專利名稱：治療性分子與產生和/或選擇所述治療性分子的方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明總體涉及可用于誘導例如但不限于癌細胞這樣的特定細胞凋亡的治療性分子，以及產生和/或選擇治療性分子的方法。本發(fā)明還提供誘導例如癌細胞這樣的細胞發(fā)生凋亡的方法以及可用于此的藥物組合物。本發(fā)明還提供通過選擇性抑制促生存(pro-survival)蛋白質來產生或選擇能夠誘導特定細胞凋亡的治療劑的方法。本發(fā)明還提供基于結構結合特征設計治療性分子的計算機方法。
現有技術描述本說明書中的任何現有技術參考文獻均不是，也不應被視作，對該現有技術構成了任何國家的公知常識的承認或任何形式的暗示。
本文中所引用參考文獻的著錄項目列于本說明書末尾。
癌癥是發(fā)展中國家的第二大死亡原因。除了使患者及其家屬遭受痛苦之外，癌癥也是在治療上最為昂貴的疾病之一(Zhang，Nat RevDrug Discov 1101-102，2002)。因此，盡管已經付出了人類生命的代價，如果同時考慮治療費用以及由于使經濟生產力降低而造成的損失，到2010年對社會的年度經濟負擔預計約為20～50億美元。
程序性細胞死亡(凋亡)的擾亂是包括癌癥在內的許多重要疾病發(fā)展過程中的一個中心步驟。Bcl-2蛋白家族是一個凋亡關鍵調控因子家族。研究表明，人濾泡淋巴細胞瘤中發(fā)生的Bcl-2過表達會抑制凋亡并促使腫瘤形成(Vaux等人，Nature 335440-442，1988；Strasser等人，Nature 348331-333，1990)。在高達90％的乳腺癌、結腸癌和前列腺癌中也注意到了Bcl-2過表達(Zhang，2002，出處同前)，這些癌癥代表了一些最為普通的癌癥。Bcl-2的促生存家族成員也在許多腫瘤中過表達。毫無疑問，凋亡受損目前已被視為大多數惡性腫瘤發(fā)生過程中的中心步驟(Cory等人，Nat Rev Cancer 2647-656，2002)。
凋亡受損也是細胞毒性癌癥療法效力的一個主要障礙(Cory等人，2002，出處同前；Johnstone等人，Cell 108153-164，2002)。大多數細胞毒性試劑，包括許多化療藥物和放射，通過比如腫瘤抑制因子p53來間接啟動凋亡(Cory等人，2002，出處同前)。然而，在多數腫瘤中p53途徑是失活的，阻止了該信號引發(fā)凋亡。因此，p53功能的喪失或者Bcl-2的過表達均能激發(fā)化學抗性，這是治療失敗的一個常見原因。
Bcl-2蛋白家族中促進細胞存活的那些成員，包括哺乳動物Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1，含有三或四個具有序列相似性的BH(Bcl-2homology，Bcl-2同源物)區(qū)，并發(fā)揮功能直至被它們的BH3-only家族成員中和。這些促凋亡拮抗劑，包括哺乳動物Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa，彼此間以及與更大的家族之間僅通過短BH3結構域相關(Huang和Strasser，Cell 103839-842，2000)。相反，Bax和Bak，促凋亡家族成員的一個亞組，卻與Bcl-2共有三個BH結構域，且可能在細胞內膜透化中具有關鍵的下游作用(Wei等人，Science 292727-730，2001)。
BH3-only蛋白質控制細胞穩(wěn)定，損傷信號啟動它們與促生存類Bcl-2蛋白質的結合，由此引發(fā)細胞死亡(Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出處同前)。它們的由轉錄信號(例如Bim、Puma、Noxa)或多種不同的翻譯后機制(例如Bim、Bmf、Bad、Bid)所誘導的差異活化，賦予了它們某些信號特異性(Putha lakath等人，Cell Death Differ 9505-512，2002)。然而通常認為，各種不同的BH3-only一旦被激活則通過靶向所有的促生存類Bcl-2蛋白質來發(fā)揮類似的功能(Adams等人，Genes Dev 172481-2495，2003；Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003；Huang和Strasser，2000，出處同前)。然而，它們的相互作用未得到系統(tǒng)的特征描述，少量的定量研究也限于Bcl-xL或Bcl-2(Letai等人，Cancer Cell 2183-192，2002；Petros等人，2000，出處同前；Sattler等人，1997，出處同前)。確定多樣變化的BH3-only蛋白質與促生存家族成員是否選擇性地或混雜地相互作用，對于澄清細胞死亡是如何引發(fā)的是非常重要的(Adams，2003，出處同前；Cory等人，2003，出處同前；Danial和Korsmeyer，Cell 116205-219，2004)且對于目前開發(fā)模擬BH3-only蛋白質起作用的化合物作為新抗癌劑的努力是非常相關的。
根據降低毒性和更好的靶向治療這一要求，顯然需要鑒定能夠與類Bcl-2蛋白質相互作用并抑制其促生存功能的分子。
發(fā)明概述在本說明書中，除非另有要求，詞語“包括”及其變體如“包含”或“含有”應理解為意指包含所述整數或步驟或所述的多個整數或步驟的組，但卻不排除任何其它整數或步驟或所述多個其它的整數或步驟的組。
本文中所使用的縮略語如表1所定義。
本發(fā)明提供促生存分子的小分子拮抗劑，尤其是促生存分子或其它相關促生存分子的Bcl-2家族中的一個或多個成員的小分子拮抗劑。拮抗劑的產生和/或選擇以Bcl-2家族蛋白質(BH3-only蛋白質)的天然拮抗劑的模擬物和/或具有僅被小范圍BH3-only蛋白質抑制的Bcl-2分子之間的結構相似性的模擬物為基礎。
結構研究揭示，由促凋亡蛋白質BH3結構域形成的兩性α-螺旋的疏水表面插入到由促生存蛋白質的BH1、BH2和BH3結構域形成的疏水溝中，并抑制它們的促生存功能。促凋亡蛋白質中的α-螺旋在其螺旋外部含有名稱為H1、H2、H3和H4的疏水區(qū)。氨基酸序列形成七個重復。H1至H4外表面與Bcl-2蛋白質上的口袋(溝)相互作用。
根據本發(fā)明，BH3-only蛋白質可以依據與之相互作用的Bcl-2靶分子譜在功能上相區(qū)分。根據本發(fā)明將這些組分作混雜型和限制型。通過鑒定混雜型和限制型BH3-only蛋白質(尤其是圍繞BH3結構域的α-螺旋與Bcl-2蛋白質疏水溝間的相互作用)的氨基酸電荷、大小、構象、溶解度、極性、疏水性、親水性以及氨基酸對三級結構差異的貢獻，可以產生或選擇出模擬這些組中的一個組或其它組的模擬物。Bcl-2蛋白質還帶有促進BH3-only蛋白質的混雜型或限制型活性的結構特征。
例如，可以對促凋亡分子上的七聯體重復中的氨基酸進行修飾，以減弱該氨基酸或在三級結構上與之最接近的氨基酸適配插入Bcl-2蛋白質上由三級結構形成的口袋中的能力。
限制型BH3-only蛋白質由此提供具有賦予其選擇性拮抗特定Bcl-2蛋白質能力的構象的支架(scaffold)。根據本發(fā)明，該支架可用作設計模擬物或模仿包括混雜型BH3-only蛋白質在內的化合物的模板，從而產生具有限制型結合譜型的拮抗劑。
相應地，在本發(fā)明的一種實施方案中，制備了能夠在所選定的例如但不限于癌細胞這樣的細胞類型中誘導凋亡的限制型BH3-only蛋白質的模擬物。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，混雜型和限制型BH3-only蛋白質在與存在于促生存Bcl-2蛋白質上的結合溝之間的相互作用水平上有所不同。
本發(fā)明還提供用于預測模擬限制型BH3-only蛋白質支架的分子構象從而產生和/或選擇和/或篩選候選化合物的計算方法，之后制備候選化合物并對其誘導凋亡的能力進行實驗評估。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供一種產生或選擇促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結構域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質結構；選擇一或多個與BH3-only蛋白質的混雜型結合表型相關的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bcl-2蛋白質的限制型結合模式的氨基酸或其化學類似物；分析各次替換后的相互作用其誘導更為限制的Bcl-2蛋白質結合譜的能力。
本發(fā)明還提供產生或選擇促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇限制型BH3-only蛋白質作為支架蛋白質，確定賦予該支架限制型表型的構象，產生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bcl-2蛋白質結合譜的構象部分的化合物。
因此，本發(fā)明提供一種根據帶有賦予其限制型表型的殘基位置的支架BH3-only蛋白質設計促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的計算機方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質；對這些蛋白質進行序列比對，和將這些蛋白質與限制型BH3-only蛋白質作同樣的比較；根據所述比對得到各氨基酸在一或多個帶來與Bcl-2蛋白質結合的混雜特性或限制特性的位置上的出現頻率；利用所述頻率產生一個選自電荷、大小、構象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結構的貢獻的計分函數；用所述計分函數和/或至少一種另外的計分函數來產生一套優(yōu)選蛋白質序列或其構象等價物，產生或選擇出一種具有與Bcl-2蛋白質的限制型結合表型的化合物或蛋白質。
在又一種實施方案中，本發(fā)明提供混雜型BH3-only蛋白質在產生或選擇賦予所述BH3-only蛋白質或其化學或構象等價物以限制型結合表型的氨基酸替換變體中的用途。
另一方面，本發(fā)明構思了一種產生或選擇Bcl-2蛋白質拮抗劑的方法，所述方法包括確定選自以下的一系列參數(1)鑒定混雜型和限制型Bcl-2蛋白質間的結構差異；(2)鑒定混雜型和限制型BH3-only蛋白質間的結構差異；和(3)鑒定Bcl-2-BH3-only蛋白質復合物的結構特征，然后設計與有限范圍內的Bcl-2蛋白質結合的BH3-only蛋白質模擬物。
BH3-only蛋白質的模擬物也可以通過例如但不限于在芯片上(insilico)篩選、高通量化學篩選、基于功能的檢測方法或結構活性關系這樣的方法來產生或選擇。
在另一種實施方案中，本發(fā)明的BH3-only模擬物易于以比如藥物組合物這樣的藥物形式提供。
本發(fā)明的組合物尤其適用于治療患有癌癥或有患癌癥傾向的受試者。
附圖簡述

圖1是顯示競爭結合實驗的圖形。(A)將Mcl-1注射進固定有突變體4EBimBH3(藍色)或wtBimBH3(紅色)的傳感器芯片。為獲得絕對結合(黑色)，從與wtBimBH3的反應中扣除了與4EBimBH3的基線反應。(B)促生存蛋白質等同地與Bim結合。傳感圖，其顯示將促生存蛋白質注射到固定化的wtBimBH3上時發(fā)生類似的反應。(C)溶液競爭實驗。提高競爭肽濃度(2)使Bcl-xL與固定化配體的結合減弱(1)。(D)與競爭劑BH3肽的預溫育使生物傳感器反應減弱。在將Bcl-xL與BikBH3的混合物注射到wtBimBH3傳感器芯片上之前，先將Bcl-xL與濃度逐漸升高的BikBH3進行了預溫育。線條(430秒處)表示用于計算IC50的反應。(E)BikBH3有效地與固定化的BimBH3競爭與Bcl-xL的結合。相對反應(％)顯示，在給定濃度的BikBH3存在下仍然與固定化肽結合的Bcl-xL與無BikBH3存在下的Bcl-xL(100％)的比率。(500秒后的不規(guī)律反應是由分析物解離后洗滌芯片引起的)。向專利權人提出請求可以獲得彩色復印件。
圖2是顯示促凋亡BH3-only和促生存類Bcl-2蛋白質具有顯著相互作用的圖形。(A)利用競爭性結合實驗，測定了所示相互作用的IC50(nM)。所示結果得自代表性實驗；多次實驗間觀察到的差異小于兩倍(用不同的芯片或不同批次的蛋白質)。(B)對相互作用的相對結合親和力(列表于A)反向作圖。顯示了促生存蛋白質的BH3結合圖。(C)中比較了形成其BH3結合溝的(α-螺旋2～8；Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003)人Bcl-2(殘基93-202)、人Bcl-xL(86-195)、人Bcl-w(42-151)、小鼠Mcl-1(190-300)和小鼠A1(33-148)的序列，并示為系統(tǒng)發(fā)生樹。向專利權人提出請求可以獲得彩色復印件。
