專利名稱：產(chǎn)量增加的植物及制備其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及相比對應(yīng)的野生型植物而言增加植物產(chǎn)量的方法。更加具體而言，本發(fā)明涉及通過向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸來增加產(chǎn)量的方法，其中所述編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸在優(yōu)選于枝條中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。本發(fā)明還涉及包含在優(yōu)選于枝條中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下的經(jīng)分離細(xì)胞周期蛋白D3核酸的植物，其中所述植物具有比相應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量。本發(fā)明也涉及在本發(fā)明方法中使用的構(gòu)建體。
不斷增加的世界人口和逐漸減少的農(nóng)業(yè)可用耕地迫使研究朝向提高農(nóng)業(yè)的效率。傳統(tǒng)的作物和園藝學(xué)改良方法利用選擇育種技術(shù)來鑒定具有預(yù)期性狀的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)有一些缺陷，即這些技術(shù)一般為勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生的植物通常包含異質(zhì)的遺傳組分，當(dāng)這些異質(zhì)的遺傳組分從親本植物傳遞時(shí)不一定產(chǎn)生預(yù)期的性狀。分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)允許人類修飾動(dòng)物和植物的種質(zhì)。植物基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質(zhì)引入植物。該技術(shù)具有傳遞具多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的作物或植物的能力。在經(jīng)濟(jì)上特別讓人感興趣的性狀是產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為作物可測量的經(jīng)濟(jì)價(jià)值產(chǎn)生。這可以以數(shù)量和/或質(zhì)量的方式進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)量和大小、植物結(jié)構(gòu)(例如，分枝的數(shù)量)、種子產(chǎn)量等等。根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是決定產(chǎn)量的重要因素?？梢酝ㄟ^優(yōu)化上述因素之一來增加作物產(chǎn)量，這可以通過修飾植物內(nèi)在的生長機(jī)制來完成。
植物內(nèi)在的生長機(jī)制在于高度有序的合起來稱為“細(xì)胞周期”的事件。通過細(xì)胞周期前進(jìn)對所有多細(xì)胞生物的生長和發(fā)育都是基本的，并且對細(xì)胞增殖是決定性的。細(xì)胞周期的主要組分在酵母、哺乳動(dòng)物和植物中高度保守。細(xì)胞周期一般分為下列連續(xù)的時(shí)期G0G1SG2M。DNA復(fù)制或合成一般發(fā)生在S期(“S”指DNA合成)，而染色體的有絲分裂分離發(fā)生在M期(“M”指有絲分裂)，其間插入間期G1(DNA復(fù)制之前的細(xì)胞生長期)和G2(DNA擴(kuò)增之后細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期)。細(xì)胞分裂在M期的最后步驟胞質(zhì)分裂之后完成。離開細(xì)胞周期并變成靜止的細(xì)胞稱為處于G0期。這個(gè)時(shí)期的細(xì)胞可以受刺激而重新進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期。G1、G2和G0中的“G”代表“間期”。細(xì)胞周期進(jìn)程的完成使得細(xì)胞分裂時(shí)的每個(gè)子細(xì)胞都接受完整拷貝的親本基因組。
細(xì)胞分裂受兩個(gè)主要的細(xì)胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有絲分裂的起始。每個(gè)這些主要事件的每步轉(zhuǎn)換受特定蛋白質(zhì)復(fù)合體(參與DNA復(fù)制和分裂)代表的檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint)控制。在哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中，G1/S邊界時(shí)DNA合成所需基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子的E2F家族調(diào)節(jié)(La Thangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人，2002)。進(jìn)入細(xì)胞周期由整合信號并允許細(xì)胞周期基因轉(zhuǎn)錄激活的E2F/Rb復(fù)合體調(diào)節(jié)/觸發(fā)。細(xì)胞周期不同時(shí)期之間的轉(zhuǎn)換以及因此細(xì)胞周期的進(jìn)行通過形成和激活不同異二聚體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(通常稱為依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶(CDK)來驅(qū)動(dòng)。這些激酶活性的前提是與特定的細(xì)胞周期蛋白物理結(jié)合，激活的時(shí)間主要取決于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合誘導(dǎo)相結(jié)合CDK的N端圓形突出部的構(gòu)象變化，并且促成復(fù)合體的定位和底物特異性。當(dāng)單體的CDK結(jié)合細(xì)胞周期蛋白時(shí)，它們被激活，并因此具有激酶活性。細(xì)胞周期蛋白的蛋白質(zhì)水平在細(xì)胞周期中起伏，并因此代表著決定CDK激活作用定時(shí)的主要因素。這些包含細(xì)胞周期蛋白和CDK的復(fù)合體在細(xì)胞周期中的周期性激活介導(dǎo)了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換(檢驗(yàn)點(diǎn))的時(shí)序調(diào)節(jié)。
細(xì)胞周期蛋白可以分為有絲分裂的細(xì)胞周期蛋白(在高等真核生物中稱為A型和B型細(xì)胞周期蛋白，而芽殖酵母中稱為CLB)和G1特異的細(xì)胞周期蛋白(在哺乳動(dòng)物中稱為D型細(xì)胞周期蛋白，而在芽殖酵母中稱為CLN)。H型細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)CAK(CDK激活性激酶)的活性。植物中已知的所有四種類型的細(xì)胞周期蛋白主要是通過與它們的人類對應(yīng)物相似而得到鑒定。在擬南芥屬(Arabidopsis)中，已經(jīng)描述了十種A型、九種B型、十種D型和一種H型細(xì)胞周期蛋白(Vandepoele等人，2002)。
10種D型細(xì)胞周期蛋白分為7個(gè)亞類D1至D7，這反映它們彼此之間沒有高度的序列相似性，這與A型和B型細(xì)胞周期蛋白相反。僅D3和D4亞類具有不同成員，分別為三個(gè)和兩個(gè)。作為敲除單個(gè)D3型細(xì)胞周期蛋白卻未能觀察到突變表型的一種解釋，先前已經(jīng)提出了D3型細(xì)胞周期蛋白的冗余(Swaminathan等人，2000)。兩個(gè)D3型細(xì)胞周期蛋白通過新近的片段重復(fù)來連接，這表明它們在功能上是冗余的。因?yàn)槿齻€(gè)中的兩個(gè)定位在重復(fù)結(jié)構(gòu)中，所以相似假說可以用于D4細(xì)胞周期蛋白。
與A型和B型細(xì)胞周期蛋白相比較，D型細(xì)胞周期蛋白表現(xiàn)出來的更大的趨異性可能反映D型細(xì)胞周期蛋白在將發(fā)育信號和環(huán)境線索整合入細(xì)胞周期中的推定作用。例如，D3型細(xì)胞周期蛋白已經(jīng)表現(xiàn)出應(yīng)答植物激素例如細(xì)胞分裂素和油菜素類固醇，而CYCD2和CYCD4在G1初期激活，并應(yīng)答糖有效性(綜述見Stals和Inzé，2001)。
已經(jīng)報(bào)道，CYCD2；1基因在煙草中過量表達(dá)增加細(xì)胞分裂并增加整體植株的生長速率而沒有形態(tài)學(xué)變化(Cockcroft等人，2000)。
已經(jīng)報(bào)道，在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的CYCD3；1基因在擬南芥屬中過量表達(dá)使植物子葉擴(kuò)大、植物終體積顯著減小以及發(fā)育畸變。在細(xì)胞水平，細(xì)胞從G1期推擠出來，從而在分生組織區(qū)域和正常沒有或有限細(xì)胞分裂的區(qū)域中都導(dǎo)致異常的細(xì)胞分裂。這種細(xì)胞數(shù)量的增加伴隨著細(xì)胞大小的下降(Dewitte等人，2003)。
更加精確地影響植物細(xì)胞周期并因此更加精確地修飾植物多種生長特征的能力將在諸如作物增產(chǎn)、植物育種的領(lǐng)域中、在觀賞植物的生產(chǎn)、樹木管理、園藝學(xué)、林業(yè)、生物反應(yīng)器(用于諸如藥物、抗體、或疫苗的生物技術(shù)生產(chǎn)、或有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化)中使用的藻類的生產(chǎn)中以及其它此類領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是克服在植物中表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D3的現(xiàn)有技術(shù)中相關(guān)的一些問題。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向植物中引入能在枝條中優(yōu)先表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子控制下的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸導(dǎo)致植物具有增加的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了在植物中增加產(chǎn)量的方法，其包括向植物引入能在枝條中優(yōu)先表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子控制下的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸。
文中所述術(shù)語“增加的產(chǎn)量”用來表示任意一種或多種下列參數(shù)的增加(每個(gè)都相比對應(yīng)的野生型植物而言)(i)植物一種或多種地上部分(可收獲的)增加的生物量(重量)；(ii)增加的種子產(chǎn)量，這可來自于種子的生物量(種子重量)增加，并且其可以是每棵植株或單粒種子基礎(chǔ)上的種子重量增加，并且種子重量的增加可來自于種子大小例如種子長度和/或種子寬度和/或種子面積改變；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(iv)增加的種子大小，這也可影響種子的成分；(iv)增加的種子體積，這也可影響種子的成分；(vi)增加的收獲指數(shù)，其表達(dá)為可收獲部分(例如種子)的產(chǎn)量與總生物量的比率；和(vii)增加的千粒核重量(TKW)，這通過計(jì)數(shù)飽滿種子數(shù)量和它們的總重量外推得到。TKW增加可來自于種子大小和/或種子密度增加。
以谷物為例，產(chǎn)量增加可以顯示為下列一種或多種情況每公頃或每英畝植物數(shù)量的增加、每棵植物谷穗數(shù)量的增加、行數(shù)、每行的果實(shí)數(shù)量、果實(shí)重量、千粒核重量、谷穗長度/直徑等的增加。以稻為例，產(chǎn)量增加可以顯示為下列一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的增加每公頃或每英畝的植物數(shù)量、每棵植物的圓錐花序數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序的花朵數(shù)量、種子填充率的增加、千粒核重量的增加等。產(chǎn)量的增加也可以導(dǎo)致改變的結(jié)構(gòu)，或可以作為改變的結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，使用本發(fā)明的方法導(dǎo)致植物具有增加的產(chǎn)量，其中所述的產(chǎn)量增加至少通過下列一種情況顯示增加的地上面積、增加的種子總數(shù)、增加的(飽滿)種子數(shù)量、增加的種子重量和增加的收獲指數(shù)，每種情況都相對于相應(yīng)的野生型植物而言。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加植物產(chǎn)量尤其是種子產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括向植物引入能在枝條中優(yōu)先表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子控制下的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸。
