專(zhuān)利名稱(chēng)：被修飾Bouganin蛋白、細(xì)胞毒素及其方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被修飾bouganin蛋白和包含可用作癌癥治療劑的被修飾蛋白的細(xì)胞毒素。確切地說(shuō)，通過(guò)去除或改變T-細(xì)胞表位從而降低bouganin毒素的免疫原性。
背景技術(shù)：
存在許多這樣的例子，治療性蛋白質(zhì)的效力受限于對(duì)該治療性蛋白質(zhì)出現(xiàn)的不期望的免疫反應(yīng)。幾種小鼠單克隆抗體已經(jīng)在許多人類(lèi)疾病環(huán)境中表現(xiàn)出作為治療劑的可能性，但它們卻在特定病例中由于誘導(dǎo)出顯著的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而失效[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對(duì)于單克隆抗體，已開(kāi)發(fā)出許多技術(shù)以試圖降低HAMA應(yīng)答[WO 89/09622；EP 0239400；EP 0438310、WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常降低最終抗體構(gòu)建物中的小鼠遺傳信息而同時(shí)提高最終構(gòu)建物中的人遺傳信息。盡管如此，在某些情況下，所得的“人源化”抗體仍然在患者體內(nèi)引發(fā)了免疫應(yīng)答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation681417-1420]。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵是在蛋白質(zhì)內(nèi)存在能夠通過(guò)呈遞至II類(lèi)MHC分子上而刺激T細(xì)胞活性的肽，即所謂的T細(xì)胞表位。這樣的T-細(xì)胞表位通常是任何能夠與II類(lèi)MHC分子結(jié)合的氨基酸殘基序列。“T-細(xì)胞表位”暗指當(dāng)其與MHC分子結(jié)合時(shí)能夠被T-細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的表位，且至少在理論上它能夠通過(guò)與TCR結(jié)合導(dǎo)致這些T細(xì)胞的活化從而促進(jìn)T-細(xì)胞應(yīng)答。
II類(lèi)MHC分子是一群高度多態(tài)的蛋白質(zhì)，它們?cè)谳o助T-細(xì)胞選擇和活化中起重要作用。人白細(xì)胞抗原群DR(HLA-DR)是這組蛋白質(zhì)的主要同種型；然而，同種型HLA-DQ和HLA-DP執(zhí)行相似的功能。在人類(lèi)群體中，個(gè)體帶有二至四個(gè)DR等位基因、兩個(gè)DQ和兩個(gè)DP等位基因。許多DR分子的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被分析清楚，它們呈現(xiàn)為具有許多與蛋白質(zhì)疏水殘基(口袋殘基)結(jié)合的疏水口袋的開(kāi)放末端肽結(jié)合溝[Brown等人(1993)Nature36433；Stern等人(1994)Nature368215]。用于區(qū)分同種異型II類(lèi)分子的多態(tài)性促成了肽結(jié)合溝內(nèi)極度多樣的不同肽結(jié)合表面，并且在群體水平上確保了其識(shí)別異源蛋白和發(fā)起對(duì)病源生物的免疫應(yīng)答的最大靈活度。
對(duì)治療性蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答通過(guò)II類(lèi)MHC肽呈遞途徑發(fā)生。此時(shí)外源蛋白質(zhì)被吞入并經(jīng)過(guò)加工與DR、DQ或DP型的II類(lèi)MHC分子一起被呈遞。II類(lèi)MHC分子由專(zhuān)門(mén)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)，比如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞等。II類(lèi)MHC肽復(fù)合物被T-細(xì)胞表面的同類(lèi)T-細(xì)胞受體的結(jié)合，以及與比如CD4分子這樣的其它特定共同受體的交叉結(jié)合，可誘導(dǎo)T-細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)活化狀態(tài)。該活化導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放并進(jìn)一步激活比如B細(xì)胞這樣的其它的淋巴細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生抗體或激活T-殺傷細(xì)胞形成全細(xì)胞免疫應(yīng)答。
根據(jù)WO98/52976、WO00/34317、WO02/069232、WO02/079232和WO02/079415所認(rèn)識(shí)到的，表位去除是T-細(xì)胞表位鑒定的第一步。在這些教導(dǎo)中，通過(guò)在目的蛋白中進(jìn)行審慎的氨基酸取代來(lái)去除預(yù)計(jì)的T-細(xì)胞表位。除計(jì)算機(jī)技術(shù)外，還有許多測(cè)定合成肽結(jié)合II類(lèi)MHC分子的能力的方法。一種示例方法利用了確定MHC同種異型的B-細(xì)胞系作為II類(lèi)MHC結(jié)合表面的來(lái)源，且可應(yīng)用于II類(lèi)MHC配體鑒定[Marshall K.W等人(1994)J.Immunol.1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)J.Immunol.1451799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol1593238-3246]。然而，這樣的技術(shù)不適于從極度多樣的MHC同種異型篩選多個(gè)潛在表位，它們也無(wú)法驗(yàn)證一種結(jié)合肽作為T(mén)-細(xì)胞表位起作用的能力。
開(kāi)發(fā)重組MHC分子與合成肽的可溶性復(fù)合物的技術(shù)也逐漸被采用[Kern，F(xiàn).等人(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol.22583-588]。這些試劑和方法用于鑒定源自人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物外周血樣品中是否存在能夠結(jié)合特定MHC-肽復(fù)合物的T-細(xì)胞克隆，且適于從極度多樣的MHC同種異型篩選多個(gè)潛在表位T-細(xì)胞活化的生物檢測(cè)法為閱讀測(cè)試肽/蛋白序列激發(fā)免疫應(yīng)答的能力提供了一種實(shí)際選擇途徑。這類(lèi)方法的例子包括Petra等人將T-細(xì)胞增殖檢測(cè)法應(yīng)用于鏈激酶、之后利用合成肽刺激T-細(xì)胞系進(jìn)行表位作圖的工作[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol.168155-161]。類(lèi)似地，利用了破傷風(fēng)毒素蛋白的合成肽的T-細(xì)胞增殖檢測(cè)法成功地定義了該毒素的主要免疫表位[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol.1516175-6184]。WO99/53038公開(kāi)了一種方法，在該方法中通過(guò)利用分離的人免疫細(xì)胞亞組，在存在目的合成肽的情況下促進(jìn)它們的體外分化和培養(yǎng)，以及測(cè)定任何所誘導(dǎo)的培養(yǎng)T-細(xì)胞的增殖，可以測(cè)定測(cè)試蛋白中的T-細(xì)胞表位。Stickler等人也描述了同樣的技術(shù)[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy23654-660]，在這兩個(gè)例子中，都將該方法應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶中的T-細(xì)胞表位。這樣的技術(shù)需要細(xì)心的細(xì)胞分離技術(shù)和添加多種細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)以獲得令人滿(mǎn)意的免疫細(xì)胞亞組(樹(shù)突細(xì)胞、CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞)，且無(wú)益于利用多個(gè)供體樣品的快通量篩選。
近來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一種將基于總體的T-細(xì)胞增殖檢測(cè)法和在設(shè)計(jì)去除表位的蛋白質(zhì)時(shí)在計(jì)算機(jī)上模擬肽MHC結(jié)合相結(jié)合的組合方法。WO 03/104803]。
如上述及其結(jié)果，令人滿(mǎn)意的是鑒定并除去或至少減少一種總體而言具有治療價(jià)值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白質(zhì)上的T-細(xì)胞表位。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是克服這一實(shí)際問(wèn)題因治療目的而導(dǎo)入人體中的可溶性蛋白質(zhì)會(huì)引發(fā)導(dǎo)致產(chǎn)生與可溶性蛋白結(jié)合的宿主抗體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明試圖通過(guò)提供具有減弱的引發(fā)免疫應(yīng)答傾向的bouganin蛋白來(lái)解決該問(wèn)題。根據(jù)本文描述的方法，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了bouganin分子中包含驅(qū)動(dòng)對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答的T-細(xì)胞表位的區(qū)域。
本發(fā)明涉及一種被修飾Bouganin蛋白，該被修飾Bouganin具有減弱的引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，該被修飾Bouganin具有減弱的激活T-細(xì)胞的傾向，且該被修飾Bouganin在T-細(xì)胞表位中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處經(jīng)過(guò)了修飾。該T-細(xì)胞表位優(yōu)選選自a)AKVDRKDLELGVYKL(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO2)，b)LGVYKLEFSIEAIHG(表位區(qū)域R2，SEQ ID NO3)；和c)NGQEIAKFFLIVIQM(表位區(qū)域R3，SEQ ID NO4)。