圖3是顯示Bad、Bik和Noxa在哺乳動物細胞中具有選擇性促生存靶的照片。借助共免疫沉淀測試了FLAG(FL)-標記的促生存蛋白質(人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1)和HA-標記的BH3-only蛋白質(A，人Bim；B，人Puma；C，人Bik；D和E，小鼠Bad；F和G，小鼠Noxa)間的相互作用。將收獲自293T細胞的等量35S-標記裂解物與HA、FLAG(FL)或對照(C)標記的抗體進行共免疫沉淀。Bim(A)或Puma(B)與Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1結合良好。在A的頂部圖版中，為從大小上使Bim與Bcl-2相區(qū)分，用BimL代替了BimEL。(C)Bik偏好與Bcl-xL結合。(D)Bad結合Bcl-2和Bcl-xL，但不與Mcl-1結合，正如用同一濾膜與所示抗體做的免疫印跡(E)證實的。**內源14-3-3，與Bad結合，如免疫印跡(E)所證實的。(F)Noxa只結合Mcl-1，如免疫印跡(G)所證實。*Mcl-1的降解產物不能發(fā)生結合。
圖4是顯示促生存類Bcl-2蛋白質通過BH3-only蛋白質發(fā)生不同靶向的圖形。BH3-only蛋白質對促生存蛋白質的親和力(列于圖2)反向作圖以便能夠比較BH3結構域。向專利權人提出請求可以獲得彩色復印件。
圖5是顯示BH3肽具有成為α-螺旋傾向的圖形。(A)BH3肽和馬心臟肌球蛋白在30mM磷酸鈉(pH7)中的CD譜，其顯示所使用的BH3肽大部分是無結構的(一些具有低％的螺旋性)，而對照蛋白質馬心臟肌球蛋白在緩沖條件下形成了所預期的α-螺旋。208nM和222nM處所指的最小值(箭頭)對于α-螺旋多肽是典型的。(B)BH3肽和肌球蛋白在添加了30％(v/v)TFE的20mM磷酸鈉(pH7)中的CD譜，其顯示所有的BH3肽都具有與馬心臟肌球蛋白在螺旋穩(wěn)定溶劑TFE存在下的構象相似的α-螺旋構象(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989)。向專利權人提出請求可以獲得彩色復印件。
圖6是顯示促凋亡Bad和Noxa靶選擇性的促生存類Bcl-2肽的圖形。注射重組促生存類-Bcl-2蛋白質(Bcl-2ΔC22、Bcl-xLΔC24、Bcl-wΔC29、Mcl-1ΔN151ΔC23、A1ΔC20)或無關蛋白質(GST和LIF-受體)時，對(A)BadBH3或(B)固定有NoxaBH3的芯片的生物傳感器反應。Mcl-1和A1對BadBH3無親和力，而Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w積極結合BadBH3(A)。用NoxaBH3觀察到了互補模式(B)。向專利權人提出請求可以獲得彩色復印件。
圖7是顯示結合選擇性靶的BH3-only蛋白質具有弱殺傷活性的圖形。(A)對BH3-only肽對促生存蛋白質的親和力(列于圖3A)反向作圖以利于比較BH3的結合模式。(B)Bim和Puma(而非Bmf、Bad、Bik、Hrk或Noxa)對MEFs的有效殺死。用只表達GFP(對照)、或表達BH3-only蛋白質之一和GFP的反轉錄病毒感染永生化3T9 MEF。感染后24小時利用PI排斥測定了被感染(GFp+ve)細胞的活力。柱狀圖表示至少三次實驗的平均值±1SD。(C)用共免疫沉淀測試了FLAG(FL)-標記的促生存蛋白質(Bcl-xL和Mcl-1)與Bims(或其變體)間的相互作用。將等量來自被感染293T細胞的裂解物與Bim、FLAG(FL)標記或對照無關抗原的抗體進行共免疫沉淀(C)。用大鼠單克隆抗-FLAG抗體探測濾膜。*Mcl-1的降解產物。(D)與促生存蛋白質的結合受到限制的Bims變體是弱殺傷劑。感染后24小時分析了被編碼所示蛋白質(GFP+ve)的反轉錄病毒感染的MEFs的活力。柱狀圖表示至少三次實驗的平均值±1SD。(E)被表達BH3的反轉錄病毒感染的MEF的長期存活。用一百個被反轉錄感染的細胞鋪板，六天后計數所形成的GFP+ve克隆的絕對數量。用Bims(+)感染后未得到集落，而Bims4E未影響長期活力。Bik、Noxa、BimsBadBH3或BimsNoxaBH3有中度影響。數據表示來自至少3次實驗所形成的GFp+ve集落的平均數量±1SD。
圖8是顯示不同類別的BH3-only蛋白質間的合作的圖形。(A)基于結合數據給出的一個模型，用于解釋具有選擇性靶的特定BH3-only蛋白質的弱殺傷活性。(B)促凋亡BH3-only蛋白質間的合作。用共表達BH3-only蛋白質(Bims、Bik、Noxa或Noxa3E)和GFP、或共表達BH3-only蛋白質和GFP-標記-Bims、-BimsBadBH3或-BimsNoxaBH3的反轉錄病毒感染MEFs。感染后24小時對細胞活力計數；數據表示至少三次實驗的平均值±1SD。
圖9是顯示選擇性較低的Noxa突變體是有效的殺傷劑的圖形。(A)α-螺旋化的BimBH3區(qū)(編號指小鼠BimL)與Bcl-xL的靶溝(關鍵殘基以黑體標記)之間的相互作用。(B)人Bim(BimL)和人Noxa的核心BH3區(qū)的比對。突變的Noxa殘基框出。(C)Noxa突變體與Bcl-xL和Bcl-w的增強結合。在溶液競爭實驗中測試了野生型或突變Noxa肽結合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w或Mcl-1的能力。柱形圖顯示各相互作用的IC50(nM)。+IC50＞100μM。(D)Noxa m3與Bcl-xL和Mcl-1都結合。通過共免疫沉淀測試了Bcl-xL或Mcl-1，與BimsNoxaBH3m3之間的相互作用。*Mcl-1降解產物。(E)NoxaBH3 m3是一種有效的殺傷劑。用所示反轉錄病毒感染后24小時MEFs的存活。(F)NoxaBH3m3的劑量依賴型殺傷。用NoxaBH3或NoxaBH3 m3感染的MEFs的活力分作低、中或高GFP表達；(E，F)中的數據表示至少三次實驗的平均值±1SD。
發(fā)明詳述本發(fā)明設想用于產生BH3-only蛋白質模擬物的方法，所述模擬物計劃可用于誘導選擇性細胞尤其是在癌細胞中誘導凋亡。提出了利用氨基酸電荷、大小、構象、溶解度、極性、疏水性、親水性以及對限制型BH3-only蛋白質和它們各自的靶Bcl-2蛋白質之間的三級結構相似性的貢獻，以產生誘導凋亡的BH3-only蛋白質的模擬物。
在詳細描述標題發(fā)明之前，應當注意，本發(fā)明不限于特定的治療成分、生產方法、劑量方案等，可以做許多的變化。還應當理解，本發(fā)明中所使用的術語是為僅為描述特定的實施方案而不意指對其進行限制。
必須注意，如在本說明書中所使用的，單數形式的“一個”和“該”包括復數的方面，除非上下文中另外指明。因此，例如，“治療劑”的含義包括單一試劑，以及兩種或多種治療劑；“方法”的含義包括一種單一的方法，以及兩種或多種方法；“殘基”包括單個殘基，以及兩個或多個殘基，等等。
本文中的“凋亡”的含義意指細胞死亡的形式，其中發(fā)生一系列程序化的事件導致細胞的消除。
相應地，在本發(fā)明的一種實施方案中，制備了能夠在所選定的例如但不限于癌細胞這樣的細胞類型中誘導凋亡的限制型 BH3-only蛋白質的模擬物。
本文中的“癌細胞”的含義指，任何表現出不正常的生長、且傾向于以失控的方式增殖、并且在某些情況下發(fā)生轉移的細胞。本文中所考慮的癌癥包括但不限于ABL1原癌基因、AIDS相關癌癥、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺樣癌、腎上腺皮質癌、起因不明的骨髓化生、脫發(fā)、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星細胞瘤、共濟失調-毛血管擴張、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經膠質瘤、腦和中樞神經系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、中樞神經系統(tǒng)腫瘤、類癌瘤、宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓性白血病、結腸直腸癌、皮膚T淋巴細胞瘤、皮膚纖維肉瘤-隆凸、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、導管細胞癌、內分泌腺癌、子宮內膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、惡性骨髓瘤、肝外膽小管癌、眼癌、眼黑素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、先天性骨髓發(fā)育不全、纖維肉瘤、膽汁膀胱癌、胃癌、胃腸道癌、胃腸道類癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖細胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)層疾病、神經膠質瘤、婦科癌、血液惡性腫瘤、毛細胞性白血病、頭頸癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細胞增多病、霍奇金氏病、人視神經乳頭水腫病毒、水泡狀胎塊、血鈣過多、咽喉癌、眼內黑素瘤、島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、Langerhan′s-Cell-組織細胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni綜合癥、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、惡性棒狀腎腫瘤(Malignant-Rhabdoid-Tumor-of-Kidney)、成神經管細胞瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、遷移癌、口癌、多發(fā)性內分泌腺瘤、蕈樣霉菌病、骨髓異常增生綜合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失調、鼻癌、鼻咽癌、腎母細胞瘤、成神經細胞瘤、神經纖維瘤病遺傳性疾病、Nijmegen Breakage綜合征、非黑素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘺術卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周神經外胚層腫瘤、垂體癌、紅血球增多癥、前列腺癌、罕見癌及其相關病癥(Rare-cancers-and-associated-disorders)、腎細胞肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、白內障-毛細血管擴張-色素沉著綜合征、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤、惡性皮膚網狀細胞增多綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊索腫瘤、鱗片細胞肉瘤(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、遷移性細胞癌(膀胱)、遷移性細胞癌(腎-骨盆-/-輸尿管)、胚胎滋養(yǎng)層癌、尿道癌、泌尿系統(tǒng)癌、Uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、陰戶癌、瓦爾登斯特倫病(股骨小頭的骨軟骨病)巨球蛋白血癥、腎母細胞瘤。
作為本發(fā)明特定靶的癌癥是那些產生過量Bcl-2蛋白質或促生存家族成員和/或減少量的抑制Bcl-2蛋白質的促凋亡分子的癌癥。
在本發(fā)明的又一種實施方案中，BH3-only蛋白質可以是混雜型或限制型。本文中的“混雜型”的含義是指，該蛋白質結合許多種靶(即，結合全部或多種Bcl-2蛋白質)。本文中的“限制型”是指，該蛋白質僅結合特定靶(即，僅結合一種或幾種Bcl-2蛋白質)?；祀s型和限制型BH3-only蛋白質在存在于促生存Bcl-2蛋白質上的結合溝的相互作用的水平方面可以不同。
根據本發(fā)明，術語“靶”用于指比如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl和A1這樣的Bcl-2蛋白質或任何其它含有三或四個Bcl-2同源(BH)區(qū)的促生存分子。
“靶結合物”用于描述分子和或模擬BH3-only蛋白質，其抑制促生存蛋白質。天然存在的靶結合物包括Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk、Bid和Noxa。
本發(fā)明的目的是產生或選擇高度限制型或特異性的模擬物，其作為特定細胞(比如癌細胞)的凋亡抑制劑的靶結合物。
本發(fā)明在另一種實施方案中，提供一種產生或選擇促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結構域形成的兩性α-螺旋之殘基位置的支架BH3-only蛋白質結構；選擇一或多個與BH3-only蛋白質的混雜型結合表型相關的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bcl-2蛋白質的限制型結合模式的氨基酸或其化學類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導更為限制的Bcl-2蛋白質結合譜的能力。
本文中的“支架蛋白”的含義是指期望其變體文庫的蛋白質(也即BH3-only蛋白質)。該支架蛋白質用作蛋白質設計計算方法中的輸入，且常用于促進實驗文庫的形成。支架蛋白可以是具有已知結構的或者可以對其結構進行計算、估計、模型化或實驗測定的任何蛋白質。