無論植物(其中引入能在枝條中優(yōu)先表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子控制下的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸)在無脅迫條件下或者植物暴露于不同脅迫下，與對照植物相比，實(shí)施本發(fā)明的方法都使植物產(chǎn)量增加。一般而言，植物暴露于脅迫時(shí)應(yīng)答為生長更加緩慢。在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至?xí)耆Ｖ股L。另一方面，本文將溫和脅迫定義為任何當(dāng)植物暴露于該脅迫時(shí)不會(huì)導(dǎo)致植物完全停止生長的脅迫。由于農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲處理)的進(jìn)步，所以種植的作物植物通常不會(huì)遇到嚴(yán)重脅迫。結(jié)果，溫和脅迫誘導(dǎo)的生長讓步常常是農(nóng)業(yè)不可預(yù)期的性狀。溫和脅迫是植物可能暴露于其中的一般脅迫(typical stress)。這些脅迫可能是植物暴露于其中的日常性生物或非生物(環(huán)境)脅迫。一般的非生物或環(huán)境脅迫包括由異常的熱或冷/冷凍溫度造成的溫度脅迫、鹽脅迫、水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫也可以由化學(xué)物質(zhì)造成。生物脅迫一般為那些由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲造成的脅迫。
更加有利地，本發(fā)明的方法可以施用于任何植物。
本文所用術(shù)語“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)以及植物細(xì)胞、組織和器官，其中上述每個(gè)部分都優(yōu)選地包含目的基因。術(shù)語“植物”也包含懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣其中每個(gè)上述部分都優(yōu)選地包含目的基因。
在本發(fā)明方法中尤其有用的植物包括所有屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的植物，尤其是包括選自下列名單的飼料或飼料莢果、觀賞植物、食品作物、樹木或灌木的單子葉和雙子葉植物，其中包括金合歡屬(Acacia spp.)、槭樹屬(Acer spp.)、獼猴桃屬(Actinidia spp.)、七葉樹屬(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、三色桫欏(Alsophila tricolor)、須芒草屬(Andropogon spp.)、落花生屬(Arachis spp)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、黃芪(Astragalus cicer)、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、蕓苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、決明屬(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜屬(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、枸子(Cotoneaster serotina)、山楂屬(Crataegus spp.)、香瓜屬(Cucumisspp.)、柏木屬(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、圓球柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蝗屬(Desmodium spp.)、迪卡蘭(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、錐穗稗(Echinochloa pyramidalis)、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐屬(Erythrina spp.)、桉屬(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅(Eulaliavillosa)、蕎麥屬(Fagopyrum spp.)、費(fèi)約羅(Feijoa sellowiana)、草雷屬(Fragaria spp.)、千斤拔屬(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidiaspp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、巖黃芪屬(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrheniarufa、小連翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán)(Indigo incarnata)、鳶尾屬(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脈根屬(Lotus spp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、蘋果屬(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicagosativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、煙草屬(Nicotianum spp.)、驢食草屬(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬(Oryza spp.)、非洲雙翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草屬(Pennisetum spp.)、鱷梨(Persea gratissima)、碧冬茄屬(Petunia spp.)、菜豆屬(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormiumcookianum、石楠屬(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、歐洲醋粟(Ribes grossularia)、茶藨子屬(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬(Rosa spp.)、懸鉤子屬(Rubus spp.)、柳屬(Salixspp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬(Spinacia spp.)、Sporobolusfimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themedatriandra)、車軸草屬(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬(Vaccinium spp.)、野豌豆屬(Viciaspp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、莧屬(amaranth)、菊芋(artichoke)、天門冬屬(asparagus)、青花椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(Brussels sprouts)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)(collard greens)、亞麻、球莖甘藍(lán)(kale)、兵豆屬(lentil)、油菜籽(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、水稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、西紅柿、南瓜(squash)、茶和藻類等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，植物為諸如大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、西紅柿、馬鈴薯或煙草的作物植物。進(jìn)一步優(yōu)選地，植物為單子葉植物，例如甘蔗。更加優(yōu)選地，植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥屬、燕麥屬或高粱屬。
細(xì)胞周期蛋白D3可以使用不同方法鑒定。例如，可以在翻譯的擬南芥屬核酸數(shù)據(jù)庫中比對(blast)(例如缺口開始罰分(the gap openingpenalty)和缺口延伸罰分(the gap extension penalty)使用比對默認(rèn)參數(shù))查詢的蛋白質(zhì)序列。在查詢序列為細(xì)胞周期蛋白D3的情況下，比對結(jié)果中第一個(gè)命中的是擬南芥屬細(xì)胞周期蛋白D3。另一種鑒定細(xì)胞周期蛋白D3的方法是，通過使用例如Vector NTI套件(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序?qū)⒉樵冃蛄信c已知的細(xì)胞周期蛋白D3的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對。然后用缺口開始罰分10和缺口延伸罰分0.01執(zhí)行多重比對。為了更好地定位一些保守區(qū)域，也需要進(jìn)行小的手工編輯。如果查詢序列是細(xì)胞周期蛋白D3，那么其將與已知的細(xì)胞周期蛋白D3序列比對。
本文所用術(shù)語“細(xì)胞周期蛋白D3”指的是用于構(gòu)建細(xì)胞周期蛋白或細(xì)胞周期蛋白D的系統(tǒng)樹(例如

圖1所示的系統(tǒng)樹)時(shí)歸入包括細(xì)胞周期蛋白D3s(而非其它D型細(xì)胞周期蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)的任何氨基酸序列。文中談及編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸是指編碼上文定義的細(xì)胞周期蛋白D3氨基酸的核酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用制作此類系統(tǒng)樹的已知技術(shù)和軟件(例如GCG、EBI或CLUSTAL軟件包)采用默認(rèn)參數(shù)輕易地確定任何討論的氨基酸序列是否屬于上述定義?；诖祟愊到y(tǒng)樹的構(gòu)建，認(rèn)為聚類在細(xì)胞周期蛋白D3組中的序列屬于“細(xì)胞周期蛋白D3”的定義。編碼此類序列的核酸將在本發(fā)明方法的使用中有用。
細(xì)胞周期蛋白D3一般具有結(jié)合和激活植物CDK以及Rb的能力。此外，細(xì)胞周期蛋白D3可以包含一種或多種并優(yōu)選所有下列序列(i)細(xì)胞周期蛋白盒；(ii)位于大約前40個(gè)氨基酸之內(nèi)的LxCxE基序(大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)圖2所示的盒標(biāo)識的一種或多種并優(yōu)選所有的保守區(qū)域(如圖2所示，允許盒內(nèi)一個(gè)錯(cuò)配)。
下文表1給出了編碼歸入上述細(xì)胞周期蛋白D3定義的細(xì)胞周期蛋白D3的核酸實(shí)例。表中顯示的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸在實(shí)施本發(fā)明的方法中有用，其中所述本發(fā)明的方法即通過引入并表達(dá)任意一種這些能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下的核酸來獲得具有相對于對應(yīng)的野生型植物產(chǎn)量增加的植物。如后文所述，編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸優(yōu)選SEQ ID NO1表示的核酸或者是SEQ ID NO1的功能變體。
表1編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸實(shí)例根據(jù)本發(fā)明，希望在枝條中增強(qiáng)或增加細(xì)胞周期蛋白D3核酸的表達(dá)。本領(lǐng)域詳細(xì)記錄了獲得增強(qiáng)或增加的基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法，而且所述方法包括例如啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過量表達(dá)、使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。