本發(fā)明還涉及一種包含與本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白結(jié)合的靶部分的細(xì)胞毒素。在一種實(shí)施方式中，該靶部分是一種與癌細(xì)胞結(jié)合的配體。在另一種實(shí)施方式中，該配體是一種與癌細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片段。在一種特定實(shí)施方式中，該抗體識(shí)別Ep-CAM或腫瘤-結(jié)相關(guān)抗原。在一種最特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種包含VB6-845或VB6-011的細(xì)胞毒素。
另一方面，本發(fā)明提供一種抑制或破壞癌細(xì)胞的方法，包括向癌細(xì)胞施用本發(fā)明的細(xì)胞毒素。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)動(dòng)物的需要通過(guò)向其施用本發(fā)明的細(xì)胞毒素來(lái)治療癌癥的方法。
更進(jìn)一步，還提供了一種制備用于治療患有癌癥的動(dòng)物的藥物的方法，包括以下步驟鑒定bouganin的T-細(xì)胞表位，修飾T-細(xì)胞表位中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基從而制備具有減弱的激活T-細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin；制備帶有一個(gè)結(jié)合于被修飾Bouganin的癌-結(jié)合配體的細(xì)胞毒素；和將該細(xì)胞毒素懸浮于藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
在又一方面，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的藥物組合物，它包含本發(fā)明的細(xì)胞毒素和藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
本發(fā)明的細(xì)胞毒素、組合物和方法可用于治療各種不同形式的癌癥，比如結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞癌、惡性毒瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
本發(fā)明還提供Bouganin蛋白的T-細(xì)胞表位肽和本發(fā)明的被修飾T-細(xì)胞表位肽。
根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將逐漸顯現(xiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，該詳細(xì)說(shuō)明和說(shuō)明本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的特定實(shí)施例僅僅作為解釋說(shuō)明而提供，因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)從該詳細(xì)說(shuō)明得到在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種不同變化和修飾是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將結(jié)合以下附圖進(jìn)行說(shuō)明附

圖1顯示去除了T-細(xì)胞表位的被修飾Bouganin蛋白Bou156(panel A)和Bou157(panel B)的活性檢測(cè)結(jié)果。Bou156包括V123A、D127A、Y133N和I152A取代。Bou157包括V123A、D127A、Y133Q和I152A取代。兩種檢測(cè)都以野生型蛋白和失活的被修飾Bouganin(Y70A)作為對(duì)照。活性以熒光素酶活性比檢測(cè)中Bouganin蛋白濃度的％表示。
附圖2顯示三個(gè)合成肽和兩個(gè)不同的PBMC供體樣品的T-細(xì)胞增殖檢測(cè)。檢測(cè)了1μM終濃度終濃度(panel A)和5μM終濃度(panel B)的名稱(chēng)為DeI-41、DeI-44和DeI-50的肽。這些肽源自bouganin分子的免疫原性區(qū)域，包含為去除其免疫原性而設(shè)計(jì)的取代。
附圖3表示VB6-845，一種具有一個(gè)Fab抗-Ep-CAM的被修飾Bouganin細(xì)胞毒素，其中該de-bouganin(Bou156)通過(guò)一個(gè)成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶接頭與CH結(jié)構(gòu)域的C-末端相連接。附圖3A顯示編碼原序列的雙順?lè)醋訂卧?，附圖3B顯示該原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO15)和氨基酸序列(SEQ ID NO16)，以及附圖3C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845蛋白。
附圖4顯示表達(dá)載體pING3302的圖形。利用EcoRI和XhoI限制性位點(diǎn)將實(shí)施例中的插入連接到3302載體中。
附圖5顯示不含植物毒素的對(duì)照Fab抗-Ep-CAM構(gòu)建體，de-bouganin(VB5-845)。附圖5A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖5B顯示該原序列的核酸編碼序列(SEQ ID NO17)和氨基酸序列(SEQID NO18)，以及附圖5C顯示不含pelB序列的組裝VB5-845蛋白。
附圖6顯示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin構(gòu)建體VB6-845-CL-de-bouganin，其中Bou156連接于CL結(jié)構(gòu)域的C-末端。附圖6A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖6B顯示該原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO19)和氨基酸序列(SEQ ID NO20)，以及附圖6C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-CL-de-Bouganin蛋白。
附圖7顯示Fab抗Ep-CAM，de-bouganin構(gòu)建體，VB6-845-NVH-de-bouganin，其中Bou156連接于VH結(jié)構(gòu)域的N-末端。附圖7A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖7B顯示該原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO21)和氨基酸序列(SEQ ID NO22)，以及附圖7C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-NVH-de-Bouganin蛋白。
附圖8顯示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin構(gòu)建體，VB6-845-NVL-de-bouganin，其中Bou156連接于VL結(jié)構(gòu)域的N-末端。附圖8A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖8B顯示該原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO23)和氨基酸序列(SEQ ID NO24)，以及附圖8C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-NVL-de-Bouganin蛋白。
附圖9是顯示在實(shí)驗(yàn)室水平誘導(dǎo)的E104細(xì)胞上清液中VB6-845(附圖3的構(gòu)建體)和VB6-845-CL-de-bouganin(Bou156)(附圖6的構(gòu)建體)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。
附圖10顯示流式細(xì)胞術(shù)反應(yīng)性研究結(jié)果。附圖10A顯示VB6-845(附圖3的構(gòu)建體)和VB6-845-CL-de-bouganin(附圖6的構(gòu)建體)在Ep-CAM-陽(yáng)性細(xì)胞系CAL 27和OVCAR-3和Ep-CAM-陰性細(xì)胞系A(chǔ)-375中的結(jié)果，而附圖10B顯示用VB6-845(附圖3的構(gòu)建體)和VB6-845-白樹(shù)毒蛋白(附圖14C的構(gòu)建體)和對(duì)照(PBS)所作的相同測(cè)試的結(jié)果。
附圖11是顯示如實(shí)施例7中所述的-VB6-845和ProxiniumTM在NIHOVCAR-3細(xì)胞中的競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)結(jié)果的圖。
附圖12是顯示實(shí)施例7的無(wú)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的圖。
附圖13顯示實(shí)施例8中比較VB6-845(附圖3的構(gòu)建體)、VB6-845-CL-de-bouganin(附圖6的構(gòu)建體)和de-bouganin(Bou156)在CAL 27(附圖13A)和NIHOVCAR3(附圖13B)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的MTS細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果。
附圖14A和B顯示實(shí)施例8中比較VB6-845(的構(gòu)建體附圖3)、VB6-845-白樹(shù)毒蛋白(的構(gòu)建體附圖14C)和白樹(shù)毒蛋白在CAL 27(附圖14A)和NIHOVCAR3(附圖14B)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的MTS細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果。附圖14C顯示核酸編碼序列(SEQ ID NO25)和VB6-845-白樹(shù)毒蛋白構(gòu)建體的氨基酸序列(SEQ ID NO26)。
附圖15顯示VB6-011原序列的核酸編碼序列(SEQ ID NO27)和氨基酸序列(SEQ ID NO28)。
