專(zhuān)利名稱(chēng)：用高效切向流過(guò)濾進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種從在初始進(jìn)料流中發(fā)現(xiàn)的污染物中澄清特異目標(biāo)分子的改進(jìn)方法和系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明的方法提供了把樣品溶液通過(guò)高效切向流過(guò)濾的改進(jìn)方法處理，其中切向流過(guò)濾能夠增強(qiáng)期望分子從給定進(jìn)料流中的澄清、濃縮和分級(jí)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種從給定進(jìn)料流中分級(jí)感興趣分子的改進(jìn)方法。應(yīng)當(dāng)注意的是，生產(chǎn)大量相對(duì)純凈的生物活性分子，對(duì)于制造人和動(dòng)物的藥物制劑、蛋白質(zhì)、酶、抗體和其他專(zhuān)用化學(xué)品在經(jīng)濟(jì)上是非常重要的。在許多多肽、抗體和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，各種重組DNA技術(shù)已經(jīng)成為選擇的方法，因?yàn)檫@些方法能大規(guī)模生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。能夠用于這些生產(chǎn)的各種“平臺(tái)”包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)，優(yōu)選的動(dòng)物類(lèi)型是在哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)，但該平臺(tái)生產(chǎn)方法也可以考慮使用鳥(niǎo)類(lèi)或甚至轉(zhuǎn)基因植物來(lái)生產(chǎn)外源性蛋白質(zhì)、抗體或其片段或融合物。
生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)包括用編碼該蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物在有利于表達(dá)重組蛋白質(zhì)或其他感興趣分子的條件下生長(zhǎng)。原核生物-大腸桿菌是一種有利的宿主系統(tǒng)，因?yàn)樗芤暂^高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。但是，對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的DNA的一般性表達(dá)存在許多美國(guó)專(zhuān)利，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了從大腸桿菌到牛的多種表達(dá)平臺(tái)。
隨著從生物系統(tǒng)中生產(chǎn)外源性蛋白質(zhì)或其他感興趣分子的改進(jìn)，在產(chǎn)業(yè)上已經(jīng)有越來(lái)越大的壓力要求開(kāi)發(fā)新技術(shù)，來(lái)增強(qiáng)如此生產(chǎn)的生物制品和藥品的純化和回收工藝和使之更高效。也就是說(shuō)，隨著新產(chǎn)品線的增加，人們有很大的興趣設(shè)計(jì)新方法來(lái)使這些治療物以商業(yè)量迅速進(jìn)入市場(chǎng)。同時(shí)，在工業(yè)上還面臨新的挑戰(zhàn)，需要開(kāi)發(fā)從各種體液包括乳汁、血液和尿中回收轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)和抗體的新工藝。生產(chǎn)規(guī)模越大，這些問(wèn)題就經(jīng)常變得越復(fù)雜。另外，還需要面對(duì)產(chǎn)品純度和安全性的挑戰(zhàn)，特別是病毒安全性和如DNA和宿主細(xì)胞等殘留污染物，其可能需要滿(mǎn)足監(jiān)督生物有用性藥物生產(chǎn)的各種政府機(jī)構(gòu)的要求。
當(dāng)前，已經(jīng)有幾種方法來(lái)從其混合物中有效地分離生物學(xué)感興趣的分子，例如蛋白質(zhì)。一個(gè)重要的技術(shù)是親和色譜法，它根據(jù)期望分子與親和基質(zhì)或凝膠的特異性和選擇性結(jié)合來(lái)分離分子，同時(shí)不期望的分子保持未結(jié)合狀態(tài)，然后可以從系統(tǒng)中移除。親和凝膠典型地由固定在凝膠載體上的配體結(jié)合部分組成。例如GB 2,178,742利用親和色譜法來(lái)純化血紅蛋白及其化學(xué)修飾衍生物，其基于如下事實(shí)天然血紅蛋白與特定族的聚陰離子結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合。這些結(jié)構(gòu)被固定于凝膠本身上用于捕獲。在該方法中，未修飾的血紅蛋白保持在親和凝膠上，而修飾的血紅蛋白由于聚陰離子結(jié)合位點(diǎn)被修飾劑共價(jià)占據(jù)，因此不能與凝膠結(jié)合而從系統(tǒng)中清除。親和色譜柱是高度特異性的，這樣就能得到非常純的產(chǎn)品；但是，親和色譜是相對(duì)昂貴的方法，因此將其用于商業(yè)操作是非常困難的。
典型地，從包含各種不同宿主細(xì)胞污染物的上清液中純化遺傳工程生物藥物。反相高效液相色譜(RP-HPLC)可以用于蛋白質(zhì)純化，因?yàn)樗芨咝Х蛛x結(jié)構(gòu)或分子量特別相似的分子。已經(jīng)公開(kāi)了利用RP-HPLC的方法可以用于許多分子。McDonaldand Bidlingmeyer，″Strategies for Successful Preparative Liquid Chromatography″，PREPARATIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY，Brian A.Bidlingmeyer(New YorkEIsevier Science Publishing，1987)，vol.38，pp.1-104；Lee et al.，Preparative HPLC.8th Biotechnology Symposium，Pt.1，593-610(1988)。
此外，在面對(duì)一些相同挑戰(zhàn)的另一產(chǎn)業(yè)中，也需要新的答案。自從開(kāi)始用于濃縮和分級(jí)乳清和處理廢水以后，乳品工業(yè)就是采用該技術(shù)使用膜系統(tǒng)來(lái)分級(jí)、澄清和純化的最擁護(hù)者之一。在20世紀(jì)80年代，乳品工業(yè)的研究者們開(kāi)始在非標(biāo)準(zhǔn)化乳酪生產(chǎn)中使用膜來(lái)濃縮乳。近年來(lái)，技術(shù)改進(jìn)使得膜濃縮乳比以往更有吸引力。同時(shí)，膜材料、工藝工程和乳組分功能性的技術(shù)進(jìn)步使得在乳處理的幾乎每個(gè)階段中膜分離工藝都更實(shí)用和更有用。雖然這些實(shí)踐并不能用于乳品工業(yè)的所有方面，但它們的潛力是巨大的。
例如，在未來(lái)膜分離對(duì)于流體乳處理器是特別有吸引力的，因?yàn)樗鼛缀醪恍枰芰浚谔幚砥陂g不會(huì)破壞任何產(chǎn)品。4種基本膜過(guò)濾類(lèi)型有潛力用于乳品工業(yè)——反滲透(PC)、納濾(NF)、超濾(UF)和微濾(MF)——每種用于不同的目的。一些應(yīng)用處理僅僅涉及單種膜；但是在給定的應(yīng)用中先進(jìn)工藝正使用兩個(gè)或更多膜處理。然而，這些處理雖然有用，但對(duì)于乳品工業(yè)、食品制造工業(yè)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物藥物生產(chǎn)的一些方面仍然是有限的。
在生物技術(shù)工業(yè)和乳品工業(yè)中，傳統(tǒng)上將超濾用于基于大小分離蛋白質(zhì)混合物，其中蛋白質(zhì)分子量的比例必須是至少約10比1。在工業(yè)領(lǐng)域的很多工業(yè)應(yīng)用中，特別是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳中回收生物藥物中，這是限制性因素。很多研究發(fā)生于超濾系統(tǒng)優(yōu)化中，通過(guò)改變物理化學(xué)條件(即pH和離子強(qiáng)度)來(lái)達(dá)到更高的選擇性(Van Reis等人，(1997))。根據(jù)本發(fā)明的方法，已在pH和離子強(qiáng)度方向上對(duì)條件優(yōu)化作出了更多改進(jìn)，使得有可能在包括乳汁的多種進(jìn)料流中開(kāi)發(fā)高效切向流過(guò)濾(HPTFF)。
HPTFF利用多種現(xiàn)象來(lái)使分級(jí)效果最大化。其包括操作溶液pH和離子強(qiáng)度來(lái)使溶質(zhì)有效體積的差異最大化，以及使用具有受控孔徑的膜。
如所述，當(dāng)前的工業(yè)和生物藥物工藝經(jīng)常使用在純化、濃縮和緩沖液交換三個(gè)分離步驟中經(jīng)常使用離子交換色譜、UF和體積排阻色譜(SEC)。但是即使互相結(jié)合，這些工藝的分離能力也是有限的。甚至超濾(UF)通常限于分離大小差異至少10倍的溶質(zhì)。此外，電荷相似的分子也非常難于分離。HPTFF是二維純化方法，其利用生物分子的大小和電荷性質(zhì)的差異。因此它有可能分離具有相同分子量的生物分子。它甚至有可能保留一種生物分子，同時(shí)讓更大分子量的分子通過(guò)膜。
大小差異小于三倍的分子可以通過(guò)使用高選擇性荷電膜并仔細(xì)優(yōu)化緩沖液和流體動(dòng)力學(xué)而分離。在HPTFF中，期望的感興趣分子的等電點(diǎn)(pI)的知識(shí)是主要因素。然后這將決定膜構(gòu)成和膜的固有電荷特性曲線、孔徑、和流動(dòng)特征。此外，HPTFF使得有可能在單個(gè)單元操作中進(jìn)行所有這些步驟，因此降低了生產(chǎn)成本。此外，HPTFF使用已經(jīng)在在UF中建立的相同線性放大原理。也可以通過(guò)優(yōu)化跨膜壓來(lái)輔助HPTFF。
根據(jù)膜的類(lèi)型，可以將其分成微濾或超濾。微濾膜，孔徑在0.1-10μm之間，典型地用于澄清、除菌、清除微?；蚴斋@細(xì)胞。超濾膜，具有0.001到0.1μm之間小得多的孔徑，用于分離出和濃縮溶解的分子(蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物和其他生物分子)、用于交換緩沖液、及用于粗分級(jí)。
但是，超濾可實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)純化程度存在限制。這些限制主要是由于濃差極化現(xiàn)象、堵塞、和大多數(shù)膜的孔徑分布較寬。因此，溶質(zhì)區(qū)分能力經(jīng)常較低。參見(jiàn)，例如Porter，ed.，HANDBOOK OF INDUSTRIAL MEMBRANE TECHNOLOGY(NoyesPublications，Park Ridge，N.J.，1990)，pp.164-173。溶質(zhì)的極化層作用相當(dāng)于附加的過(guò)濾器，且實(shí)質(zhì)上與初始超濾器串聯(lián)。這種作用產(chǎn)生了對(duì)過(guò)濾給定溶劑的顯著抗性。極化程度隨著在進(jìn)料中保留的溶質(zhì)的濃度增加而增加，可以在真實(shí)系統(tǒng)中導(dǎo)致很多表面異?；虿豢深A(yù)測(cè)的效應(yīng)。例如，在高度極化條件下，濾過(guò)速率隨著壓力的增加僅輕微地增加，相比較而言，非極化條件下過(guò)濾速率通常與壓力成線性。使用更開(kāi)放、更高通量的膜可能不增加濾過(guò)率，因?yàn)闃O化層提供對(duì)過(guò)濾的限制抗性。保留和被洗脫的溶質(zhì)之間的相互作用使這種情況進(jìn)一步復(fù)雜。濃差極化和堵塞過(guò)程的結(jié)果使得不能有效利用超濾膜的大分子分級(jí)能力用于大規(guī)模分級(jí)大分子混合物，例如血漿蛋白。參見(jiàn)Michaels，″Fifteen Years of UltrafiltrationProblems and Future Promises of anAdolescent Technology″，in ULTRAFILTRATION MEMBRANES ANDAPPLICATIONS，POLYMER SCIENCE AND TECHNOLOGY，13(Plenum Press，N.Y.，1979，Anthony R.Cooper，ed.，)，pp.1-19。
TFF和HPTFF可以根據(jù)分離級(jí)組分的大小進(jìn)一步細(xì)分。對(duì)于蛋白質(zhì)處理，其范圍可以從完整細(xì)胞到緩沖鹽的大小。下面的表1詳述了每種小類(lèi)中被膜保留的和通過(guò)膜的典型組分。此外，它顯示了通常落入每個(gè)小類(lèi)中的膜孔徑分級(jí)或名義分子量限制(NMWL)的范圍。

表1切向流過(guò)濾法的細(xì)分使用切向流過(guò)濾來(lái)分離物質(zhì)是已知的。Marinaccio等人的美國(guó)專(zhuān)利US 4,888,115披露了用于分離生物液體例如用于血漿去除術(shù)的血液組分的方法(稱(chēng)為“錯(cuò)流”)。在該方法中，血液切向通過(guò)(即跨過(guò))有機(jī)聚合物微孔濾膜，并除去顆粒物。在本領(lǐng)域的另一個(gè)例子中，披露了將切向流過(guò)濾用于過(guò)濾啤酒溶液(Shackleton，EP 0,208,450，公開(kāi)于1987年1月14日)，特別是用于去除顆粒物如酵母細(xì)胞和其他懸浮固體。Kothe等人(美國(guó)專(zhuān)利4,644,056，授權(quán)于1987年2月17日)披露了使用該方法從乳或初乳中純化免疫球蛋白，Castino(美國(guó)專(zhuān)利4,420,398，授權(quán)于1983年12月13日)描述了它用于從含抗病毒物質(zhì)以及病毒顆粒及其產(chǎn)生它們的細(xì)胞培養(yǎng)剩余物的肉湯中分離抗病毒物質(zhì)例如干擾素。