編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸與能在枝條中優(yōu)先表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效相連。該啟動(dòng)子的實(shí)例是具有可與β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)特性的啟動(dòng)子。應(yīng)當(dāng)清楚地是，本發(fā)明的適用范圍既不限制于SEQ ID NO1代表的細(xì)胞周期蛋白D3，也不限制于在本發(fā)明方法中使用β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子。
編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸可以得自任意來源。編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸/基因可以從微生物來源例如、酵母或真菌、或從植物、藻類或動(dòng)物(包括人類)來源分離。這個(gè)核酸可以通過精心設(shè)計(jì)的人工處理來修飾其在組合物和/或基因組環(huán)境中的天然形式。核酸優(yōu)選同源的核酸，即從植物(無論是從它將被引入的相同物種，或者從不同植物物種)獲得的核酸。核酸可以從雙子葉物種中分離，優(yōu)選從蕓苔科(Brassicaceae)中分離、更加優(yōu)選從擬南芥中分離。更加優(yōu)選地，從擬南芥中分離的細(xì)胞周期蛋白D3是D3型細(xì)胞周期蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白D3；1、細(xì)胞周期蛋白D3；2或細(xì)胞周期蛋白D3；3。最優(yōu)選地，細(xì)胞周期蛋白D3是來自擬南芥的細(xì)胞周期蛋白D3；3，尤其是SEQ ID NO1代表的核酸序列和SEQ ID NO2代表的氨基酸序列。
SEQ ID NO1代表的序列描述了來自擬南芥的細(xì)胞周期蛋白D3；3，而SEQ ID NO2為相應(yīng)的氨基酸序列。有利地，本發(fā)明的適用范圍不限制于使用SEQ ID NO1代表的來自擬南芥屬的細(xì)胞周期蛋白D3；3。本發(fā)明的方法也可以使用編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的功能性變體或使用所編碼多肽的功能性變體來實(shí)行。在本發(fā)明的方法中尤其有用的是SEQ IDNO1代表的核酸的功能性變體或SEQ ID NO2代表的氨基酸的功能性變體。
本文所用術(shù)語“功能性變體”為保持結(jié)合及激活植物CDK能力的細(xì)胞周期蛋白D3(例如見Healy等人(2001，J.Biol.Chem.276(10)7041-7047))。在大多數(shù)情況下，功能性變體也補(bǔ)償CLN(酵母中D型細(xì)胞周期蛋白的術(shù)語)缺陷的酵母突變體，見例如Swaminathan等人(2000，PlantPhys 1241658-1667)，尤其是1663頁。功能性變體是如下意義的細(xì)胞周期蛋白D3，即當(dāng)用于構(gòu)建細(xì)胞周期蛋白或細(xì)胞周期蛋白D系統(tǒng)樹(例如圖1描述的系統(tǒng)樹)時(shí)，歸入包括細(xì)胞周期蛋白D3(而非其它D型細(xì)胞周期蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)的氨基酸序列。本文談及編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸是指編碼上文定義的細(xì)胞周期蛋白D3氨基酸的核酸。此外，功能性變體可以包含一種或多種并優(yōu)選地所有下列特征(i)細(xì)胞周期蛋白盒；(ii)位于大約前40個(gè)氨基酸之內(nèi)的LxCxE基序(大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)圖2所示的盒標(biāo)識的一種或多種并優(yōu)選所有的保守區(qū)域(如圖2所示，允許盒內(nèi)一個(gè)錯(cuò)配)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以輕易地通過簡單地用待檢驗(yàn)功能的變體代替下文實(shí)施例部分描述的序列來確定特定細(xì)胞周期蛋白D3是否為功能性變體(根據(jù)其是否能夠增加植物產(chǎn)量)。
在實(shí)施本發(fā)明方法中有用的合適功能性變體核酸及氨基酸序列包括(i)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的部分，優(yōu)選SEQ ID NO1的序列代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的部分；(ii)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體，優(yōu)選SEQ ID NO1的序列代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體；(iii)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體，優(yōu)選SEQ ID NO1的序列代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體；以及細(xì)胞周期蛋白D3氨基酸序列的同源物、衍生物和活性片段，其中優(yōu)選SEQID NO2的序列代表的細(xì)胞周期蛋白D3。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，使用全長的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的DNA序列并非執(zhí)行本發(fā)明方法的先決條件。本發(fā)明方法可以有利地使用編碼細(xì)胞周期蛋白D3的DNA/核酸的功能性部分、尤其是SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的功能性部分來實(shí)行。部分指的是由原始的(更大的)DNA分子衍生或制備的一段DNA。部分可以進(jìn)行制備，例如通過使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)例如通過在例如SEQ ID NO1的核酸序列中制造一個(gè)或多個(gè)刪除來制備。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加植物產(chǎn)量的方法，其包括向植物引入SEQ ID NO1代表的核酸的功能性部分，而其中所述功能性部分于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)所述功能性部分的啟動(dòng)子控制之下。
另一在本發(fā)明方法中有用的功能性變體是編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體，尤其是SEQ ID NO1的序列代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體。本文所用術(shù)語“備選剪接變體”包含其中所選的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)被刪除、替代或添加的核酸序列變體。此類變體是其中蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性保持不受影響的變體，這可以通過選擇性地保持蛋白質(zhì)的功能性片段來實(shí)現(xiàn)。此類剪接變體可以在自然中找到或者可以是人造的。制備此類剪接變體的方法在本領(lǐng)域眾所周知。
因此，本發(fā)明也提供了增加植物產(chǎn)物的方法，其中包括向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體，尤其是SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體，而其中所述備選剪接變體于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該剪接變體的啟動(dòng)子控制之下。
另一在本發(fā)明的方法中有用的變體為編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體，尤其是SEQ ID NO1的序列代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體。等位變體天然存在，而且包含在本發(fā)明方法中的是使用這些天然的等位基因。等位變體包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小插入/刪除多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成了大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性株系中最大的序列變體集。
因此，本發(fā)明也提供了增加植物產(chǎn)物的方法，其中包括向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體，尤其是SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體，其中所述等位變體于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該剪接變體的啟動(dòng)子控制之下。
更有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用細(xì)胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段來實(shí)行，優(yōu)選使用SEQ ID NO2代表的細(xì)胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段。編碼SEQ ID NO2代表的氨基酸的同源物、衍生物或活性片段的核酸可以輕易地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)技術(shù)來確定。
蛋白質(zhì)的“同源物”包含相對所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸替換、刪除和/或插入、但具有與它們所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)類似的生物學(xué)和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。要產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以用其它具有相似性質(zhì)(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或斷裂α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向性)的氨基酸代替。保守替換表為本領(lǐng)域眾所周知(例如見Creighton(1984) Proteins.W.H.Freemanand Company)。
在本發(fā)明方法中有用的同源物為那些歸入功能性變體定義的同源物，即具有結(jié)合及激活植物CDK的能力并且是上文定義的細(xì)胞周期蛋白D3的同源物。此外，同源物可以表征為具有優(yōu)選至少與SEQ ID NO2代表的氨基酸序列有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的增加的序列同一性(見圖3，其顯示細(xì)胞周期蛋白D3彼此之間具有低百分?jǐn)?shù)的同一性，但是盡管如此，與SEQ IDNO230％的同一性足以鑒定其它細(xì)胞周期蛋白D3)。此外，同源物可以包含一種或多種并且優(yōu)選所有下列序列(i)細(xì)胞周期蛋白盒；(ii)位于大約前40個(gè)氨基酸之內(nèi)的LxCxE基序(大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)圖2所示的盒標(biāo)識的一種或多種并優(yōu)選所有的保守區(qū)域(如圖2所示，允許盒內(nèi)一個(gè)錯(cuò)配)。
術(shù)語“同源物”還包含兩種特殊形式的同源物，其中包括涉及用來描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念的種間類似序列和種內(nèi)類似序列。術(shù)語“種內(nèi)類似的”涉及物種基因組中導(dǎo)致種內(nèi)類似基因的基因重復(fù)。術(shù)語“種間類似的”涉及不同生物中由于祖先關(guān)系的同源基因。
在例如單子葉植物物種中的種間類似物可以輕易地通過進(jìn)行所謂的相互匹配搜索(reciprocal blast search)找到。這可以通過第一次匹配完成，其中涉及在任意序列數(shù)據(jù)庫(例如對公眾開放的NCBI數(shù)據(jù)庫，這可以在http//www.ncbi.nlm.nih.gov.上找到)中匹配正在討論的序列(例如SEQ IDNO1或SEQ ID NO2)。如果在稻中搜索種間類似物時(shí)，那么就可以用在例如NCBI上可獲得的水稻日本晴(Oryza sativa Nipponbare)的28,469個(gè)全長cDNA克隆中匹配正在討論的序列。當(dāng)從核苷酸開始時(shí)，可以使用BLASTn，或者當(dāng)從蛋白質(zhì)開始時(shí)使用TBLASTX，其中使用標(biāo)準(zhǔn)的默認(rèn)值(期望10，排列50)。匹配結(jié)果可以進(jìn)行過濾。然后將已過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列對正在討論的序列(SEQ ID NO1或2)進(jìn)行反向匹配(第二次匹配)。最后比較第一次和第二次匹配的結(jié)果。在大家族的情況下，使用ClustalW，然后通過臨近連接樹來幫助形象化聚類。