附圖16顯示實(shí)施例9的MTS細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果，其VB6-011在MB-435S細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。
發(fā)明詳述本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了Bouganin中的T-細(xì)胞表位，并且已經(jīng)設(shè)計(jì)和制備出了與非-被修飾Bouganin蛋白相比具有減弱的激活人T細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin蛋白。
(A)被修飾Bouganin蛋白本發(fā)明涉及一種被修飾Bouganin蛋白，其中為獲得與非被修飾-Bouganin蛋白相比減弱了的引發(fā)免疫應(yīng)答，優(yōu)選為T(mén)-細(xì)胞應(yīng)答，的傾向已經(jīng)對(duì)bouganin進(jìn)行了修飾。成熟的Bouganin蛋白是具有250個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子量約為26,200 Da[Den Hartog等人(2002)EuR.J.Biochem.2691772-1779；美國(guó)專(zhuān)利NO.6,680,296]。Bouganin最初是分離自植物Bougainvillea spectabilis Willd的1型核糖體失活蛋白(RIP)[Bolognesi等人(1997)Planta203422-429]。這些來(lái)自植物的RIP是使細(xì)胞的主要核糖體RNA脫嘌呤、由此破壞核糖體和導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成中止及細(xì)胞死亡的RNA N-糖苷酶。
成熟Bouganin蛋白的氨基酸序列(以單字母碼表示)為YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK[SEQ ID NO1]。
術(shù)語(yǔ)“非-被修飾Bouganin蛋白”意指，未經(jīng)為降低其引發(fā)免疫應(yīng)答傾向的修飾的Bouganin蛋白。野生型或非-被修飾Bouganin的序列示于SEQ ID NO1中。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，術(shù)語(yǔ)“非-被修飾Bouganin”也包括對(duì)SEQ ID NO1的修飾，只要這樣的修飾不會(huì)降低其引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向?？梢詫?duì)SEQ ID NO1作出的修飾的例子包括肽片段和不降低該蛋白質(zhì)免疫原性的保守氨基酸取代。
術(shù)語(yǔ)“被修飾Bouganin蛋白”意指與非-被修飾Bouganin蛋白(如上所述)相比已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾的Bouganin蛋白，其中所述修飾會(huì)降低bouganin引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向。被修飾Bouganin蛋白還可以指脫免疫的bouganin?！氨恍揎桞ouganin蛋白”可以是經(jīng)過(guò)修飾的全長(zhǎng)序列或經(jīng)過(guò)修飾的非-被修飾Bouganin蛋白片段。與野生型bouganin序列相比，“被修飾Bouganin蛋白”還可能包含其它不改變?cè)撾牡拿庖咴缘母淖?。被修飾Bouganin蛋白優(yōu)選具有與非-被修飾Bouganin相同的生物學(xué)活性。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“降低的引發(fā)免疫應(yīng)答的傾向”意指，被修飾Bouganin蛋白具有比非-被修飾Bouganin更低的免疫原性。
術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”包括細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答二者。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，被修飾Bouganin具有降低的激活T-細(xì)胞的傾向。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“降低的激活人T-細(xì)胞的傾向”意指被修飾Bouganin蛋白具有比非-被修飾Bouganin蛋白更低的激活人T-細(xì)胞的傾向。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用本領(lǐng)域已知的方法，包括評(píng)估該蛋白的刺激指數(shù)，測(cè)試被修飾Bouganin是否具有更低的激活T-細(xì)胞的傾向。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“刺激指數(shù)”指被修飾或非-被修飾Bouganin蛋白激活人T細(xì)胞的能力的度量。例如，可以測(cè)試被修飾或非-被修飾Bouganin蛋白、或其肽在體外激發(fā)人T-細(xì)胞增殖應(yīng)答的能力。當(dāng)采用取自健康供體的原始人T-細(xì)胞來(lái)完成該類(lèi)型的方法，本發(fā)明人已經(jīng)確定，在這樣一種檢測(cè)方法的操作中，等于或大于2.0的刺激指數(shù)是一個(gè)有效的誘導(dǎo)增殖的度量。刺激指數(shù)通常得自將用測(cè)試肽測(cè)得的增殖分?jǐn)?shù)(例如如果使用3H-胸腺嘧啶摻入的話(huà)計(jì)算每分鐘的放射活性)除以在未接觸測(cè)試肽的細(xì)胞中測(cè)得的分?jǐn)?shù)。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾Bouganin蛋白，該被修飾Bouganin蛋白具有生物活性且具有比非-被修飾Bouganin蛋白低的激活人T細(xì)胞的傾向。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾Bouganin蛋白，該被修飾Bouganin蛋白具有比非-被修飾Bouganin蛋白低的激活人T細(xì)胞的傾向以及具有低于非-被修飾Bouganin蛋白的生物活性。在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾Bouganin蛋白，該被修飾Bouganin蛋白具有降低的激活人T細(xì)胞的傾向且無(wú)生物活性。這樣的被修飾蛋白可以，例如，用作對(duì)照、用于檢測(cè)或tolerize subjects。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”是指被修飾或非-被修飾Bouganin蛋白抑制核糖體上的蛋白質(zhì)合成的能力，它可以通過(guò)多種方法進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)當(dāng)注意，被修飾Bouganin蛋白仍然具有生物活性，即使這樣的活性低于非-被修飾的蛋白的，然而它需要具有一定水平的可檢測(cè)活性。例如，被修飾或非-被修飾Bouganin蛋白的生物活性可以通過(guò)鑒定其N(xiāo)-糖苷酶活性來(lái)測(cè)定，且尤其具有足夠的活性來(lái)提供對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的顯著抑制。一種這樣的適宜檢測(cè)方法包括在無(wú)細(xì)胞蛋白合成檢測(cè)中測(cè)試變體bouganin蛋白與非-被修飾Bouganin相比的活性。將包含甲硫氨酸的轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)混合物、編碼報(bào)告蛋白熒光素酶的DNA和非被修飾和被修飾Bouganin蛋白的梯度稀釋物共同孵育。加入底物試劑后用發(fā)光計(jì)數(shù)器可以容易地測(cè)定所翻譯的熒光素酶水平。所測(cè)定的發(fā)光量與反應(yīng)中存在的bouganin N-糖苷酶活性成反比。通常提供比如失活Bouganin蛋白，例如包含Y70A取代，這樣的陰性對(duì)照。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，被修飾Bouganin肽在Bouganin蛋白序列中的一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位被修飾。
術(shù)語(yǔ)“T-細(xì)胞表位”意指，能夠結(jié)合II型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)、能夠刺激T-細(xì)胞和/或在與II類(lèi)MHC的復(fù)合物中能夠結(jié)合(不需要可測(cè)定的激活)T-細(xì)胞的氨基酸序列。
一方面，可以在本發(fā)明中使用得到含有經(jīng)過(guò)修飾的T-細(xì)胞表位的被修飾Bouganin蛋白的總體方法包括以下步驟(i)確定蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列；(ii)通過(guò)比如利用體外或計(jì)算機(jī)芯片技術(shù)或生物檢測(cè)法測(cè)定肽與MHC分子的結(jié)合這樣的方法鑒定該蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一或多個(gè)潛在T-細(xì)胞表位；(iii)設(shè)計(jì)帶有一或多個(gè)位于所鑒定的T-細(xì)胞表位中的經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸的新序列變體，根據(jù)利用體外或計(jì)算機(jī)芯片技術(shù)或生物檢測(cè)法測(cè)定肽與MHC分子的結(jié)合所確定的，通過(guò)這種方式來(lái)基本上降低或去除該T-細(xì)胞表位的活性。以避免由于該序列突變而形成新的潛在T-細(xì)胞表位的方式來(lái)構(gòu)造這樣的序列變體表位，除非接下來(lái)再以這種方式來(lái)修飾這樣的新潛在T-細(xì)胞表位以基本或去除T-細(xì)胞表位的活性；(iv)通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建這樣的序列變體，和根據(jù)熟知的重組技術(shù)測(cè)試所述變體以鑒定一或多個(gè)具有所需特性的變體；和(v)選擇性地重復(fù)步驟(ii)至(iv)。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)對(duì)非-被修飾Bouganin蛋白中任一T-細(xì)胞表位中的氨基酸殘基進(jìn)行取代、添加或缺失來(lái)實(shí)施步驟(iii)。在另一個(gè)實(shí)施例中，制備被修飾Bouganin蛋白的方法參照同源蛋白序列和/或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行。