TFF單元已經(jīng)用于從細(xì)胞碎片中分離細(xì)菌酶(Quirk et al.，1984，ENZYMEMICROB.TECHNOL.，6(5)201)。使用該技術(shù)，Quirk等人能以比用常規(guī)離心技術(shù)更高的收率和更少的時(shí)間來(lái)提取酶。在制藥領(lǐng)域中切向流過(guò)濾的幾種應(yīng)用已經(jīng)由Genovesi做了綜述(1983，J.PARENTER.Aci.TECHNOL.，37(3)81)，包括過(guò)濾無(wú)菌注射用水、澄清溶劑系統(tǒng)、和從肉湯和細(xì)菌培養(yǎng)物中過(guò)濾酶。
但是，在該技術(shù)的商業(yè)應(yīng)用中所需的精確控制顆粒大小是困難的，通常也不會(huì)成功。在本發(fā)明中，切向流過(guò)濾的使用已經(jīng)被改進(jìn)，用于在商業(yè)有效和重要的工藝中根據(jù)大小和電荷來(lái)分離顆粒。所得的HPTFF系統(tǒng)用于本發(fā)明，從TFF實(shí)現(xiàn)的水平來(lái)改善澄清和分級(jí)效果。還披露了使用選定大小的過(guò)濾器，進(jìn)一步依次使用或串聯(lián)使用不同大小的濾器(即過(guò)濾系統(tǒng))，用于分離顆粒以獲得特定期望大小范圍的顆粒。
可以從細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因乳進(jìn)料流中純化的一種這樣的感興趣分子是人重組甲胎蛋白。其他感興趣分子包括但不限于，人白蛋白、抗體、抗體的Fc片段和融合分子，其中在融合分子中人白蛋白或甲胎蛋白蛋白質(zhì)片段作為載體分子。
本發(fā)明的方法也提供濾器和條件的精確組合，允許優(yōu)化從給定進(jìn)料流中感興趣分子的產(chǎn)率。在這些方法中，重要的工藝參數(shù)如pH和溫度被精確操作。
生物制品工業(yè)對(duì)產(chǎn)品安全性、純度以及產(chǎn)品成本越來(lái)越關(guān)注。根據(jù)本發(fā)明，使用HPTFF是一種快速和更有效的生物分子分離方法。它可以廣泛地應(yīng)用于生物領(lǐng)域，例如免疫學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)。


附圖1顯示從進(jìn)料流通過(guò)HPTFF至裝填和完成的物料流動(dòng)的工藝流程圖。
附圖2A顯示微濾的工藝和設(shè)備構(gòu)成。
附圖2B顯示TFF的工藝和設(shè)備構(gòu)成。
附圖3顯示通過(guò)不同TFF和HPTFF模塊的流體流路。
附圖4顯示過(guò)濾工藝流程圖。
附圖5顯示從DNA構(gòu)建體至生產(chǎn)韓重組感興趣蛋白質(zhì)的澄清乳的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程。
附圖6顯示用于本發(fā)明方法的設(shè)備示意圖。
附圖7顯示在HPTFF模塊類(lèi)型中開(kāi)放和促進(jìn)湍流的進(jìn)料通道。
附圖8顯示本發(fā)明的HPTFF系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
簡(jiǎn)述之，本發(fā)明的目的是使用HPTFF技術(shù)實(shí)現(xiàn)更有效地蛋白質(zhì)分級(jí)。也就是說(shuō)，使用HPTFF來(lái)改進(jìn)從污染蛋白中分離感興趣蛋白質(zhì)。感興趣蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是重組人甲胎蛋白，其是分子量約66KD的蛋白質(zhì)，具有與白蛋白相似的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法的目標(biāo)是以可能最有效的方法保留靶蛋白(rhAFP)，并讓主要的污染乳蛋白質(zhì)通過(guò)。根據(jù)本發(fā)明，污染的乳蛋白包括IgG、乳鐵蛋白、白蛋白、酪蛋白、乳球蛋白、和乳白蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用100KD切向流膜方法有效降低了除重組人甲胎蛋白和山羊白蛋白之外全部的濃度。通過(guò)減少污染蛋白的濃度，保留的重組人甲胎蛋白在純度和穩(wěn)定性方面都被增強(qiáng)，并能進(jìn)一步用常規(guī)色譜法更有效地純化。
本發(fā)明的方法使用rhAFP作為實(shí)例，但是也可用于其他感興趣的蛋白質(zhì)。當(dāng)用20mM磷酸緩沖液對(duì)溶液連續(xù)滲濾時(shí)，使用100KD MWCO膜來(lái)保留重組人甲胎蛋白，然后其他蛋白質(zhì)可以自由地通過(guò)該膜。
用SDS PAGE分析純度，在澄清乳中重組人甲胎蛋白的初始純度為約5-7％。在蛋自質(zhì)分級(jí)后，相對(duì)純度提高到約30％，收率為85％。本發(fā)明的這種初步分級(jí)提高了下游工藝的效率，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)達(dá)到半純化的狀態(tài)加速了從多種進(jìn)料流優(yōu)選從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳汁中對(duì)人治療性蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或抗體的處理。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所開(kāi)發(fā)并提供的過(guò)濾技術(shù)提供了一種從乳的天然組分或其污染物中澄清、濃縮和分級(jí)期望的重組蛋白質(zhì)或其他感興趣分子的方法。所得的澄清的大量中間體是適于傳統(tǒng)純化技術(shù)如色譜的進(jìn)料材料，其中色譜法在HPTFF處理下游使用，使產(chǎn)品達(dá)到最終的制劑和純度。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案利用三個(gè)過(guò)濾單元操作從含感興趣分子的給定轉(zhuǎn)基因乳體積中澄清、濃縮和分級(jí)該產(chǎn)物。澄清步驟從產(chǎn)物中除去較大的顆粒物，例如脂肪球和酪蛋白膠團(tuán)。其后的濃縮和分級(jí)步驟除去大部分的小分子，包括乳糖、礦物質(zhì)和水，來(lái)提高純度和減小所得產(chǎn)物組合物的體積。HPTFF工藝的產(chǎn)物被濃縮至適當(dāng)水平，以利于最佳的下游純化和整體產(chǎn)物穩(wěn)定性。然后把該濃縮產(chǎn)物無(wú)菌過(guò)濾，以確保生物負(fù)荷最小并增強(qiáng)產(chǎn)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。大量產(chǎn)物的純度將達(dá)到65％至85％，可以包含例如白蛋白、乳清蛋白(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、和BSA)、和低水平的殘留脂肪和酪蛋白。這種部分純化的產(chǎn)物是用于常規(guī)下游色譜技術(shù)的理想起始原料。
可以用本發(fā)明處理的代表性產(chǎn)品是轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的感興趣蛋白質(zhì)，包括但不限于甲胎蛋白、IgG1抗體、融合蛋白(例如紅細(xì)胞生成素-人白蛋白融合物-“HEAP”或人白蛋白-紅細(xì)胞生成素；β-干擾素-甲胎蛋白融合物)、抗凝血酶III、α-1-抗胰蛋白酶、IgG4、IgM、IgA、Fc部分、包含結(jié)合至免疫球蛋白片段的肽或多肽的融合分子?？梢杂帽景l(fā)明處理的其他蛋白質(zhì)包括重組蛋白質(zhì)、外源激素、內(nèi)源蛋白質(zhì)或可在以后經(jīng)處理恢復(fù)生物學(xué)功能的無(wú)生物活性蛋白質(zhì)。在這些處理中，包括但不限于，人生長(zhǎng)激素、重組人白蛋白、核心蛋白聚糖(decorin)、人甲胎蛋白尿激酶、tPA和催乳素。
此外，根據(jù)本發(fā)明，鹽(NaCl)濃度變化和兩個(gè)滲濾(diafiltration)步驟與現(xiàn)有技術(shù)不同，并用于提高根據(jù)本發(fā)明方法中可以達(dá)到的純度。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供更有效的高效切向流過(guò)濾方法，用于根據(jù)大小來(lái)分離顆粒和分子等物質(zhì)，該方法對(duì)感興趣物質(zhì)具有選擇性，獲得該物質(zhì)更高倍數(shù)的純化。
另一個(gè)目的是提供改進(jìn)的過(guò)濾方法，包括超濾法，用于分離蛋白質(zhì)等生物大分子，該方法使?jié)獠顦O化最小并且不增加通量。
另一個(gè)目的是提供過(guò)濾方法，其能根據(jù)大小分離大小差異小于10倍的物質(zhì)，并且不需要在過(guò)濾前稀釋該混合物。
這些和其他的目的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。通過(guò)以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述，并參考附圖，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述在本說(shuō)明書(shū)中，如下的縮寫(xiě)具有指定的含義縮寫(xiě)詞BSA牛血清白蛋白CHO中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CV 錯(cuò)流速度DFF直流過(guò)濾DV 滲濾體積IEF等電聚焦GMH質(zhì)量通量(克/m2/小時(shí))-也可作JMLMH液體通量(升/m2/小時(shí))-也可作JLLPM升/分M 摩爾濃度MF 微濾NMWCO 名義截留分子量NWP標(biāo)準(zhǔn)化的透水性
PES 聚(醚)-砜pH根據(jù)公知的科學(xué)參數(shù)用于描述化學(xué)物或化合物的氫離子活性的術(shù)語(yǔ)PPM 百萬(wàn)分之一份SDS-PAGE SDS(十二烷基硫酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳SEC 體積排阻色譜TFF 切向流過(guò)濾PEG 聚乙二醇TMP 跨膜壓力UF超濾術(shù)語(yǔ)解釋澄清從溶液中去除顆粒物，以使得溶液能夠通過(guò)0.2μm膜。
膠體涉及不能容易地穿過(guò)毛細(xì)壁的大分子。這些化合物產(chǎn)生腫脹的(即它們吸引液體)負(fù)荷，通常施用于恢復(fù)血管內(nèi)體積和改善組織灌注。
濃縮用膜除去水和小分子，以使得保留分子相對(duì)于小分子的比例增加。
濃差極化由多種因素的組合導(dǎo)致保留分子在膜表面積累(凝膠層)跨膜壓力、錯(cuò)流速度、樣品粘度、和溶質(zhì)濃度。
錯(cuò)流速度流體跨膜表面頂部的速度。CF＝Pi-Po，其中Pi是入口處壓力，Po是出口處壓力，它與保留物流速相關(guān)。
滲濾(Diafiltration)洗滌較小分子通過(guò)膜，將感興趣的較大分子留在保留物中的分級(jí)工藝。它是一種方便和有效的技術(shù)，用于除去或交換鹽、除去去污劑、分離游離和未結(jié)合分子、除去低分子量物質(zhì)、或快速改變離子或pH環(huán)境。該工藝典型地使用微濾膜，微濾膜用于從淤漿(slurry)中除去感興趣產(chǎn)物，同時(shí)維持淤漿濃度恒定。
進(jìn)料流供用于工藝或方法的原料或原料溶液，包含感興趣蛋白質(zhì)，也可以包含各種污染物，包括微生物、病毒和細(xì)胞片段。本發(fā)明優(yōu)選的進(jìn)料流是包含感興趣的外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因乳。
濾出物流量(J)樣品的一部分已經(jīng)通過(guò)膜的比率。
流速(V)流體通過(guò)膜表面的速度被認(rèn)為是流體的流速。隨流速變化將測(cè)量產(chǎn)物流量。這兩個(gè)變量之間的關(guān)系允許我們確定流動(dòng)的最佳操作窗。
分級(jí)根據(jù)物理或化學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)先分離分子。
凝腔層可在膜頂部形成的分子的顯微薄層。它可以通過(guò)阻塞膜表面影響分子保留并因此降低濾出物流動(dòng)。
高效切向流過(guò)濾HPTFF是一種可根據(jù)大小和電荷進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分離的高分辨工藝，從而得到與色譜相似的產(chǎn)物收率和純化因子。用于HPTFF的膜NMWL在10kD至300kD范圍。
膜孔大小等級(jí)(MPSR)膜孔大小等級(jí)，典型地以微米值給出，表示比該等級(jí)更大的顆粒將被膜保留。
名義截留分子量(NMWCO)指定的超濾膜的大小(千道爾頓)。NMWCO被定義為90％保留在膜上的球形蛋白質(zhì)的分子量。
名義分子量極限(NMWL)膜分級(jí)系統(tǒng)，指示分子量高于NMWL的大部分溶解大分子、及分子量低于NMWL的一些將被所討論膜保留。
標(biāo)難化誘水性(NWP)在TFF裝置最初清洗期間以特定再循環(huán)率確定的水濾出流速。該值用于計(jì)算膜的恢復(fù)。
感興趣分子準(zhǔn)備從流體如液體形式的溶液或懸液中分離的顆?；蚱渌N類(lèi)的分子。感興趣的顆粒或分子從流體中分離，大多數(shù)情況下是從流體的其他顆?；蚍肿又蟹蛛x出來(lái)的。待分離的感興趣分子的大小將決定待用膜的孔徑。優(yōu)選地，感興趣的分子是生物和生化來(lái)源的或通過(guò)轉(zhuǎn)基因或體外方法生產(chǎn)的，并包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、抗體或抗體片段。優(yōu)選進(jìn)料流來(lái)源的例子包括哺乳動(dòng)物乳汁、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物細(xì)胞培養(yǎng)例如細(xì)菌、真菌和酵母。應(yīng)當(dāng)注意的是，待濾出物質(zhì)包括不希望的多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞組分、DNA、膠體、支原體、內(nèi)毒素、病毒、碳水化合物、和其他感興趣的生物分子，而不論其是否被糖基化。
