細(xì)胞(一式三份)。在相同板上的細(xì)胞以相應(yīng)的對(duì)照物(i)包含DMSO的培養(yǎng)基，和(ii)無(wú)添加物的培養(yǎng)基處理。
細(xì)胞經(jīng)處理1、2、3、6、8和10天，但在一些實(shí)驗(yàn)中，在處理后的第2、3、4、7和10天收集樣本。每次處理做三份。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)按如下收集樣本移去培養(yǎng)基并于室溫下向每孔加入50μL的結(jié)晶紫溶液(0.1％的結(jié)晶紫的0.1M檸檬酸溶液)并將板孵育15分鐘，隨后用去離子水洗滌。將板于室溫下干燥過(guò)夜。次日，通過(guò)向每個(gè)孔添加100μL的0.1M檸檬酸鈉溶液使板退色。將板孵育一個(gè)小時(shí)。在Ultramark微板成像系統(tǒng)(BioRad，Philadelphia，PA)上于550nm讀出樣本的光密度(OD)。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)兩次，得到每個(gè)樣本的九個(gè)測(cè)量值的平均值。使用t檢驗(yàn)分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
線粒體膜電位使用ApoAlertTM線粒體膜傳感器藥劑盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA)測(cè)定線粒體膜電位。于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，將MDA MB-231、MCF-7、MDA MB-468、MDA MB-436、SKBR-3、MCF-10A、MCF-10A-c-Myc和AIN4細(xì)胞生長(zhǎng)至60-70％匯合(在25cm2的盤(pán)中)。次日，以含有(i)五聚物(100μg/mL，或在一些實(shí)驗(yàn)中用25μg/mL)，(ii)帶有DMSO的培養(yǎng)基，或(iii)只有培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基置換完全培養(yǎng)基。最初，使細(xì)胞在五聚物存在下生長(zhǎng)1、2、3、6、12和24小時(shí)，但僅選擇1、2和6個(gè)小時(shí)的處理用于后續(xù)的研究。合并所有漂浮的和粘附的細(xì)胞，然后將細(xì)胞分成等份放入流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)管中。依照制備商的說(shuō)明書(shū)，每管分析1×106細(xì)胞。在LombardiComprehensive Cancer Center Core Flow Cytometry Shared ResourceFacility分析樣本。
液體樣本在多孔板(LPS/MWP)中的分層蛋白掃描分層蛋白掃描(LPS)是使用多孔板[Englert，C.R.et al.，CancerRes.，601526-1530，2000]，以高通量的方式篩選液體蛋白質(zhì)樣本的方法，并由20/20Gene Systems，Inc.，(Rockville，MD)引導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，使細(xì)胞分層并將蛋白質(zhì)提取物裝載至真空歧管(vacuum manifold)的孔中和通過(guò)一疊(stack)膜轉(zhuǎn)移。從每組樣本中，產(chǎn)生最多至五個(gè)斑點(diǎn)印跡膜。
用或不用100μg/mL五聚物處理MDA MB-231人乳腺癌細(xì)胞48和72個(gè)小時(shí)。使細(xì)胞分層于LPS/MWP溶胞緩沖液(20/20GeneSystems，Inc.)中。使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將10和20μg的每個(gè)蛋白質(zhì)樣本雙份下載到斑點(diǎn)印跡微濾儀(BioRad，Philadelphia，PA)并按照制備商(20/20GeneSystems)的建議通過(guò)5層膜的疊層轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，于室溫下，將所有的膜在1mg/mL EZ-Link Sulfo-NHS-生物素溶液以1x PBS中進(jìn)行生物素化作用10分鐘(Pierce)。