根據(jù)步驟(ii)來(lái)鑒定潛在的T-細(xì)胞表位可以按照本領(lǐng)域以前描述過(guò)的方法來(lái)完成。適宜的方法公開(kāi)于WO 98/59244、WO 98/52976、WO00/34317、WO 02/069232，可用于鑒定bouganin衍生肽與II類(lèi)MHC分子的結(jié)合傾向。為鑒定生物相關(guān)肽，本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)出一種用于exploiting離體人T-細(xì)胞增殖檢測(cè)的方法。已證實(shí)該方法是一種非常有效的方法，它包括在某個(gè)方案中對(duì)重疊bouganin衍生肽序列進(jìn)行測(cè)試以?huà)呙韬蜏y(cè)試整個(gè)bouganin序列。測(cè)試合成肽激發(fā)體外培養(yǎng)的人T-細(xì)胞的增殖應(yīng)答的能力。本發(fā)明人用取自健康供體的天然人T-細(xì)胞來(lái)實(shí)施該類(lèi)型方法，已經(jīng)確立，在這樣一種檢測(cè)方法的操作中，等于或大于2.0的刺激指數(shù)是一個(gè)有效的誘導(dǎo)增殖的度量。刺激指數(shù)通常得自將用測(cè)試肽測(cè)得的增殖分?jǐn)?shù)(例如如果使用3H-胸腺嘧啶摻入的話(huà)計(jì)算每分鐘的放射活性)除以在未接觸測(cè)試肽的細(xì)胞中測(cè)得的分?jǐn)?shù)。
相應(yīng)地，在本發(fā)明的研究中，在用取自天然供體(也即不存在已知的bouganin的致敏)的PBMC(外周血單核細(xì)胞)做的T-細(xì)胞增殖檢測(cè)中，使用了89個(gè)合成的15-mer肽(列于表1)。選擇了20份供體PBMC樣品以達(dá)到最理想的II類(lèi)MHC同種異型覆蓋率。在通過(guò)3H-胸腺嘧啶摻入來(lái)評(píng)估增殖之前，用各肽在三份培養(yǎng)物中刺激7天。所有的肽均稀釋為兩個(gè)濃度1μM和5μM。刺激指數(shù)(SI)計(jì)算為摻入細(xì)胞的3H量，除以假刺激對(duì)照中摻入的3H量。
本方法已經(jīng)鑒定出了bouganin分子在人體中最具免疫原性的區(qū)域。因此，在一種特定實(shí)施方式中，被修飾Bouganin蛋白在T-細(xì)胞表位中選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基得到修飾a)AKVDRKDLELGVYKL，本文中稱(chēng)作表位區(qū)域R1(SEQID NO2)；b)LGVYKLEFSIEAIHG，本文中稱(chēng)作表位區(qū)域R2(SEQ IDNO3)；和c)NGQEIAKFFLIVIQM，本文中稱(chēng)作表位區(qū)域R3(SEQ IDNO4)
根據(jù)在兩個(gè)或多個(gè)供體PBMC樣品中給出的SI＞2，已經(jīng)鑒定出了這些T-細(xì)胞表位。上述公開(kāi)的肽序列給出了構(gòu)建被修飾Bouganin蛋白所需的關(guān)鍵信息，在這些被修飾蛋白中一個(gè)或多個(gè)這些肽被弱化。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白被除去了至少一個(gè)T-細(xì)胞表位。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白被除去了一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)T-細(xì)胞表位。本發(fā)明還考慮了一種被修飾Bouganin蛋白，其中優(yōu)選在T-細(xì)胞表位中有1至9個(gè)氨基酸殘基被修飾。在另一種實(shí)施方式中，修飾了1至5個(gè)氨基酸殘基。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“被修飾”意指，通過(guò)取代、添加或缺失對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行被修飾，優(yōu)選通過(guò)取代，但Bouganin蛋白具有減弱的刺激人T細(xì)胞的傾向。在另一種實(shí)施方式中，被修飾的蛋白具有生物學(xué)活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白通過(guò)在對(duì)應(yīng)于上述序列(a)、(b)或(c)中特定的任一氨基酸的位置進(jìn)行取代得以修飾。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式包括bouganin蛋白，對(duì)于這些蛋白，對(duì)在表位R1～R3任何一個(gè)中鑒定到的II類(lèi)MHC配體進(jìn)行了修飾以使結(jié)合消失或者減少該肽能夠結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量?？梢酝ㄟ^(guò)取代、添加或缺失來(lái)對(duì)R1至R3區(qū)域中使結(jié)合消失或者減少該肽能夠結(jié)合的MHC同種異型數(shù)量的氨基酸進(jìn)行修飾。
為去除T-細(xì)胞表位，在肽序列中預(yù)計(jì)能夠?qū)崿F(xiàn)基本減弱或除去T-細(xì)胞表位活性的適當(dāng)位置進(jìn)行氨基酸取代。在實(shí)踐中，適宜位置在一種實(shí)施方式中是結(jié)合于II類(lèi)MHC結(jié)合溝口袋內(nèi)的氨基酸殘基。
在一種實(shí)施方式中，對(duì)位于肽的所謂的P1或P1錨位置的裂隙的第一個(gè)口袋內(nèi)的結(jié)合進(jìn)行修飾。肽P1錨殘基與II類(lèi)MHC結(jié)合溝第一口袋間的結(jié)合互作的質(zhì)量被視為整個(gè)肽分子的總結(jié)合親和力的主要決定因素。肽該位置的適宜取代將用更不易于容納進(jìn)該口袋的殘基來(lái)進(jìn)行，例如，取代為一個(gè)更加親水的殘基。還考慮了肽中位于等同于MHC結(jié)合裂隙中的其它口袋區(qū)域的結(jié)合的氨基酸殘基。
可以理解，在給定潛在T-細(xì)胞表位中的單個(gè)氨基酸取代、缺失或添加是一種優(yōu)選的去除表位的途徑。可以考慮在單一表位中的組合修飾(也即取代、缺失和添加)，例如當(dāng)各定義表位間彼此重疊時(shí)尤其適于采用組合修飾，正如本發(fā)明中表位區(qū)域R1和R2重疊了5個(gè)殘基。此外，可以在類(lèi)似于II類(lèi)MHC結(jié)合溝“口袋殘基”的位置進(jìn)行給定表位中的單個(gè)氨基酸修飾或者單個(gè)表位中的組合修飾，但不是在肽序列中的任何位置。可以利用本領(lǐng)域已知的基于芯片的技術(shù)參照同源結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)學(xué)方法來(lái)做修飾。所有這樣的修飾均落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
對(duì)Bouganin的肽區(qū)域R1～R3進(jìn)行了分析以指示出其各序列中的II類(lèi)MHC配體。采用了WO 98/59244和WO 02/069232中給出的開(kāi)發(fā)這種方案的軟件工具作這一分析。該軟件模擬肽II類(lèi)MHC結(jié)合互作水平的抗原呈遞過(guò)程從而為任何給定肽序列提供結(jié)合分?jǐn)?shù)。對(duì)群體中存在的許多主要II類(lèi)MHC同種異型測(cè)定了這樣的分?jǐn)?shù)。由于該方案能夠測(cè)試任何肽序列，因此能夠預(yù)測(cè)氨基酸取代、添加或缺失后對(duì)于肽與II類(lèi)MHC結(jié)合溝的相互作用的結(jié)果。由此可以設(shè)計(jì)出新的序列組成，它包含數(shù)量減少的能夠與II類(lèi)MHC互作并由此作為免疫原性T-細(xì)胞表位起作用的肽。
在這種方案下，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，表位區(qū)域R1內(nèi)的取代包括在位置V123、D127和/或E129的變化。類(lèi)似地，對(duì)于表位區(qū)域R2，在一種實(shí)施方式中該取代位于Y133。該殘基落入R1和R2的重疊區(qū)，但Y133位的取代足以除去R2相關(guān)的II類(lèi)MHC配體且其自身不足以除去R1相關(guān)的II類(lèi)MHC配體。對(duì)于表位區(qū)域R3，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是對(duì)殘基E151和/或I152進(jìn)行取代。
在所有情況中，都是對(duì)一或多個(gè)替代氨基酸殘基進(jìn)行取代。用MHCII模擬軟件對(duì)R1作的分析表明，氨基酸殘基123、127、129和131是該表位中結(jié)合MHC II分子的關(guān)鍵殘基。殘基123是R1區(qū)的一個(gè)優(yōu)選突變位點(diǎn)，因?yàn)樗挥诜肿颖砻妗⑦h(yuǎn)離活性位點(diǎn)且在RIP序列比對(duì)中是可變的。然而，并不是所有的取代都產(chǎn)生活性分子，因此需要在生物活性檢測(cè)中對(duì)突變進(jìn)行驗(yàn)證。因此，例如在R1中，取代V123T、V123A和V123Q是優(yōu)選的可選擇的取代例子。RIP中發(fā)現(xiàn)殘基131是絕對(duì)保守的，因此它有可能不適于突變。殘基127和129不是高度保守的，但發(fā)現(xiàn)只有有限數(shù)量的殘基對(duì)MHC II結(jié)合有影響。取代組D127G、D127A、E129Q和E129G也是優(yōu)選取代。對(duì)于R2，殘基133顯示為除去MHC II結(jié)合的一個(gè)可能的候選殘基，其明顯的表面定位(根據(jù)模型確定)加上它在RIP中不是高度保守的這樣一個(gè)事實(shí)使它成為了突變的一個(gè)好候選殘基。發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的可選擇取代是Y133N、Y133T、Y133A、Y133R、Y133D、Y133E、Y133Q、Y133G、Y133K、Y133H和Y133S。對(duì)于R3，氨基酸殘基152、155和158被鑒定為MHC II結(jié)合的關(guān)鍵殘基。然而，殘基155和158是一段高度保守疏水序列的一部分，由此暗示它們的突變將不能產(chǎn)生有生物活性的分子。發(fā)現(xiàn)弱保守殘基是更為可能的候選者。對(duì)于R3，取代組I152Q和I152A也是優(yōu)選取代。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種被修飾Bouganin蛋白，其中的bouganin在以下X1、X2、X3、X4或X5中的一或多個(gè)位置處被修飾a)AKX1DRKX2LX3LGVX4KL(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO:5)；b)LGVX4KLEFSIEAIHG(表位區(qū)域R2，SEQ ID NO:6)；和c)NGQEX5AKFFLIVIQM(表位區(qū)域R3，SEQ ID NO7)其中的X1至X5可以是任何氨基酸。