切向流過(guò)濾一種工藝，其中包含待過(guò)濾分離組分的流體混合物與膜平面相切以高速循環(huán)，以增加背向擴(kuò)散的質(zhì)量傳遞系數(shù)。在這種過(guò)濾中，沿膜的長(zhǎng)度方向施加壓力差，以促使流體和可濾過(guò)溶質(zhì)流過(guò)過(guò)濾器。這種過(guò)濾適合以分批工藝和連續(xù)流工藝進(jìn)行。例如，可以將溶液反復(fù)通過(guò)膜，同時(shí)把通過(guò)濾器的流體連續(xù)排出到分離的單元中；或者將溶液通過(guò)膜一次，通過(guò)濾器的流體連續(xù)進(jìn)行下游處理。
跨膜壓力沿濾膜長(zhǎng)度方向施加的壓力差梯度，以促使流體和可濾過(guò)溶質(zhì)流過(guò)過(guò)濾器。在切向流系統(tǒng)中，TMP在進(jìn)口處(流動(dòng)通道的開(kāi)始)最高，而在出口處(流動(dòng)通道的末端)最低。用進(jìn)口、出口、濾出物口的平均壓力來(lái)計(jì)算TMP。
回收處理后可以回收的感興趣分子的量。通常用起始物質(zhì)的百分比或收率表示。
保留物樣品不能通過(guò)膜的部分，也可以稱(chēng)作濃縮物。保留物在TFF期間被再循環(huán)。
切向流過(guò)濾基礎(chǔ)在所有切向流裝置中有兩個(gè)重要的變量跨膜壓力(TMP)和錯(cuò)流流速(CF)。跨膜壓力(TMP)是實(shí)際推動(dòng)分子通過(guò)過(guò)濾器孔的力。錯(cuò)流流速是溶液跨過(guò)膜的流速。它提供力量來(lái)掃除能阻塞膜并因此降低工藝效率的較大分子。事實(shí)上，從樣品進(jìn)料儲(chǔ)器中泵出流體進(jìn)料流跨過(guò)過(guò)濾器的膜表面(錯(cuò)流)，并作為保留物返回樣品進(jìn)料儲(chǔ)器。通過(guò)夾子施加于保留物管的反壓建立了跨膜壓力，驅(qū)使比膜孔小的分子穿過(guò)過(guò)濾器并進(jìn)入濾出物(或滲出物)部分。該錯(cuò)流掃除保留在膜表面的較大分子，作為保留物返回進(jìn)料。成功進(jìn)行TFF方案的主要目的是優(yōu)化TMP和CF，以使得可以過(guò)濾最大體積的樣品，而不產(chǎn)生堵塞膜的凝膠。如果TMP沿膜長(zhǎng)度沒(méi)有增加或減少一般地超過(guò)約10psi的平均TMP，優(yōu)選超過(guò)約5psi，那么TMP是“基本上恒定的”。至于整個(gè)過(guò)濾期間的TMP水平，在濃縮步驟期間TMP保持恒定或降低以在較高濃度下保持選擇性。因此，“基本上恒定的TMP”涉及TMP相對(duì)于膜長(zhǎng)度，而不是相對(duì)于過(guò)濾時(shí)間。
縱覽根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，用微濾來(lái)去除脂肪球和酪蛋白膠團(tuán)以初步澄清轉(zhuǎn)基因(“TG”)乳汁。微濾的滲出液通過(guò)30kD TFF盒系統(tǒng)再循環(huán)，其中保留乳蛋白質(zhì)；鹽和糖通過(guò)膜，并再循環(huán)到微濾保留物中作為滲濾緩沖液。重組人甲胎蛋白產(chǎn)品存在于30kd膜保留的澄清乳中?，F(xiàn)在，重組人甲胎蛋白就在含乳蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物的溶液中，其中一些是很豐富的。設(shè)計(jì)100KD蛋白質(zhì)分級(jí)步驟，以減少污染乳蛋白質(zhì)的量，并制備用于色譜純化的人甲胎蛋白。
在進(jìn)行100KD分級(jí)前，包含感興趣蛋白質(zhì)的澄清乳必須進(jìn)行緩沖液交換以除去乳中可見(jiàn)的鹽。因此，一旦完成澄清，然后就可以把感興趣蛋白質(zhì)(例如重組人甲胎蛋白)用pH6.5的20mM磷酸緩沖液使用相同的30kD TFF盒滲濾5次。這種初步滲濾是必需的，以降低澄清乳中的鹽濃度。通過(guò)降低鹽濃度，重組人甲胎蛋白的流體力學(xué)半徑增加，蛋白質(zhì)就容易被100kD MWCO的HPTFF膜保留。其它乳蛋白質(zhì)(山羊白蛋白除外)不受與重組人甲胎蛋白相同的方式影響。因此，它們可以自由地通過(guò)100kD膜，這樣就被除去并作為廢物丟棄。
100kD蛋白質(zhì)分級(jí)的目的是在進(jìn)行色譜前除去不想要的乳蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和低分子量污染物。通過(guò)滲濾有效地除去污染物，可以減小在該方法剩余的色譜步驟中的負(fù)荷。
乳汁作為進(jìn)料流根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，HPTFF方法使用三個(gè)過(guò)濾單元操作，以從乳汁進(jìn)料流中澄清、濃縮和分級(jí)產(chǎn)物。該乳汁可以是包含生物藥物或其他感興趣分子的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)該系統(tǒng)使得它對(duì)感興趣分子具有高選擇性。澄清步驟從乳進(jìn)料流中除去較大的顆粒物，例如脂肪球和酪蛋白膠團(tuán)。濃縮/分級(jí)步驟除去大部分的小分子，包括乳糖、礦物質(zhì)和水，以增加產(chǎn)品的純度和減小產(chǎn)品的體積。TFF工藝的產(chǎn)物隨后被濃縮至適當(dāng)水平，以利于最佳的下游純化和整體產(chǎn)物穩(wěn)定性。然后把包含感興趣分子的該濃縮產(chǎn)物無(wú)菌過(guò)濾，以確保生物負(fù)荷(即內(nèi)毒素)最小化并增強(qiáng)感興趣分子的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，大量產(chǎn)物的純度將達(dá)到65％至85％，可以包含山羊抗體(來(lái)自轉(zhuǎn)基因山羊)、乳清蛋白(β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、和BSA)、和低水平的殘留脂肪和酪蛋白。這種部分純化的產(chǎn)物是用于常規(guī)下游色譜技術(shù)的理想起始原料，這些下游技術(shù)進(jìn)一步選擇并分離感興趣分子，所述分子可以包括但不限于在乳中生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)、在乳中生產(chǎn)的免疫球蛋白、或融合蛋白。
步驟1(澄清)轉(zhuǎn)到圖1，利用分批式微濾來(lái)澄清轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳，乳優(yōu)選來(lái)自羊或牛。將乳放入進(jìn)料罐中，并泵到環(huán)路中，將乳保留物濃縮2倍(見(jiàn)圖1的流程圖)。一旦完成濃縮，然后就滲濾乳保留物，以使得產(chǎn)物和低分子量蛋白質(zhì)、糖和礦物質(zhì)通過(guò)適當(dāng)孔徑的膜。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計(jì)這種操作進(jìn)行2到3小時(shí)，并每天處理1000升乳?？梢苑糯蟊景l(fā)明的技術(shù)和方法，可以生產(chǎn)的產(chǎn)物的總體體積取決于商業(yè)和/或治療上對(duì)特定的感興趣分子的需要。
步驟2(濃縮/分級(jí))還是參考圖1，用超濾法(“UF”)濃縮和分級(jí)步驟一的澄清滲出物。將澄清的滲出物流入U(xiǎn)F進(jìn)料罐中，并泵到環(huán)路中，將產(chǎn)物濃縮2倍。一旦開(kāi)始濃縮步驟，就將UF的滲出物放入步驟一澄清進(jìn)料罐中的乳保留物中。使得步驟一和二的規(guī)模和時(shí)間允許同時(shí)操作。UF的滲出物包含通過(guò)膜的小分子量蛋白質(zhì)、糖和礦物質(zhì)。一旦95％的產(chǎn)物積累在UF的保留物，即停止澄清，開(kāi)始濃縮/滲濾UF物料。將產(chǎn)物相對(duì)于初始乳體積進(jìn)行5-10倍濃縮，并將緩沖液加入U(xiǎn)F進(jìn)料罐中。這樣就洗除了大多數(shù)的小分子量蛋白質(zhì)、糖、和礦物質(zhì)。設(shè)計(jì)該操作進(jìn)行2.5到3.5小時(shí)，并每天可處理高達(dá)500升澄清滲出物。如上所述，可以放大本發(fā)明的技術(shù)和方法，可以生產(chǎn)的產(chǎn)物的總體體積取決于商業(yè)和/或治療上對(duì)特定的感興趣分子的需要。
步驟3(無(wú)菌過(guò)濾)根據(jù)圖1和本發(fā)明，然后把澄清的大量濃縮物無(wú)菌過(guò)濾。將所得50到100升UF保留物放入進(jìn)料罐中，將其泵吸通過(guò)死端絕對(duì)0.2μm MF過(guò)濾系統(tǒng)以除去大多數(shù)的生物負(fù)荷并增強(qiáng)產(chǎn)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。將產(chǎn)物泵吸通過(guò)本發(fā)明的過(guò)濾系統(tǒng)，然后可以直接填充到最終的包裝結(jié)構(gòu)中。在滿(mǎn)足凈室規(guī)范(如100級(jí)條件)的GMP設(shè)施中處理感興趣分子的條件下。設(shè)計(jì)該操作進(jìn)行0.5到1小時(shí)，并且每天可處理高達(dá)100L的澄清的大量中間體。如上所述，可以放大本發(fā)明的技術(shù)和方法，可以生產(chǎn)的產(chǎn)物的總體體積取決于商業(yè)和/或治療上對(duì)特定感興趣分子的需要。
實(shí)施例1乳用作澄清感興趣分子的進(jìn)料流下列數(shù)據(jù)提供了本發(fā)明的應(yīng)用，其提供了基于膜的方法來(lái)從生乳進(jìn)料流中澄清、濃縮、和分級(jí)轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的感興趣蛋白質(zhì)(例如人重組甲胎蛋白)。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例，提供乳用于處理的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是山羊，但也可以使用其它哺乳動(dòng)物，包括牛、兔、小鼠以及綿羊和豬。
已經(jīng)用微濾澄清用于蛋白質(zhì)分級(jí)的起始物料，然后留出一部分用于初步膜優(yōu)化研究。設(shè)計(jì)一組實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)這些參數(shù)中每一個(gè)的作用，并精確地找出從污染的乳蛋白質(zhì)中分離重組人甲胎蛋白的最佳條件。開(kāi)始時(shí)在某一時(shí)間改變一個(gè)參數(shù)，直至優(yōu)化完每一個(gè)參數(shù)，并顯示分級(jí)條件的適當(dāng)組合。選擇如下范圍的參數(shù)用于分級(jí)實(shí)驗(yàn)I.截留分子量(MWCO)50-100kDII.跨膜壓力(TMP) 5-30psiIII.澄清乳的pH和離子強(qiáng)度(20mM磷酸鹽pH6.5) 0M-1.0M NaClIV.澄清乳液濃縮因子(Cfac) 1X-4XV.滲濾體積的數(shù)目 12-20 DV′sVI.澄清乳批次 (見(jiàn)材料)VII.膜復(fù)原(見(jiàn)第VII節(jié))將TFF系統(tǒng)用0.1M NaOH消毒，用USP水沖洗，并用pH6.5的20mM磷酸鈉緩沖液平衡。測(cè)量并記錄初始的水滲透性比率。開(kāi)始時(shí)將4升澄清乳濃縮一定倍數(shù)并將體積減少至1升。然后用pH6.5的20mM磷酸鈉緩沖液滲濾該濃縮的澄清乳。將該乳滲濾到280nm處O.D.為4.0，而不是將其滲濾固定量的滲濾體積。該光吸收大致相當(dāng)于6g/l的總蛋白。選擇此總蛋白濃度是由于隨后色譜步驟對(duì)該工藝的限制。一旦完成滲濾后，就將該系統(tǒng)排干并用1升磷酸緩沖液沖洗，然后把磷酸緩沖液與最終的保留物合并。然后用0.2μm囊式過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾分級(jí)后的重組人甲胎蛋白。
然后用RPC分析分級(jí)后的重組人甲胎蛋白的總蛋白、AFP濃度和污染蛋白。此外，跑SDS凝膠來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)剩余的污染蛋白。
本發(fā)明的HPTFF系統(tǒng)由具有2個(gè)蠕動(dòng)泵的Pall Centramate四量器系統(tǒng)組成。第一個(gè)泵用于保留物的再循環(huán)，第二個(gè)泵用于滲出物的再循環(huán)。該泵吸方案被稱(chēng)作共流流動(dòng)(Co-Current flow)，參見(jiàn)圖1和2。它最通常用于沿膜的全路徑長(zhǎng)度平衡TMP，以確保分級(jí)更加均勻。
結(jié)果I.膜截留分子量(MWCO)


II.跨膜壓力(TMP)蛋白質(zhì)分級(jí)步驟的開(kāi)發(fā)包括在再循環(huán)模式中用100KD HPTFF進(jìn)行工藝優(yōu)化。開(kāi)始時(shí)通過(guò)比較TMP比流量(見(jiàn)下)來(lái)表征工藝條件。起始材料是用pH6.5的20mM磷酸緩沖液滲濾的澄清乳。緩沖液條件適合該分級(jí)，因?yàn)榈望}濃度增加rhAFP分子的保留。該優(yōu)化表明我們的最佳TMP應(yīng)當(dāng)在12到20psi之間，其在膜控制區(qū)之外并進(jìn)入膜被分層控制的過(guò)渡區(qū)。錯(cuò)流流速未進(jìn)一步優(yōu)化，而是保持在制造商推薦的0.6L/分/ft2。

一旦完成優(yōu)化，就可以確定一套運(yùn)行參數(shù)用于HPTFF分級(jí)。這些確定用于蛋白質(zhì)分級(jí)的運(yùn)行參數(shù)對(duì)于維持可重復(fù)的工藝是關(guān)鍵性的。需要監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵參數(shù)包括跨膜壓力、錯(cuò)流速度、和緩沖液條件。