本發(fā)明還提供一種產生或選擇促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇一種限制型BH3-only蛋白質作為支架蛋白質，確定賦予該支架限制型表型的構象，產生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bcl-2蛋白質結合譜的構象部分的化合物。
在又一種實施方案中，本發(fā)明提供混雜型BH3-only蛋白質作為氨基酸殘基替換基質在產生或選擇替換變體中的用途，所述變體賦予所述BH3-only蛋白質或其化學或構象等價物以限制型結合表型。
在一個實施例中，描述了Noxa BH3-only蛋白質選擇性的分子基礎。
Noxa BH3選擇性地結合Mcl-1和A1，且不結合Bcl-2、Bcl-w或Bcl-xL。
一項對Noxa BH3結構域序列的研究揭示，在人Noxa和兩個鼠NoxaBH3結構域中緊鄰在H4前方的氨基酸非常獨特地是一個堿性氨基酸(表3)。有人提出，如果將該位置恢復為在其它BH3結構域序列中更常見的酸性殘基，則會恢復其與Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的結合。一項對突變人Noxa BH3結構域的實驗(其中將相關賴氨酸替換為谷氨酸)顯示，突變肽的IC50為5.8μM，也即比野生型肽緊密至少17倍。
人Noxa BH3結構域的另一個獨特特性是在H3位置存在有芳香氨基酸苯丙氨酸。這是帶有支鏈γ碳原子的唯一一次出現(表3)，提示在靶Bcl-2家族蛋白中該位置需要更多的空間來接收較大的氨基酸。若將Bcl-2家族蛋白質的氨基酸序列進行比對，很明顯，Mcl-1和A1在BH3結構域H3氨基酸的受體位點包含較小的氨基酸。通過在已經發(fā)表的與Bim BH3結構域的復合Bcl-xL的三維結構(Liu，X.等人，Immunity 19341-352，2003)上繪圖以及利用上述序列比對，這一結論是有可能的。人Noxa BH3在H3位置從F突變?yōu)镮導致突變肽的IC50為1.1uM，也即比野生型緊密至少90倍。K突變?yōu)镋加上F突變?yōu)镮的雙突變顯示該變化產生協同作用，其IC50為0.1μM。
這解釋了本發(fā)明如何能夠將選擇性的BH3結構域轉變?yōu)榛祀s型的BH3結構域。
本文中的“試劑”應理解為，源自天然、重組或合成途徑的任何蛋白性或非蛋白性分子這一含義?？衫玫膩碓窗êY選天然產生的文庫、化學分子文庫以及組合文庫、噬菌體展示文庫以及基于體外翻譯的文庫。尤其有用的來源是對混雜型BH3-only蛋白質支架進行修飾從而產生限制型分子。
在一種實施方案中，本發(fā)明可用于完全抑制或部分降低Bcl-2或促生存家族成員的促生存功能的活性的試劑可以是蛋白質性的或化學分子。所有這樣的對Bcl-2家族蛋白的促生存活性的降低、抑制、減弱或下調均包括在術語“拮抗劑”或“拮抗”內。
對于蛋白質性分子試劑，這樣的分子包括肽、多肽和蛋白質。此外，術語突變體、部分、衍生物、同源物、類似物或模擬物意指包括各種不同形式的完全抑制或基本上降低Bcl-2家族蛋白質的促生存功能的試劑。
試劑可以是天然存在的或人工產生的分子。試劑可以是包含一個或多個氨基酸替換、缺失或添加的BH-3 only蛋白質。試劑可以是通過突變或其它化學方法產生的，或重組或合成產生的。丙氨酸掃描是一種鑒定重要的氨基酸的有效技術(Wells，Methods Enzymol 2022699-2705，1991)。該技術中，用丙氨酸替換氨基酸殘基，并測定其對肽活性的影響。通過這種方法對試劑中的每個氨基酸殘基進行分析以確定重要的結構和/或電荷和/或構象和/或疏水/親水區(qū)域。測試試劑與Bcl-2結合的能力以及其它性質，比如壽命、結合親和力、解離速率、跨膜能力或誘導凋亡的能力。
本發(fā)明的試劑還可以包括全長BH3-only蛋白質的Bcl-2結合部分。這些部分是至少1個、至少10個、至少20個和至少30個連續(xù)的氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個氨基酸，其定義一個比如兩性α-螺旋結構的Bcl-2結合片段。建議該結構與Bcl-2蛋白質的疏水溝相互作用。該類型的肽可以通過應用標準重組核酸技術獲得或用常規(guī)液相或固相合成技術合成。例如，對于液相合成或固定合成，可以參考由Blackwell科技出版社出版、Nicholson編輯、名稱為“合成疫苗”中的Atherton和Shephard描述的第九章“肽合成”?；蛘撸梢酝ㄟ^用比如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶這樣的蛋白酶消化本發(fā)明的氨基酸序列來制備肽。消化片段可以通過，例如，高效液相色譜(HPLC)技術純化。任何這樣的片段，無論其產生的途徑如何，均應理解為包含在本文所使用的術語“拮抗劑”中。
因此拮抗劑可能包含混雜型BH3-only蛋白質的衍生物。這樣的一種衍生物包括部分、突變體、同源物、片段、類似物以及雜交體或融合分子以及混雜型BH3-only蛋白質的糖基化變體。衍生還包括在進行優(yōu)化比對后在比較框中具有百分比氨基酸序列同一性的分子。優(yōu)選地，特定序列和對照序列間的相似性百分數至少約為60％或至少約70％或至少約80％或至少約90％或至少約95％或更高，比如至少約96％、97％、98％、99％或更高。優(yōu)選地，本試劑的種間、功能或結構同源物間的相似性百分數為至少約60％或至少約70％或至少約80％或至少約90％或至少約95％或更高，比如至少約96％、97％、98％、99％或更高。介于60％和100％之間的相似性或同一性百分數也是預期的，比如60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
本文中所構思的蛋白質拮抗劑(比如BH3-only蛋白質的衍生物)中的殘基類似物包括但不限于對側鏈的修飾，在肽、多肽或蛋白質合成過程中摻入非天然氨基酸和/或它們的衍生物，以及使用交聯劑和其它的對蛋白質性分子或其類似物施加構象約束的方法。該術語也不排除對多肽進行修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。該定義中包括，例如，包含一個或多個氨基酸類似物(包括，例如，比如表1中所列的那些非天然氨基酸)的多肽，或具有替換的連鍵的多肽。這樣的多肽可能需要能夠進入細胞。
本發(fā)明所構思的側鏈修飾的例子包括氨基基團修飾，比如通過與醛反應之后用NaBH4還原進行的還原性烷基化；用甲基亞氨逐乙酸酯進行脒化；用乙酸酐進行?；?；用氰酸鹽使氨基基團甲氨?；?；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基基團三硝基苯基化；用琥珀酸酐和四羥基鄰苯二甲酸酐使氨基基團?；?；和用吡哆醛-5-磷酸使賴氨酸吡啶化，之后再用NaBH4還原。
精氨酸殘基的胍基可以通過用比如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛這樣的試劑形成雜環(huán)縮合產物進行修飾。
羧基可以通過碳二亞胺活化、形成O-?；愲濉⒅笱苌鸀槔鐚陌被衔飦磉M行修飾。
巰基可以通過，比如用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；過甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其它取代馬來酰亞胺反應；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯汞氯化物、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞劑形成含汞衍生物；用氰酸鹽在堿性pH下甲氨?；瘉磉M行修飾。
色氨酸殘基可以通過例如用N-溴琥珀酰亞胺氧化或用2-羥基-5-溴化硝基苯或硫苯基鹵化物使吲哚環(huán)烷基化進行修飾。另一方面，酪氨酸殘基可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物進行改變。
對組氨酸的咪唑環(huán)的修飾可以這樣實現用碘乙酸衍生物使其烷基化或用二乙基焦碳酸使其N-乙酯基化。
肽合成中摻入的非天然氨基酸及其衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構體。本文所考慮的非天然氨基酸的清單示于表1。這樣的非天然氨基酸可用于形成類似于限制型BH3-only支架的三級結構。
表1非常規(guī)氨基酸代碼
表1(續(xù))
表1(續(xù))
表1(續(xù))
例如，可以使用交聯劑來穩(wěn)定3D構象，用比如帶有n＝1至n＝6的(CH2)n間隔基團的雙功能酰亞胺酯、戊二醛、N-羥琥珀酰亞胺酯這樣的同-雙功能交聯劑，和通常含有比如N-羥琥珀酰亞胺這樣的氨基-反應性部分以及另一個比如馬來酰亞胺或巰基(SH)或碳二亞胺(COOH)這樣的基團特異性反應部分的雜-雙功能試劑。此外，可以通過，例如，摻入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸Cα和Cβ原予之間引入雙鍵，和通過比如在N和C末端之間、兩條側鏈之間或側鏈和N或C末端之間形成氨基化合物這樣在導入共價鍵來形成環(huán)肽或類似物，來限制肽的構象。
BH3-only蛋白質的模擬物的含義包括結構和/或功能水平上的靶結合物(也即BH3-only蛋白質)且抑制促生存Bcl-2-蛋白質。根據本發(fā)明的一種實施方案，提出產生經過選擇的BH3-only蛋白質模擬物。根據靶間的結構差異以及靶結合物間的結構差異設計了一種BH3-only蛋白質。根據本發(fā)明以及如上文所定義的，后一種可以分為混雜型(也即結合所有或多種Bcl-2蛋白質)或限制型(也即只結合一種或幾種Bcl-2蛋白質)。
肽模擬物可以是模擬蛋白質二級結構組件的含肽分子(Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993)。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質肽骨架的存在主要是為了以有利于比如抗體和抗原、酶和底物這樣的分子相互作用的方式確定氨基酸側鏈的方向或支撐蛋白質。設計了一種能夠發(fā)生與天然分子類似的分子互作的肽模擬物。BH3-only蛋白質的肽或非肽模擬物在本發(fā)明中可用作降低Bcl-2促生存功能的試劑。
將模擬物設計成藥學活性化合物是本領域已知的一種根據“先導”化合物開發(fā)藥物的方法。當活性化合物難以合成或合成花費昂貴或者它不適于特定的給藥方式時，這種方法則比較令人滿意，例如肽不是口服組合物的活性試劑，因為傾向于在食道中被蛋白酶快速降解。模擬物設計、合成和測試通常用于避免為尋找靶特性而隨機篩選大量的分子。
從具有給定靶特性的化合物設計模擬物通常采取幾個步驟。首先，確定該化合物中對于確定該靶特性來說是關鍵和/或重要的特定部位。就肽而言，這可以通過系統(tǒng)地改變該肽中的氨基酸殘基來完成，例如依次替換各殘基。如上文所述，肽的丙氨酸掃描常用于提煉這樣的肽基序。這些構成該化合物的活性區(qū)域的部位或殘基已知為其“藥效團”。
一旦發(fā)現了藥效團，則利用多種來源的數據，例如分光鏡技術、x-射線衍射數據和NMR，根據其物理特性，例如立體化學、鍵、大小和/或電荷，將其結構建立模型。模型建立過程中可以利用計算機分析、相似性作圖(其模擬藥效團的電荷和/或體積而非各原子間的鍵)和其它技術。
在該方法的一種變化中，建立了配體及其結合伴侶的三維結構。這在配體和/或結合伴侶在結合后構象發(fā)生改變的情況尤其有用，它使得該模型在設計模擬物中能夠考慮到這一點。模型可用于產生與線性序列或三維構型相互作用的抑制劑。
之后選擇一種在其上可以移植模擬藥效團的化學基團之模板分子?？梢苑奖愕剡x擇該模板分子和移植到它上面的化學基團，從而使得該模擬物易于合成、可能是藥學可接受的、且在體內不會降解而同時保持先導化合物的生物學活性?；蛘?，如果該模擬物是以肽為基礎的，則可以通過使肽環(huán)化從而提高其剛性來使其更加穩(wěn)定。之后可以對用這種方法找到的模擬物進行篩選以觀察它們是否具有靶特性，或它們表現到什么程度。之后可以進行進一步的優(yōu)化或修飾得到一個或多個最終的模擬物用于體內或臨床實驗。
根據本發(fā)明合理的藥物設計的目標是為制備藥物而利用計算機方法產生和/或選擇限制型BH3-only蛋白質的結構類似物，例如，所述類似物是多肽的更具活性或穩(wěn)定的形式，且具有限制性結合譜。在一種方法中，首先借助X射線晶體照相術、計算機模型或最典型地通過組合方法確定目的蛋白質的三維結構。關于多肽的有用信息也可以通過以同源蛋白質結構為基礎的模型來獲得。一個合理的藥物設計的例子是開發(fā)HIV蛋白酶抑制劑(Erickson等人，Science 249527-533，1990)。
一種藥物篩選方法，優(yōu)選在競爭性結合實驗中，利用了用表達多肽或片段的重組多核苷酸穩(wěn)定轉化的真核或原核細胞。這樣的細胞，無論是存活的或固定的，均可用于標準結合實驗?？梢詼y定，例如，靶或片段與被測試劑間的復合物形成，或檢查靶或片段與已知配體的復合物的形成受被測試劑的輔助或干擾到何種程度。
篩選程序包括檢測(i)藥物和靶之間復合物的存在，或(ii)編碼靶的核酸分子的表達水平的變化。一種檢測形式涉及競爭性結合實驗。在這樣的競爭結合實驗中，典型地對靶進行標記。從任何推定的復合物中分離出游離靶，游離(也即未復合的)標記的量是被測試劑與靶分子的結合度量。也可以測定結合靶的量，而不是游離靶的量。也可能對化合物而非靶進行標記，以及測定在被測試藥物存在或不存在的情況下與靶結合的化合物的量。