在一種特定實(shí)施方式中，X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S；和X5是Q或A(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO8；表位區(qū)域R2，SEQ ID NO9；表位區(qū)域R3，SEQ ID NO10)。
根據(jù)用離體T-細(xì)胞檢測(cè)做的肽表位作圖研究、基于芯片的MHC肽結(jié)合模擬以及來(lái)自序列同源性分析的結(jié)構(gòu)考量進(jìn)行綜合考慮，可以編輯得到一個(gè)最優(yōu)選的取代組。最后，如果某一個(gè)活性肽是優(yōu)選的，可以對(duì)這一包含一個(gè)或多個(gè)取代的被修飾蛋白進(jìn)行體外活性檢測(cè)。
相應(yīng)地，在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾Bouganin肽，它包含氨基酸序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEAIHGKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETE
VVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK其中的X1至X5可以是任何氨基酸(SEQ ID NO:11)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S；和X5是Q或A(SEQ ID NO12)。
在一種特定實(shí)施方式中，被修飾Bouganin蛋白包含氨基酸序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ ID NO13)。
在又一種實(shí)施方式中，被修飾Bouganin蛋白包含氨基酸序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVQKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ ID NO14)。
下劃線(xiàn)殘基被來(lái)自非-被修飾Bouganin蛋白的殘基取代。
如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的，多個(gè)可選擇的修飾組能夠?qū)崿F(xiàn)除去不需要的表位這一目的。然而所得序列將在很大程度上與本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)保持同源，它們由此落入本發(fā)明的范圍。本發(fā)明公開(kāi)的序列的明顯的化學(xué)等價(jià)物也被考慮落入本發(fā)明范圍內(nèi)。這樣的等價(jià)物包括以基本相同的方式基本完成相同功能的蛋白質(zhì)。
在另一種實(shí)施方式中本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白在蛋白質(zhì)的T-細(xì)胞表位中有1、2、3、4、5或更多個(gè)氨基酸修飾。
在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白在T-細(xì)胞檢測(cè)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)與非-被修飾Bouganin蛋白相比激發(fā)出降低的刺激指數(shù)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，用T-細(xì)胞檢測(cè)對(duì)Bouganin蛋白的T-細(xì)胞表位作圖，之后對(duì)這些表位進(jìn)行修飾以使得再次在T-細(xì)胞檢測(cè)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)被修飾Bouganin蛋白激發(fā)出低于非-被修飾Bouganin蛋白的刺激指數(shù)，優(yōu)選該刺激指數(shù)小于2.0。
本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，如果被修飾Bouganin蛋白具有基本降低的或者沒(méi)有生物活性，則它還需要通過(guò)氨基酸殘基取代、添加或缺失作進(jìn)一步以恢復(fù)被修飾Bouganin蛋白的生物活性。然而，這樣的具有基本降低的或者沒(méi)有生物活性的被修飾Bouganin蛋白仍然包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，并且可以用作檢測(cè)中的對(duì)照，或者用于tolerization。
在一種實(shí)施方式中，被修飾Bouganin在70位的酪氨酸殘基處發(fā)生突變從而產(chǎn)生一種失活bouganin。在一種特定實(shí)施方式中，酪氨酸位置70被丙氨酸取代。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，被修飾Bouganin具有序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK[SEQ ID NO129]。
在本發(fā)明的規(guī)劃下，通過(guò)突變對(duì)表位進(jìn)行弱化處理從而得到不再能夠作為T(mén)-細(xì)胞表位起作用的序列。有可能用重組DNA方法來(lái)實(shí)現(xiàn)靶序列定向誘變，許多這樣的技術(shù)都是可以獲得的也是本領(lǐng)域已知的。實(shí)踐中，為獲得所需的免疫和功能特征可以制備并測(cè)試許多被修飾Bouganin蛋白。尤其重要的是，對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行修飾時(shí)，所構(gòu)思的改變不會(huì)引入新的免疫原性表位。實(shí)踐中可以通過(guò)利用任何適宜的方法再次測(cè)試所構(gòu)思序列中表位和/或II類(lèi)MHC配體的存在與否來(lái)避免這一事件的發(fā)生。
本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白還可以包含或用于獲得或設(shè)計(jì)“肽模擬物”?！半哪M物”是在分子間互作中用作肽替代物的結(jié)構(gòu)(綜述參見(jiàn)Morgan等人(1989)，Ann.Reports Med.Chem.24243-252)。肽模擬物包括可能包含或可能不包含氨基酸和/或肽鍵但保持本發(fā)明肽的結(jié)構(gòu)和功能特征，包括生物活性和降低的激活人T細(xì)胞的傾向，的合成結(jié)構(gòu)。肽模擬物還包括肽、寡肽(Simon等人(1972)Proc.Natl.Acad，Sci USA899367)。
可以根據(jù)通過(guò)D-氨基酸對(duì)L-氨基酸的系統(tǒng)替換、用帶有具不同電性特征的基團(tuán)的側(cè)鏈替換、和通過(guò)用氨基鍵系統(tǒng)替換肽鍵獲得的信息來(lái)設(shè)計(jì)肽模擬物。還可以導(dǎo)入位置構(gòu)型限制來(lái)確定對(duì)候選肽模擬物的活性構(gòu)型要求。這些模擬物包括電子等排氨基鍵、或D-氨基酸以穩(wěn)定或促進(jìn)反向構(gòu)型和輔助穩(wěn)定分子。環(huán)形氨基酸類(lèi)似物可用于約束氨基酸殘基于特定的構(gòu)型狀態(tài)。這些模擬物還可包括本發(fā)明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬物。這些結(jié)構(gòu)可以將氨基酸殘基的三維定向模擬進(jìn)蛋白質(zhì)的已知二級(jí)構(gòu)型中。還可以使用N-取代氨基酸寡肽擬肽，也可以將擬肽用作產(chǎn)生新分子化學(xué)多樣性文庫(kù)的結(jié)構(gòu)基序。
可以通過(guò)幾種方法中的任何一種來(lái)制備本發(fā)明的分子，但最優(yōu)選采用常規(guī)重組技術(shù)來(lái)完成。用本文提供的蛋白質(zhì)序列和信息來(lái)推導(dǎo)編碼任一優(yōu)選蛋白質(zhì)序列的多核苷酸(DNA)是一種相對(duì)直接的方法。例如可以利用計(jì)算機(jī)軟件工具，比如DNSstar軟件套[DNAstar Inc，Madison，WI，USA]或類(lèi)似的軟件，來(lái)實(shí)現(xiàn)。任何這樣的能夠編碼本發(fā)明的優(yōu)選多肽或其顯著同源物的DNA序列應(yīng)理解為本發(fā)明的實(shí)施方式。
作為一個(gè)總體規(guī)劃，編碼任一被修飾Bouganin蛋白序列的基因可以通過(guò)基因合成來(lái)制備并將其克隆進(jìn)適宜的表達(dá)載體。依次將表達(dá)導(dǎo)入宿主細(xì)胞和所選擇及培養(yǎng)的細(xì)胞。從培養(yǎng)基中純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，并將其制成用于治療性給藥的制劑。作為可選擇的形式，通過(guò)例如依照cDNA克隆策略利用從Bougainvillea spectabilis Willd植物根組織制得的RNA獲得野生型bouganin基因序列。野生型基因可用作突變模板和用于構(gòu)建優(yōu)選的變體序列。在這點(diǎn)上，利用Higuchi等人[Higuchi等人(1988)Nucleic Acids Res.167351]描述的“重疊延伸PCR”策略是非常方便的，盡管其它方法和系統(tǒng)也易于應(yīng)用。
同樣可以通過(guò)許多方式評(píng)估本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性。在一種實(shí)施方式中，用N-糖苷酶活性，尤其是用足以對(duì)蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生顯著抑制的活性，來(lái)鑒定被修飾Bouganin分子。一種這樣的適宜檢測(cè)包括在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中測(cè)試被修飾Bouganin蛋白與非-被修飾Bouganin相比的活性。將包含甲硫氨酸、編碼報(bào)告蛋白質(zhì)熒光素酶的DNA以及非-被修飾和被修飾Bouganin蛋白的系列稀釋物的轉(zhuǎn)錄/翻譯耦聯(lián)混合物進(jìn)共培養(yǎng)。加入底物試劑用發(fā)光計(jì)可以容易地探測(cè)所翻譯的熒光素酶水平。所測(cè)得的發(fā)光與反應(yīng)中存在的bouganin N-糖苷酶活性成反比。提供例如包含Y70A取代這樣的失活Bouganin蛋白作為陰性對(duì)照是常規(guī)的。