III.澄清乳液pH和離子強(qiáng)度
IV.澄清乳的濃縮因子(CFac)此蛋白質(zhì)分級(jí)由初始4X濃縮以減小體積和節(jié)約滲濾所需的緩沖液量組成。工藝開(kāi)發(fā)期間開(kāi)始時(shí)未使用濃縮步驟，但后來(lái)證明這是必要的，因?yàn)橐?X滲濾需要的緩沖液體積太多。然后把濃縮后的澄清乳滲濾10-20倍體積。
以1X分級(jí)用pH6.5的20mM磷酸鈉緩沖液初步滲濾澄清的乳。由于從保留物中除去了污染蛋白，一旦開(kāi)始滲濾通量就開(kāi)始升高。




表3.HPTFF運(yùn)行參數(shù)以4X分級(jí)澄清乳被初步濃縮一定倍數(shù)，并把體積減小到初始體積的25％。在濃縮期間通量的初始下降可以參見(jiàn)該圖的DV0點(diǎn)。然后用pH6.5的20mM磷酸鈉緩沖液滲濾該濃縮的澄清乳20倍。由于從保留物中除去了污染蛋白，一旦開(kāi)始滲濾通量就開(kāi)始升高。然后用等體積的緩沖液從TFF系統(tǒng)中沖洗最終的4X濃縮物，將最終濃縮物減小到2倍于初始體積。


表5.TFF運(yùn)行參數(shù)

V.滲濾體積數(shù)用固定數(shù)的滲濾體積分級(jí)澄清乳的一個(gè)替代方案是滲濾至保留物降至280nm處的一個(gè)O.D.。由保留物在280nm的光吸收來(lái)確定停止?jié)B濾的準(zhǔn)確點(diǎn)。在4X濃縮中目標(biāo)吸光度是4.0AU。280nm光吸收4.0大致相當(dāng)于用RPC分析的6mg/ml總蛋白。這使得不論起始濃度如何，該工藝都能夠始終如一地產(chǎn)生相同總蛋白濃度的分級(jí)產(chǎn)物。在用20mM磷酸緩沖沖洗液1∶1稀釋后，最終總蛋白濃度的目標(biāo)設(shè)定為2.8-3.2mg/ml。

該圖立即顯示了滲濾體積對(duì)通量和滲濾對(duì)光吸收的趨勢(shì)。當(dāng)滲濾進(jìn)行時(shí)光吸收遵循大致的指數(shù)式衰減。一旦除去了大多數(shù)通過(guò)的蛋白質(zhì)，剩余的蛋白質(zhì)就構(gòu)成了最終分級(jí)產(chǎn)物。該最終產(chǎn)物典型地主要包含重組人甲胎蛋白、白蛋白、和酪蛋白。
表6.百分收率(根據(jù)RPC)

每個(gè)樣品準(zhǔn)備兩個(gè)稀釋并重復(fù)測(cè)試。濃度報(bào)告為四次注射的平均值。
RPC分析顯示兩類(lèi)重要的數(shù)據(jù)，重組人甲胎蛋白濃度和總蛋白濃度。上表顯示在分級(jí)開(kāi)始前重組人甲胎蛋白的初始濃度是0.61mg/ml。分級(jí)后，在2倍的濃縮因子下最終濃度是0.94mg/ml。假定目標(biāo)濃縮因子為2X，可以用以下方式計(jì)算最終收率。
％收率＝((最終濃度/濃縮因子)/初始濃度)×100％收率＝((0.94mg/ml/2)/0.61mg/ml)×100＝78％收率·注該收率僅是大致值，因?yàn)樗脻饪s因子僅是目標(biāo)值表7.總蛋白質(zhì)(根據(jù)RPC)

每個(gè)樣品準(zhǔn)備兩個(gè)稀釋并重復(fù)測(cè)試。濃度報(bào)告為四次注射的平均值。
用rpc測(cè)定最終重組人甲胎蛋白樣品的總蛋白濃度。這是隨后將用于柱加樣的信息。在4X濃縮下，最終分級(jí)重組人甲胎蛋白的目標(biāo)總蛋白濃度初步定為6mg/ml。然后用等體積的沖洗緩沖液稀釋分級(jí)的重組人甲胎蛋白，使得最終的目標(biāo)總蛋白濃度為3.0mg/ml。
蛋白質(zhì)純度(根據(jù)RPC和SDS PAGE)然后用RPC分析分級(jí)的重組人甲胎蛋白的污染蛋白。另外，進(jìn)行SDS PAGE來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)剩余的污染蛋白。
蛋白質(zhì)純度(根據(jù)RPC和SDS PAGE)以上RPC色譜圖有助于證明由100KD切向流膜進(jìn)行的蛋白質(zhì)分級(jí)。第一個(gè)RPC色譜圖顯示1.0mg/ml重組人甲胎蛋白純化參照具有4.2分鐘的洗脫時(shí)間。第二個(gè)RPC色譜圖顯示在蛋白質(zhì)分級(jí)前澄清的起始乳。第三個(gè)RPC色譜圖顯示分級(jí)的重組人甲胎蛋白(6號(hào)峰)和剩余的污染乳蛋白質(zhì)。1和2號(hào)峰是未鑒定的乳蛋白質(zhì)，3和5號(hào)峰是酪蛋白，4號(hào)峰是羊血清白蛋白，7號(hào)峰是高分子量乳蛋白質(zhì)。第二和第三個(gè)色譜圖的差異顯示由蛋白質(zhì)分級(jí)步驟除去的污染蛋白質(zhì)的相對(duì)量。



VI.膜恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化的透水性(NWP)是評(píng)價(jià)膜性能從運(yùn)行中恢復(fù)的量度。如果沒(méi)有測(cè)量膜清潔有效性的手段，膜性能將會(huì)隨膜壽命而喪失。測(cè)量新膜的NWP，并作為所有進(jìn)一步記錄的NWP數(shù)據(jù)的參照點(diǎn)。當(dāng)已經(jīng)恢復(fù)原始NWP的90％以上時(shí)，典型地認(rèn)為該膜是“潔凈的”。下圖顯示在開(kāi)發(fā)期間使用的一種Pall OS100C12盒的趨勢(shì)。
顯示使用未適當(dāng)清潔的盒的作用的最有效途徑是用堵塞的膜實(shí)際地進(jìn)行該工藝。下圖顯示膜NWP未恢復(fù)超過(guò)原NWP的60％時(shí)，3次分離的運(yùn)行中的工藝通量。運(yùn)行號(hào)081403A、081403B、081503A和081503B都顯示工藝通量在50-70LMH范圍。這四項(xiàng)運(yùn)行完成后，在50℃用0.5M NaOH和400ppm NaOCl徹底清潔膜。測(cè)量NWP，顯示已經(jīng)恢復(fù)到原NWP的90％以上。運(yùn)行號(hào)081803A、081803B、081903A都顯示工藝通量在110-130LMH范圍。這些工藝通量與運(yùn)行號(hào)082003A所表明的新膜的工藝通量相應(yīng)。
用SDS Page對(duì)每次運(yùn)行的最終分級(jí)產(chǎn)物進(jìn)行比較。盡管當(dāng)用堵塞膜時(shí)工藝通量顯著降低，但分級(jí)并未顯示出受到很大影響。該數(shù)據(jù)支持先前描述的NWP恢復(fù)模型是有效的并可以用于該分級(jí)工藝。

根據(jù)本發(fā)明，用HPTFF法從污染蛋白中分離出感興趣蛋白質(zhì)的目標(biāo)得以證實(shí)。該分級(jí)的目的是保留目標(biāo)蛋白(AFP)并過(guò)濾掉大多數(shù)的污染乳蛋白質(zhì)。RPC、總蛋白和SDS凝膠結(jié)果最終表明，污染乳蛋白質(zhì)的濃度可以有效降低。使用本發(fā)明的100KD切向流膜和方法使得除重組人甲胎蛋白和CSA之外的全部濃度都被降低。
膜截留分子量(MWCO)膜孔徑和化學(xué)性質(zhì)在分級(jí)有效性中發(fā)揮了重要的作用。評(píng)價(jià)幾種MWCO膜，包括30KD、50KD、70KD和100KD。如果MWCO太低例如是30KD，無(wú)論使用什么操作條件，污染蛋白都會(huì)被保留。使用該孔徑的分級(jí)不能有效地從重組人甲胎蛋白分級(jí)出污染蛋白。評(píng)價(jià)每種更大孔徑的保留性質(zhì)和選擇性。30kd、50kd、和70kd都被證明可以保留許多污染乳蛋白，而不能有效地用于該分級(jí)。在優(yōu)化前100kd膜在初始時(shí)顯示了產(chǎn)物的實(shí)質(zhì)性損失。該膜的孔徑被證明是可用的最大孔徑，然而仍能保留重組人甲胎蛋白。
各種類(lèi)型的膜，包括再生纖維素、聚丙烯腈(PAN)、和改性聚醚砜(PES)。每種膜都有它自身獨(dú)特的性質(zhì)組合，并能夠影響分級(jí)。一旦選定適當(dāng)?shù)哪た讖?，就評(píng)價(jià)該膜的類(lèi)型或化學(xué)性質(zhì)。由于其均勻的孔徑和中性膜電荷，選擇Pall Corp.Omega的改性聚醚砜(PES)。
跨膜壓力(TMP)在再循環(huán)模式中用100KD HPTFF膜確定最佳的跨膜壓力。起始材料是用pH6.5的20mM磷酸鹽緩沖液滲濾的澄清乳。該緩沖液條件適合此分級(jí)，因?yàn)榈望}濃度增加rhAFP分子的保留。優(yōu)化曲線表明工藝TMP應(yīng)當(dāng)是約12-20psi，恰好進(jìn)入過(guò)渡區(qū)。在膜控制區(qū)，更低的TMP放大了污染乳蛋白和膜之間的電荷相互作用，減少了它們的傳遞。在凝膠層控制區(qū)，更高的TMP驅(qū)使所有蛋白質(zhì)到表面，增加了總體溶液的質(zhì)量傳遞系數(shù)。這使得重組人甲胎蛋白回收降低和分級(jí)的效率降低。未進(jìn)一步優(yōu)化錯(cuò)流流速，而是保持在制造商所推薦的0.6L/分/ft2。
澄清乳的pH和離子強(qiáng)度重組人甲胎蛋白的等電點(diǎn)是約5.0，膜的等電點(diǎn)是約7.0。為了使重組人甲胎蛋白的保留最大化，選擇緩沖溶液的pH為6.0-6.5。在這些條件下，膜和重組人甲胎蛋白分子都具有負(fù)電荷并相互排斥。離子強(qiáng)度在重組人甲胎蛋白分子的保留性質(zhì)中發(fā)揮著顯著作用。在提高鹽條件(＞1.0ml NaCl)的條件下在大多數(shù)操作條件下分子可以更自由地通過(guò)100kd膜的孔。在鹽條件降低的條件下，情況正好相反；多數(shù)的重組人甲胎蛋白分子被保留。已知有兩種因素對(duì)此現(xiàn)象有貢獻(xiàn)。鹽濃度的降低增加了蛋白質(zhì)和膜之間的電荷作用。另外，鹽濃度的降低導(dǎo)致了重組人甲胎蛋白周?chē)畬拥摹叭苊洝毙?yīng)。這些因素組合的效果導(dǎo)致了該分子可以被100KD膜所保留，而正常情況下并非如此。
澄清乳濃縮因子(Cfac)澄清乳的濃縮因子在初始時(shí)是全乳濃度的2倍。然后用本發(fā)明的100KD HPTFF膜系統(tǒng)分級(jí)該澄清乳。典型地，滲濾(CD)的最佳點(diǎn)是由最大凝膠層濃度(CG)乘以CG/e的值確定的CD＝CG/e＝0.37CG用于分級(jí)的滲濾部分的最佳濃度并不容易計(jì)算，因?yàn)楫?dāng)澄清乳被濃縮時(shí)顯著量的蛋白質(zhì)被去除。因此CG總是在改變的，而如半對(duì)數(shù)圖預(yù)測(cè)的那樣總體蛋白的濃度并不增加。
因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)達(dá)到滲濾的最佳點(diǎn)。以1X、2X和4X來(lái)滲濾該澄清乳。在分級(jí)前增加濃縮因子的效果增加了達(dá)到相同純度水平所需的滲濾體積數(shù)。然而，4X濃縮的好處在于即使?jié)B濾體積翻倍，仍然可以實(shí)現(xiàn)緩沖液需求量降低50％。
滲濾體積數(shù)用于分級(jí)重組人甲胎蛋白的滲濾體積數(shù)是由除去的污染蛋白的量小于損失于滲出物中的重組人甲胎蛋白的量的點(diǎn)決定的。該點(diǎn)可以通過(guò)觀察SDS PAGE信息來(lái)估計(jì)。1X濃縮所需的初步滲濾體積數(shù)是約10DV′s，4X濃縮則為20DV′s。最有效的方案經(jīng)證明是后者，即4X濃縮下20DV′s。
在初步Q-柱開(kāi)發(fā)后選擇改變滲濾終點(diǎn)。在運(yùn)行之間監(jiān)測(cè)總蛋白的量，這被證明是更有效預(yù)測(cè)使用適當(dāng)數(shù)量滲濾體積的方式。
選用于分級(jí)的最終方法是滲濾至保留物降至280nm測(cè)定的某一O.D.以下。根據(jù)280nm處保留物的光吸收來(lái)確定停止?jié)B濾的準(zhǔn)確點(diǎn)。在4X濃縮時(shí)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)光吸收為4.0AU。在280nm處的4.0光吸收大致相當(dāng)于用RPC分析的6mg/ml總蛋白。這使得不論起始濃度如何，該方法都能夠始終如一地產(chǎn)生相同總蛋白濃度的分級(jí)產(chǎn)物。該總蛋白濃度的選擇是由于隨后的陰離子交換色譜步驟對(duì)工藝的限制。污染蛋白對(duì)AFP的比例會(huì)影響Q-柱的負(fù)荷，因此必須在運(yùn)行之間保持一致。在用20mM磷酸緩沖沖洗液1∶1稀釋后，Q-負(fù)荷的最終總蛋白目標(biāo)濃度設(shè)定為2.8-3.2mg/ml。
澄清乳批次用于分級(jí)的澄清乳的批次對(duì)于達(dá)到相同終點(diǎn)(O.D.@280nm)需要的滲濾量有影響。在泌乳早期收集的澄清乳與在泌乳結(jié)束時(shí)收集的批次相比，總蛋白的量多50％。然而在澄清批次中的產(chǎn)物量?jī)A向于保持恒定。蛋白質(zhì)濃度的差別可能是由于在泌乳早期污染乳蛋白的量較高。這些早期批次的澄清乳與晚期批次的乳相比相應(yīng)地需要多滲濾約50％。用包括RPC、SDS PAGE和Bradford總蛋白測(cè)定的分析均表明，不論使用何種澄清材料，所有的分級(jí)批次之間均具有相似的結(jié)果。
膜恢復(fù)-標(biāo)準(zhǔn)化的透水性(NWP)HPTFF盒系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成用于在長(zhǎng)達(dá)一年期間重復(fù)使用。因此，在每次運(yùn)行以后有效地清洗膜是重要的。用于100KD膜的清洗溶液是40-50℃的0.5M NaOH和400ppm漂白劑，沖洗1小時(shí)。該清洗方案被證明可以有效恢復(fù)膜的標(biāo)準(zhǔn)化透水性(NWP)。如果在當(dāng)采用新盒時(shí)原NWP的90％之內(nèi)，就認(rèn)為膜的NMP已經(jīng)“恢復(fù)”。循環(huán)數(shù)對(duì)NMP的曲線圖表明，膜應(yīng)當(dāng)具有至少運(yùn)行60次的預(yù)期壽命。
為進(jìn)一步證明蛋白質(zhì)分級(jí)是可靠的并且膜恢復(fù)能預(yù)測(cè)膜性能，故意堵塞該膜，然后用于三次蛋白質(zhì)分級(jí)。工藝通量約為對(duì)應(yīng)清潔膜的一半，但令人驚奇地，分級(jí)效率并沒(méi)有改變。用RPC和SDS PAGE分析分級(jí)后的材料顯示了一致性。該數(shù)據(jù)表明，水通量可以很好地在對(duì)其規(guī)定的90％恢復(fù)之下。