同源物可以是蛋白質(zhì)的“替換變體”形式，即氨基酸序列中至少有一個(gè)殘基被移去，而在其位置插入了不同殘基。氨基酸替換一般為單殘基，但也可以是成群的，這取決于多肽的功能性約束因素(functionalconstraints)；插入通常為大約1-10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量，而刪除在大約1-20個(gè)殘基的范圍。優(yōu)選地，氨基酸替換包含保守性氨基酸替換。
同源物也可以是蛋白質(zhì)的“插入變體”形式，即在蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可以包含單個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基末端融合和/或羧基末端融合以及序列內(nèi)的插入。一般而言，氨基酸序列內(nèi)的插入比氨基末端或羧基末端融合小，數(shù)量大約為1-10個(gè)殘基。氨基或羧基末端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括酵母雙雜交系統(tǒng)中使用的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外被蛋白、6×(組氨酸)標(biāo)記、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、表位100標(biāo)記、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
蛋白質(zhì)“刪除變體”形式的同源物表征為從蛋白質(zhì)移去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
蛋白質(zhì)的氨基酸變體可以輕易地使用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)(例如固相肽合成法等)或通過重組DNA操作來制備。操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的替換、插入或刪除變體的方法在本領(lǐng)域眾所周知。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)制備替換突變的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，并且其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其它定點(diǎn)誘變方法。
“衍生物”包括與天然存在形式的蛋白質(zhì)例如SEQ ID NO2代表的蛋白質(zhì)的氨基酸相比包含天然及非天然存在氨基酸殘基的替換、刪除或添加的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)的“衍生物”包含與天然存在形式的多肽的氨基酸序列相比包括天然發(fā)生改變的、糖基化的、?；幕蚍翘烊淮嬖诘陌被釟埢碾摹⒐央?、多肽、蛋白質(zhì)和酶。與衍生物衍生自的氨基酸序列相比，衍生物也可以包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸替換物，例如與氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)道分子或其它配基、以及相比天然存在的蛋白質(zhì)為非天然存在的氨基酸殘基，例如結(jié)合以促進(jìn)其檢測的報(bào)道分子。
細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)的“活性片段”包含蛋白質(zhì)的至少五個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，其中殘基保持與天然存在的蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)和/或功能性活性。任何情況下，“同源物、衍生物和活性片段”為那些落入上述“功能性變體”定義的同源物、衍生物和活性片段。
搜索和鑒定細(xì)胞周期蛋白D3同源物的方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。用于比較的序列比對方法為本領(lǐng)域眾所周知，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、ALIGN X(來自載體NTI)和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)來尋找兩個(gè)全序列最大化匹配數(shù)目而最小化缺口數(shù)目的比對。BLAST算法計(jì)算兩個(gè)序列之間的百分?jǐn)?shù)序列同一性，并進(jìn)行相似性的統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過國際生物技術(shù)中心(National Centre forBiotechnology Information)對公眾開放。適合在本發(fā)明的方法中使用的同源物，即那些具有與SEQ ID NO2代表的氨基酸序列至少30％序列同一性的同源物，可以通過取得全長的細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)序列并使用相似性/同一性矩陣發(fā)生器例如MatGAT(矩陣總體比對工具)來鑒定，其中所述相似性/同一性矩陣發(fā)生器計(jì)算所給數(shù)據(jù)集每對序列之間的相似性和同一性，而不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)的預(yù)先比對。該程序使用Myers和Miller總體比對算法(缺口開始罰分為12，而缺口延伸罰分為2)進(jìn)行一系列的配對比對。然后使用例如Blosum60作為算分矩陣來計(jì)算相似性和同一性，最后將結(jié)果置于距離矩陣中。
因此，本發(fā)明也提供了包括向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段例如SEQ ID NO2代表的細(xì)胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段的核酸來增加植物產(chǎn)量的方法，其中所述同源物、衍生物或活性片段于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下。
本發(fā)明也提供了促進(jìn)本發(fā)明方法中使用的核苷酸序列引入和/或表達(dá)的基因構(gòu)建體和載體。
因此，提供的基因構(gòu)建體包含(i)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體、優(yōu)選SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體(如上文定義)，其中所述核酸編碼細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體、優(yōu)選編碼SEQ IDNO2代表的細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體；(ii)能在枝條尤其是營養(yǎng)性(地上)枝條的細(xì)胞膨脹帶(cell expansionzone)中優(yōu)選表達(dá)(i)的核酸的啟動(dòng)子；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
本發(fā)明方法中使用的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建?；驑?gòu)建體可以插入適合轉(zhuǎn)化入植物并且適合在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體中，所述載體可以是商品化載體。
用包含目的序列(即編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體(如上文定義)，例如SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體(如上文定義))的載體轉(zhuǎn)化植物。目的序列與能在枝條優(yōu)選表達(dá)目的序列的啟動(dòng)子有效連接。術(shù)語“調(diào)控元件”、“控制序列”和“啟動(dòng)子”在本文都可以相互交換使用，并且用來表示更廣泛的含義，指能夠影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)控性核酸序列。上述術(shù)語包含衍生自經(jīng)典真核基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA盒，包括或不包括CCAAT盒序列)和額外的調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，其中所述調(diào)控元件改變基因在響應(yīng)發(fā)育和/或外界刺激或組織特異方式中的表達(dá)。術(shù)語還包含經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，此時(shí)其可包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語“調(diào)控元件”還包含賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的合成的融合分子或衍生物。本文所用術(shù)語“有效連接的”指啟動(dòng)子序列和目的基因之間的功能性連接，如此來使啟動(dòng)子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。
編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體例如SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體與能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效相連。優(yōu)選地，能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子具有與β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜，例如圖5所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)輕易地鑒定出具有與β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)表達(dá)譜的啟動(dòng)子。更加具體而言，能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子為能在枝條、尤其是營養(yǎng)性(地上)枝條的細(xì)胞膨脹帶中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。最優(yōu)選地，能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子為β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子(SEQ ID NO3)。
任選地，也可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列。術(shù)語“終止子”包含調(diào)控序列，其為轉(zhuǎn)錄單位末端標(biāo)志的3’加工、初級轉(zhuǎn)錄物多聚腺苷化和轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列。額外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適合在實(shí)施本發(fā)明中使用的終止子和增強(qiáng)子序列。此類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知或者能夠輕易獲得。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制序列起始點(diǎn)。實(shí)例之一是，當(dāng)需要基因構(gòu)建體作為附加型基因元件(例如質(zhì)?；蝠ち７肿?維持在細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不局限于復(fù)制起始點(diǎn)f1和colE1。