可以通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)優(yōu)選和活性bouganin分子的構(gòu)建，這包括與目的抗體或其它靶部分融合的bouganin分子。純化和操作重組蛋白的方法包括融合蛋白是本領(lǐng)域熟知的。文獻(xiàn)中充分描述了所需技術(shù)，例如，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，second edition(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)；“Handbook of ExperimentalImmunology”(D.M.Weir&C.C.Blackwell，eds.)；“Gene TransferVectors for Mammalian Cell”(J.M.Miller&M.P.Calos，eds.，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人，eds.，1987)；“PCRThe Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等人，eds.，1994)；“Current Protocols in Immunology”(J.E.Coligan等人，eds.，1991)。
可以用重組DNA方法來(lái)制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽。還可以利用蛋白質(zhì)化學(xué)中熟知的技術(shù)比如固相合成(Merrifield，1964，J.Am.Chem.Assoc.852149-2154)或在同質(zhì)液中合成(Houbenweyl，1987，Methodsof Organic Chemistry，ed.E.Wansch，第15I和II卷，Thieme，Stuttgart)通過(guò)化學(xué)合成制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明被修飾Bouganin蛋白或肽序列，優(yōu)選編碼如SEQ ID NO13或SEQ ID NO14的本文所述的蛋白質(zhì)的序列，的分離純化的核酸分子。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“分離純化的”指，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的基本無(wú)細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基的核酸，通過(guò)化學(xué)合成的化學(xué)前體、或其它化合物?！胺蛛x純化”的核酸也基本不含其天然序列兩側(cè)的序列(也即位于核酸5′和3′末端的序列)。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”指由天然堿基、糖和intersugar(骨架)連接組成的核苷酸序列或核苷單體。該術(shù)語(yǔ)還包括具有類(lèi)似功能的包含非天然單體的被修飾或被取代序列或其部分。本發(fā)明的核酸序列可以是核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)，可以包含包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶在內(nèi)的天然堿基。序列還可以包含比如黃漂亮、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基、和其它烷基腺嘌呤、5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、6-氮胞嘧啶、和6-氮胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-鹵腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫腺嘌呤、8-硫-烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤和其它8-取代腺嘌呤、8-鹵鳥(niǎo)嘌呤、8-氨基鳥(niǎo)嘌呤、8-硫鳥(niǎo)嘌呤、8-硫烷基鳥(niǎo)嘌呤、8-羥基鳥(niǎo)嘌呤和其它8-取代鳥(niǎo)嘌呤、其它氮和deaza尿嘧啶、胸腺嘧啶脫氧核、胞嘧啶、腺嘌呤、或鳥(niǎo)嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶這樣的被修飾堿基。
在一種實(shí)施方式中，純化分離的核酸分子包含本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)和肽的序列，優(yōu)選SEQ ID NO13或SEQ ID NO14，包括(a)核酸序列，其中T也可以是U；(b)與(a)互補(bǔ)的核酸序列序列；(c)與(a)或(b)同源的核酸序列序列；(d)在嚴(yán)緊條件下與(a)至(c)雜交的(a)至(c)的至少15個(gè)堿基、優(yōu)選20至30個(gè)堿基的片段，；或(e)由于遺傳密碼簡(jiǎn)并而在密碼子上不同于(a)至(c)中任一的核酸序列的核酸序列分子。
此外，可以理解，本發(fā)明包括包含與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和肽的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列的核酸序列分子及其片段。術(shù)語(yǔ)“具有基本序列同源性的序列”意指具有不同于這些序列的輕微或不重要變化的那些核酸序列序列，即，以基本相同的方式產(chǎn)生功能等價(jià)蛋白質(zhì)的序列。這些變化可以促成定位突變或結(jié)構(gòu)修飾。
具有基本序列同源性的核酸序列包括與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和肽的核酸序列具有至少80％、優(yōu)選90％同一性的核酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供在雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)緊條件下，能夠與本發(fā)明的核酸序列分子雜交的核酸分子及其具有至少15個(gè)堿基的片段。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6找到。例如，可以使用以下條件約45℃下6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，之后于50℃用2.0×SSC洗滌?？梢愿鶕?jù)洗滌步驟中所使用的條件選擇嚴(yán)緊度。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自50℃下約0.2×SSC的高嚴(yán)緊度。此外，洗滌步驟中的溫度可以處于約65℃的高嚴(yán)緊條件。
相應(yīng)地，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法將具有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和肽的本發(fā)明的核酸序列分子整合進(jìn)確保該蛋白質(zhì)和肽良好表達(dá)的適宜表達(dá)載體中。可能的表達(dá)載體包括但不限于粘粒、質(zhì)粒、或被修飾的病毒(例如，復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，只要該載體與所使用的宿主細(xì)胞相容即可?！斑m于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的載體”這一表達(dá)意指，該表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸序列分子和根據(jù)所使用的用于表達(dá)的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇的與核酸序列分子可操作性相連的調(diào)控序列?！翱刹僮餍韵噙B”意指該核酸序列以允許該核酸序列表達(dá)的方式與調(diào)控序列相連。
本發(fā)明由此考慮包含本發(fā)明核酸序列或其片段以及所插入蛋白序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)控序列的本發(fā)明重組表達(dá)載體。適宜的調(diào)控序列可來(lái)自多種來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、或病毒基因(例如，參見(jiàn)Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述的調(diào)控序列)。對(duì)適宜調(diào)控序列的選擇依賴(lài)于所選擇的宿主細(xì)胞，并且可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成。這樣的調(diào)控序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序列、包括翻譯起始信號(hào)在內(nèi)的核糖體結(jié)合序列。此外，根據(jù)所選擇的宿主和所使用的載體，可以向表達(dá)載體中整合進(jìn)比如復(fù)制起點(diǎn)、附加DNA限制位點(diǎn)、增強(qiáng)子和為序列帶來(lái)轉(zhuǎn)錄可誘導(dǎo)性的序列這樣的其它序列。可以理解，所需的調(diào)控序列可以由天然蛋白質(zhì)和/或其側(cè)翼區(qū)域提供。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以包含有利于對(duì)用本發(fā)明的重組分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因的例子包括編碼比如G418和潮霉素這樣的帶來(lái)特定藥物抗性的蛋白質(zhì)、β-半乳糖苷酶、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、或螢火蟲(chóng)熒光素酶的基因。通過(guò)比如β-半乳糖苷酶、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶、或螢火蟲(chóng)熒光素酶這樣的選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的濃度的變化來(lái)監(jiān)控選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄。如果選擇標(biāo)記基因編碼賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞抗生素抗性比如潮霉素抗性的蛋白質(zhì)，則可以選擇G418。整合有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞將死亡。這可以將本發(fā)明的重組表達(dá)載體的表達(dá)可視化并能夠進(jìn)行檢測(cè)，尤其是測(cè)定突變對(duì)于表達(dá)和表型的效果?？梢岳斫?，選擇標(biāo)記可以在獨(dú)立于目的核酸序列的載體上導(dǎo)入。