藥物篩選的另一種技術提供為對具有適宜親和力的化合物提供高通量篩選，該技術詳細描述于Geysen(國際專利公布號WO 84/03564)。簡言之，在固相基質，比如塑料插腳或一些其它表面，上合成了大量不同的小肽測試化合物。使肽測試化合物與靶反應，并洗滌之。之后用本領域已知的方法檢測結合的靶分子。該方法可適于篩選非肽、化學基團。因此，這一方面延展到了篩選靶拮抗劑或激動劑的組合方法。
可將純化的靶物直接包被到平板上用于上述藥物篩選技術中。然而，也可以使用靶的非中和抗體來將靶固定到固相上。為利于結合和鑒定，也可以將靶與容易選擇的標簽表達為融合蛋白。
在另一種實施方案中，可以對Bcl-2和Bcl-w抑制劑實施高通量化學篩選(HTCS)。如果BH3-only蛋白質，比如Bim，與促生存分子(Bcl-2或Bcl-w)的相互作用促成凋亡，則可以在文庫中篩選以預防BH3結合的方式與促生存蛋白質結合的小有機分子。為鑒定靶向一種或同時靶向兩種抗凋亡分子的化合物，可以實施多次篩選活動。
可以在細菌中產生高容量實驗所需的蛋白質，用光學生物傳感器(BiaCore)所作的一項初期研究顯示，生物素化的BimBH3肽以高親和力與His6-標記的Bcl-wΔC10(Kd～11nM)結合(Hinds等人，EMBOJ221497-1507，2003)。利用AlphaScreenTM(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)技術(Glickman等人，J Biomol Screen73-10，2002)已經開發(fā)出了一種HTCS所需的高容量結合實驗。通過揭示兩個伴侶蛋白質相互作用時發(fā)生的熒光輸出量變化，可以高靈敏度地監(jiān)控蛋白質的相互作用。AlphaScreenTM非常適于HTCS，因為它非常有效且易于在很寬的動態(tài)范圍內作為同源實驗以小體積實施。
在一種實施方案中，將His6Bcl-wΔC10結合到鎳包被的受體珠上，將生物素化的BimBH3肽結合到鏈霉抗生物素包被的供體珠。之后將這些珠與測試化合物在384-孔微量滴定板的板孔中孵育(每孔一種化合物)，并用Fusion alpha平板閱讀器讀取實驗結果。結合實驗可以根據蛋白質配體和珠的濃度、孵育時間和實驗體積進行優(yōu)化，以使得實驗主要產生信號與背景的比率大于30∶1。該檢測已經被證實有效，因為得自一系列肽的IC50值與用光學傳感器得到的數值相當。盡管肽親和力跨越三個數量級(8nM-35μM)，在兩組結果中觀察到的強相關性(R2＝0.9983)表明這些實驗測定出相同的相互作用。也可以對His6Bcl-2ΔC22/Bim BH3的結合實驗進行優(yōu)化。一旦該實驗得到優(yōu)化，即可對其進行嚴格的質量控制從而評估板-板或天-天的重復性。之后可用各次實驗篩選一個獨特的探索文庫。為消除假陽性，可在二次競爭實驗中對滿足靶效力(IC50＜25μM)的所有抑制化合物進行確認(AlphaScreenTM，熒光極化和BiaCore光學生物傳感器)。光學生物傳感器可以使得對Bcl-2家族成員間的相互作用的定量更為便利，可以容易地在強候選物的親和力和BH3-only蛋白質的生理結合間作比較。
可以通過尤其是液相色譜-質譜來鑒定已通過這些初期測試的化合物的同一性和純度，之后測試它們的靶特異性，也即對Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w的親和力。活性化合物還要在設計用于預測腸道吸收(Wohnsland等人，J Med chem 44923-930，2001)和肝中毒進行測試。此外，可以用在芯片上(in silico)的方法來預測它們的生物分布特性，以及排除可能存在代謝或毒性問題的藥效團(DrugMetabolism Databases and High-Throughput Testing During DrugDesign and Development，Ed Erhardt，Blackwell Science，Malden，MA，USA，1999)?？梢愿鶕Y合實驗中的效力、靶選擇性、令人滿意的預測ADMET(吸收、分布、代謝、分泌和毒性)特性(van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2192-204，2003)和化學易處理性，將所有活性化合物的數據分級。然后，可以得到頂級化合物的所有可獲得的相近結構類似物，并測試它們在結合和殺傷實驗中的抑制活性從而確定各結構系列的初步結構-活性關系。
關于先導化合物的生物活性的實驗，若尋找到了有前景的先導物，則可以評估它們對培養(yǎng)物中的細胞活力的活性。可以在一板培養(yǎng)的腫瘤發(fā)生和非腫瘤發(fā)生細胞系，以及原發(fā)級小鼠和人細胞群體，例如淋巴細胞，上測試多達50種根據上述標準優(yōu)化的先導化合物。與1nM-100μM的化合物孵育3～7天可以監(jiān)控細胞活力。當然最大的注意力將放在比它們的正常細胞對應物更為有效地殺死腫瘤細胞的化合物上?？梢栽u估在＜10μM水平上殺死的化合物對其靶物的特異性以及作用方式。驗證它們的作用模式是重要的，因為測試化合物也可能間接地殺死細胞。例如，如果先導化合物以高度的選擇性與Bcl-2結合，它不應當殺死缺乏Bcl-2的細胞。因此，可以通過比較化合物在野生型細胞和缺少Bcl-2的細胞中的活性來驗證作用特異性。
可以對最有前景的候選物徹底分析其在小鼠模型中的抗腫瘤效力。在兩種已經被充分描述過的模型中，用源自myc轉基因小鼠(Adams等人，Nature 318533-538，1985)或myc/bcl-2雙重轉基因動物(Strasser等人，出處同前)的B淋巴細胞瘤注射過的免疫競爭小鼠，均快速、可重復地死于白血病/淋巴瘤綜合征。盡管兩種腫瘤都對標準化療(環(huán)磷酰胺)有反應，用myc/bcl-2腫瘤細胞注射的小鼠總是會復發(fā)。這兩種移植的腫瘤使得能夠在治療這些非常模擬人淋巴瘤的惡性增生過程中，單獨或與環(huán)磷酰胺結合，測試任何化合物。
關于先導化合物的結構-活性關系(SAR)及其優(yōu)化，從初篩中選擇出的先導物進行相當多的修飾以增強它們的生物化學、生物學和藥學特性(Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2369-378，2003)。為輔助這些化合物的優(yōu)化，可以在生物化學或結構研究中驗證它們的作用模式。此外，可以通過NMR分光術分析試劑與促生存分子間形成的復合物。因為NMR能夠探測低親和力的配體，并揭示它們結合在靶蛋白質上的什么地方，它能夠極大地輔助對結合的優(yōu)化并加速藥物探索過程(Hajduk等人，J Med Chem 422315-2317，1999；Pellecchia等人，Nat Rev Drug Discov 1211-219，2002)。利用比如化學位移作圖這樣的技術可以監(jiān)控測試化合物與Bcl-2蛋白質的結合，并且可以選擇那些模擬BH3結構域的測試化合物進行優(yōu)化。
在一種相關方法中，可以建立先導試劑的分子模型以利用改編的DOCK程序評估它們在芯片上的結合(Kuntz，Science 2571078-1082，1992)。將先導化合物的模型建立到靶Bcl-2溝上，并用計分函數預測最可能的結合模式。這將指導對能夠提供附加的相互作用從而增強結合的衍生物的設計。源自NMR的實驗數據的可獲得性也使得為預測改良配體而錨定配體和靶物靈活性成為可能(Lugovskoy等人，J AmChem Soc 1241234-1240，2002)。
該信息以及那些來自生物實驗的信息可用于合成用于進一步測試的衍生化合物。對于各類先導化合物，合成衍生物的策略。例如，典型的成功化合物由兩個或單個連接環(huán)系統(tǒng)組成，各系統(tǒng)各自可用大量官能團取代。通過系統(tǒng)地取代各官能團，可以制備和測試具有廣泛化學特性的化合物。
本發(fā)明還提供用于預測分子構象從而產生和/或選擇和/或篩選候選試劑的的計算方法，所述分子模擬限制型BH3-only蛋白質支架，所述候選試劑隨后被制備并進行實驗室評估其誘導凋亡的能力。
本發(fā)明由此提供一種根據帶有賦予其限制型表型的殘基位置的支架BH3-only蛋白質設計促生存Bcl-2蛋白質家族的拮抗劑的計算方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質；對這些蛋白質進行序列比對，和將這些蛋白質與限制型BH3-only蛋白質作比較；根據所述比對得到各氨基酸在一或多個帶來與Bcl-2蛋白質結合的混雜特性或限制特性的位置上的出現頻率；利用所述頻率產生一個選自電荷、大小、構象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結構的貢獻的計分函數；用所述計分函數和至少一種另外的計分函數來產生一套優(yōu)化蛋白質序列或其構象等價物，產生或選擇出一種具有與Bcl-2蛋白質的限制型結合表型的化合物或蛋白質。
對限制型BH3-only蛋白質拮抗Bcl-2蛋白質和誘導凋亡的能力作評估對于選擇適宜的治療方案是重要的。這種的一種評估可以適當地借助軟件編程的計算機來簡化，所述軟件尤其增加了一個關于至少一種與限制型BH3-only蛋白質有關的特征之計分函數(SF)，從而提供對應于所誘導的Bcl-2拮抗程度的效力值(PA)。SF尤其選自(a)酸性殘基的數量和位置；或(b)堿性殘基的數量和位置；或(c)極性殘基的數量和位置；或(d)非極性殘基的數量和位置；或(e)帶電荷殘基的數量和位置；或(f)不帶電荷的殘基的數量和位置；或(g)親水殘基的數量和位置；或(h)疏水殘基的數量和位置；或(i)殘基的水平；或(j)殘基的溶解度水平；或(k)殘基的大?。换?l)該殘基在BH3-only蛋白質中對三級結構的貢獻。因此，根據本發(fā)明，這樣的特征的SF存儲于一中機器可讀存儲介質中，該介質能夠處理數據從而提供特定限制型BH3-only蛋白質或化學等價物的PA。
因此，另一方面，本發(fā)明構思了一種用于確定在細胞中誘導凋亡的試劑的結構的計算機程序產品，所述產品包括(1)被接收為輸入計分函數(SF)的至少兩種與所述BH3-only或Bcl-2蛋白質相關的特征的代碼，其中所述特征尤其選自(a)酸性殘基的數量和位置；(b)堿性殘基的數量和位置；(c)極性殘基的數量和位置；(d)非極性殘基的數量和位置；(e)帶電荷殘基的數量和位置；(f)不帶電荷殘基的數量和位置；(g)親水殘基的數量和位置；(h)疏水殘基的數量和位置；(i)殘基的水平；(j)殘基溶解度水平；(k)殘基的大?。?l)該殘基在BH3-only蛋白質中對三級結構的貢獻(2)為提供一個對應于BH3-only蛋白質的PV的總數而疊加所述SF的代碼；和(3)儲存所述代碼的計算機可讀介質。
在一個相關的方面，本發(fā)明延展至一種用于評估BH3-only蛋白質或化學等價物在細胞中誘導凋亡的可能用途的計算機，其中所述計算機包括(1)機器可讀數據存儲介質，該介質包括編碼有機器可讀數據的數據存儲材料，其中所述機器可讀數據包含至少兩種與所述BH3-only或Bcl-2蛋白質相關的特征IV，其中所述特征尤其選自(a)酸性殘基的數量和位置；
(b)堿性殘基的數量和位置；(c)極性殘基的數量和位置；(d)非極性殘基的數量和位置；(e)帶電荷殘基的數量和位置；(f)不帶電荷殘基的數量和位置；(g)親水殘基的數量和位置；(h)疏水殘基的數量和位置；(i)殘基的水平；(j)殘基溶解度水平；(k)殘基的大?。?l)該殘基在BH3-only蛋白質中對三級結構的貢獻(2)用于存儲處理所述機器可讀數據的指令的工作存儲器；(3)與所述工作存儲器以及所述機器可讀數據存儲介質相耦連的中央處理單元，用于處理所述機器可讀數據以提供對應于所述化合物PV的所述SF的總和；和(4)與所述中央處理單元相耦連的輸出硬件，用于接收所述PV。
本發(fā)明構思了任何一般或特定用途的計算機系統(tǒng)，包括與存儲器和至少一個輸入\輸出設備，比如終端，電子聯通的處理器。這樣的系統(tǒng)可以包括，但不限于，個人計算機、工作站或大型機。處理器可以是執(zhí)行位于RAM存儲器中的程序的一般目的的處理器或者微處理器或者特定處理器。程序可位于比如硬盤或預程序化的ROM存儲器這樣的存儲裝置的RAM中。在一種實施方案中，RAM存儲器同時用作數據存儲和程序執(zhí)行。計算機系統(tǒng)也包括處理器和存儲器位于不同的物理實體中但通過網絡進行電子聯通的系統(tǒng)。
根據本發(fā)明鑒定的試劑可用于治療癌癥。
本文中的“治療”的含義是指減輕已有狀態(tài)的嚴重程度。術語“治療”也包括為預防某種狀況發(fā)作的“預防性治療”。術語“治療”不必意味著接復試者被治療至完全康復。類似地，“預防性治療”不必意味著復試者最終不會發(fā)生某種狀況。
本文中所使用的復試者指，人和非人靈長類(例如大猩猩、短尾猿、狨猴)、家畜動物(例如綿羊、奶牛、馬、驢、豬)、伴侶動物(例如狗、貓)、實驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、倉鼠)、被俘野生動物(例如狐貍、鹿)、爬行動物或兩棲動物(例如cane蟾蜍)、魚(例如斑馬魚)和任何其它能夠受益于本發(fā)明試劑的生物(例如c.elegans)。對于能夠受益于目前描述的試劑的動物類型沒有限制。最優(yōu)選的本發(fā)明的復試者是人。受試者，無論其是人或非人生物，可以指患者、個體、動物、宿主或受體。
相應地，本發(fā)明的另一方面提供一種預防或減輕受試者的癌癥的方法，所述方法包括在足以預防或減輕癌癥的狀況下向所述受試者施用有效量的Bcl-2蛋白質拮抗劑一定時間。