基因構(gòu)建體可以任選地包含選擇性標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語“選擇性標(biāo)記基因”包括任何賦予細(xì)胞表型的基因，其中它的表達(dá)促進(jìn)已用目的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定和/或篩選。適當(dāng)標(biāo)記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的代謝性狀或允許視覺篩選。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的npt II，或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代謝性狀的基因(例如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA)。視覺標(biāo)記基因?qū)е滦纬深伾?例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、發(fā)光(例如螢光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。
本發(fā)明也包括通過本發(fā)明方法可以獲得的植物。因此本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法可以獲得的植物，其中所述植物包含與能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效連接的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中包括向植物引入和表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，尤其是SEQID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體(如上文定義)，其中所述核酸與在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效連接。
更加具體而言，本發(fā)明提供了生產(chǎn)相比對應(yīng)的野生型植物具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，優(yōu)選SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，其中所述核酸或其功能性變體編碼細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體，其中所述多肽優(yōu)選SEQ ID NO2為代表、或者是其功能性變體，并且所述核酸或其功能性變體于能在枝條尤其是營養(yǎng)(地上)枝條的細(xì)胞膨脹帶中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下；(ii)在促進(jìn)再生和成熟植物生長的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
核酸或功能性變體可直接引入植物細(xì)胞或植物本身(包括引入組織、器官或植物的任何其它部分)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特性，核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化引入植物。
術(shù)語“引入植物”主要指用正在討論的特定核酸(編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體)轉(zhuǎn)化植物，然而該術(shù)語也指其它導(dǎo)致正在討論的特定核酸引入植物的方法，例如育種技術(shù)。育種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
本文所指術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包含外源多核苷酸向宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，不論用來轉(zhuǎn)移的方法為何種方法。能夠隨后克隆繁殖的植物組織(不論通過器官發(fā)生還是通過胚胎發(fā)生)都可以用本發(fā)明的基因構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化，并由其再生出整棵植物。特定組織的選擇由于對所轉(zhuǎn)化的特定物種有效并且最適合的克隆繁殖系統(tǒng)而不盡相同。示例性的組織靶點(diǎn)包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子、愈傷組織、呈現(xiàn)分生組織的組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘發(fā)性分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞，并且可以維持非整合的，例如作為質(zhì)粒。備選地，它可以整合入宿主基因組。然后，所得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以用來以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生植物。
現(xiàn)在，植物物種的轉(zhuǎn)化是非常常規(guī)的技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任意一種都可以用來將目的基因引入適當(dāng)?shù)淖婕?xì)胞。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學(xué)物質(zhì)、直接將DNA注射入植物、基因槍轟擊、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可以選自制備原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等人，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)、顯微注射入植物材料(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)、DNA或RNA包被的粒子轟擊(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)、用病毒感染(非整合型)等。表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體的轉(zhuǎn)基因水稻植物優(yōu)選地通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用水稻轉(zhuǎn)化眾所周知的方法來生產(chǎn)，例如任意一篇下列文章描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985 A1、Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)271-282，1994)，其中所述公開在此處以其整體引入作為參考。在谷物轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方法為如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)所述，其中所述公開在此處以其整體引入作為參考。
一般在轉(zhuǎn)化之后，對植物細(xì)胞或細(xì)胞群篩選一種或多種標(biāo)記的存在，其中所述標(biāo)記由與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)的基因編碼，然后將轉(zhuǎn)化的材料再生成為整個(gè)植物。
DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，推定轉(zhuǎn)化的植物可以估測(例如使用Southern分析)目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組織。備選地或額外地，新引入DNA的表達(dá)水平可以使用Northern和/或Western分析來監(jiān)測，這兩種技術(shù)都為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
產(chǎn)生的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，例如通過克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化的植物可以自交來產(chǎn)生純合的第二代(T2)轉(zhuǎn)化體，然后T2代植物通過經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體、無性系轉(zhuǎn)化體(例如所有轉(zhuǎn)化為包含表達(dá)盒的細(xì)胞)、轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的嫁接物(例如，在植物中，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的根狀莖嫁接于未轉(zhuǎn)化的接穗)。
根據(jù)本發(fā)明的方法也可以不向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體來實(shí)行。這可以通過優(yōu)選在編碼細(xì)胞周期蛋白D3的基因的基因座中引入基因修飾來實(shí)現(xiàn)，如此以便允許在枝條中優(yōu)選表達(dá)該基因。本文定義的基因的基因座用來表示基因組區(qū)域，其包括目的基因和編碼區(qū)域上游或下游的10KB。
遺傳修飾可以例如通過任意一種(或多種)下列方法來引入T-DNA激活、TILLING、誘變、同源重組或者如上文詳述通過在植物(細(xì)胞)中引入和表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，該核酸于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下。
T-DNA激活標(biāo)記(Hayashi等人，Science (1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10KB中插入通常包含啟動(dòng)子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA，如此構(gòu)型以便啟動(dòng)子指引靶基因表達(dá)。一般地，破壞靶基因的天然啟動(dòng)子對其表達(dá)的調(diào)節(jié)，并將基因置于新引入的啟動(dòng)子的控制。啟動(dòng)子一般插入在T-DNA中。這個(gè)T-DNA例如通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium)感染隨機(jī)插入植物基因組，并導(dǎo)致插入T-DNA附近的基因過量表達(dá)。所得轉(zhuǎn)基因植物顯示由于臨近所引入啟動(dòng)子的基因過量表達(dá)造成的顯性表型。為了實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量增加，待引入的啟動(dòng)子可以是任意能在枝條中優(yōu)選表達(dá)的啟動(dòng)子。
遺傳修飾也可以使用TILLING(Targeted Induced Local Lesions INGenomes，靶向誘導(dǎo)基因組局部損害)技術(shù)引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸/基因的基因座中。這是在產(chǎn)生和/或鑒定、并最終分離能夠呈現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D3生物活性的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的誘變變體中有用的誘變技術(shù)。TILLING也允許篩選攜帶此類突變變體的植物。這些突變變體甚至可以呈現(xiàn)比其天然形式的基因呈現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白D3活性更高的細(xì)胞周期蛋白D3活性。TILLNG組合了高密度誘變和高通量篩選方法。TILLNG中一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等人，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制備和混合個(gè)體；(c)PCR擴(kuò)增目的區(qū)域；(d)變性和退火以便形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中混合物中異源雙鏈體的存在檢測為色譜圖中額外的峰；(f)鑒定突變個(gè)體；以及(g)測序突變體的PCR產(chǎn)物。TILLING法為本領(lǐng)域眾所周知(McCallumNat Biotechnol.2000 ADr；18(4)455-7，Stemple 2004(TILLING-ahigh-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004Feb；5(2)145-50)綜述)。
誘變可以用來產(chǎn)生編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的變體。產(chǎn)生突變變體的方法為本領(lǐng)域眾所周知。
TDNA激活、TILLING和定點(diǎn)誘變是能夠產(chǎn)生新型等位基因和細(xì)胞周期蛋白D3變體的技術(shù)的實(shí)例。