重組表達(dá)載體還可以包含編碼融合部分的基因，該融合部分可提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、提高重組蛋白的溶解度、和作為親和純化的配體從而有助于靶重組蛋白的純化。例如，可以在靶重組蛋白中加入蛋白酶切割位點(diǎn)從而允許在融合蛋白純化后將重組蛋白能夠從融合部分中分離出來(lái)。
可以將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”意欲包括已經(jīng)用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核和真核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“用......轉(zhuǎn)化的”、“用......轉(zhuǎn)染的”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意欲包括核酸序列(例如載體)通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多可能技術(shù)之一向細(xì)胞中的導(dǎo)入。原核細(xì)胞可以通過(guò)，例如，點(diǎn)擊或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^(guò)比如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、點(diǎn)擊或微注射這樣的常規(guī)技術(shù)將核酸序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))以及其它這樣的實(shí)驗(yàn)室教科書(shū)中可以找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適宜方法。
適宜的宿主細(xì)胞包括各種原核和真核宿主細(xì)胞。例如，可以在比如大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞(利用桿狀病毒)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞這樣的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在Goeddel，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中可以找到其它的適宜宿主細(xì)胞。
若核酸序列的放置方式使其與另一核酸序列在功能上相關(guān)，則該核酸序列是“可操作連接的”。例如，如果前序列或分泌引導(dǎo)序列的DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則它是與多肽DNA是可操作性相連的；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列是可操作性相連的；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有利于翻譯，則其與編碼序列是可操作性相連的?？傊?，“可操作性相連”意指被連接的DNA序列是鄰近的，而且對(duì)于分泌引導(dǎo)序列，是鄰近的且在同一閱讀框中。然而，增強(qiáng)子不必須是鄰近的。可以通過(guò)在常規(guī)的限制性位點(diǎn)的連接來(lái)完成連接。如果沒(méi)有這樣的位點(diǎn)，那么可以根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭。
在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含編碼這樣的被修飾Bouganin的核酸序列它們具有減少數(shù)量的潛在T細(xì)胞表位的，并與表達(dá)控制序列可操作性連接。在不同的實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或肽的核酸序列或其簡(jiǎn)并變體，將至少包含與適宜表達(dá)控制和選擇序列可操作性相連的所述核酸序列的RIP編碼結(jié)構(gòu)域。關(guān)于多核苷酸的簡(jiǎn)并指這樣個(gè)已得到普遍認(rèn)識(shí)的事實(shí)遺傳密碼中有許多氨基酸由超過(guò)一種密碼子指定。密碼簡(jiǎn)并使得由構(gòu)成DNA的四種不同堿基的64種可能三聯(lián)體序列編碼20種不同的氨基酸。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“RIP編碼結(jié)構(gòu)域”或“核糖體失活蛋白編碼結(jié)構(gòu)域”意指賦予bouganin生物活性的功能結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的核酸序列分子還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成多聚脫氧核苷酸的各種方法是已知的，包括已經(jīng)在可商業(yè)獲得的DNA合成儀中完全自動(dòng)化的固相合成，例如肽合成(參見(jiàn)例如，Itakura等人，美國(guó)專(zhuān)利4 598 049；Carnthers等人，美國(guó)專(zhuān)利4 458 066；和Itakura，美國(guó)專(zhuān)利4 401 796和4 373 071)。
本發(fā)明還提供編碼包含本發(fā)明新蛋白質(zhì)和所選擇的蛋白、或選擇標(biāo)記蛋白的融合蛋白的核酸序列。
本發(fā)明的另一方面是包含至少一種上述載體的培養(yǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明的又一方面是被修飾Bouganin的方法，包括在允許被修飾Bouganin從表達(dá)載體中表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞并從細(xì)胞中純化bouganin。
(B)被修飾Bouganin細(xì)胞毒素如前述，bouganin是使細(xì)胞的主要核糖體RNA脫嘌呤從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止和細(xì)胞死亡的I型核糖體失活蛋白(RIP)。因此，本發(fā)明的被修飾Bouganin可用于制備細(xì)胞毒素。包含被修飾Bouganin蛋白的細(xì)胞毒素優(yōu)選于包含非-被修飾Bouganin蛋白的細(xì)胞毒素，因?yàn)榍罢呔哂懈偷拿庖咴郧逸^為不太可能在達(dá)到靶物前被免疫系統(tǒng)破壞。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供細(xì)胞毒素，它包含(a)本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白以及(b)附著于(a)的靶部分。
為方便介紹使用術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白”，它包括本文所描述的任何或全部被修飾Bouganin蛋白，比如在上述部分(A)以及附圖和實(shí)施例中所描述的被修飾Bouganin蛋白。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“靶部分”指將被修飾Bouganin蛋白運(yùn)送至靶細(xì)胞的物質(zhì)、方法、或技術(shù)。在一種實(shí)施方式中該靶部分是一種抗體。在一種實(shí)施方式中該靶部分可能是一種脂質(zhì)體。在一種實(shí)施方式中該脂質(zhì)體可連接于抗體。在另一種實(shí)施方式中該靶部分是一種能夠?qū)蚺c特定靶細(xì)胞發(fā)生特定結(jié)合互作的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)部分包括有特定細(xì)胞表面受體的各種多肽配體，由此包括許多細(xì)胞因子、太或多肽激素和其它生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物質(zhì)。主要例子包括比如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、heregulin、白介素、干擾素、腫瘤壞死因子和其它蛋白質(zhì)和糖蛋白分子?？梢钥紤]本發(fā)明bouganin與這些或其它分子的融合蛋白，根據(jù)蛋白配體結(jié)構(gòu)域可以在N-末端或C-末端方向包含被修飾Bouganin部分?？蓪⒅苯訉胁糠峙c本發(fā)明的蛋白質(zhì)相連或者通過(guò)接頭連接。在一種實(shí)施方式中，接頭是太接頭或化學(xué)接頭。同樣地，也可以考慮純化配體與被修飾Bouganin蛋白的化學(xué)交聯(lián)，這也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供細(xì)胞毒素，它包含(a)本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白，(b)附著于(a)的能夠與癌細(xì)胞結(jié)合的配體。
配體可以是能夠與癌細(xì)胞結(jié)合的任何分子，包括但不限于蛋白質(zhì)。在一種實(shí)施方式中，配體是可識(shí)別癌細(xì)胞表面的抗體或抗體片段。
相應(yīng)地，本發(fā)明的細(xì)胞毒素可用于治療各種形式的癌癥，比如結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
在一種實(shí)施方式中，癌細(xì)胞結(jié)合配體包括與癌細(xì)胞結(jié)合的完整免疫球蛋白分子。若癌細(xì)胞結(jié)合配體是抗體或其片段，細(xì)胞毒素優(yōu)選為免疫毒素。在另一種實(shí)施方式中，癌細(xì)胞結(jié)合配體是Fab、Fab′、scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體片段、或通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段的二聚體。在另一種實(shí)施方式中，癌抗體包括可變重鏈、可變輕鏈、Fab、Fab′、scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體片段、或通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段。癌細(xì)胞結(jié)合配體的部分可源自一或多個(gè)物種，優(yōu)選包含源自人的部分，最優(yōu)選是完全人的或人源化的。所設(shè)計(jì)利于純化以及與毒素耦聯(lián)的區(qū)域也可以包括在或者被添加到癌細(xì)胞結(jié)合部分中。