從該實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)表明，用本發(fā)明的100KD MWCO HPTFF系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)，能有效地降低污染乳蛋白的濃度。該工藝在液體通量為80至100 LMH時(shí)可以有效地運(yùn)行，當(dāng)與其他的上流純化方法例如色譜法比較時(shí)需要最低限度的設(shè)備投資。在初始時(shí)澄清乳中重組人甲胎蛋白的相對(duì)純度為6-10％，經(jīng)分級(jí)后上升到30％純度。該工藝的收率持續(xù)保持在80％的范圍，與隨后的純化步驟相當(dāng)。
根據(jù)本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)策略是確定可以大規(guī)模控制的過(guò)濾工藝變量(CM、V、TMP、T)之間的關(guān)系，其中V是流速，例如可以控制產(chǎn)物通過(guò)、保留和質(zhì)量。通過(guò)一系列單獨(dú)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)確定其關(guān)系，并確定了最佳的操作窗。將這些最佳參數(shù)組合到系列實(shí)驗(yàn)中，來(lái)研究總收率和質(zhì)量平衡。通過(guò)產(chǎn)品收率、澄清度和通量效率來(lái)確定性能。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模系列實(shí)驗(yàn)中調(diào)查了如下的工藝變量。
濃縮(Cm)用經(jīng)驗(yàn)件產(chǎn)物通過(guò)數(shù)據(jù)來(lái)確定最佳的乳濃縮因子。產(chǎn)物通量(Jp)表示在固定時(shí)間內(nèi)每平方米的產(chǎn)物通過(guò)率。產(chǎn)物通量將根據(jù)澄清步驟(操作單元#1)期間的濃縮因子關(guān)系測(cè)量。
仍參考圖1，如下提供了對(duì)本發(fā)明要素的解釋說(shuō)明。
圖1要素工藝流程說(shuō)明流程號(hào)說(shuō)明1a原始轉(zhuǎn)基因乳1b微濾CIP溶液2a滲濾后排出的微濾保留物2b排出的使用后CIP溶液3 工藝中MF保留物(環(huán)路)4 MF CIP再循環(huán)(環(huán)路)5 微濾濾出物6 超濾CIP溶液7 排出的使用后CIP溶液8 超濾進(jìn)料(微濾濾出物)9 工藝中UF保留物(環(huán)路)10超濾滲出物(用于滲濾MF保留物)11濃縮的澄清乳12UF CIP再循環(huán)(環(huán)路)13AF CIP溶液14無(wú)菌濾器進(jìn)料15生物負(fù)荷減少的濃縮澄清乳16排出的使用后CIP溶液就其最廣泛方面，此處提供的本發(fā)明所關(guān)注的高效切向流過(guò)濾工藝包括在某些TMP和通量條件下將待分離物質(zhì)的混合物在設(shè)計(jì)用于HPTFF類(lèi)型系統(tǒng)的裝置或模塊中通過(guò)一或多個(gè)過(guò)濾膜。將TMP保持在通量對(duì)TMP曲線的壓力依賴(lài)區(qū)的范圍內(nèi)，即在不大于轉(zhuǎn)變點(diǎn)TMP值的范圍內(nèi)。因此，進(jìn)行過(guò)濾的通量范圍是在轉(zhuǎn)變點(diǎn)通量的約5％至100％。見(jiàn)下圖A和B，其中沿轉(zhuǎn)變點(diǎn)描繪通量對(duì)TMP曲線。因此，膜選擇性保留感興趣物質(zhì)作為保留物，而較小的物質(zhì)作為濾出物通過(guò)膜，或者感興趣物質(zhì)作為濾出物通過(guò)膜而混合物中的污染物被膜保留。應(yīng)當(dāng)注意的是，對(duì)于超濾的感興趣物質(zhì)優(yōu)選是分子量至少約1000道爾頓的生物大分子，最優(yōu)選多肽和蛋白質(zhì)。也優(yōu)選感興趣物質(zhì)比要與之分離的物質(zhì)即污染物大不到10倍，或者比要與之分離的物質(zhì)小不到10倍。
此處使用的表述“將濾出物通過(guò)與過(guò)濾室中流體方向平行的濾出物室再循環(huán)的手段”表示一種機(jī)構(gòu)或裝置，其指導(dǎo)濾出物室的部分流體流動(dòng)，其流動(dòng)方向與流體從過(guò)濾室入口至出口通過(guò)相鄰過(guò)濾室流動(dòng)方向平行并且基本相同(允許出現(xiàn)一些漩渦)。優(yōu)選地，該手段是泵吸手段。
應(yīng)當(dāng)注意的是，TMP不隨分級(jí)時(shí)間而增加，而且在過(guò)濾期間不必保持恒定。TMP可以保持大致恒定或者也可以隨過(guò)濾進(jìn)行而降低。如果濃縮保留物，那么優(yōu)選在濃縮步驟的過(guò)程中降低TMP。
每種膜優(yōu)選具有能保持粒徑高達(dá)約10微米、更優(yōu)選1KDa到10微米的物質(zhì)的孔徑。可以用超濾分離的物質(zhì)的例子包括蛋白質(zhì)、多肽、膠體、免疫球蛋白、融合蛋白、免疫球蛋白片段、支原體、內(nèi)毒素、病毒、氨基酸、DNA、RNA和碳水化合物?？梢杂梦V分離的物質(zhì)的例子包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和微生物，例如細(xì)菌。
由于膜過(guò)濾器并非完美，可能有一些孔或缺陷足夠大使一些期望的保留分子濾過(guò)，因此此處一個(gè)優(yōu)選的方面是利用超過(guò)一個(gè)相同孔徑的膜，其中放置該膜以使其互相平行層疊，優(yōu)選一層在另一層的上面。優(yōu)選用于該目的的膜的數(shù)量是2。
盡管在上述工藝中保持壓力的適當(dāng)通量范圍為約5到100％，通量越低，需要的膜表面積就越大。因此，為了使膜的成本最小，優(yōu)選在操作壓力使得通量在譜圖的較高端。優(yōu)選的范圍是轉(zhuǎn)換點(diǎn)通量的約50到100％，更優(yōu)選的范圍是轉(zhuǎn)換點(diǎn)通量的約75到100％。
盡管不需要沿膜表面維持TMP基本恒定，但優(yōu)選維持TMP基本恒定。這樣的條件通?？梢酝ㄟ^(guò)在膜的濾出物側(cè)建立壓力梯度來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，按照與過(guò)濾裝置的保留物隔室中混合物流動(dòng)相同的方向或平行方向?yàn)V出物再循環(huán)通過(guò)該裝置的濾出物隔室。調(diào)節(jié)再循環(huán)材料的進(jìn)口和出口壓力以使得跨濾出物隔室的壓力降等于跨保留物隔室的壓力降。
幾種實(shí)用手段可用于實(shí)現(xiàn)該濾出物壓力梯度。優(yōu)選實(shí)施方案的一些例子是如附圖2A和2B中所示結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)，待分離的溶質(zhì)通過(guò)進(jìn)口管36進(jìn)入裝置，如果待分離產(chǎn)物在發(fā)酵液中，那么進(jìn)口管36與發(fā)酵罐(未顯示)連通。它還可以與保存轉(zhuǎn)基因(Tg)乳或在收獲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞以后的細(xì)胞裂解物或上清液的容器(未顯示)連通。通過(guò)泵手段40調(diào)節(jié)管36的流速。泵可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的泵，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的過(guò)濾性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)流速。
在本發(fā)明的微濾單元30中，任選使用壓力計(jì)45來(lái)測(cè)量從泵手段40流動(dòng)的進(jìn)口壓力。進(jìn)口管36中的流體進(jìn)入過(guò)濾單元50。該過(guò)濾單元50包括在其進(jìn)入頂部的過(guò)濾室51和在出口部分的濾出物室52。這兩個(gè)隔室用過(guò)濾膜55分開(kāi)。進(jìn)口流體流動(dòng)方向平行于過(guò)濾室51內(nèi)的過(guò)濾膜55。過(guò)濾室51在上端接受包含溶質(zhì)的混合物，其中含有感興趣分子。比目標(biāo)分子小的分子能通過(guò)膜55進(jìn)入濾出物或排出室52。濃縮的保留物從過(guò)濾單元50經(jīng)出口管60通過(guò)，如果必要可以用微濾(MF)膜65收集并進(jìn)一步處理該保留物，以獲得期望的感興趣物質(zhì)，包括通過(guò)另外的膜。在整個(gè)過(guò)程期間，并為了質(zhì)量控制的目的，本發(fā)明也包括一系列的樣品點(diǎn)99，以允許監(jiān)測(cè)分子濃度、pH和污染-“路徑B”。作為替代，保留物流可以循環(huán)回產(chǎn)生混合物的罐或發(fā)酵罐35“路徑A”，通過(guò)進(jìn)口管36而被再循環(huán)以進(jìn)行進(jìn)一步純化。
通過(guò)膜55進(jìn)入濾出物室52的包含感興趣分子的溶液也可以通過(guò)在過(guò)濾單元50相同末端的出口管70離開(kāi)過(guò)濾單元50，而保留物流體則經(jīng)出口管60流出。但是流過(guò)出口管70的溶液和感興趣分子被送回罐35中，并用壓力計(jì)72測(cè)量以進(jìn)一步處理。
類(lèi)似地，如圖2B所示，也考慮到根據(jù)本發(fā)明的雙重TFF系統(tǒng)。
在圖2A所示的結(jié)構(gòu)中，膜需要相對(duì)于室51和52放置來(lái)提供指定的流速和跨膜壓力差。用于本發(fā)明工藝的膜一般是平片狀、卷繞片狀、圓筒狀、同心圓筒狀、不同橫截面的管狀和其他結(jié)構(gòu)，其單個(gè)組裝或成組組裝，并在過(guò)濾單元內(nèi)串聯(lián)或并聯(lián)。一般構(gòu)建該裝置，使得過(guò)濾和濾出物室運(yùn)行在膜長(zhǎng)度上。
合適的膜能把期望物質(zhì)與混合物中不期望物質(zhì)分離開(kāi)而基本上沒(méi)有堵塞問(wèn)題且是在足以使系統(tǒng)連續(xù)操作的速率。其實(shí)例包括孔徑典型地為0.1到10微米的微孔膜，并可以使得它保留比規(guī)定直徑大的所有顆粒。根據(jù)本發(fā)明用于微濾應(yīng)用和TFF應(yīng)用的膜優(yōu)選都是陶瓷的。超濾膜具有更小的孔，并根據(jù)所要保留的蛋白質(zhì)的大小來(lái)表征?？梢垣@得從1000至1,000,000道爾頓名義分子量限逐漸增加的膜。
超濾膜最通常適用于本發(fā)明工藝中。超濾膜一般是非對(duì)稱(chēng)的，其上游表面上具有負(fù)責(zé)其分離能力的薄膜或皮膚。這些膜通常是由再生纖維素或聚砜制成的。
切向流過(guò)濾系統(tǒng)80的膜過(guò)濾器可以根據(jù)待處理液體體積和以多種不同孔徑作為不同構(gòu)造的單元提供。在相對(duì)較大的范圍內(nèi)，特別適用于本發(fā)明的是那些已知的、商業(yè)可用的切向流過(guò)濾單元。
在一個(gè)替代性和優(yōu)選的裝置中，并由于如上所述的理由，附圖2A的微濾單元30包括多個(gè)、優(yōu)選二個(gè)濾膜，如膜56和57。這些膜按照平行結(jié)構(gòu)層疊。
本發(fā)明也包括多級(jí)串聯(lián)工藝，其中來(lái)自上述工藝的濾出物在第二個(gè)切向流過(guò)濾裝置中通過(guò)比第一個(gè)裝置中膜孔徑更小的濾膜，該第二過(guò)濾的濾出物再循環(huán)回第一裝置中，并重復(fù)該工藝。
適用于本發(fā)明工藝或與微濾單元30聯(lián)合使用的一種切向流系統(tǒng)80如附圖2B所示。在此，第一容器85經(jīng)進(jìn)口管90與位于過(guò)濾單元95中的過(guò)濾室96相連。第一輸入泵手段100位于第一容器85和過(guò)濾室96之間。過(guò)濾室96經(jīng)出口管110與第一容器85相連。在過(guò)濾單元95內(nèi)，過(guò)濾室96通過(guò)第一濾膜115與直接位于其下的第一濾出物室97分隔開(kāi)。第一濾出物室97具有出口管98，其與室97的入口相連，且具有位于管98內(nèi)的濾出物泵手段120。與出口管98相連的管45也與第二容器120相連。
該容器120經(jīng)進(jìn)口管125與位于第二過(guò)濾單元130中的第二過(guò)濾室127相連。第二輸入泵手段133位于第二容器120和過(guò)濾室127之間。在過(guò)濾單元130內(nèi)，過(guò)濾室127通過(guò)第二過(guò)濾膜128與直接位于其下的第二濾出物室129分隔開(kāi)。第二濾出物室129具有出口管135，其與室129的進(jìn)口相連，且具有位于管135中的過(guò)濾泵手段140。與出口管135相連的管1255也與第三容器150相連。
該容器150經(jīng)進(jìn)口管155與位于第三過(guò)濾單元160中的第三過(guò)濾室157相連。第三輸入泵手段165位于第三容器150和過(guò)濾室157之間。在過(guò)濾單元160內(nèi)，過(guò)濾室157通過(guò)第三過(guò)濾膜165與直接位于其下的第三濾出物室159分隔開(kāi)。第三濾出物室159具有與管155相連的出口管170，其與第一容器150相連，以使得濾出物再循環(huán)到該原罐中。也提供樣品點(diǎn)99以及壓力計(jì)175以監(jiān)測(cè)該工藝。
本發(fā)明的工藝非常適用于商業(yè)規(guī)模。它可以按照批次或連續(xù)操作，或者以半連續(xù)方式運(yùn)行，例如以包含期望物質(zhì)的溶液的連續(xù)流動(dòng)為基礎(chǔ)通過(guò)切向流濾器，直至全部的大批物質(zhì)因而被過(guò)濾，在過(guò)濾階段之間可以插入清洗步驟。然后處理新的一批溶液。用這種方法，可以進(jìn)行連續(xù)循環(huán)處理，在相對(duì)較短的時(shí)間里得到純度可接受的大量期望產(chǎn)物。