于4℃，將膜與示于表1中的抗體(1∶500或1∶1000稀釋)一起孵育過(guò)夜。次日，膜用含吐溫20(0.1％)(TBST緩沖液)的Tris-緩沖鹽水洗滌并于室溫下在FluoroLink Cy 5-標(biāo)記的鏈球菌抗生物素蛋白(1∶500，Amersham)和熒光素標(biāo)記的次級(jí)抗-鼠或抗-兔抗體(1∶2,000，分子探針，Eugene，OR)的混合物中孵育60分鐘，隨后在TBST中洗滌。使膜干燥并在Typhoon掃描儀(Amersham)上掃描，并用ImageQuant軟件(Amersham)分析所得到的圖像。數(shù)據(jù)用Excel繪圖和用JMP(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。施行等級(jí)類(lèi)聚分析以評(píng)價(jià)被分為對(duì)照組和處理組樣本的分離。
表2.用于LPS-多孔板分析的抗體
免疫印跡法對(duì)LPS/MWP結(jié)果的確認(rèn)受五聚物影響的蛋白質(zhì)，如通過(guò)LPS檢測(cè)的，由免疫印跡法作進(jìn)一步分析。應(yīng)用對(duì)抗下列蛋白質(zhì)的抗體Cdc2(Tyr15)、FKHR(Ser256)、p53(Ser37、Ser46和Ser392)、PKC-δ(Ser643)、PKC-θ(Ser643/676)、pRb(Ser795和Ser807/811)、SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)和Stat 5(Tyr694)(所有抗體從Cell Signaling獲得)。
將來(lái)自經(jīng)五聚物處理的MDA MB-231、MDA MB-468和MCF-7細(xì)胞蛋白質(zhì)小球和相應(yīng)的經(jīng)DMSO處理的對(duì)照物溶解于含1％SDS的PBS中并用于5瓦特功率下的超聲波處理15秒鐘。然后于10,000rpm離心樣本并將上清液移入干凈試管中。如上所述地測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。10μg的每個(gè)蛋白質(zhì)樣本通過(guò)PAGE于4-20％梯度凝膠(BioRad，Philadelphia，PA)上分離。依照制備商(20/20Gene Systems)的說(shuō)明書(shū)將凝膠轉(zhuǎn)移至或者PVDF膜(BioRad)或者P-FILM膜(10層膜的疊層)。在用初級(jí)抗體孵育之前，使PVDF膜封閉于0.5％的酪蛋白溶液(VectorLaboratories，Burlingame，CA)中1個(gè)小時(shí)。在用初級(jí)抗體孵育之前，P-FILM膜不需要封閉。于4℃下，以1∶500稀釋的初級(jí)抗體孵育膜過(guò)夜，在TBST中洗滌膜5分鐘三次，以HRP-共軛的次級(jí)抗體孵育，再洗滌和于添加了ECL的試劑(Amersham)中孵育。信號(hào)在BIOMAX MR膠片(Kodak，Rochester，NY)上顯現(xiàn)。在與初級(jí)抗體孵育后，使膜在抗GAPDH抗體(1∶500稀釋?zhuān)籆hemicon，Temecula，CA)中孵育。這種蛋白質(zhì)的存在用與堿性磷酸酯酶DuoLux底物(VectorLaboratories)共軛的次級(jí)抗體顯現(xiàn)。
作為對(duì)照，依照制備商(Cell Signaling)的說(shuō)明書(shū)，剝離用于探測(cè)Cdc2、FKHR、p53和pRb的PVDF膜。剝離后，在TBST緩沖液中洗滌膜四次(每次5分鐘)，如上所述的封閉，再洗滌和于4℃下在初級(jí)抗體中孵育過(guò)夜。所用的初級(jí)抗體為抗總Cdc2(1∶1000稀釋?zhuān)珻ellSignaling)、抗總FKHR(1∶1000稀釋?zhuān)珻ell Signaling)、抗內(nèi)源性的p53(1∶1000，Cell Signaling)和抗內(nèi)源性的pRb(1∶1000，Santa Cruz)。次日，洗滌膜并在HRP共軛的次級(jí)抗體中孵育，再洗滌和于添加了ECL的試劑(Amersham)中孵育。信號(hào)如前述檢測(cè)。為了測(cè)試荷載的相等性，用如上所述的抗GAPDH抗體(1∶500稀釋?zhuān)籆hemicon，Temecula，CA)探測(cè)膜。
p53和pRb的高分辯圖p53和pRb均包含多磷酸化位點(diǎn)，并且分別評(píng)價(jià)每個(gè)位點(diǎn)，以提供每個(gè)蛋白質(zhì)的潛在功能的更正確的適應(yīng)征。因此，使用P-FILM技術(shù)(20/20Gene Systems，Inc.)完成蛋白質(zhì)的高分辯功能的圖。