同源重組允許在基因組確定的選擇位置引入所選核酸。同源重組是在生物科學(xué)中常規(guī)地用于低等生物例如酵母或蘚類植物立碗蘚(physcomitrella)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在植物中進(jìn)行同源重組的方法已經(jīng)不僅在模型植物(Offringa等人，Extrachromosomal homologous recombinationand gene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediatedtransformation.1990 EMBO J.1990 Oct；9(10)3077-84)中得到描述，也在作物植物例如稻(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targeting by homologous recombination in rice.NatBiotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene andT-DNAgene targeting by homologous recombination in rice. Curr OpinBiotechnol.2004 Apr；15(2)132-8)中得到描述。待靶向的核酸(可以是編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或如上文定義的其變體)不必靶向編碼細(xì)胞周期蛋白D3的基因的基因座，而是可以引入到例如高表達(dá)的區(qū)域。待靶向的核酸可以是改良的用來替代內(nèi)源基因的等位基因，或者可以除了內(nèi)源基因以外額外地引入。
本發(fā)明清楚地延及通過本文所述的任意方法產(chǎn)生的任意植物細(xì)胞或植物，并且涉及其所有植物部分和繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步延及包含通過任意上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整個(gè)植物的后代，其中唯一的要求是后代呈現(xiàn)與那些通過根據(jù)本發(fā)明的方法在親本中產(chǎn)生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括包含分離的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸分子的宿主細(xì)胞，其中所述核酸分子與能在枝條中表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效相連。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明也延及植物的可收獲部分，例如但不局限于種子、葉、果實(shí)、花、莖培養(yǎng)物、根狀莖、塊莖和鱗莖。
本發(fā)明也包含編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的用途以及細(xì)胞周期蛋白D3多肽的用途。
這樣的一種用途當(dāng)然涉及編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸在增加植物產(chǎn)量、尤其是在增加地上面積、增加種子總數(shù)、增加(飽滿)種子數(shù)量、增加種子重量以及增加收獲指數(shù)等的用途，其中所述核酸與能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子有效連接。編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體如上文定義。優(yōu)選SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體。
編碼細(xì)胞周期蛋白D3和細(xì)胞周期蛋白D3多肽的核酸也可以在育種程序中找到用途。細(xì)胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體；或者細(xì)胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其如上文定義的功能性變體。例如，編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其部分可以在染色體(或其部分)上、優(yōu)選和一個(gè)或多個(gè)相關(guān)家族成員在一起。在此育種程序的實(shí)例中，在植物中鑒定可能與編碼細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)的核酸遺傳性連接的DNA標(biāo)記，其中所述基因可以是編碼細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)自身的基因或任意其它可以直接或間接影響編碼細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)表達(dá)和/或細(xì)胞周期蛋白D3自身活性的基因。然后這個(gè)DNA標(biāo)記可以在育種程序中用來選擇相比對應(yīng)的野生型植物具增加產(chǎn)量的植物。
細(xì)胞周期蛋白D3的等位變體也可以用于常規(guī)育種程序，例如標(biāo)記輔助育種。此類育種程序有時(shí)需要通過誘變處理植物來向植物中引入等位變體。一種合適的誘變方法是EMS誘變。然后通過例如PCR來鑒定等位變體。接下來是篩選步驟，篩選正在討論序列導(dǎo)致植物相比對應(yīng)的野生型植物產(chǎn)量增加的優(yōu)良等位變體。篩選一般通過監(jiān)測包含正在討論序列的不同等位變體例如SEQ ID NO1的不同等位變體的植物產(chǎn)量來實(shí)施。產(chǎn)量監(jiān)測可以在溫室或田地中完成。更多的任選步驟包括雜交植物，其中將鑒定出來的優(yōu)良等位變體與另一植物雜交。這可以用來例如制備感興趣的表型特征的組合。
編碼細(xì)胞周期蛋白D3和細(xì)胞周期蛋白D3多肽的核酸也可以在其作為生長調(diào)節(jié)劑中找到用途。細(xì)胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體；或者細(xì)胞周期蛋白D3可以是SEQ IDNO2代表的氨基酸或其如上文定義的功能性變體。因?yàn)檫@些細(xì)胞周期蛋白D3在增加植物產(chǎn)量中有用，所以細(xì)胞周期蛋白D3也是有用的生長調(diào)節(jié)劑，例如除草劑或生長刺激劑。因此，本發(fā)明提供了用作生長調(diào)節(jié)劑的包含細(xì)胞周期蛋白D3、以及適當(dāng)載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致植物具有增加的產(chǎn)量。這些有利性狀也可以與其它有利的經(jīng)濟(jì)性狀例如進(jìn)一步的產(chǎn)量增強(qiáng)性狀、多種脅迫的耐受性、修飾多種結(jié)構(gòu)特征和/或生物學(xué)和/或生理學(xué)特征的性狀組合。
附圖描述現(xiàn)在本發(fā)明將參考下列圖進(jìn)行描述，其中圖1為用ClustalW和默認(rèn)值、然后通過平均距離樹計(jì)算制備的多重比對。顯示了細(xì)胞周期蛋白D3的聚類。
圖2為已知的細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)序列的比對。該序列使用VectorNTI套件(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序進(jìn)行比對。多重比對使用缺口開始罰分10和缺口延伸罰分0.01進(jìn)行。在需要更好放置一些保守區(qū)域的地方也進(jìn)行了較小的人工編輯。顯示的線指示細(xì)胞周期蛋白D3與其它細(xì)胞周期蛋白D分離。一些細(xì)胞周期蛋白D3特異的基序用方框框住。
圖3為用MatGAT(矩陣總體比對工具)制備的相似性/同一性，其中MatGAT計(jì)算所給數(shù)據(jù)集中每對序列之間的相似性和同一性，而不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)比對。該程序使用Myers和Miller總體比對算法(缺口開始罰分為12，而缺口延伸罰分為2)進(jìn)行一系列配對比對。然后使用例如Blosum60作為算分矩陣來計(jì)算相似性和同一性，最后將結(jié)果置于距離矩陣中。序列相似性顯示在分界線底部一半處，而序列同一性顯示在分界線頂部一半處。SEQ ID NO2的序列在矩陣中指示為數(shù)字5。具有與SEQ ID NO2的序列至少30％序列同一性的序列包含細(xì)胞周期蛋白D3。
圖4顯示用來在稻(Oryza sativa)中表達(dá)β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子控制下的擬南芥細(xì)胞周期蛋白D3；3基因的雙元載體。
圖5顯示β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)的照片?！癈植物”的照片是當(dāng)?shù)局参镞_(dá)到大約5cm大小時(shí)GUS染色的照片?！癇植物”的照片是當(dāng)?shù)局参镞_(dá)到大約10cm大小時(shí)GUS染色的照片。具有相當(dāng)表達(dá)譜的啟動(dòng)子也可用于本發(fā)明的方法中。
圖6詳述了用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法中的序列的實(shí)例。
實(shí)施例現(xiàn)在本發(fā)明將參考下列實(shí)施例進(jìn)行描述，其中所述實(shí)施例僅作為例證DNA操作除非另外說明，否則重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，CSH，紐約)或Ausubel等人(1994)、Current Protocols in Molecular Biology、CurrentProtocols的卷1和2中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)(BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)發(fā)表)中進(jìn)行了描述。
實(shí)施例1基因克隆擬南芥屬細(xì)胞周期蛋白D3；3(國內(nèi)索引CDS0018)使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴(kuò)增。在對從幼苗提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄之后，將cDNA克隆進(jìn)入pCMV Sport6.0。庫的平均插入片段大小為1.5kb，而最初克隆數(shù)為1.59×107集落生成單位(cfu)。在第一次6×1011cfu/ml的擴(kuò)增之后，最初效價(jià)測定為9.6×105cfu/ml。提取質(zhì)粒之后，在50μl PCR混合物中使用200ng用作模板。使用引物prm0360(正義、起始密碼子黑體，AttB1位點(diǎn)斜體5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTTTAGAAGAGGAGGA 3’)和prm0361(反義、互補(bǔ)的，終止密碼子黑體，AttB2位點(diǎn)斜體5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTATAAGCA 3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述引物包括進(jìn)行Gateway重組的AttB位點(diǎn)。PCR在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaq DNA聚合酶進(jìn)行。也使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增1086bp的PCR片段并純化。然后進(jìn)行Gateway方法的第一個(gè)步驟BP反應(yīng)，在此期間PCR片段在體內(nèi)與pDONR201質(zhì)粒重組，從而產(chǎn)生根據(jù)Gateway命名法的“進(jìn)入”克隆p0443。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway技術(shù)的部分從Invitrogen購得。
實(shí)施例2載體構(gòu)建隨后進(jìn)入克隆p0443用來與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體p3169進(jìn)行LR反應(yīng)。這個(gè)載體在T-DNA邊界中包含下列功能原件植物選擇性標(biāo)記、植物篩選性標(biāo)記和用于LR與已在進(jìn)入克隆中克隆了的目的序列體內(nèi)重組的Gateway盒。用于在營養(yǎng)性(地上)枝條的膨脹帶中表達(dá)的β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子定位于Gateway盒上游。
LR重組步驟之后，將所得表達(dá)載體(見圖4)轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，并隨后轉(zhuǎn)化入稻植物。讓轉(zhuǎn)化的稻植物生長，然后檢測實(shí)施例3中描述的參數(shù)。
實(shí)施例3評估和結(jié)果產(chǎn)生了大約15-20顆獨(dú)立的T0代稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫室進(jìn)行生長和T1代種子收獲。維持5個(gè)T1后代分離出轉(zhuǎn)基因3∶1存在/缺失比的事件。對于每一個(gè)這些事件，通過監(jiān)測可見標(biāo)記的表達(dá)篩選出大約10株包含轉(zhuǎn)基因的T1代幼苗(雜合子和純合子)和大約10株缺少轉(zhuǎn)基因的T1代幼苗(失效合子)。最好的T1事件進(jìn)一步在T2代中用與T1代相同的方法進(jìn)行評估，但其中每個(gè)事件使用更多的個(gè)體。