此處所述的切向流過(guò)濾的獨(dú)特特征，以及它提供連續(xù)過(guò)濾含固體溶液而無(wú)濾器堵塞的能力，導(dǎo)致一種非常有利的可以連續(xù)基礎(chǔ)和商業(yè)規(guī)模使用的用于分離和純化生物反應(yīng)產(chǎn)物的工藝。此外，該工藝可用于寬范圍的生物分子，例如轉(zhuǎn)基因來(lái)源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、抗體、細(xì)胞片段和細(xì)胞培養(yǎng)裂解物。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不是進(jìn)行限制。在這些實(shí)施例中，引用的所有參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都明確并入本文。
澄清模塊可用于本發(fā)明的膜可以以幾種形式制造成生產(chǎn)模塊。用于切向流過(guò)濾的最通常的形式是-平板-螺旋卷繞-中空纖維這些模塊中每種的基本流路如附圖3所示，其舉例說(shuō)明進(jìn)料流通過(guò)不同的HPTFF和TFF模塊的流體流路。
經(jīng)常在螺旋卷繞和平板模塊中進(jìn)料和/或?yàn)V出物通道內(nèi)插入網(wǎng)板(screen)，以增加通道中的湍流并降低濃差極化。在中空纖維模塊中則沒(méi)有此項(xiàng)選擇。促進(jìn)湍流的通道在較低錯(cuò)流速率下具有較高的質(zhì)量傳遞系數(shù)，意味著在泵入需求較低的情況下實(shí)現(xiàn)了較高的通量。因此促進(jìn)湍流的進(jìn)料通道比開(kāi)放通道更高效。在平板模塊中使用懸浮網(wǎng)板可以帶來(lái)開(kāi)放通道和促進(jìn)湍流通道的一些好處。附圖7表明了不同類(lèi)型的通道結(jié)構(gòu)。
平板(經(jīng)常稱(chēng)作盒)在平板膜模塊中，數(shù)層膜或者與或者無(wú)交替排列的分離網(wǎng)板層堆疊在一起，然后將其密封到包裝中。進(jìn)料流體被泵入到在堆疊的一個(gè)末端的交替通道中，濾出物通過(guò)膜進(jìn)入濾出物通道中。平板模塊通常具有較高的填充密度(每底面面積的膜面積)，允許線性放大，其中一些提供了開(kāi)放或促進(jìn)湍流通道的選擇。
螺旋卷繞在螺旋卷繞模塊中，交替的膜和分離網(wǎng)板層卷繞中空的中間核心。進(jìn)料流被泵入一端并沿卷筒軸線向下流動(dòng)。濾出物通過(guò)膜并相對(duì)于核心轉(zhuǎn)繞，其在此被除去。分離網(wǎng)板增加流路中湍流，使其成為比中空纖維更高效的模塊。螺旋卷繞模塊的一個(gè)缺點(diǎn)是，它們不可以線性放大，因?yàn)檫M(jìn)料流路長(zhǎng)度(卷筒長(zhǎng)度)或?yàn)V出物流路長(zhǎng)度(卷筒寬度)必須按比例變動(dòng)。
中空纖維中空纖維模塊由束狀膜管組成，膜管具有窄直徑，典型地在0.1至2.0mm范圍。在中空纖維模塊中，進(jìn)料流被泵入管的內(nèi)腔(內(nèi)部)中，濾出物通過(guò)膜到殼側(cè)，在此其被除去。由于進(jìn)料流路非常開(kāi)放，甚至在中等錯(cuò)流速率只產(chǎn)生較低剪切力。盡管這對(duì)于對(duì)剪切力高度敏感的產(chǎn)物有用，但一般來(lái)說(shuō)由于它需要非常高的泵能力來(lái)實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性通量將降低模塊的效率。
對(duì)于所有用微濾系統(tǒng)完成的實(shí)驗(yàn)，除了進(jìn)料-和-流出實(shí)驗(yàn)，使用的設(shè)備如下60lpm泵，對(duì)相關(guān)泵校準(zhǔn)(泵曲線)1″OD不銹鋼潔凈管0.2sqft或1.5sqft的0.2μm孔徑陶瓷膜具有一個(gè)1/2″出口的不銹鋼潔凈膜支架1/4″ID柔韌的滲出物管在保留物線上的隔膜閥2個(gè)壓力計(jì)鋼制1.2 L進(jìn)料儲(chǔ)器3/4″ID柔韌的保留物管。
對(duì)于所有HPTFF實(shí)驗(yàn)，用下面的設(shè)備配合前述設(shè)備最大輸出800mLPM的隔膜閥在所有線上的1/4″ID柔韌的耐壓管1個(gè)用于測(cè)量進(jìn)料壓力的壓力計(jì)在保留物和滲出物線上的2個(gè)隔膜閥0.2sqft或1sqft的30kDa NMWCO PES Pall Filtron Centramate膜不銹鋼P(yáng)all Filtron Centramate膜支架1個(gè)與滲出物口相連的不銹鋼u-形彎管。
膜選擇選用于本發(fā)明HPTFF系統(tǒng)的膜選自具有不同幾何形狀和名義截留分子量的膜。先前的研究對(duì)于在澄清步驟中使用聚合物基的高M(jìn)WCO UF膜、以及陶瓷膜進(jìn)行了探索。將乳向下濃縮2X，然后進(jìn)行HPTFF來(lái)實(shí)驗(yàn)所有的膜。然后通過(guò)多重運(yùn)行和清洗來(lái)實(shí)驗(yàn)它們，分析這些膜的可復(fù)用性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化的水通量維持在新膜的80％以上時(shí)，即認(rèn)為該膜被恢復(fù)，可用于下一次處理。平片聚合物膜盒在使用3次后，都不能維持恢復(fù)目標(biāo)水通量，而陶瓷膜則可以恢復(fù)超過(guò)60次。這是由于能夠用更高化學(xué)濃度和更高溫的更苛刻條件清洗陶瓷。在超過(guò)20個(gè)循環(huán)后，30kDa超濾膜仍可以維持恢復(fù)高水通量。
用0.2μm名義陶瓷管狀膜來(lái)測(cè)試用于澄清乳液和通過(guò)感興趣蛋白質(zhì)的第一單元。用30kDa截留分子量的平片超濾膜來(lái)測(cè)試用于捕獲感興趣分子的第二系統(tǒng)。
分析方法通過(guò)蛋白質(zhì)A HPLC分析來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品中的樣品中的重組人甲胎蛋白(rhAFP)含量，通過(guò)SDS-PAGE分析其降解，通過(guò)等電點(diǎn)聚焦(IEF)來(lái)分析其修飾，通過(guò)體積排阻色譜(SEC)來(lái)分析其聚集。
操作使用0.2μm截留分子量的陶瓷微濾膜進(jìn)行一系列的控制實(shí)驗(yàn)，希望了解工藝操作關(guān)系。測(cè)量產(chǎn)品通量(Jp)，因?yàn)樗c流速(u)、跨膜壓力(TMP)、溫度(t)和乳濃度(c)有關(guān)。一旦確定了關(guān)系，就可以確定最佳的操作窗，并試驗(yàn)經(jīng)修改后的工藝。采集樣品，并收集質(zhì)量平衡數(shù)據(jù)用于分析初始產(chǎn)物收率和通量規(guī)模。(請(qǐng)參見(jiàn)附圖2A和2B)。
溫度實(shí)驗(yàn)其目的是確定操作溫度的范圍，這種操作溫度得到以最低體積通過(guò)0.2μm、3mm通道陶瓷膜的最佳rhAFP通量。為了在工藝運(yùn)行期間用SDS-PAGE和Western印跡分析rhAFP降解，在合并乳之前測(cè)定各部分乳的pH。將乳合并入MF進(jìn)料罐，記錄總體積。此時(shí)，將MF泵控制器從20Hz調(diào)高到45Hz(從約5L/分到約20L)。記錄每個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的所有參數(shù)，例如溫度、壓力、錯(cuò)流流速、滲出物流速、和體積。在再循環(huán)(路徑A)中運(yùn)行該MF環(huán)路5分鐘，把跨膜壓調(diào)整到12psig并再循環(huán)(路徑A)5分鐘(溫度維持在20℃)。滲出物線指向排出，直至乳相對(duì)于原始乳體積被2X濃縮(收集滲出物)。溫度維持在20℃。從進(jìn)料儲(chǔ)器和滲出物線中取樣品2和3。然后滲出線返回路徑A中，并再循環(huán)10分鐘。取樣品4和5。把溫度上升到25℃。然后把系統(tǒng)再循環(huán)10分鐘，取樣品6和7。把溫度上升到30℃。然后把系統(tǒng)再循環(huán)10分鐘，取樣品8和9。把溫度上升到35℃。然后把系統(tǒng)再循環(huán)10分鐘，取樣品10和11。把溫度上升到40℃。然后把系統(tǒng)再循環(huán)10分鐘，取樣品12和13。然后關(guān)閉泵，把樣品保存在2-8℃并送去定量。用IEF分析樣品。
MF乳濃縮實(shí)驗(yàn)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本實(shí)驗(yàn)的目的是確定初始乳濃度范圍，該初始濃度得到以最低體積通過(guò)0.2μm、3mm通道陶瓷MF膜的感興趣蛋白質(zhì)的最佳通量。
為了操作，在合并乳之前測(cè)定各部分乳的pH。把乳合并入MF進(jìn)料罐，記錄總體積。此時(shí)，將MF泵控制器從20Hz調(diào)高到45Hz(從約5L/分到約20L)。記錄每個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的所有參數(shù)，例如溫度、壓力、錯(cuò)流流速、滲出物流速、和體積。在再循環(huán)(路徑A)中運(yùn)行該MF環(huán)路5分鐘，把跨膜壓調(diào)節(jié)到12psig，并再循環(huán)(路徑A)5分鐘(溫度維持在20℃)。把跨膜壓調(diào)節(jié)到15psig，并再循環(huán)(路徑A)5分鐘。滲出物線指向排出，直至乳被濃縮，收集550ml滲出物，然后把滲出物線返回路徑A。(再循環(huán)10分鐘)。分別從進(jìn)料儲(chǔ)器和滲出物線中取樣品2和3。
將滲出物線用于路徑B，向進(jìn)料儲(chǔ)器中加入600ml乳。滲出物線指向排出，直至乳被濃縮，收集500ml滲出物，然后把滲出物線返回路徑A。(再循環(huán)10分鐘)。分別從進(jìn)料儲(chǔ)器和滲出物線中取樣品4和5。然后將滲出物線指向路徑B，向進(jìn)料儲(chǔ)器中加入500ml乳。滲出物線指向排出，直至乳被濃縮，收集500ml滲出物，然后把滲出物線返回路徑A。(再循環(huán)10分鐘)。分別從進(jìn)料儲(chǔ)器和滲出物線中取樣品6和7。然后將滲出物線指向路徑B，向進(jìn)料儲(chǔ)器中加入380ml乳。滲出物線指向排出，直至乳被濃縮，收集400ml滲出物，然后把滲出物線返回路徑A。(再循環(huán)10分鐘)。分別從進(jìn)料儲(chǔ)器和滲出物線中取樣品8和9。然后關(guān)閉泵，把樣品保存在2-8℃，用于定量感興趣蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)A分析、SDS-PAGE和Western分析其降解和聚集，用SEC分析聚集，和用IEF分析等電點(diǎn)遷移。
通過(guò)從生乳中除去顆粒物例如脂肪、酪蛋白膠團(tuán)和細(xì)菌，使用HPTFF作為在乳基質(zhì)中澄清和穩(wěn)定rhAFP的工藝。在生物技術(shù)和乳品工業(yè)中以有限的方式使用HPTFF來(lái)除去雜質(zhì)和濃縮產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，為了有效使用HPTFF，重要的是選擇適當(dāng)?shù)哪ぃ瑑?yōu)化工藝參數(shù)(溫度、跨膜壓力、錯(cuò)流流速和乳濃度)以獲得高產(chǎn)物通量，開(kāi)發(fā)清洗和保存方法來(lái)確保膜的使用期限較長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)的基本參數(shù)根據(jù)本發(fā)明如此處所述，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因山羊奶中以驗(yàn)證前述的操作參數(shù)。也研究了膜的清洗和保存條件。在完成HPTFF工藝后，還開(kāi)發(fā)了無(wú)菌過(guò)濾步驟以從含感興趣蛋白質(zhì)的澄清乳中除去殘余的任何細(xì)菌。然后把工藝信息轉(zhuǎn)用于中試設(shè)備上，在其上進(jìn)行初步的工程運(yùn)行。一些工藝設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)包括，不使用添加劑以免需要注射用水、膜使用期限長(zhǎng)、高收率、和處理時(shí)間短。本發(fā)明的工藝優(yōu)選設(shè)計(jì)成可放大用于中試和生產(chǎn)操作。
非轉(zhuǎn)基因進(jìn)料-和-流出實(shí)驗(yàn)用非轉(zhuǎn)基因乳來(lái)分析用0.2μm陶瓷微濾膜濃縮期間的液體通量衰減，因?yàn)榭捎玫姆寝D(zhuǎn)基因乳供應(yīng)非常充足。用于該實(shí)驗(yàn)的設(shè)備包括與微濾實(shí)驗(yàn)所述相同的設(shè)備，但還需要增加第二進(jìn)料儲(chǔ)器和進(jìn)料泵，以使乳液以與滲出物流出膜相同的速率流進(jìn)微濾系統(tǒng)的進(jìn)料儲(chǔ)器中。設(shè)備示意圖是 從圖A可見(jiàn)，用1500ml乳填充進(jìn)料儲(chǔ)器，以45Hz啟動(dòng)泵。在再循環(huán)中運(yùn)行該系統(tǒng)10分鐘，而不施加保留物壓力。記錄所有參數(shù)。然后把保留物壓力增加到10psig，使得跨膜壓力為11psig。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間通過(guò)調(diào)節(jié)保留物閥來(lái)保持跨膜壓力恒定。排出滲出物，開(kāi)啟第二個(gè)泵以與除去滲出物相同的速率向進(jìn)料儲(chǔ)器中泵入鮮乳，保持進(jìn)料儲(chǔ)器中體積恒定。每隔5-10分鐘記錄所有參數(shù)，調(diào)節(jié)第二個(gè)泵的速度以保持進(jìn)料儲(chǔ)器中乳水平恒定。運(yùn)行該試驗(yàn)直至乳被濃縮5.37X或82％。
膜清洗使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑捶桨敢员ＷC循環(huán)操作期間膜的水通量恢復(fù)較高。模擬乳品工業(yè)中標(biāo)準(zhǔn)化膜清洗來(lái)設(shè)計(jì)清洗步驟，并考慮生制藥規(guī)范的各方面。在表1和2中提供每個(gè)處理步驟后進(jìn)行如下的清洗循環(huán)表5.