使用與那些用于PDVF膜印跡的相同的蛋白質(zhì)樣本。使以100μg/mL的五聚物處理或以對(duì)照組DMSO處理的10μg的每個(gè)MDAMB-231細(xì)胞，在一些情況下為MDA MB-468和MCF-7細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣本，通過(guò)PAGE在4-20％梯度凝膠(BioRad)上分離。按照制備商(20/20Gene Systems，Inc.)的說(shuō)明書(shū)使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至10層膜的疊層。以如由制備商(Cell Signaling)推薦的于1∶1000稀釋的抗體探測(cè)膜以確認(rèn)總的和磷酸化的p53(p53 Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser37、Ser46和Ser392)。在所有情況下用的次級(jí)抗體為抗-兔多克隆的1∶2000(Amersham)。信號(hào)在BIOMAX MR膠片(Kodak)上顯現(xiàn)。使用以1∶1000稀釋的抗磷酸化的pRb(Ser780、Ser795和Ser807/811)和抗pRb多克隆抗體(Cell Signaling)完成pRb的圖。在所有情況下用的次級(jí)抗體為1∶2000稀釋的抗-兔抗體(Amersham)。使用Kodak 1D圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。采用GAPDH強(qiáng)度使背景校正強(qiáng)度值對(duì)荷載標(biāo)準(zhǔn)化。用Excel進(jìn)行數(shù)字分析。
結(jié)果五聚物引起的生長(zhǎng)抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA MB-231、MDA MB-436、SKBR-3和MDAMB-468細(xì)胞比未轉(zhuǎn)化的、自然地?zé)o限增殖化人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞(其對(duì)五聚物耐藥)對(duì)五聚物引起的生長(zhǎng)抑制更敏感。用五聚物處理后10天，MDA MB-231、MDA MB-436、SKBR-3和MDA MB-468細(xì)胞的生長(zhǎng)，與用DMSO處理的對(duì)照組比較，分別被抑制5倍、4.1倍、5.5倍和4倍。與MCF-10A細(xì)胞類(lèi)似，正常人HMECs對(duì)于五聚物的生長(zhǎng)抑制劑作用是不響應(yīng)的，僅被抑制1.4倍。與用DMSO處理的對(duì)照組比較，苯并芘-無(wú)限增殖化的、未轉(zhuǎn)化的184B5和AIN4細(xì)胞的生長(zhǎng)被分別抑制2.8倍和7.3倍。在用五聚物處理后的第6天，乳腺癌細(xì)胞的大多數(shù)為對(duì)五聚物表現(xiàn)出顯著的敏感，早于無(wú)限增殖化184B5細(xì)胞，后者于處理后的第10天對(duì)五聚物表現(xiàn)出顯著的敏感。
五聚物在以上的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用獨(dú)立于p53和ER狀態(tài)，因?yàn)槲寰畚锾幚磉€引起MCF-7細(xì)胞的顯著的、5.6倍的生長(zhǎng)抑制，所述MCF-7細(xì)胞含有野生型p53并且為ER-陽(yáng)性的。還有，五聚物的作用獨(dú)立于細(xì)胞增殖率，因?yàn)槁鲋承缘腗CF-10A細(xì)胞(群體倍增時(shí)間為31.4hrs)和高增殖性的MCF-10A-c-Myc(群體倍增時(shí)間20.4hrs)以及MCF-10A-ErbB2/Ras(比親代的MCF-10A細(xì)胞快四倍的倍增時(shí)間)對(duì)五聚物引起的生長(zhǎng)抑制的抵抗是相等的。
五聚物引起的線粒體膜電位的去極化大多數(shù)轉(zhuǎn)化的乳腺癌細(xì)胞在用五聚物(表3，表示得自三次實(shí)驗(yàn)中的平均數(shù)據(jù))處理后表現(xiàn)出線粒體膜的高度去極化。這個(gè)發(fā)現(xiàn)的例外是MCF-7，在多次試圖使用不同的傳代細(xì)胞后，去極化不能被證明。
表3MMP去極化(％)
*無(wú)限增殖化細(xì)胞系MDA MB-231細(xì)胞對(duì)五聚物的反應(yīng)表現(xiàn)為線粒體膜的高度去極化(平均為58％)，而用DMSO處理的細(xì)胞的膜的去極化范圍為5-10％。然而，五聚物處理僅導(dǎo)致20％的MCF-10A細(xì)胞線粒體膜去極化。DMSO處理僅引起10％MCF-10A線粒體膜去極化。這些結(jié)果在期望的背景值范圍內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞僅以培養(yǎng)基處理時(shí)得到類(lèi)似的結(jié)果。另外，檢測(cè)到用五聚物處理的MCF-10A-Myc細(xì)胞有類(lèi)似的對(duì)膜去極化的抗性。在MDA MB-436、MDAMB-468和SKBR-3細(xì)胞中，五聚物還引起顯著的線粒體膜去極化(表3)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將MCF-10A和MDA MB-231細(xì)胞暴露于五聚物1、2和6個(gè)小時(shí)。結(jié)果顯示100μg/mL的五聚物僅在MDA MB-231細(xì)胞中引起時(shí)間依賴(lài)性線粒體膜去極化，類(lèi)似地，僅MDA MB-231細(xì)胞對(duì)25和100μg/mL的五聚物表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性反應(yīng)。