統(tǒng)計(jì)分析t-檢驗(yàn)和F-檢驗(yàn)使用雙因素ANOVA(變體分析)作為植物表型特征整體評價(jià)的統(tǒng)計(jì)模型。對從用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植物中測量得到的所有參數(shù)進(jìn)行F-檢驗(yàn)。F-檢驗(yàn)用來檢驗(yàn)基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的影響以及驗(yàn)證基因的整體效應(yīng)(也稱為總體基因效應(yīng))。真實(shí)總體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F-檢驗(yàn)5％的概率水準(zhǔn)。顯著的F-檢驗(yàn)值指基因效果，其表示不僅僅是基因的存在或位置導(dǎo)致表型不同。
3.1營養(yǎng)生長測量將經(jīng)選擇的T1代植物(大約10株具轉(zhuǎn)基因，而大約10株不具轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)移至溫室。每棵植物接受獨(dú)特的條碼標(biāo)簽來將表型數(shù)據(jù)與相應(yīng)植物明確地聯(lián)系起來。經(jīng)選擇的T1代植物在10cm直徑盆的土壤中在下列環(huán)境設(shè)置下生長(在土上)光周期＝11.5小時(shí)、日光強(qiáng)度＝30,000Lux或更多、白天溫度＝28℃或更高、夜間溫度＝22℃、相對濕度＝60-70％。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置相鄰地生長。從播種階段到成熟階段，每棵植物數(shù)次經(jīng)過數(shù)字成像機(jī)(digital imaging cabinet)成像。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每棵植物至少從6個(gè)不同角度采取數(shù)字圖像(2048×1536像素、1千6百萬色彩(16 million colours))。下文所述參數(shù)使用圖像分析軟件以自動(dòng)方式從所有植物的所有數(shù)字圖像中衍生。
3.1.1地上植物面積植物地上面積通過計(jì)數(shù)排除背景后地上植物部分的像素總數(shù)測定。這個(gè)值為在同一時(shí)間點(diǎn)從不同角度拍攝的圖像的平均數(shù)，并通過校準(zhǔn)將其轉(zhuǎn)化為以平方毫米表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)顯示，這種方式測定的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。T1和T2的評測結(jié)果如下文表1所示。顯示了轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。進(jìn)行T1和T2評估的F檢驗(yàn)p值都很顯著，表明轉(zhuǎn)基因的存在對地上面積具有總體效應(yīng)。
表2地上面積
3.2種子相關(guān)參數(shù)測量收獲成熟的初級圓錐花序、裝袋、并貼上條碼標(biāo)簽，然后在37℃烤箱中干燥三天。最后拍打圓錐花序，并收集和計(jì)數(shù)所有種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開。棄去空外殼，再次計(jì)數(shù)剩余部分。在分析天平上稱重飽滿外殼。這個(gè)過程產(chǎn)生下文描述的種子相關(guān)參數(shù)。
3.2.1種子總數(shù)通過計(jì)數(shù)從植物收獲的外殼數(shù)目測定每棵植物的種子總數(shù)。下文表2顯示T1和T2評估的結(jié)果。顯示了轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。進(jìn)行T1和T2評估的F檢驗(yàn)p值都很顯著，表明轉(zhuǎn)基因的存在對產(chǎn)生的種子總數(shù)具有顯著效應(yīng)。
表3種子總數(shù)
3.2.2飽滿種子數(shù)飽滿種子數(shù)通過計(jì)數(shù)分離步驟后依然存在的飽滿外殼數(shù)測定。T1和T2代評估的結(jié)果如下文表3所示。顯示了轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。進(jìn)行T1和T2評估的F檢驗(yàn)p值都很顯著，表明轉(zhuǎn)基因的存在顯著增加產(chǎn)生的飽滿種子數(shù)。
表4飽滿種子數(shù)
3.2.3種子總重量種子總產(chǎn)量通過稱重從植物收獲的飽滿外殼測定。下文表4顯示T1和T2評估的結(jié)果。顯示了轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。進(jìn)行T1和T2評估的F檢驗(yàn)p值都很顯著，表明轉(zhuǎn)基因的存在顯著增加種子重量。
表5種子總重量
3.2.4植物的收獲指數(shù)本發(fā)明中收獲指數(shù)定義為種子總產(chǎn)量和地上面積(mm2)的比率乘以因子106。下文表5顯示T1和T2評估的結(jié)果。顯示了轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。進(jìn)行T1和T2評估的F檢驗(yàn)p值都很顯著，表明轉(zhuǎn)基因的存在顯著增加收獲指數(shù)。
表6收獲指數(shù)
實(shí)施例4p油質(zhì)蛋白∷cyclin D3；3的比較數(shù)據(jù)使用與上述制備和評估pβ-擴(kuò)展蛋白∷cyclin D3；3相同的方法制備和評估包含上述構(gòu)建體的植物。下文表6-8顯示T1代的評估結(jié)果。每個(gè)表中顯示轉(zhuǎn)基因植物和對應(yīng)失效合子之間的百分?jǐn)?shù)差異。也顯示了F檢驗(yàn)的p值。
表7地上面積
F檢驗(yàn)的p值顯著，表明受這個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)顯著減少地上面積。
表8種子總重量
結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植物的種子總重量低于相應(yīng)失效合子的種子總重量。
表9飽滿種子數(shù)
結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植物的飽滿種子數(shù)低于相應(yīng)失效合子的飽滿種子數(shù)。
實(shí)施例5β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)使用“BP重組反應(yīng)”將β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子克隆入GatewayTM系統(tǒng)(Life Techologies)的pDONR201進(jìn)入質(zhì)粒。所克隆的插入片段的身份和堿基對組分通過測序得到確認(rèn)，并額外地進(jìn)行限制性消化來檢測所得質(zhì)粒。
為了將啟動(dòng)子克隆在報(bào)道基因的前面，隨后將每個(gè)進(jìn)入克隆與目的載體用于“LR重組反應(yīng)”(Gateway TM)。這個(gè)目的載體設(shè)計(jì)為啟動(dòng)子與大腸桿菌(Escherichia coli)β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因有效連接，這通過替換在GUS基因前的Gateway重組盒實(shí)施。所得報(bào)道載體包含與GUS有效連接的啟動(dòng)子，隨后用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株LBA4044，并接下來轉(zhuǎn)化入稻植物。
轉(zhuǎn)基因稻植物從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生。植物在正常條件下生長。
用90％冰冷的丙酮覆蓋待檢測的植物或植物部分，并在4℃孵育30分鐘。用Tris緩沖液[15.76g Trizma HCl(Sigma T3253)+2.922g NaCl溶于1升重蒸餾水，用NaOH調(diào)pH 7.0]洗滌3次、每次5分鐘之后，用Tris/鐵氰酸鹽/X-Gluc溶液[9.8ml Tris緩沖液+0.2ml鐵氰酸鹽母液(0.33g鐵氰酸鉀(Sigma P3667)溶于10ml Tris緩沖液)+0.2ml X-Gluc母液(26.1mgX-Gluc(Europa Bioproducts ML 113A)溶于500μl DMSO)]。進(jìn)行真空滲入15-30分鐘。植物和植物部分在37℃孵育高達(dá)16小時(shí)，直至看見藍(lán)色產(chǎn)生。用Tris緩沖液洗滌樣品3次，每次5分鐘。在50％、70％和90％一系列的乙醇(每種30分鐘)中提取葉綠素。
序列表序列表<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>產(chǎn)量增加的植物及制備其的方法<130>CD-111-PCT<150>EP 04100991.1<151>2004-03-10<150>US 60/553,418<151>2004-03-16<160>5<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1086<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggctttag aagaggagga agagagtcaa aacgcaccgt tttgtgttct tgatggtctt 60ttctgtgagg aagagagtga gtttcacgaa caagtagatt tgtgcgacga gagtgttgaa 120aagtttcctt ttttaaatct gggtttgtct gatcatgata tgttgtggga tgatgatgag 180ttatcaactt tgatttcgaa acaagaaccg tgtctttatg acgaaatctt agatgatgag 240tttctggttt tgtgtcgtga aaaggctctt gattggattt ttaaagtgaa atctcattat 300gggtttaatt cattgacggc tcttttagct gttaattact tcgataggtt tattacaagc 360aggaagtttc agacagataa gccatggatg tctcagctta ctgctttggc ttgtctgtct 420ttagctgcta aggttgaaga gatccgtgtt ccttttctct tagattttca agtggaagaa 480gcaagatatg tctttgaagc taagactata cagagaatgg agcttcttgt tctgtctact 540cttgactgga ggatgcatcc tgtgactcca atctcgtttt tcgatcacat tattcgacga 600tacagcttta aatctcatca tcaattggag ttcttgagta gatgtgaatc tttattactc 660tccattattc ctgattcgag atttctgagt tttagtcctt ctgtgttagc cactgcaata 720atggtctctg ttattagaga tttgaagatg tgtgacgaag ctgtatacca atctcagctc 780
atgactctac tcaaagttga ttcggagaag gtaaataaat gctatgagtt agtgttagac 840cacagtccaa gcaagaaaag gatgatgaat tggatgcaac aacccgctag tccgatcggt 900gtgtttgatg cgtcattcag ttctgatagc tcgaatgagt cgtgggttgt gtctgcttct 960gcttcagtgt cgtcttcacc atcttcagag cctttgctca agaggagaag agtgcaagag 1020cagcagatga ggctatcttc aataaaccga atgtttttcg atgtgcttag tagtagtcct 1080cgctaa 1086<210>2<211>361<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Ala Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Gln Asn Ala Pro Phe Cys Val1 5 10 15Leu Asp Gly Leu Phe Cys Glu Glu Glu Ser Glu Phe His Glu Gln Val20 25 30Asp Leu Cys Asp Glu Ser Val Glu Lys Phe Pro Phe Leu Asn Leu Gly35 40 45Leu Ser Asp His Asp Met Leu Trp Asp Asp Asp Glu Leu Ser Thr Leu50 55 60Ile Ser Lys Gln Glu Pro Cys Leu Tyr Asp Glu Ile Leu Asp Asp Glu65 70 75 80Phe Leu Val Leu Cys Arg Glu Lys Ala Leu Asp Trp Ile Phe Lys Val85 90 95Lys Ser His Tyr Gly Phe Asn Ser Leu Thr Ala Leu Leu Ala Val Asn100 105 110Tyr Phe Asp Arg Phe Ile Thr Ser Arg Lys Phe Gln Thr Asp Lys Pro115 120 125