陶瓷膜清潔步驟

在中試工廠中使用的澄清乳的設(shè)備上進(jìn)行了大量的工程運(yùn)行后，確定了所用設(shè)備和操作需要修改以穩(wěn)定地制造潔凈的澄清乳。把設(shè)備從中試工廠的GMP環(huán)境移到開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行廣泛的測(cè)試。對(duì)該系統(tǒng)的改動(dòng)包括減少滲出物管和改變系統(tǒng)中閥的位置，以利于在清洗和消毒步驟期間更容易漂洗。稍微修改清洗方案以提高清洗效率和降低用水量。確定工藝溫度范圍。最后在GMP文件中更好地定義工藝參數(shù)。
中試設(shè)備的原始設(shè)計(jì)完全使用不銹鋼構(gòu)造。該設(shè)計(jì)清洗較麻煩，因?yàn)樾枰獙⒑芏嚅L(zhǎng)管從工藝模式拆解成清洗模式。由于UF滲出物管的長(zhǎng)度和內(nèi)徑，在清洗方案中其不能被有效地清洗或漂洗。把許多小段加入MF系統(tǒng)中以促進(jìn)清洗，但是它們的構(gòu)造引起死腔而積累碎屑。這些問(wèn)題通過(guò)將長(zhǎng)UF滲出物管更換為1/4″內(nèi)徑的管而被解決。改變清洗方案，使得MF膜的頂部用于清洗膜的滲出物側(cè)，也就不需要其他小段了。然后在清洗期間將UF滲出物管保留在UF上。同時(shí)，在系統(tǒng)的MF部分也安裝一個(gè)大熱交換器，這就允許對(duì)MF進(jìn)行精密的溫度控制，但卻阻止了將UF溫度控制在工藝適用的范圍。從系統(tǒng)中移出熱交換器，調(diào)節(jié)冷卻設(shè)置以將兩個(gè)系統(tǒng)都適當(dāng)冷卻在適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)。下面是最終設(shè)計(jì)。裝配設(shè)備用于保存、消毒和處理。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中設(shè)備的結(jié)構(gòu)提供于下圖O和P。
清洗和消毒變化所做設(shè)備變化需要改變清洗和消毒方案。在如上表每次運(yùn)行后運(yùn)行清洗方案。MF上的保留物閥需要是半開(kāi)放的，以在每個(gè)漂洗步驟期間輔助適當(dāng)?shù)钠矗@是由于在閥和容器之間有長(zhǎng)的死腳。在第4次運(yùn)行以后，運(yùn)行清洗方案，并追蹤耗水量(記錄本10586)。在第5、6和7次運(yùn)行后驗(yàn)證在該實(shí)驗(yàn)中所用的水，并推薦用于GMP工藝中。正如先前所述，設(shè)備變化也允許系統(tǒng)在工藝模式中消毒。這是經(jīng)過(guò)測(cè)試的。也確定了從系統(tǒng)中漂洗消毒劑所需的USP水。
操作用HPTFF進(jìn)行乳加工處理的實(shí)際步驟描述于下面部分。這些包括從消毒系統(tǒng)到加工處理、到清洗和到保存的全部工藝過(guò)程。在第5-7次運(yùn)行期間，在開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室中的設(shè)備上使用這些操作，并生產(chǎn)潔凈的澄清乳。
消毒為進(jìn)行HPTFF，使用陶瓷0.2μm微濾膜和30kda超濾膜來(lái)澄清和濃縮轉(zhuǎn)基因山羊奶，必須用0.1M氫氧化鈉來(lái)消毒系統(tǒng)。如上裝配設(shè)備以用于消毒和工藝處理。泵入用USP水制備的2L 0.1M氫氧化鈉穿過(guò)每個(gè)系統(tǒng)，在MF上錯(cuò)流為15LPM，在UF上錯(cuò)流為1LPM。對(duì)MF不施加保留物壓力，而對(duì)UF的保留物施加5psi的壓力。完全打開(kāi)滲出物閥以允許氫氧化鈉環(huán)繞全部系統(tǒng)再循環(huán)。將再循環(huán)進(jìn)行15分鐘，然后通過(guò)罐和泵之間的流出閥從系統(tǒng)中排出該溶液。必要時(shí)通過(guò)用USP水完全充滿(mǎn)罐來(lái)用USP水漂洗系統(tǒng)。從每個(gè)流出閥中排出1L水。半關(guān)閉MF上的保留物閥，并將滲出物閥完全指向廢棄物。UF上的保留物和滲出物閥完全指向廢棄物。用12L USP水以錯(cuò)流流速20LPM徹底沖洗通過(guò)MF保留物。用4L USP水以錯(cuò)流流速15-20LPM和6-8psi的TMP徹底沖洗通過(guò)MF滲出物。用7L USP水以錯(cuò)流流速1LPM徹底沖洗通過(guò)UF保留物和滲出物線，然后再用3L USP水沖洗滲出物。
以20LPM使用USP水(如果需要還可加入更多)泵MF，增加保留物壓力直至TMP達(dá)到15psi而沒(méi)有滲出物壓力，然后用泵入速度調(diào)節(jié)錯(cuò)流流速至15LPM。記錄溫度(必須在25-28℃之間)、壓力和錯(cuò)流流速。測(cè)量通過(guò)滲出物排出閥的滲出物流速。用1LPM錯(cuò)流和5psig保留物壓力和沒(méi)有滲出物壓力(TMP約為10psig)在UF上重復(fù)上述過(guò)程。比較滲出物流速與新膜透水性時(shí)的滲出物流速。如果滲出物速率小于原值的80％，需要再清洗膜或者更換它們。
乳加工處理必須合并乳，并升溫至15-20℃。在MF容器中合并乳，然后關(guān)閉MF滲出物閥，打開(kāi)保留物閥，并打開(kāi)泵至錯(cuò)流流速為20LPM。5分鐘后，取初始乳樣品。然后將壓力升至TMP為15psig，錯(cuò)流流速為15LPM。繼續(xù)再循環(huán)直至乳溫度達(dá)到20℃。然后在10℃打開(kāi)冷卻器，打開(kāi)MF滲出物閥，通過(guò)收集陶瓷膜的滲出物以在微濾系統(tǒng)中將乳濃縮至原體積的一半。在15psi的跨膜壓下在15LPM錯(cuò)流流速運(yùn)行MF。MF的溫度應(yīng)該增加并維持在26℃±2.0。然后必須開(kāi)啟超濾系統(tǒng)上至0.8-1LPM/sqft的錯(cuò)流流速。測(cè)量通過(guò)滲出物閥的每個(gè)膜的滲出物流速。必須調(diào)節(jié)UF的保留物和滲出物壓力以使得滲出物流速匹配MF的滲出物流速。一旦UF滲出物流速匹配MF的滲出物流速，應(yīng)該將該系統(tǒng)配對(duì)運(yùn)行5-6個(gè)滲濾體積。
一旦完成滲濾，斷開(kāi)系統(tǒng)，關(guān)閉MF并排出和清洗，排出UF滲出物直至在UF的進(jìn)料儲(chǔ)器中整體的澄清濃縮物的體積濃縮至其體積的一半，以實(shí)現(xiàn)4X總濃縮。然后排出UF，無(wú)菌過(guò)濾整體的澄清濃縮物，并清洗UF。
清洗和保存方案為了適當(dāng)清洗和保存本裝置的部件以允許分級(jí)感興趣蛋白質(zhì)，首先從進(jìn)料流輸入斷開(kāi)系統(tǒng)。半打開(kāi)保留物閥，用20L熱的軟水(45-65℃)漂洗MF，排出滲出物。將閥指向使溶液再循環(huán)回進(jìn)料儲(chǔ)器中，用含400ppm次氯酸鈉的2L熱0.5M氫氧化鈉再循環(huán)5分鐘。從系統(tǒng)中排出溶液，用2L相同的化學(xué)品代替。用新鮮溶液再循環(huán)30分鐘，然后從流出閥中排出。用20L熱的軟水通過(guò)半打開(kāi)的保留物閥沖洗系統(tǒng)。通過(guò)在6-8psi的TMP下以20lpm在膜的保留物側(cè)進(jìn)行水的再循環(huán)，用4L熱的軟水僅徹底沖洗通過(guò)滲出物。通過(guò)流出閥排出剩余的水。在6-8psi的TMP下以20LPM用2L熱的0.5M檸檬酸再循環(huán)通過(guò)整個(gè)系統(tǒng)30分鐘，然后通過(guò)流出閥排出檸檬酸。在苛性堿步驟以后，用15L軟水徹底沖洗MF的保留物側(cè)，用4L軟水徹底沖洗滲出物側(cè)。然后用含400ppm漂白劑的2L熱0.05M氫氧化鈉再循環(huán)通過(guò)MF15分鐘，然后排出，在苛性堿步驟以后用10L水徹底沖洗保留物側(cè)，用4L水徹底沖洗滲出物。
通過(guò)將保留物閥指向排出和將整個(gè)滲出物線指向排出(不是通過(guò)閥)，將UF保留物和滲出物線指向排出，以進(jìn)行初步的水沖洗?？偸且?LPM運(yùn)行泵，即如果保留物壓力增加，泵速度也必須增加以維持1LPM。用4LUSP水漂洗這兩條線。用由USP水制成的含250ppm次氯酸鈉的2L 0.5M氫氧化鈉沖洗這兩條線。用2L新鮮溶液再循環(huán)通過(guò)滲出物線與進(jìn)料儲(chǔ)器相連的整個(gè)系統(tǒng)，保留物閥開(kāi)放通至儲(chǔ)器60分鐘。通過(guò)流出閥排出溶液。如初始清洗將這兩條線指向排出。用USP水填充容器，并通過(guò)流出閥排出1L。用8L水沖洗這兩條線，然后在5psi保留物壓力下再用4L水沖洗滲出物線。然后用2L 0.4M檸檬酸再循環(huán)通過(guò)整個(gè)系統(tǒng)60分鐘。通過(guò)流出閥排出酸溶液，然后用USP水填充儲(chǔ)器，并通過(guò)流出閥排出1L。用8L水沖洗通過(guò)保留物和滲出物線，然后在5psi保留物壓力和1LPM跨膜錯(cuò)流流速下，再用8L沖洗通過(guò)滲出物。
當(dāng)清洗和漂洗完這兩個(gè)系統(tǒng)后，把它們裝配起來(lái)保存(上圖)。向每個(gè)進(jìn)料容器中倒入2L 0.1M氫氧化鈉，并打開(kāi)保留物和滲出物閥泵入通過(guò)整個(gè)系統(tǒng)再循環(huán)，關(guān)閉至廢棄物，持續(xù)2分鐘。然后蓋上容器，標(biāo)記狀態(tài)為潔凈，并保存在0.1M氫氧化鈉中。
已經(jīng)顯示，工藝參數(shù)對(duì)于生產(chǎn)一致性的物質(zhì)是重要的。用于澄清的膜是CerCor陶瓷0.2μm孔徑膜、1.5sqft和30kDa NMWCO Pall Filtron PES盒、2sq.ft.(2個(gè)盒)。對(duì)于感興趣蛋白質(zhì)的最佳的澄清和通量，微濾系統(tǒng)的溫度應(yīng)維持在26-29℃。微濾系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)在14 LPM(42cm/s)的保留物流速和15psig的跨膜壓力下運(yùn)行。乳應(yīng)當(dāng)濃縮到原合并體積的40-70％(1.5-2.5X)。系統(tǒng)的超濾部分應(yīng)當(dāng)運(yùn)行在1.6-2LPM保留物流速和20-30psig進(jìn)料壓力下。通過(guò)調(diào)節(jié)滲出物壓力，滲出物流速應(yīng)當(dāng)與微濾系統(tǒng)的滲出物流速匹配。最終的整體澄清濃縮物應(yīng)當(dāng)是合并原乳體積的四分之一(4X濃縮)。
重組體制備在治療和診斷應(yīng)用中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)量不斷增加的大量重組蛋白。但是，這些蛋白質(zhì)中有許多用常規(guī)方法以功能形式和/或需要量制備是困難或昂貴的。常規(guī)方法包括向宿主細(xì)胞例如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如COS或CHO細(xì)胞中插入負(fù)責(zé)生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)的基因，然后讓細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。然后培養(yǎng)的細(xì)胞合成期望蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的細(xì)菌或酵母系統(tǒng)可能不能制備功能形式的很多復(fù)雜蛋白質(zhì)。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以重復(fù)生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)，但它們的生長(zhǎng)一般是困難和昂貴的，并且經(jīng)常只能生產(chǎn)mg/L量的蛋白質(zhì)。此外，從原核或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中純化非分泌蛋白質(zhì)相對(duì)困難，因?yàn)樗鼈儾槐环置诘脚囵B(yǎng)基中。
一般地，轉(zhuǎn)基因技術(shù)特征是，制造和分泌通常并不被分泌的蛋白質(zhì)(非分泌蛋白)的方法。該方法包括從核酸構(gòu)建體中表達(dá)蛋白質(zhì)，所述核酸構(gòu)建體包括(a)啟動(dòng)子，例如乳腺上皮特異性啟動(dòng)子，例如乳蛋白啟動(dòng)子；(b)信號(hào)序列，其可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，例如乳特異性蛋白質(zhì)的信號(hào)序列；(c)任選地，編碼分泌蛋白如分泌到乳中的蛋白質(zhì)的氨基端編碼區(qū)的足夠部分的序列，以允許非分泌蛋白分泌入例如轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中；和(d)編碼非分泌蛋白的序列，其中元件(a)、(b)、任選地(c)、和(d)優(yōu)選按照所述順序可操作的連接。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中元件a、b、c(如果存在)和d來(lái)自相同基因；元件a、b、c(如果存在)和d來(lái)自?xún)煞N或更多基因；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分泌是分泌到轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號(hào)序列是β-酪蛋白信號(hào)序列；啟動(dòng)子是β-酪蛋白啟動(dòng)子序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，非分泌蛋白質(zhì)編碼序列是來(lái)源于人；編碼截短的、核或細(xì)胞漿多肽；編碼人血清白蛋白或其他期望的感興趣蛋白質(zhì)。
除非另有說(shuō)明，實(shí)施本發(fā)明是使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)描述于文獻(xiàn)中。例如參見(jiàn)Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.By Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor LaboratoryPress1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture OfAnimal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，VolumesI-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
乳特異性啟動(dòng)子用于實(shí)施本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子優(yōu)選是在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子，包括控制編碼乳蛋白如酪蛋白、β-乳球蛋白(Clark et al.，(1989)BIO/TECHNOLOGY 7487-492)、乳清酸蛋白(Gorton et a.，(1987)Bio/Technology 51183-1187)、和乳白蛋白(Soulier et a.，(1992)FEBS LETTS.29713)的基因的啟動(dòng)子。酪蛋白啟動(dòng)子可以來(lái)源于任何哺乳動(dòng)物物種的α、β、γ或κ酪蛋白基因；優(yōu)選的啟動(dòng)子來(lái)自山羊β酪蛋白基因(DiTullio，(1992)Bio/Technology 1074-77)。乳特異性蛋白質(zhì)啟動(dòng)子或在乳腺組織中被特異性激活的啟動(dòng)子可以來(lái)源于cDNA或基因組序列。優(yōu)選它們來(lái)自基因組。