對能夠拮抗Bcl-2并誘導凋亡的試劑的鑒定提供了用于治療性治療癌癥的藥物組合物。
本發(fā)明的試劑可以與一種或多種藥學可接受載體和/或稀釋劑結合形成一種藥物組合物。藥學可接受載體可包括一種其作用為穩(wěn)定、或增強或降低本發(fā)明的藥物組合物的吸收或廓清速率的生理可接受的化合物。生理接受的化合物可包括，例如，比如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷這樣的碳水化合物，比如抗壞血酸、谷胱甘肽這樣的抗氧化劑，鰲合劑，低分子量蛋白質，減少肽或多肽的廓清或水解的組合物，賦形劑或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖液。也可以用去污劑來穩(wěn)定或提高或降低藥物組合物的吸收，包括脂質體載體。肽或多肽的藥學可接受載體或劑型是本領域技術人員已知的，并詳細描述于科技和專利文獻中，參見例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，MackPublishing Company，Easton，PA，1990(“Remington′s”)。
其它的生理學可接受化合物包括濕潤劑、乳化劑、分散劑或對于預防微生物生長和起作用尤其有用的防腐劑。各種防腐劑是本領域熟知的，包括例如苯酚和抗壞血酸。本領域技術人員將理解，對藥學可接受載體包括藥學可接受化合物的選擇依賴于，例如，本發(fā)明的調節(jié)試劑的常規(guī)給藥途徑及其獨特的生理-化學特征。
藥物組合物形式的試劑的施用，可以通過本領域已知的任何便利的方法來完成。給藥途徑包括但不限于呼吸道、氣管內、鼻咽、靜脈內、腹膜內、顱內、皮內、肌內、眼內、鞘內、小腦內、鼻內、灌注、口服、直腸、貼片和植入給藥。
對于口服給藥，可將化合物配制成固態(tài)或液態(tài)制劑，比如膠囊、藥丸、片劑、錠劑、粉末、懸浮液或乳劑。在制備口服劑量形式的組合物時，可以使用任何有用的藥學介質，比如，對于液態(tài)口服制劑(比如懸浮液、酏劑或溶液)使用水、乙二醇、油、乙醇、調味劑、防腐劑、色素、懸浮劑等；或者對于固態(tài)口服制劑(比如粉末、膠囊和片劑)使用比如淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤滑劑、粘合劑、裂解劑等這樣的載體。由于片劑和膠囊易于施用，因此它們代表最有力的口服劑量單位形式，此時顯然采用了固體藥學可接受載體。如果需要的話，片劑可以是用標準技術糖包衣的或腸包衣的?？梢詫⒒钚栽噭┠z囊化從而使它穩(wěn)定地穿過胃腸道而同時也允許穿過血腦屏障，參見，例如國際專利公布號WO 96/11698。
若口服給藥，可以將本發(fā)明的試劑保護起來以防止其被消化。這可以通過將核酸、肽或多肽與一種組合物混合從而使其能夠抗酸和酶解或者將核酸、肽或多肽包裝在比如脂質體這樣的適宜抗性載體中來實現。保護化合物使其免遭消化的方法是本領域熟知的，參見，例如Fix，Pharm Res 131760-1764，1996；Samanen等人，J PharmPharmacol 48119-135，1996；美國專利號5 391 377，其中描述了用于口服運送治療劑的脂質組合物(下文中詳細描述了脂質體運送)。
適于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(若為水可溶的)或分散劑和用于與無菌注射液或分散劑臨時配制的無菌粉末或者可以是乳膏或其它適于局部使用的形式。它必須在制備和儲存條件下是穩(wěn)定的，且必須能夠抵御比如細節(jié)和真菌這樣的微生物的污染作用進行保存。載體可以是含有，例如水、乙二醇、多元醇(例如丙三醇、丙烯乙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、或其適宜的混合物、以及植物油的溶劑或分散介質?？梢酝ㄟ^，例如，使用比如卵磷脂這樣的包衣，對于分散劑維持所需顆粒的大小，以及使用超微油膏來保持適當的流動性?？梢酝ㄟ^各種抗細菌抗真菌劑，比如氯丁醇、對羥苯甲酸酯、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，來預防微生物的作用。在許多情況中，其優(yōu)選包括等滲劑，例如，蔗糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和凝膠，來延長對可注射組合物的吸收。
將所需量的試劑和各種其它以上列舉的成分摻入到適宜的溶劑中，如果需要的話，之后再進行無菌過濾，可以制備出無菌注射溶液。通常，分散劑是通過將各種無菌活性成分摻入到包含基本分散介質和所需的以上列舉的其它成分的無菌載體中來制備的。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術，通過這種方法可以從其無菌過濾溶液得到活性成分與任何其它所需成分的粉末。
對于非胃腸道給藥，可將試劑溶解于藥學載體中，并以溶液或懸液的形式給藥。適宜載體的例子是水、鹽、葡萄糖液、果糖溶液、乙二醇或動物油、植物油或合成油。載體可以包含其它成分，比如防腐劑、懸浮劑、溶解劑、緩沖液等。若要經鞘施用試劑，還可以將它們溶解在腦脊液中。
對于經黏膜或經皮給藥，可以用適于載體滲透的滲透劑來運送試劑。這樣的滲透劑是本領域已知的，例如用于經黏膜給藥的膽汁鹽和褐霉酸衍生物。此外，滲透劑可用于促進滲透。經黏膜給藥方式可以通過鼻噴霧或使用栓劑例如Sayani和Chien，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 1385-184，1996。對于局部、經皮給藥，可以將試劑配制成藥膏、乳膏、油膏、粉末和凝膠。經皮運送系統(tǒng)還可以包括貼片。
對于吸入，本發(fā)明的試劑可以用本領域已知的任何系統(tǒng)來運送，包括干粉氣霧劑、液體運送系統(tǒng)、空氣噴射噴霧劑、推進系統(tǒng)等，參見例如Patton，Nat Bioteeh 16141-143，1998；用于多肽分子的產品和吸入系統(tǒng)，例如Dura Pharmaceuticals(San Diego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、InhaleTherapeutic Systems(San Carlos，CA)等。例如，藥物劑型可以以氣體或薄霧形式施用。對于氣體給藥，劑型可以與表明活性劑極細的形式提供，并配以推進器。另一方面，用于將制劑運送至呼吸組織的裝置是一種制劑在其中蒸發(fā)的吸入器。其它的液體運送系統(tǒng)包括，例如，極度分散的形式空氣噴射噴霧劑。
本發(fā)明的試劑可以以持續(xù)運送或持續(xù)釋放機制施用，其能夠在體內運送制劑。例如，本發(fā)明的劑型中可包括可生物降解的微球體或膠囊或其它能夠持續(xù)運送多肽的可生物降解的聚合物結構(例如Putney和Burke，Nat Biotech 16153-157，1998)。
在制備本發(fā)明的藥物時，可以作各種劑型變化并對劑型進行操作從而改變藥物代謝動力學和生物分布。本領域技術人員已知許多改變藥物代謝動力學和生物分布的方法。這樣的方法的例子包括在由比如蛋白質、脂質(例如，脂質體，參見下述)、碳水化合物、或合成聚合物(上述)這樣的載體中保護本發(fā)明的組合物。對藥物代謝動力學的討論參見例如Remington′s。
在一個方面，將含有本發(fā)明試劑的藥物劑型摻入單層脂質或比如脂質體這樣的雙層脂質中，參見例如美國專利號6 110 490、6096 716、5 283 185和5 279 833。本發(fā)明還提供這樣的劑型，該劑型中本發(fā)明的水可溶性調節(jié)試劑已經被附著到單層或雙層表面。例如，可以將肽附著到含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰)乙醇胺的脂質體中(例如Zalipsky等人，Biocojug Chem 6705-708，1995)?？梢允┯弥|體或任何形式的脂質膜，比如平面脂質膜或完整細胞的細胞膜，例如血紅細胞。脂質體劑型可以通過任何途徑給藥，包括靜脈內、經皮(Vutla等人，J Pharm Sci 855-8，1996)、經黏膜或口服。本發(fā)明還提供這樣的藥物制劑，其中將本發(fā)明的核酸、肽和/或多肽整合進了微囊和/或脂質體(Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 4623-28，1994；Woodle等人，Pharm Res 9260-265，1992)。脂質體和脂質體劑型可以根據本領域熟知的標準方法制備，參見例如Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1197-210，1995；Alving等人，Immunol Rev 1455-31，1995；Szoka和Papahadjopoulos，AnnRev Biophys Bioeng 9467-508，1980，美國專利號4 235 871、4 501728和4 837 028。
根據施用方法，可以以各種單位劑量形式施用本發(fā)明的藥物組合物。藥物組合物的典型劑量是本領域技術人員熟知的。通常這樣的劑量依性質而定并根據特定的治療狀況、患者的耐受能力等進行調整。適于實現這一目的的試劑量定義為“有效量”。為此目的的劑量進度和有效率，也即“劑量方案”依賴于各種因素，包括疾病的階段或狀況、疾病或狀況的嚴重程度、患者的整體健康狀態(tài)、患者的物理狀態(tài)、年齡、藥物劑型、活性試劑濃度等。在計算患者的給藥方案時，還應當考慮給藥模式。劑量方案還必須考慮藥物代謝動力學，也即藥物組合物的吸收、生物可接近性、代謝、清除等的速率。參見，例如Remington′s；Egleton和Davis，Peptides 18143-1439，1997；Langer，Science 2491527-1533，1990。
根據這些方法，根據本發(fā)明定義的試劑和/或藥物組合物可以與一種或多種其它試劑同時施用。本文中的“共同施用”的含義指，以相同的劑型或兩種不同的劑型經相同或不同的途徑或給藥順序通過相同或不同的途徑同時施用。本文中的“順序”給藥的含義是指，兩種類型的試劑和/或藥物組合物在給藥時間上的秒、分、小時或天差異。試劑和/或藥物組合物的共同施用可以以任意順序進行。
或者，通過使用比如抗體或細胞特異性配體或特異性核酸分子這樣的靶向系統(tǒng)可以用靶向療法更特異地將活性試劑運送至特定類型的細胞。由于許多原因，靶向都是人們所希望的，例如如果試劑具有不能接受的毒性或者它另外需要太高的劑量或者如果它不能進入靶細胞。
不直接施用試劑的話，也可以在靶細胞中產生這些試劑，例如在比如上述的病毒載體中，或者在比如面美國專利號5 550 050和國際專利公布號WO 92/19195、WO 94/25503、WO 95/01203、WO 95/05452、WO 96/02286、WO 96/02646、WO 96/40871、WO 96/40959和WO 97/12635中所描述的基于細胞的運送系統(tǒng)中?？梢允馆d體靶向靶細胞。將基于細胞的運送系統(tǒng)設計成被植入患者體內的目的靶位且其中包含靶試劑的編碼序列?；蛘?，試劑也可以以前體的形式施用，該前體被在所靶向或治療的細胞中產生的激活劑轉化為活性形式。參見，例如，歐洲專利公布號0 425 731A和國際專利公布號WO 90/07936。
又一方面，本發(fā)明提供含有組合物，例如本發(fā)明試劑，的試劑盒。該試劑盒還包含教導如本文中描述的方法和本發(fā)明用途的說明材料。
本領域技術人員將理解，本文所描述的發(fā)明除了以上特別描述的之外易于進行變化或修改。應理解，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修改。本發(fā)明還包括本說明書中單獨或總體提及或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任意兩種或多種所述步驟或特征的任何和全部組合。
通過以下非限制性實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1實驗方法以下實驗方法用于下述實施例中。
表達構建體將人Bcl-2(登錄號登錄號NP_000624；殘基1-217)和人Bcl-w(登錄號NP_004041；殘基1-164；C29S A128E)克隆進pQE-9(Qiagen)；所表達的蛋白質具有附加的N-末端殘基(MRGSHHHHHHGS，SEQ ID NO1)。將人Bcl-xL(登錄號NP_612815；殘基1-209)、小鼠Mcl-1(登錄號NP_031588；殘基152-308)和小鼠A1(登錄號NP_033872；殘基1-152)克隆進pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)，在經過PreScission蛋白酶消化的蛋白質中僅有五個附加的從載體衍生而來的殘基(GPLGS)(參見下述)。人Bcl-2、人Bcl-xL和小鼠Mcl-1的FLAG(DYKDDDDK，SEQ ID NO2)-標記的哺乳動物表達載體描述于Huang等人，EMBO J 164628-4638，1997。將N-末端HA(YPYDVPDYA，SEQ ID NO3)-標記的全長人BimEL、人BimL、人Puma、小鼠Bad、人Bik和小鼠Noxa亞克隆進pEF PGKhygro(Huang等人，出處同前；O′Conner等人，EMBO J 17384-395，1998)。用校正閱讀Pfu聚合酶(Stratagene)進行PCR，并通過自動測序驗證構建體。關于所使用的寡核苷酸和構建體的細節(jié)可以從發(fā)明人處獲知。