五聚物引起的PARP表達(dá)減少。
為了確定由五聚物引起的線粒體膜的去極化是否導(dǎo)致在人乳腺癌細(xì)胞系中的凋亡細(xì)胞的死亡，將MDA MB-231和MCF-7細(xì)胞用于PARP裂解產(chǎn)品的檢測(cè)。由于PARP是裂解級(jí)聯(lián)中的下游底物之一，其為極好的細(xì)胞凋亡標(biāo)志[Soldani，C.et al.，Apoptosis，7321-328，2002]。
結(jié)果指出PARP的主要帶(band)在以五聚物處理MDA MB-231細(xì)胞48個(gè)小時(shí)后仍未被裂解，且對(duì)于期望的85kDa裂解產(chǎn)品沒(méi)有提供證據(jù)。在所有未處理的對(duì)照組中觀測(cè)到低于116kDa分子量位置的PARP的未經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)帶，但是在五聚物處理的細(xì)胞中未見(jiàn)有這樣的蛋白質(zhì)帶。該結(jié)合的重要意義目前不明。
在缺少級(jí)聯(lián)3的MCF-7細(xì)胞中，以五聚物處理48個(gè)小時(shí)，引起完全長(zhǎng)度的PARP(116kDa)減小。這個(gè)結(jié)果可能是由于在這些細(xì)胞中的或者級(jí)聯(lián)7或者級(jí)聯(lián)6的作用。然而，沒(méi)有檢測(cè)到裂解的PARP片段。目前，五聚物在引起人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡中所起的作用尚有待研究。
五聚物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶作用作為潛在的五聚物靶向用于LPS篩選的所選擇的蛋白質(zhì)為那些通常涉及控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)(參見(jiàn)表1)?？偣灿?5個(gè)不同的抗體用于重點(diǎn)在于被測(cè)試蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，顯示它們的活化狀態(tài)的篩選。
LPS試驗(yàn)結(jié)果表明，有8種蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)受五聚物的影響Cdc2、FKHR、p53、PKC-δ、PKC-θ、pRb、SAPK/JNK和Stat5。在48hrs內(nèi)，五聚物使5種蛋白質(zhì)的磷酸化作用減少，而經(jīng)過(guò)五聚物處理72hrs后，所有8種蛋白質(zhì)的磷酸化作用均減少。
與各自的對(duì)照組相比較，并基于密度計(jì)量學(xué)，在48hrs的處理后Cdc2(Tyr15)的磷酸化作用減少了31％和72hrs的處理后減少45％，在72個(gè)小時(shí)后FKHR(Ser256)的磷酸化作用減少了63％；處理后的p53(如用抗體混合物在Ser37、46和392檢測(cè))的磷酸化作用減少了36％；在48hrs時(shí)PKC-δ于Ser643的磷酸化作用減少了22％和72hrs后減少49％；PKC-θ于Ser643/676的磷酸化作用僅在72hrs后即減少49％；于48hrs時(shí)pRb于Ser795和Ser807/811的磷酸化作用減少36％和處理后72hrs減少40％；于48hrs時(shí)SAPK/JNK于Thr183/Tyr185的磷酸化作用減少34％和于處理后72hrs時(shí)減少26％；和于48hrs時(shí)Stat5于Tyr694的磷酸化作用減少28％和于72hrs時(shí)減少33％。蛋白質(zhì)p53殘基Ser6、Ser9、Ser20和Ser15受五聚物的影響不顯著。盡管這些蛋白質(zhì)的磷酸化作用受五聚物的影響，但是它們的總細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)并不受影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示基于蛋白質(zhì)行為的聚類(lèi)列于所有在五聚物處理72個(gè)小時(shí)后用LPS分析的樣本中。分析顯示對(duì)照組和處理組之間存在明顯分離。