對(duì)于以上列舉的所有乳腺特異性基因，DNA序列信息在至少一種經(jīng)常是幾種動(dòng)物中是可用的。例如，參見(jiàn)Richards et al.，J.Biol.Chem.256，526-532(1981)(α-乳白蛋白大鼠)；Campbell et al.，Nucleic Acids Res.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones et al.，J.Biol.Chem.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen，J.Biol.Chem.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242，735-742(1987)(α-乳白蛋白人)；Stewart，Nucleic Acids Res.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky et al.，Gene 66，87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，Eur.J.Biochem.178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon et al.，F(xiàn)EBS Lett.188，48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson et al.，Gene 61，85-90(1987)，Ivanov et al.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)，Alexander et al.，Nucleic Acids Res.17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte et al.，Biochimie 69，609-620(1987)(牛α-乳白蛋白)。不同乳蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能綜述于Mercier & Vilotte，J.Dairy Sci.76，3079-3098(1993)(為所有目的將其整體引入作為參考)。對(duì)于可能需要的其他序列數(shù)據(jù)的范圍，可以使用現(xiàn)有的序列作為探針容易地克隆已獲得區(qū)域旁側(cè)的序列。通過(guò)使用已知的同族核苷酸序列或同族蛋白質(zhì)的抗體作為探針篩選來(lái)自不同生物的文庫(kù)，也可以獲得來(lái)自這些生物的乳腺特異性調(diào)節(jié)序列。
盡管為了理解的目的通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例有些詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是對(duì)其實(shí)施一些變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此，這些描述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求來(lái)限定的。
因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明提供了用于高效切向流過(guò)濾的改進(jìn)方法的實(shí)施方案，以從給定的進(jìn)料流中得到高收率的感興趣分子，但這些實(shí)施方案僅僅是對(duì)本發(fā)明的原理的應(yīng)用的實(shí)例。顯而易見(jiàn)地，從前述說(shuō)明中改變形式、使用方法和所披露的元件的應(yīng)用都不會(huì)偏離本發(fā)明的精神、或所附權(quán)利要求的范圍。
作為參考并入本文的現(xiàn)有技術(shù)1.Aranha-Creado H，and Fennington GJ Jr(1997，Cumulative Viral TiterReduction Demonstrated By Sequential Challenge Of A Tangential FlowMembrane Filtration System And A Direct Flow Pleated Filter Cartridge，PDAJPHARM SC TECHNOL 51(5)208-212.
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權(quán)利要求
1.一種從進(jìn)料流中分離感興趣蛋白質(zhì)的方法，包括(a)通過(guò)高效切向流過(guò)濾工藝過(guò)濾所述進(jìn)料流，該工藝基于所述感興趣蛋白質(zhì)的孔徑和電荷從所述進(jìn)料流中分離所述感興趣分子，同時(shí)保持通量在通量對(duì)TMP曲線的壓力依賴(lài)區(qū)中轉(zhuǎn)變點(diǎn)通量的約5到100％范圍的水平，其中沿膜的方向保持跨膜壓力基本恒定在不大于過(guò)濾的轉(zhuǎn)變點(diǎn)的跨膜壓力的水平，從而所述感興趣蛋白質(zhì)從所述進(jìn)料流中被選擇性分離，使得所述感興趣蛋白質(zhì)保持其生物活性；(b)通過(guò)超濾工藝過(guò)濾所述進(jìn)料流；和其中所述過(guò)濾發(fā)生在所述感興趣蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)通量以上；其中所述分子具有1到1000kDa之間的分子量。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括分級(jí)所述進(jìn)料流。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括澄清所述進(jìn)料流。
4.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括滲濾所述進(jìn)料流。
5.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在過(guò)濾的第一半中增加跨膜壓力和降低流量。
6.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括在該工藝的第二半中降低跨膜壓力。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述進(jìn)料流在過(guò)濾前被濃縮。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)的分子量比所述進(jìn)料流中第二種感興趣蛋白質(zhì)大不到10倍，或者比其小不到10倍。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)的分子量比混和物中第二種感興趣蛋白質(zhì)大超過(guò)10倍，或者比其小超過(guò)10倍，但是它們具有相同的電荷或等電點(diǎn)。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括濃縮所述進(jìn)料流。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所有的過(guò)濾階段是超濾。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述進(jìn)料流是乳。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述進(jìn)料流是細(xì)胞裂解溶液。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是生物藥物。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述乳的條件選自以下?tīng)顟B(tài)a)生乳；b)稀釋的；c)用緩沖溶液處理的；d)化學(xué)處理的；和e)部分蒸發(fā)的。
16.權(quán)利要求2的方法，其中所述分級(jí)步驟利用陶瓷濾膜。
17.權(quán)利要求3的方法，其中所述澄清步驟利用陶瓷濾膜。
18.權(quán)利要求2的方法，其中所述分級(jí)步驟利用具有確定等電特性的聚合物濾膜。
19.權(quán)利要求3的方法，其中所述澄清步驟利用聚合物濾膜。
20.權(quán)利要求2的方法，其中所述分級(jí)步驟利用纖維素濾膜。
21.權(quán)利要求3的方法，其中所述澄清步驟利用纖維素濾膜。
22.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括優(yōu)化系統(tǒng)參數(shù)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述系統(tǒng)參數(shù)包括溫度、進(jìn)料流流速、跨膜壓力、進(jìn)料流濃度和滲濾體積。
24.權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括優(yōu)化系統(tǒng)參數(shù)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述系統(tǒng)參數(shù)包括溫度、進(jìn)料流流速、跨膜壓力、進(jìn)料流濃度和滲濾體積。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述感興趣分子是生物學(xué)實(shí)體，選自蛋白質(zhì)、免疫球蛋白、多肽、肽、糖蛋白、RNA和DNA。
27.權(quán)利要求23的方法，其中最佳的溫度范圍是15℃到50℃。
28.權(quán)利要求23的方法，其中最佳的溫度范圍是20℃到35℃。
29.權(quán)利要求23的方法，其中最佳的溫度范圍是25℃到29℃。
30.權(quán)利要求25的方法，其中最佳的溫度范圍是15℃到50℃。
31.權(quán)利要求25的方法，其中最佳的溫度范圍是20℃到35℃。
32.權(quán)利要求25的方法，其中最佳的溫度范圍是25℃到29℃。
33.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流流速是10cm/秒到100cm/秒。
34.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流流速是20cm/秒到60cm/秒。
35.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流流速是25cm/秒到45cm/秒。
36.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流流速是10cm/秒到100cm/秒。
37.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流流速是20cm/秒到60cm/秒。
38.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流流速是25cm/秒到45cm/秒。
39.權(quán)利要求23的方法，其中跨膜壓力的范圍是2psi到40psi。
40.權(quán)利要求23的方法，其中跨膜壓力的范圍是5psi到30psi。
41.權(quán)利要求23的方法，其中跨膜壓力的范圍是10psi到20psi。
42.權(quán)利要求25的方法，其中跨膜壓力的范圍是2psi到40psi。
43.權(quán)利要求25的方法，其中跨膜壓力的范圍是5psi到30psi。
44.權(quán)利要求25的方法，其中跨膜壓力的范圍是10psi到20psi。
45.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的0.25X到4X。
46.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的0.5X到3X。
47.權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的1.0X到2X。
48.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的0.25X到4X。
49.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的0.5X到3X。
50.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料流濃度是天然乳的1.0X到2X。
51.權(quán)利要求23的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的1X到20X。
52.權(quán)利要求23的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的3X到15X。
53.權(quán)利要求23的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的5X到10X。
54.權(quán)利要求25的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的1X到20X。
55.權(quán)利要求25的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的3X到15X。
56.權(quán)利要求25的方法，其中滲濾體積范圍是濃縮的MF保留物體積的5X到10X。
57.權(quán)利要求2的方法，其中超濾膜用于所有的過(guò)濾步驟。
58.權(quán)利要求7的方法，其中超濾膜用于所有的過(guò)濾步驟。
59.權(quán)利要求12的方法，其中所述乳用選自以下的溶液處理a)水；b)緩沖的鹽的水溶液；c)鰲合劑；d)酸溶液；和e)堿溶液。
60.權(quán)利要求4的方法，其中所述滲濾利用超濾滲出物。
61.權(quán)利要求4的方法，其中所述滲濾利用水。
62.權(quán)利要求4的方法，其中所述滲濾利用緩沖的鹽溶液。
63.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用溫度超過(guò)20℃的溶液清洗。
64.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用溫度為20℃-70℃范圍的溶液清洗。
65.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用溫度為40℃-60℃范圍的溶液清洗。
66.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用酸溶液清洗。
67.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用堿溶液清洗。
68.權(quán)利要求1的方法，其中使用的膜用次氯酸鹽溶液清洗。
69.權(quán)利要求66、67或68的方法，進(jìn)一步包括在使用所選擇的溶液以后用水沖洗。
70.權(quán)利要求1的方法，其中在使用前用氫氧化物溶液消毒所使用的膜。
71.權(quán)利要求1的方法，其中在使用前用醇溶液消毒所使用的膜。
72.權(quán)利要求1的方法，其中在使用前用次氯酸鹽溶液消毒所使用的膜。
73.權(quán)利要求1的方法，其中所使用的膜清洗20分鐘到45分鐘時(shí)間。
74.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在第二切向流過(guò)濾階段通過(guò)比第一過(guò)濾階段膜孔徑更小的膜過(guò)濾來(lái)自過(guò)濾的濾出物，并把該第二過(guò)濾階段的濾出物再循環(huán)回第一過(guò)濾階段，從而重復(fù)該工藝。
75.一種從進(jìn)料流中分離感興趣蛋白質(zhì)的方法，包括(a)通過(guò)高效切向流過(guò)濾工藝過(guò)濾所述進(jìn)料流，該工藝基于所述感興趣蛋白質(zhì)的孔徑和電荷從所述進(jìn)料流中分離所述感興趣分子，同時(shí)保持通量在通量對(duì)TMP曲線的壓力依賴(lài)區(qū)中轉(zhuǎn)變點(diǎn)流量的約5到100％范圍的水平，其中沿膜的方向保持跨膜壓力基本恒定在不大于過(guò)濾的轉(zhuǎn)變點(diǎn)的跨膜壓力的水平，借此所述感興趣蛋白質(zhì)從所述進(jìn)料流中被選擇性分離，使得所述感興趣蛋白質(zhì)保持其生物活性；(b)通過(guò)超濾工藝過(guò)濾所述進(jìn)料流；和(c)在過(guò)濾的第一半中增加跨膜壓力和降低流量；(d)隨過(guò)濾進(jìn)行降低隨后增加或維持通量，其中所述過(guò)濾發(fā)生在所述感興趣蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)通量以上；其中所述分子具有1到1000kDa之間的分子量。
76.權(quán)利要求1或75的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)是重組人甲胎蛋白。
77.權(quán)利要求1或75的方法，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是重組人白蛋白。
78.權(quán)利要求1或75的方法，其中所述感興趣蛋白質(zhì)來(lái)源于轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳。
全文摘要
本發(fā)明提供用于把感興趣分子從包含其的混合物中分離出來(lái)的方法和裝置，其包括將高效切向流過(guò)濾(HPTFF)的改進(jìn)方法用于該混合物，本發(fā)明的HPTFF用于澄清和處理不同的進(jìn)料流，以根據(jù)感興趣分子的大小和電荷移出感興趣分子。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因乳進(jìn)料流被穩(wěn)定化，并除去顆粒物例如脂肪、酪蛋白微粒和細(xì)菌。在本發(fā)明中使用的HPTFF法利用優(yōu)化的工藝參數(shù)，包括溫度、跨膜壓、分子電荷、分子大小、錯(cuò)流速度和乳濃度。也開(kāi)發(fā)了清洗和保存方法，以確保長(zhǎng)的膜使用壽命。也開(kāi)發(fā)了無(wú)菌過(guò)濾步驟以除去殘留在澄清的轉(zhuǎn)基因乳進(jìn)料流中的任何細(xì)菌。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101027080SQ200580013810
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月4日
發(fā)明者馬克·佩羅 申請(qǐng)人:Gtc生物治療有限公司