pQE-9(Qiagen)中的構建體包括人(h)Bcl-2(登錄號NP_000624；殘基1-217)和帶有C29S和A128E突變以提高其穩(wěn)定性(Hinds等人，2003)的hBcl-w(NP_612815；殘基1-209)。六組氨酸標簽(HHHHHH)使其能夠在鎳柱上純化。重組hBcl-xLΔC24、小鼠(m)Mcl-1ΔN151ΔC23和mA1ΔC20表達為GST融合蛋白，并根據(Day等人，1999；Hinds等人，2003)的描述用PreScission蛋白酶谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠柱上切割下來及純化。所使用的pGEX-6P-3(Amersham Biosciences)中的構建體，包括來自Bcl-xL(NP_612815；殘基1-209)、Mcl-1(NP_031588；殘基152-308)、和A1(NP_033872；殘基1-152)的序列。蛋白酶切割后，它們保留了五個N-末端由載體衍生的殘基(GPLGS)。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽(附圖2A)由Mimotopes(Victoria，澳大利亞)合成。所有肽都經反相HPLC純化，且除hBik(87％)、mBmf(85％)和mNoxa B(78％)之外，純度均大于90％。通過電霧化質譜法鑒定了它們的同一性。將這些根據其重量和在分析HPLC柱上214nM處的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的儲存液；將hBimBH3溶解于DMSO中。這些肽所依據的登錄號是mBimL(AAC40030)、hBimL(AAC39594)、hPuma(AAK39542)、mBmf(AAK38747)、hBad(NP_004313)、hBik(NP_001188)、hHrk(NP_003797)、hBid(NP_001187)、hNoxa(NP_066950)、mNoxa(NP_067426)。
重組蛋白質和肽根據Wilson-Annan等人，J cell Biol 162877-888，2003描述的方法制備表達為N-末端六組氨酸融合蛋白的重組人Bcl-2ΔC22和人Bcl-wΔC29(包含C29S和A128E突變以提高蛋白質穩(wěn)定性但不影響其結合特性)。根據(Day等人，Cell Death Differ 61125-1132，1999；Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003)的描述將重組人Bcl-xLΔC24、小鼠Mcl-1ΔN151ΔC23和小鼠A1ΔC20表達為GST融合蛋白，并從谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱上切下。
本研究中所使用的具有自由N-和C-末端的肽由Mimotopes合成。所有肽都經反相HPLC純化，且除Bik(87％)、mBmf(85％)和mNoxa2(78％)之外，純度均大于90％。通過電霧化質譜分析鑒定了它們的同一性。將這些根據其重量和在分析HPLC柱上214nM處的吸光度定量的肽完全溶解于水中形成1-2mM的儲存液。這些肽的登錄號是小鼠BimL(AAC40030)、人BimL(AAC39594)、人Puma(AAK39542)、小鼠Bmf(AAK38747)、人Bad(NP_004313)、人Bik(NP_001188)、人Hrk(NP_003797)、人Bid(NP_001187)、人Noxa(NP_066950)和小鼠Noxa(NP_067426)。
圓二色(CD)譜學為進行圓二色(CD)測定，將肽貯存液和馬心臟肌球蛋白在添加了30％(v/v)(2，2，2-三氟乙醇)(TFE)的30mM磷酸鈉(pH 7)或20mM磷酸鈉(pH 7)稀釋至終濃度為0.15mg/ml。室溫下用0.1cm的小試管在AVIV 62DS型分光偏振計記錄CD譜。記錄了兩次連續(xù)掃描，且扣除了緩沖液單獨的背景譜。
親和測定和溶液競爭性檢測法室溫下在Biacore 3000生物傳感器(Biacore)上以HBS(10mMHEPES pH 7.2，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20為流動緩沖液完成親和測定。采用胺-耦聯化學法(Wilson-Annan等人，出處同前)將小鼠26-merwtBimBH3、4EBimBH3突變體、BadBH3、NoxaBH3或無關肽對照固定到CM5傳感器芯片上。為評定促生存類Bcl-2蛋白質對BimBH3的直接親和力，直接將該蛋白質以20μl/min注射到傳感器芯片中。用50mM NaOH或6M GuHCl(pH 7.2)將剩余的殘留結合蛋白釋放出來，之后用流動緩沖液洗滌兩次。扣除基線反應后，用BIA評估軟件(第三版，Biacore)(Wilson-Annan等人，出處同前)從傳感圖得到結合動力學。
通過比較它們與固定化的wtBimBH3肽競爭結合類Bcl-2蛋白質的能力來評估BH3肽對促生存Bcl-2蛋白質的相對親和力(Wilson-Annan等人，出處同前)。將固定亞飽和量(10nM)的促生存Bcl-2蛋白質與不同量的競爭劑BH3肽在HBS中冰浴超過2小時。之后將該混合物注射到一片傳感器表面，該傳感器包含一個固定有小鼠wtBimBH3的通道和一個固定有小鼠4EBimBH3的對照通道?？鄢€反應(對照通道)后得到絕對結合反應。以對促生存蛋白的反應作為最大反應(100％)，之后在給定注射時間(430s)內提高競爭肽含量的情況下計算相對殘余結合(％)。以初始肽濃度對相對殘余反應(f)作圖，并將其代入方程f＝100/(1+(c/IC50)m)，其中c＝競爭肽的濃度，m＝曲率常數，以及IC50＝將結合降低50％所需的競爭肽濃度。理論上，IC50＝[A]/2+KD，其中[A]是分析物濃度。
所研究的一些重組蛋白質(Bcl-2、Bcl-xL、A1)包含半胱氨酸殘基，但Bcl-2或Bcl-xL的表現卻不受二硫蘇糖醇(DTT)的影響。A1的孵育混合物中包括2.5mM Tris-(羧乙基)膦氯化氫(TCEP)，A1包含兩個半胱氨酸且似乎比所研究的其它蛋白質都更加不穩(wěn)定。
瞬間轉染、免疫沉淀和免疫印跡人胚腎(HEK)293T細胞的維持、轉染和用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(NEN)對人胚腎(HEK)293T細胞的代謝標記以及共免疫沉淀已得到描述(Huang等人，出處同前；Moriishi等人，Proc Natl Acad SciUSA 969683-9688，1999；O′Conner等人，出處同前)。簡言之，用HA(HA.11；CRP)、FLAG(M2；Sigma)和對照Glu-Glu(CRP)標簽的小鼠單克隆抗體對等量的TCA-可沉淀裂解物進行免疫沉淀。用SDSPAGE裂解蛋白質，將其轉移到硝酸纖維素膜上并用熒光照相術(Amplify；Amersham Biosciences)檢測。免疫印跡用HA(3F10；Roche)、FLAG(9H1；(Wilson-Annan等人，出處同前)的大鼠單克隆抗體或小鼠單克隆抗-14-3-3β(H-8；Santa Cruz)完成，用HRP-耦聯的抗大鼠(Southern Biotechnology)或抗小鼠(Silenus)抗體檢測。通過增強的化學發(fā)光來顯露這些蛋白質(ECL；AmershamBiosciences)。
實施例2BimBH3緊密結合Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1產生體外比較結合研究所需的可溶、單體、等量重組促生存蛋白質需要除去它們的疏水C-末端結構域(例如Hinds等人，出處同前)和Mcl-1的N-末端PEST區(qū)(Kozopas等人，Proc Natl Acad Sci 903516-3520，1993)。同樣，由于無法可靠地產生全長BH3-only蛋白質，因此我們使用了長肽(24-26殘基；表3)，因為較短的肽具有減弱的螺旋傾向這會使結合減弱(Petros等人，2000，出處同前)。由于跨小鼠BimBH3結構域(BimBH3)的26-mer肽與較長的Bim多肽同樣易于結合Bcl-w(Wilson-Annan等人，出處同前)，因此我們用它來測定Bim對其他哺乳動物促生存分子的親和力。例如Mcl-1，它流經固定化的野生型BimBH3肽而非突變BimBH3肽(不結合)時表現強結合反應(圖1A)。確實，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1均顯示與wtBimBH3的強1∶1化學計量式結合(圖1B)，0.2～4.5nM的解離平衡常數(KD)(表2)。因此，Bim類似地靶向全部五種哺乳動物促生存蛋白質。
表2BIM對促生存蛋白質的比較結合
如Hinds等人，出處同前；Wilson-Annan等人，出處同前所述，利用生物傳感器實驗在傳感器芯片上測定了促生存分子對wtBimBH3的結合常數。
實施例3特定的BH3結構域選擇性結合促互存靶為評估其它的BH3肽是否類似地結合促生存蛋白質，我們用競爭結合檢測法直接比較了它們在溶液中的結合親和力。在這樣的檢測法中，靶蛋白的質量和絕對量不如在直接結合中那么重要，且溶液結合排除了一些固定化肽所遭遇的空間障礙。圖1C顯示這一過程Bcl-xL在溶液中和逐漸增加量的BikBH3預培養(yǎng)減弱了其與wtBimBH3的結合(圖1D)。從結合的衰減可以計算出BikBH3的IC50(半數結合時的競爭肽濃度)(圖1E)。由于IC50值反映相對結合親和力(參見實驗方法)，我們用該檢測法來比較八種BH3肽(表3)與五種促生存蛋白質的結合親和力。
令人吃驚的是，BH3肽對不同的促生存蛋白質的相對親和力相差10,000倍(圖2A和表2)。它們的結合特性分作幾類(圖2B和圖4)。只有BimBH3和PumaBH3對所有的促生存蛋白質具有相當的親和力。其它的BH3肽對其特定的亞組具有驚人的選擇性。例如，相比A1(～15μM)或Mcl-1(＞100μM)，BadBH3強烈偏好Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w(5.3～30nM)(圖2A和B)，BmfBH3也表現出類似的偏好。與此截然相反，NoxaBH3對Mcl-1和A1(nM范圍)具有高度的選擇性，但是與其它的促生存蛋白質卻不發(fā)生可檢測的結合(＞100μM)。最后，目比Bcl-2或Mcl-1，BikBH3、HrkBH3和BidBH3更偏好Bcl-xL、Bcl-w和A1。與主流觀點相反，促生存蛋白質還具有獨特的BH3結合模式Bcl-xL與Bcl-w表現類似，Bcl-2較為獨特，而Mcl-1和A1構成一個獨立的組(附圖2B)。
表3BH3肽
固定化的肽(頂部2行)源自小鼠(m)BimL。4EBimBH3有四個對于與促生存蛋白質(參見文本)相互作用非常關鍵的疏水殘基(H1～H4)突變?yōu)楣劝彼?E)。除注明“m”(小鼠)之外，競爭肽均源自人蛋白質。按照Huang和Strasser，出處同前所述用GCG“PILEUP”程序進行序列比對。
由于全部的BH3肽都易于結合至少兩種促生存蛋白質(附圖2)，因此它們的完整性和構象不太可能影響我們的結果。盡管如此，由于較短的BadBH3肽與Bcl-xL的結合依賴于它們的螺旋性(Petros等人，2000，出處同前)，我們評估了CD(圓二色)譜學中所使用的肽的構象。在水性環(huán)境下，所有的肽似乎大部分都無結構(圖5A)。然而，在加入30％TFE(2，2，2-三氟乙醇)后，一種穩(wěn)定α-螺旋形成的溶劑(Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989)，它們很容易α-螺旋化(補充圖S2B)，這表明它們的螺旋化潛力。我們觀察到，它們在TFE中的螺旋化傾向與結合親和力無相關性。
對Bad和Noxa觀察到的與眾不同的互補結合模式尤其驚人(圖2)。Noxa的結果與另一溶液競爭檢測中的一致(Letai等人，出處同前)，但是有報道稱Noxa在免疫沉淀檢測法中與Bcl-2和Bcl-xL結合(Oda等人，Science 2881053-1058，2000)。為解釋這一矛盾，我們還做了與固定化BadBH3或NoxaBH3肽的直接結合試驗。與溶液競爭結果一致，只有Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w與BadBH3結合(圖6A)，且只有Mcl-1和A1與NoxaBH3結合(圖6B)。與人Noxa不同，小鼠Noxa包含兩個BH3結構域(Oda等人，出處同前)，但兩個小鼠NoxaBH3肽(表2)都結合Mcl-1(IC5087和109nM)，而不結合Bcl-2、Bcl-xL或Bcl-w。因此，推測Noxa特異性拮抗Mcl-1和A1。