對(duì)于Cdc2-P、FKHR-P、p53-P和pRb的LPS分析的結(jié)果示于圖1A。
參考圖1B，使用免疫印跡確認(rèn)LPS結(jié)果。在這個(gè)試驗(yàn)中，五聚物對(duì)Cdc2(Tyr15)于48和72hrs時(shí)、FKHR(Ser256)于48和72hrs時(shí)、p53(Ser37、Ser46和Ser392)于72hrs時(shí)和pRb(Ser795和Ser807/811)于48和72hrs時(shí)的磷酸化形成有作用。
如通過(guò)LPS分析(圖1A)和從PVDF膜實(shí)驗(yàn)所證明的，Cdc2、FKHR和p53的總蛋白質(zhì)表達(dá)不受五聚物的影響。然而，至于pRb，總的和磷酸化特異性位點(diǎn)均受五聚物的影響(圖1C)。用GAPDH表達(dá)(圖1B和1C)證實(shí)荷載的相等性。
使用現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)性免疫印跡條件和PVDF膜，通過(guò)LPS對(duì)五聚物對(duì)PKC-δ、PKC-θ、SAPK/JNK和Stat5的作用的初步篩選所得結(jié)果未被證實(shí)。
五聚物減少p53(Ser392)和pRb(Ser780、Ser795和Ser807/811)磷酸化作用p53和Rb兩者均包含大量的磷酸化位點(diǎn)，和每個(gè)單獨(dú)的位點(diǎn)決定獨(dú)特的蛋白質(zhì)功能。由于五聚物對(duì)G0/G1細(xì)胞周期生長(zhǎng)停止(其中p53和pRb在控制細(xì)胞周期的這個(gè)階段中起關(guān)鍵作用)的作用，采用P-FILM技術(shù)(20/20Gene Systems)，對(duì)以100μg/mL的五聚物處理MDAMB-231中的這兩種蛋白48和72hrs和相應(yīng)的DMSO處理對(duì)照組進(jìn)行高分辯功能的繪圖。該項(xiàng)分析的結(jié)果示于圖2和3。
如于圖2A中所示，在MDA MB-231細(xì)胞中的內(nèi)源性p53表達(dá)的水平，經(jīng)五聚物處理的樣本僅于48hrs后稍微減少?；诿芏扔?jì)量學(xué)數(shù)據(jù)，這項(xiàng)減少不顯著(數(shù)據(jù)未顯示)。p53的絲氨酸殘基的圖顯示Ser15殘基和Ser46的于處理后48h的磷酸化作用僅少量減少(圖2A和2B)，而于處理后48和72hrs時(shí)均檢測(cè)出p53 Ser392殘基的應(yīng)答于五聚物的顯著的脫磷酸作用(圖2A)。通過(guò)傳統(tǒng)的在PVDF膜上的免疫印跡法得到該結(jié)果另外的確證。Ser20殘基的磷酸化作用于48hrs時(shí)減少，但在以五聚物處理72hrs的樣本中不受影響(圖2A)。蛋白質(zhì)荷載的可比性通過(guò)監(jiān)測(cè)GAPDH蛋白質(zhì)表達(dá)證實(shí)(圖2A)。
除了MBA MD-231細(xì)胞，于48和72hrs處理的時(shí)間段，在以五聚物處理的MDA MB-468(變異的p53)和MCF-7(野生型p53)中評(píng)價(jià)p53狀態(tài)。類(lèi)似于MDA MB-231細(xì)胞，內(nèi)源性p53在MDA MB-468中的表達(dá)受五聚物處理的影響不顯著(圖2B)。當(dāng)比較時(shí)，p53于Ser392的磷酸化百分率在MDA MB-231(53％，與未處理的對(duì)照組比較)和MD MB-468細(xì)胞(33％，與未處理的對(duì)照組比較)中均減少，而在MDAMB-468細(xì)胞中Ser15和Ser46未受顯著的影響。
在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)于內(nèi)源性野生型p53或MCF-7細(xì)胞中的磷酸化p53的信號(hào)(圖2B)。這個(gè)結(jié)果是所預(yù)料的，因?yàn)榕c過(guò)度表達(dá)的變異的p53(DiCioccio et al.，Cancer GenetCytogenet.，10593-102，1998)對(duì)照，野生型p53的內(nèi)源性水平不易通過(guò)免疫印跡檢測(cè)出。
參考圖3，還研究了MDA MB-231細(xì)胞中的pRb于Ser780、Ser795和Ser807/811的對(duì)五聚物的反應(yīng)的磷酸化狀態(tài)。五聚物處理引起內(nèi)源性pRb的蛋白質(zhì)表達(dá)的減少，可能導(dǎo)致所有被測(cè)試的殘基于處理后48和72個(gè)小時(shí)的磷酸化作用的減少?；贕APDH蛋白質(zhì)表達(dá)，樣本荷載相等。
權(quán)利要求