Trp Met Ser Gln Leu Thr Ala Leu Ala Cys Leu Ser Leu Ala Ala Lys130 135 140Val Glu Glu Ile Arg Val Pro Phe Leu Leu Asp Phe Gln Val Glu Glu145 150 155 160Ala Arg Tyr Val Phe Glu Ala Lys Thr Ile Gln Arg Met Glu Leu Leu165 170 175Val Leu Ser Thr Leu Asp Trp Arg Met His Pro Val Thr Pro Ile Ser180 185 190Phe Phe Asp Hi s IleIle Arg Arg Tyr Ser Phe Lys Ser His His Gln195 200 205Leu Glu Phe Leu Ser Arg Cys Glu Ser Leu Leu Leu Ser Ile Ile Pro210 215 220Asp Ser Arg Phe Leu Ser Phe Ser Pro Ser Val Leu Ala Thr Ala Ile225 230 235 240Met Val Ser Val Ile Arg Asp Leu Lys Met Cys Asp Glu Ala Val Tyr245 250 255Gln Ser Gln Leu Met Thr Leu Leu Lys Val Asp Ser Glu Lys Val Asn260 265 270Lys Cys Tyr Glu Leu Val Leu Asp His Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met275 280 285Met Asn Trp Met Gln Gln Pro Ala Ser Pro Ile Gly Val Phe Asp Ala290 295 300Ser Phe Ser Ser Asp Ser Ser Asn Glu Ser Trp Val Val Ser Ala Ser305 310 315 320
Ala Ser Val Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Pro Leu Leu Lys Arg Arg325 330 335Arg Val Gln Glu Gln Gln Met Arg Leu Ser Ser Ile Asn Arg Met Phe340 345 350Phe Asp Val Leu Ser Ser Ser Pro Arg355 360<210>3<211>1243<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>3aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataaggaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960
gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa 1020gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcggcgcgc acgtacgaat gcacgcacgc acgcccaacc 1080ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccat ccacccgcgc cctcacctcg 1140ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa 1200aggaaaaaaa aacaaaacac accaagccaa ataaaagcga caa1243<210>4<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm0360<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct ttagaagagg agga 54<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm0361<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tagcgaggac tactataagc a 5權(quán)利要求
1.增加植物產(chǎn)量的方法，其包括向植物中引入于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子控制之下的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的地上面積。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(iii)增加的種子大??；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數(shù)；和(vi)增加的千粒核重量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)胞周期蛋白D3的所述核酸從植物中獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其包括向植物中引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，其中所述核酸或其功能性變體選自(i)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的部分；(ii)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的備選剪接變體；(iii)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的等位變體；和(iv)細(xì)胞周期蛋白D3氨基酸的同源物、衍生物和活性片段，其中所述功能性變體(i)-(iv)能夠結(jié)合并激活植物CDK。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中能在枝條中優(yōu)選表達(dá)所述核酸的所述啟動(dòng)子具有與β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜。
8.產(chǎn)生相比對應(yīng)的野生型植物具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其變體，優(yōu)選SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，其中所述核酸或其功能性變體編碼細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體，其中所述多肽優(yōu)選如SEQ ID NO2所示、或者是其功能性變體，并且所述核酸或其功能性變體與能在枝條尤其是營養(yǎng)性(地上)枝條的細(xì)胞膨脹帶中優(yōu)選表達(dá)所述核酸的啟動(dòng)子有效連接；(ii)在促進(jìn)再生和成熟植物生長的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其中所述增加的產(chǎn)量包含增加的地上面積，并且其中所述增加的種子產(chǎn)量選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(iii)增加的種子大小；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數(shù)；和(vi)增加的千粒核重量。
11.增加植物產(chǎn)量尤其是種子產(chǎn)量的方法，其包括向植物中編碼細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體的基因的基因座中引入遺傳修飾，以允許基因在枝條中優(yōu)選表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述遺傳修飾通過誘變、同源重組、TILLING和T-DNA激活中的任意一種或多種實(shí)施。
13.通過根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法可以獲得的植物。
14.構(gòu)建體，其包含(i)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體、優(yōu)選SEQ ID NO1代表的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，其中所述核酸編碼細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體、優(yōu)選編碼SEQ ID NO2代表的細(xì)胞周期蛋白D3多肽或其功能性變體；(ii)能在枝條尤其是營養(yǎng)性(地上)枝條的細(xì)胞膨脹帶中優(yōu)選表達(dá)(i)的核酸的啟動(dòng)子；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子具有與β-擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜。
16.用根據(jù)權(quán)利要求14或15的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。
17.相比對應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述植物包含編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸或其功能性變體，位于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)所述核酸的啟動(dòng)子控制下。
18.根據(jù)權(quán)利要求13、16或16的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物例如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥屬、燕麥屬或高粱屬。
19.根據(jù)權(quán)利要求13或16-18中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物的可收獲部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
21.與能在枝條中優(yōu)選表達(dá)編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸的啟動(dòng)子有效連接的編碼細(xì)胞周期蛋白D3的經(jīng)分離核酸的用途，用于增加產(chǎn)量尤其是增加種子產(chǎn)量。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其中所述種子產(chǎn)量包括(i)增加的種子生物量、(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)量、(iii)增加的種子大小、(iv)增加的種子體積、(v)增加的收獲指數(shù)和(vi)增加的千粒核重量中的任意一種或多種。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其中所述編碼細(xì)胞周期蛋白D3的核酸是SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性變體，或者其中所述細(xì)胞周期蛋白D3是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其功能性變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過向植物引入編碼細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)的核酸來增加植物產(chǎn)量的方法，其中所述核酸于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下。本發(fā)明也涉及包含編碼細(xì)胞周期蛋白D3蛋白質(zhì)的核酸的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸于能在枝條中優(yōu)選表達(dá)該核酸的啟動(dòng)子控制之下，并且其中所述植物相比對應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)量。本發(fā)明也涉及在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
文檔編號C07K14/415GK1950511SQ200580014746
公開日2007年4月18日 申請日期2005年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者V·弗蘭卡德 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司