實施例4Bad、Bik和Noxa在哺乳動物細胞中有選擇性生理靶在不同的試驗中對選擇性相互作用進行了驗證。用可以制備的重組BH3-only蛋白質完成(Bim、Bmf、Bad和Bid)的GST下調(pull-down)實驗，給出的結果與溶液競爭試驗一致。最確切的是，GST Mcl-1緊密結合Bim，弱結合Bmf，而不結合Bad。為驗證該體外結果，用共免疫沉淀法在哺乳動物細胞中調查了所選擇的成對全長N-末端標記的蛋白質間的相互作用。HA-Bim、Puma、Bad、Bik或Noxa在HEK293T細胞中與作為所描述的三類促生存蛋白質代表的FLAG-Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1共表達(圖2B)。細胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標記從而可以對共相關放射標記蛋白質間的任何相互作用做半定量評估。對于所測試的任何一對，通過免疫沉淀所檢測的相互作用(圖3)與之前的親和力測定同時進行(圖2)。尤其是，Bad與Bcl-2和Bcl-xL結合得很好，但卻一點兒都不與Mcl-1結合(圖3D、3E)(Opferman等人，Na ture 426671-676，2003)，而Noxa(帶有兩個BH3的全長小鼠Noxa)僅與Mcl-1互作(圖3F、3G)。Bik與Bcl-xL的程度大于Bcl-2或Mcl-1(圖3C)，而Bim和Puma如同所預期的，與全部三種促生存蛋白質結合良好(圖3A和3B)。
實施例5特定殘基對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的比較BH3結構域的序列時發(fā)現，似乎F32和K35對于確定Noxa對Mcl-1的結合是重要的。野生型Noxa不與Bcl-xL結合，但F32或K35突變均增強Bcl-xL結合，雙重突變則結合更加增強(表4)。這強烈暗示，Noxa的F32和K35對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的。
表4特定殘基對于確定Noxa對Mcl-1的選擇性是重要的
實施例6Bad、Bik和Noxa在哺乳動物細胞中有不同的靶為驗證體外結果，用共免疫沉淀法在哺乳動物細胞中調查了所選擇的成對全長N-末端標記的蛋白質。作為所描述的三類促生存蛋白質代表(圖4)，Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1在293T細胞中與Bim、Puma、Bik、Bad或Noxa共表達。細胞被35S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標記從而可以對放射標記蛋白質間的任何相互作用做半定量評估或者通過更為敏感的蛋白質印跡法對相互作用進行測定。
值得注意的是，對于每一受測試對，通過免疫沉淀所檢測到的相互作用與從在先的親和力測定預計的相同(圖4)。尤其是，Bad與Bcl-2和Bcl-xL結合良好，但不與Mcl-1結合，而Noxa(帶有兩個BH3的全長小鼠Noxa)僅與Mcl-1相互作用。此外，Bik與Bcl-xL的結合大于Bcl-2或Mcl-1，而Bim，如同所預期的，同Puma一樣易于與全部三種促生存蛋白質結合。
實施例7具有限制性靶的BH3-only蛋白質是較弱的殺傷物質為評估選擇性結合的生物相關性，采用反轉錄病毒遞送來比較不同的BH3-only蛋白質殺死野生型小鼠胚纖維原細胞(MEFs)的能力。為監(jiān)控所導入基因的表達，使用了載體(pMIG)，在該載體中所導入基因的表達通過經內部核糖體進入位點(IRES)與綠色熒光蛋白(GFP)的表達耦聯(Van Parijs等人，Immunity 11281-288，1999)。細胞被有效感染(＞90％)且所導入的BH3-only蛋白質被有效表達。感染后24小時(圖7A，7B)以及在長期克隆檢測中(圖7E)對所感染的(GFP+ve)細胞的活力進行記分。
盡管采用親本病毒所作的感染引起最小程度的凋亡，但大多數用表達Puma或各種Bim異構體(Bims、BimL或BimEL)的病毒感染的細胞以劑量依賴的方式迅速死亡(圖7B)，并且未能形成集落(圖7E)。重要的是，其它被測試的BH3-only蛋白質(Bmf、Bad、Bik、Hrk、Noxa)，盡管得到了充分的表達，其作為殺傷劑的潛力卻低得多(圖7B)，這可能是因為這些BH3-only蛋白質中沒有一個能夠中和在MEFs中基本表達的所有促生存分子(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)。
特定BH3-only蛋白質的較弱的促凋亡活性，通常歸因于特定的負調控機制，比如Bad被14-3-3蛋白質結合。為排除這樣的影響并允許對不同的BH3結構域作直接比較，對其中用Puma、Bad或Noxa的BH3替換了BimsBH3嵌合分子作了分析。之所以選擇Bims作為基本骨架，是因為Bims，最有效的Bim異構體，不是通過與動力蛋白運動復合物的相互作用來調控的。其促凋亡活性僅依賴于BH3區(qū)域，因為Bims4E，其BH3已突變，不與任何一種促生存分子結合并缺乏促凋亡功能。與嵌合蛋白的天然對應物不同，嵌合蛋白的另一個優(yōu)點是均以相當量的水平表達。
值得注意的是，Bims與PumaBH3的嵌合體保留了Puma結合所有受試促生存分子的能力，且其殺傷效力與天然Bim或Puma相同。相反，Bims與BadBH3或NoxaBH3的嵌合體的表現分別與天然Bad或Noxa相似。BimsBadBH3結合Bcl-xL，但不結合Mcl-1，而BimsNoxaBH3相反卻結合Mcl-1。相應地，這兩種嵌合體在短和長期的試驗中均表現出弱的促凋亡活性。因此，由各BH3-only蛋白質誘導的殺傷似乎反映出其緊密結合細胞中存在的所有促生存類-Bcl-2分子的能力。
實施例8Bad和Noxa間的功能互補由于結果顯示，凋亡需要中和所有的相關促生存蛋白質，因此具有互補結合譜的BH3-only蛋白質(圖8A)應當合作殺死細胞。因此，Noxa對Mcl-1的中和應當由BadBH3的共表達來補充以中和MEF中的Bcl-2和Bcl-xL(圖8A)。同樣地，NoxaBH3應當增強由Bik誘導的殺傷，Bik結合Mcl-1比結合Bcl-xL弱40倍。為了能夠做互補實驗，通過用Bims的GFP融合物、或嵌合BimsBadBH3和BimsNoxaBH3替換GFP，在pMIG載體中共表達幾對BH3-only蛋白質。這樣的融合體表現類似于它們的親本BH3-only對應物，因為GFP Bims融合體是強殺傷物(圖8B)。
重要的是，Noxa與BadBH3的共表達導致與僅表達Bims同樣多的細胞死亡(圖8B)。類似地，NoxaBH3被Bik有效地增強殺傷。所觀察到的協同作用反映出互補的BH3功能，因為NoxaBH3的共表達不會增強Noxa殺傷，而且當與GFP融合的BimsBadBH3與不結合Mcl-1的惰性形式的Noxa(3EBH3突變體；參見實驗方法)共表達時未觀察到顯著的殺傷(圖8B)。因此，當三種BH3-only蛋白質中的任意一種單獨在纖維原細胞中表達時，主要與Bcl-2和Bcl-xL結合的Bad和Bik能夠有效地與選擇性結合Mcl-1的Noxa共同作用從而增強所觀察到的弱殺傷。
實施例9由混雜型Noxa突變體誘導的有效殺傷隨后探究了Noxa的選擇性結合譜和弱殺傷活性的分子基礎。功能互補實驗結果(圖8)提示，結合額外的促生存蛋白質的Noxa形式有可能是一種有效的殺傷劑。Bcl-xLBim復合物的高分辨率X-射線晶體學結構指導了尋找該變體的研究(圖9A)。BimBH3的疏水殘基(包括亮氨酸L94、異亮氨酸I97、苯丙氨酸F101；基于小鼠BimL編號)結合Bcl-xL表面的疏水口袋。Bcl-xL(和Bcl-2)上對應Bim I97(h3)的口袋部分地由苯丙氨酸(F97)和酪氨酸(Y101)殘基形成，它們比Mcl-1(纈氨酸、組氨酸)或A1(纈氨酸、纈氨酸)中相應的殘基大，這提示，Mcl-1和A1能夠容易地容納在人NoxaBH3中發(fā)現的γ-支鏈苯丙氨酸(F32)(圖9B)。此外，在Bim的帶負電荷的谷氨酸(E100)和Bcl-xL上的帶正電的精氨酸(R100)之間形成了一個共有電荷對，但是這一在Bcl-2和Bcl-w中保守的精氨酸，在Mcl-1中被中性的天冬酰胺所替換、在A1中被谷氨酸所替換。因此，從BimBH3中的谷氨酸(E100)到Noxa中的賴氨酸(K35)的電荷改變(附圖9B)可能是削弱NoxaBH3與Bcl-xL結合的一個因素。
基于這些考慮，在溶液競爭試驗中測試了帶有突變K35E(m1)、F32I(m2)或這二者(m3)的Noxa(圖9B)對促生存蛋白質的結合。它們與Bcl-2的結合仍然很弱，但與Bcl-xL和Bcl-w的結合卻顯著增強(圖9C)。對于Bcl-xL，電荷改變突變K35E(m1)使結合增強了20倍以上；F32I替換(m2)使結合增強了超過100倍；雙突變(m3)更進一步使結合得到增強(圖9C)。而wtNoxaBH3對Bcl-xL和Bcl-w二者的IC50均大于100,000nM，m3突變體表現對Bcl-xL的IC50為110nM、對Bcl-w的是410nM，而Mcl-1結合得到輕微地提高(圖9C)。共免疫沉淀實驗證實，Noxa m3在細胞中結合Bcl-xL(圖9D)，而野生型Noxa不結合(圖7C)。因此，兩個關鍵BH3殘基的改變足夠拓寬Noxa的特異性。
值得注意的是，當在纖維原細胞中表達時，Noxa m3被證實是一種比野生型Noxa更有效的殺傷劑(圖9E、9F)。因此，Noxa只與Mcl-1結合不足以殺死MEFs。Noxa對凋亡的有效誘導需要其它的BH3與Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-w類蛋白質之間的互作，或者通過Bad-類蛋白質的共表達(圖8)或者通過降低Noxa選擇性的突變(m3；圖9)來提供這種相互作用。
參考書目Adams等人，Nature 318533-538，1985Adams等人，Genes Dev 172481-2495，2003Alving等人，Immunol Rev 1455-31，1995Bleicher等人，Nat Rev Drug Discov 2369-378，2003Cory等人，Nat Rev Cancer 2647-656，2002Cory等人，Oncogene 228590-8607，2003Danial和Korsmeyer Cell 116205-219，2004Day等人，Cell Death Differ 61125-1132，1999Day等人，1999；Hinds等人，2003Erickson等人，Science 249527-533，1990Fix，Pharm Res 131760-1764，1996Glickman等人，J Biomol Screen 73-10，2002Hajduk等人，J Med Chem 422315-2317，1999Hinds等人，EMBO J 221497-1507，2003Huang和Strasser，Cell 103839-842，2000Johnson等人，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology andPharmacy，Pezzuto等人，Eds.，Chapman and Hall，New York，1993Kozopas等人，Proc Natl Acad Sci 903516-3520，1993Kuntz，Science 2571078-1082，1992Langer，Science 2491527-1533，1990Letai等人，Cancer Cell 2183-192，2002Liu，X等人，Immunity 19341-352，2003Lugovskoy等人，J Am Chem Soc 1241234-1240，2002Moriishi等人，ProcNatl Acad Sci USA 969683-9688，1999Nelson和Kallenbach，Biochemistry 285256-5261，1989Opferman等人，Nature 426671-676，2003Patton，Nat Biotech 16141-143，1998
Pellecchia等人，Nat Rev Drug Discov 1211-219，2002Petros等人，2000，出處同前Puthalakath等人，Cell Death Differ 9505-512，2002Putney和Burke，Nat Biotech 16153-157，1998Remington′s；Akimaru等人，Cytokines Mol Ther 1197-210，1995Remington′s；Egleton和Dayis，Peptides 181431-1439，1997Samanenet A1，J Pharm Pharmacol 48119-135，1996Sattler等人，1997，出處同前Sayani和Chien，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1385-184，1996Strasser等人，Nature 348331-333，1990Suntres和Shek，J Pharm Pharmacol 4623-28，1994Szoka和Papahadjopoulos，Ann Rev Biophys Bioeng 9467-508，1980van de Waterbeemd和Gifford，Nat Rev Drug Disc 2192-204，2003Van Parijs等人，Immunity 11281-288，1999Vaux等人，Nature 335440-442，1988Vutla等人，J Pharm Sci 855-8，1996Wei等人，Science 292727-730，2000Wells，Methods Enzymol 2022699-2705，1991Wilson-Annan等人，J Cell Biol 162877-888，2003Wohnsland等人，J Med Chem 44923-930，2000Woodle等人，Pharm Res 9260-265，1992Zhang，Nat Rev Drug Discov 1101-102，2002