1.一種在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用的方法，其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化，該方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物接觸 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白選自Cdc2、分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)、p53和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白(pRb)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
4.權(quán)利要求2的方法，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖是單糖。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述糖是單糖。
7.權(quán)利要求1的方法，其中n是5。
8.權(quán)利要求2的方法，其中n是5。
9.權(quán)利要求3的方法，其中n是5。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中n是5。
11.一種治療其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的超磷酸化對(duì)腫瘤表型起作用的腫瘤的方法，該方法包括給予罹患所述腫瘤的人或脊椎動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白選自Cdc2、分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)、p53和視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白(pRb)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
14.權(quán)利要求12的方法，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述糖是單糖。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述糖是單糖。
17.權(quán)利要求11的方法，其中n是5。
18.權(quán)利要求12的方法，其中n是5。
19.權(quán)利要求13的方法，其中n是5。
20.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其中n是5。
21.權(quán)利要求11的方法，其中所述人罹患以至少在氨基酸位置Ser392的p53過(guò)度表達(dá)和超磷酸化為特征的癌癥。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述人罹患乳腺癌或結(jié)腸癌。
23.權(quán)利要求11的方法，其中所述人罹患過(guò)度表達(dá)AKT激酶的癌癥。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌或結(jié)腸直腸癌。
25.權(quán)利要求11的方法，其中所述人罹患過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的癌癥。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
27.權(quán)利要求11的方法，其中所述人或脊椎動(dòng)物罹患對(duì)用紫杉醇治療不敏感的癌癥。
28.權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)的方法，其中n是5，R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
29.一種治療過(guò)度表達(dá)AKT激酶的癌癥的方法，該方法包括給予罹患所述癌癥的哺乳動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代；其中所述哺乳動(dòng)物是人或脊椎動(dòng)物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
31.權(quán)利要求30的方法，該方法包括給予另外的化學(xué)治療劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述另外的化學(xué)治療劑是AKT抑制劑。
33.一種治療過(guò)度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的癌癥的方法，該方法包括給予罹患所述癌癥的哺乳動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代；其中所述哺乳動(dòng)物是人或脊椎動(dòng)物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
35.權(quán)利要求34的方法，該方法包括給予另外的化學(xué)治療劑。
36.一種治療對(duì)紫杉醇耐藥的癌癥的方法，該方法包括給予罹患所述癌癥的哺乳動(dòng)物有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代；其中所述哺乳動(dòng)物是人或脊椎動(dòng)物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
38.權(quán)利要求37的方法，該方法包括給予另外的化學(xué)治療劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述另外的化學(xué)治療劑是紫杉醇。
40.一種個(gè)性化治療腫瘤的方法，該方法包括(i)評(píng)價(jià)患者細(xì)胞樣本中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)；和(ii)通過(guò)給予有效量的具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物治療表現(xiàn)出Cdc2、p53、FKHR或pRb的超磷酸化和/或p53、AKT或細(xì)胞周期蛋白D1過(guò)度表達(dá)的患者 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代；其中所述患者是人或脊椎動(dòng)物。
41.一種適合用于聯(lián)合治療腫瘤的制成品，它包含(i)至少一個(gè)容器；(ii)第一種化合物，其是具有式An的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或其衍生物包括氧化產(chǎn)物 其中n是2至18的整數(shù)；R和X各自具有或者α或者β立體化學(xué)；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y，以及單體單元的連接發(fā)生在C-4、C-6或C-8上；當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通過(guò)酯鍵由酚的部分任選取代；和(iii)第二種化合物，其為不同于第一種化合物的另外的化學(xué)治療劑，其中第二種化合物是在單獨(dú)的組合物中，在單獨(dú)的容器中，或與第一種化合物混合。
42.權(quán)利要求41的方法，其中第二種化合物是紫杉醇。
43.權(quán)利要求41的方法，其中第二種化合物是AKT抑制劑。
44.權(quán)利要求41的方法，其中第二種化合物是細(xì)胞周期蛋白D1抑制劑。
45.權(quán)利要求41的方法，其中第二種化合物是EGFR、IGFR或Her-2抑制劑。
46.權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的方法，其中n是5。
47.權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的方法，其中R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
48.權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的方法，其中n是5，R是OH，和當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元相連接時(shí)，X、Y和Z是氫。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療某些腫瘤的、包含多元酚例如矢車(chē)菊苷配質(zhì)及其衍生物的組合物及其使用的方法，更通常地說(shuō)，是引起在腫瘤細(xì)胞中的超磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的脫磷酸作用，其中所述蛋白質(zhì)的超磷酸化促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)C07D311/78GK1933818SQ200580009441
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2005年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者D·拉姆爾亞克, L·J·小羅曼茨克, R·B·迪克遜 申請(qǐng)人:馬爾斯公司