<110>The Walter and Eliza Hall Institute of Medical ResearchHUANG，David C.S(US Only)COLMAN，Peter M(US Only)DAY，Catherine L(US Only)ADAMS，Jerry M(US Only)CHEN，Lin(US Only)WILLIS，Simon N(US Only)WEI，Andrew(US Only)SMITH，Brian J(US Only)HINDS，Mark G(US Only)<120>治療性分子和用于產生和/或選擇所述分子的方法<130>12563560/EJH<150>Australian Provisional Patent Application No.20049000562<151>2004-02-06<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>肽<400>1Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>肽<400>2Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5
<210>3<211>9<212>PRT<213>肽<400>3Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 權利要求
1.一種產生促生存Bc1-2家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇帶有定義由BH3結構域形成的兩性α-螺旋之殘基位置的支架BH3-only蛋白質結構；選擇一或多個與BH3-only蛋白質的混雜型結合表型相關的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質的限制型結合模式的氨基酸或其化學類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導更為限制的Bc1-2蛋白質結合譜的能力。
2.權利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗劑特異于Bc1-2、XBc1-xL、Bc1-w、Mc1或A1中的一種或多種。
3.權利要求1或2的方法，其中Bc1-2拮抗劑基于選自Noxa、Bim、Puma、Bmf、Bad、Bik、Hrk和Bid的分子的結構。
4.權利要求1的方法，其中Bc1-2拮抗劑抑制癌細胞上的促生存蛋白質。
5.權利要求4的方法，其中癌細胞選自ABL1原癌基因、AIDS相關癌癥、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、囊性腺樣癌、腎上腺皮質癌、起因不明的骨髓化生、脫發(fā)、軟組織腺泡狀肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、星細胞瘤、共濟失調-毛血管擴張、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干神經膠質瘤、腦和中樞神經系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、中樞神經系統(tǒng)腫瘤、類癌瘤、宮頸癌、兒童期腦腫瘤、兒童期癌、兒童期白血病、兒童期軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓性白血病、結腸直腸癌、皮膚T淋巴細胞瘤、皮膚纖維肉瘤-隆凸、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、導管細胞癌、內分泌腺癌、子宮內膜癌、室鼓膜瘤、食道癌、惡性骨髓瘤、肝外膽小管癌、眼癌、眼黑素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、先天性骨髓發(fā)育不全、纖維肉瘤、膽汁膀胱癌、胃癌、胃腸道癌、胃腸道類癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖細胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)層疾病、神經膠質瘤、婦科癌、血液惡性腫瘤、毛細胞性白血病、頭頸癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細胞增多病、霍奇金氏病、人視神經乳頭水腫病毒、水泡狀胎塊、血鈣過多、咽喉癌、眼內黑素瘤、島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、郎格罕氏細胞-組織細胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni綜合癥、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳腺癌、惡性棒狀腎腫瘤、成神經管細胞瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌、間皮瘤、遷移癌、口癌、多發(fā)性內分泌腺瘤、蕈樣霉菌病、骨髓異常增生綜合征、骨髓瘤、骨髓及外骨髓增殖失調、鼻癌、鼻咽癌、腎母細胞瘤、成神經細胞瘤、神經纖維瘤病遺傳性疾病、Nijmegen Breakage綜合征、非黑素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食管癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造瘺術卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周神經外胚層腫瘤、垂體癌、紅血球增多癥、前列腺癌、罕見癌及其相關病癥、腎細胞肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、白內障-毛細血管擴張-色素沉著綜合征、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤、惡性皮膚網狀細胞增多綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊索腫瘤、鱗片細胞肉瘤(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、遷移性細胞癌(膀胱)、遷移性細胞癌(腎-骨盆-/-輸尿管)、胚胎滋養(yǎng)層癌、尿道癌、泌尿系統(tǒng)癌、Uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、陰戶癌、瓦爾登斯特倫病(股骨小頭的骨軟骨病)巨球蛋白血癥、腎母細胞瘤。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中Bc1-2拮抗劑抑制哺乳動物中的促生存蛋白質。
7.權利要求6的方法，其中所述哺乳動物是人。
8.一種產生或選擇促生存Bc1-2蛋白質家族的拮抗劑的方法，所述方法包括選擇限制型BH3-only蛋白質作為支架蛋白質，確定賦予該支架限制型表型的構象，和產生或篩選模擬所述支架和/或賦予其限制型Bc1-2蛋白質結合譜的構象部分的化合物。
9.混雜型BH3-only蛋白質作為氨基酸殘基替換基質在產生或選擇替換變體中的用途，所述變體賦予所述BH3-only蛋白質或其化學或構象等價物以限制型結合表型。
10.一種基于帶有賦予其限制型表型的殘基位置之支架BH3-only蛋白質設計促生存Bc1-2蛋白質家族的拮抗劑的計算方法，該方法包括選擇一些混雜型BH3-only蛋白質；對這些蛋白質進行序列比對，將這些蛋白質與限制型BH3-only蛋白質比較；根據所述比對得到各氨基酸在一或多個帶來與Bc1-2蛋白質結合的混雜特性或限制特性的位置上的出現頻率；利用所述頻率產生選自電荷、大小、構象、溶解度、極性、疏水性、親水性和對三級結構的貢獻的計分函數；用所述計分函數和至少一種另外的計分函數來產生一套優(yōu)化蛋白質序列或其構象等價物，和產生或選擇具有與Bc1-2蛋白質的限制型結合表型的化合物或蛋白質。
11.權利要求10的方法，其中所述計分函數選自(a)酸性殘基的數量和位置；或(b)堿性殘基的數量和位置；或(c)極性殘基的數量和位置；或(d)非極性殘基的數量和位置；或(e)帶電荷殘基的數量和位置；或(f)不帶電荷殘基的數量和位置；或(g)親水殘基的數量和位置；或(h)疏水殘基的數量和位置；或(i)殘基的水平；或(j)殘基的溶解度水平；或(k)殘基的大??；或(1)該殘基在BH3-only蛋白質中作出的對三級結構的貢獻。
12.一種用于確定在細胞中誘導凋亡的試劑之結構的計算機程序產品，所述產品包括(1)被接收為輸入計分函數(SF)的至少兩種與所述BH3-only或Bc1-2蛋白質相關的特征的代碼，其中所述特征尤其選自(m)酸性殘基的數量和位置；(n)堿性殘基的數量和位置；(o)極性殘基的數量和位置；(p)非極性殘基的數量和位置；(q)帶電荷殘基的數量和位置；(r)不帶電荷殘基的數量和位置；(s)親水殘基的數量和位置；(t)疏水殘基的數量和位置；(u)殘基的水平；(v)殘基的溶解度水平；(w)殘基的大小；(x)該殘基在BH3-only蛋白質中作出的對三級結構的貢獻(2)累加所述SF以提供相應于BH3-only蛋白質的PV的總和的代碼；和(3)儲存代碼的計算機可讀介質。
13.一種用于評估BH3-only蛋白質或化學等價物在細胞中誘導凋亡的可能用途的計算機，其中所述計算機包括(1)機器可讀數據存儲介質，該介質包括編碼有機器可讀數據的數據存儲材料，其中所述機器可讀數據包含至少兩種與所述BH3-only或Bc1-2蛋白質相關的特征的Iv，其中所述特征尤其選自(m)酸性殘基的數量和位置；(n)堿性殘基的數量和位置；(o)極性殘基的數量和位置；(p)非極性殘基的數量和位置；(q)帶電荷殘基的數量和位置；(r)不帶電荷殘基的數量和位置；(s)親水殘基的數量和位置；(t)疏水殘基的數量和位置；(u)殘基的水平；(v)殘基的溶解度水平；(w)殘基的大小；(x)該殘基在BH3-only蛋白質中作出的對三級結構的貢獻(2)用于存儲處理所述機器可讀數據的指令的工作存儲器；(3)與所述工作存儲器以及所述機器可讀數據存儲介質相耦連的中央處理單元，用于處理所述機器可讀數據以提供相應于所述化合物PV的所述SF的總和；和(4)與所述中央處理單元相耦連的輸出硬件，用于接收所述PV。
14.一種預防或減輕受試者的癌癥的方法，所述方法包括在足以預防或減輕癌癥的條件下向所述受試者施用有效量的Bc1-2蛋白質拮抗劑一定時間。
15.權利要求14的方法，其中所述拮抗劑與一種或多種藥學可接受載體和/或稀釋劑相結合形成藥物組合物。
16.權利要求14或15的方法，其中拮抗劑的施用經呼吸道、氣管內、鼻咽、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、皮內、肌內、眼內、鞘內、小腦內、鼻內、灌注、口服、直腸、貼片和植入途徑給藥。
17.一種包含促生存Bc1-2蛋白質家族拮抗劑的組合物，所述拮抗劑通過以下方法產生選擇帶有定義由BH3結構域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質結構；選擇一或多個與BH3-only蛋白質的混雜型結合表型相關的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質的限制型結合模式的氨基酸或其化學類似物；分析各次替換后的相互作用其誘導更為限制的Bc1-2蛋白質結合譜的能力，所述組合物還包含一種或多種藥學可接受載體和/或稀釋劑。
18.促生存Bc1-2蛋白質家族的拮抗劑在生產癌癥治療藥物中的用途，所述拮抗劑通過以下方法產生選擇帶有定義由BH3結構域形成的兩性α-螺旋的殘基位置的支架BH3-only蛋白質結構；選擇一或多個與BH3-only蛋白質的混雜型結合表型相關的殘基位置；將賦予其混雜型表型的氨基酸殘基替換為賦予其與Bc1-2蛋白質的限制型結合模式的氨基酸或其化學類似物；和分析各次替換后的相互作用其誘導更為限制的Bc1-2蛋白質結合譜的能力。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及可用于誘導例如但不限于癌細胞這樣的特定細胞凋亡的治療性分子，以及產生和/或選擇治療性分子的方法。本發(fā)明還提供誘導例如癌細胞這樣的細胞發(fā)生凋亡的方法以及可用于此的藥物組合物。本發(fā)明還提供通過選擇性抑制促生存蛋白質來產生或選擇能夠誘導特定細胞凋亡的治療劑的方法。本發(fā)明還提供基于結構結合特征進行治療性分子設計的計算方法。
文檔編號C07K14/435GK1973041SQ200580010491
公開日2007年5月30日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權日2004年2月6日
發(fā)明者D·C·S·黃, P·M·科爾曼, C·L·戴, J·M·亞當斯, L·陳, S·N·威利斯, A·魏, B·J·史密斯, M·G·海因茲 申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學研究院