在一種特定實(shí)施方式中，癌細(xì)胞結(jié)合配體識(shí)別Ep-CAM。Ep-CAM(上皮細(xì)胞粘連分子，還已知為17-1A，KSA，EGP-2和GA733-2)是一種在許多固體腫瘤，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌和頭頸鱗片狀細(xì)胞肉瘤，中高度表達(dá)但在多數(shù)正常上皮組織中弱表達(dá)的的跨膜蛋白。
相應(yīng)地，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種Ep-CAM-targeted-被修飾Bouganin細(xì)胞毒素，它包含(a)與非-被修飾Bouganin蛋白相比具有降低的激活T-細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin蛋白，(b)附著于(a)的能夠結(jié)合癌細(xì)胞上的Ep-CAM的配體(比如抗體或抗體片段。
在一種特定實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含(a)與非-被修飾Bouganin蛋白相比具有降低的激活T-細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin蛋白，(b)附著于(a)的人源化抗體或抗體片段，它能夠與人Ep-CAM細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合且包含來(lái)自Moc-31抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列的。
根據(jù)本發(fā)明的適宜Ep-CAM-targeted-被修飾Bouganin包括，不限于，VB6-845及其變體，包含選擇性結(jié)合Ep-CAM的其它單或雙鏈免疫球蛋白的其它細(xì)胞毒素及其變體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“VB6-845”意指，包含與被修飾形式的bouganin，Bou 156(SEQ ID NO13)相連的抗-Ep-CAM scFv抗體的Fab的細(xì)胞毒素。VB6-845的氨基酸序列和核酸相連示于附圖3B(分別為SEQ ID NO16和SEQ ID NO15)。
在另一種實(shí)施方式中，癌細(xì)胞結(jié)合配體識(shí)別在贅生性細(xì)胞上特異發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞上未發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，配體是與腫瘤相關(guān)抗原的抗體。抗腫瘤相關(guān)抗原抗體特異性識(shí)別來(lái)源于各種癌癥的癌細(xì)胞但不識(shí)別正常的非癌性細(xì)胞。
因此在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種細(xì)胞毒素，它包含(a)與非-被修飾Bouganin蛋白相比具有降低的激活T-細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin蛋白；(b)附著于(a)的能夠與癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的配體(比如抗體或抗體片段)。
根據(jù)本發(fā)明的適宜的腫瘤相關(guān)抗原靶向被修飾Bouganin包括，不限于，VB6-011及其變體，選擇性結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的其它單鏈或雙鏈免疫球蛋白的其它細(xì)胞毒素或其變體。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“VB6-011”意指，包含與被修飾形式的bouganin，Bou 156(SEQ ID NO13)相連的H11人單克隆抗體的Fab的細(xì)胞毒素。H11抗體是通過(guò)將64歲男性癌癥患者的外周血淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合制成雜交瘤得到的。雜交瘤NBGM1/H11產(chǎn)生IgMk，將它再次工程化成Fab抗體形式形成VB6-011(詳見(jiàn)US 6 207 153或WO 97/44461中H11抗體分泌雜交瘤的制備)。VB6-011的氨基酸序列和核酸序列示于附圖15(分別為SEQ ID NO28和SEQ ID NO27)。
在一種特定的非限制性實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含VB6-845(附圖3B，SEQ ID No.16)或VB6-011(附圖15，SEQ ID NO28)。在其它的非限制性實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含VB6-845或VB6-011的變體。
VB6-845變體同樣結(jié)合Ep-CAM表位或結(jié)合與VB6-845所結(jié)合表位基本類(lèi)似的Ep-CAM表位，在生理?xiàng)l件下該變體能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制VB6-845與Ep-CAM結(jié)合的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。VB6-845變體包含與VB6-845相同的被修飾Bouganin，或者可以包含與不同本發(fā)明被修飾Bouganin。在另一種非限制性實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含含有MOC31可變區(qū)或其變體的Ep-CAM-結(jié)合部分。在又一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含含有4D5MOCB[C2]或其部分的Ep-CAM-結(jié)合部分。在生理?xiàng)l件下通過(guò)與reference MOC31或4D5MOCB抗體競(jìng)爭(zhēng)，這些細(xì)胞毒素中的任何一種與Ep-CAM的結(jié)合可以被減少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
VB6-011變體與VB6-011結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)抗原表位或者結(jié)合與VB6-011所結(jié)合的基本類(lèi)似的腫瘤相關(guān)抗原表位，生理?xiàng)l件下，該變體可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制VB6-011與腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。VB6-011變體可包含與VB6-011相同的被修飾Bouganin，或可以包含不同的本發(fā)明被修飾Bouganin。在另一種非限制性實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素包含含有H11單克隆抗體、H11抗原結(jié)合片段或其變體的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分。在生理?xiàng)l件下通過(guò)與reference H11抗體競(jìng)爭(zhēng)可以使這些細(xì)胞毒素中的任一種與VB6-011的結(jié)合減少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)定的Ep-CAM-結(jié)合部分或腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分的結(jié)合親和力比VB6-845或VB6-011的結(jié)合親和力低至少四個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選至少三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。在一種非限制性實(shí)施方式中，在生理?xiàng)l件下，Ep-CAM-結(jié)合部分可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷已知抗-Ep-CAM抗體，例如但不限于PANOREX或MT201，與Ep-CAM的結(jié)合至少0.1％、1％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。在一種非限制性實(shí)施方式中，在生理?xiàng)l件下，腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷已知抗腫瘤相關(guān)抗原抗體，例如但不限于H11，與腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合至少0.1％、1％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以鑒定決定特異性的殘基。術(shù)語(yǔ)“特異性決定殘基”，也稱(chēng)作“SDR”，指形成抗體的部分抗體決定簇的殘基，尤其是CDR殘基，不依賴(lài)于任何其它突變的用丙氨酸作的單一取代能夠減少抗體對(duì)表位至少10倍、優(yōu)選至少100倍、更優(yōu)選至少1000倍的結(jié)合親和力。親和力的喪失強(qiáng)調(diào)了殘基對(duì)于抗體結(jié)合表位的能力的重要性。參見(jiàn)例如，Tamura等人，2000，“Structural correlates of an anticarcinomaantibodyidentification of specificity-determining residues(SDRs)anddevelopment of a minimally immunogenic antibody variant by retention ofSDRs only”，J.Immunol.164(3)1432-1441。
可以同時(shí)評(píng)價(jià)單個(gè)或多個(gè)突變對(duì)于結(jié)合活性的影響，尤其是對(duì)結(jié)合親和力的影響，從而評(píng)估特定系列氨基酸對(duì)于結(jié)合互作的重要性(例如，輕鏈或重鏈CDR2對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn))。還可以對(duì)某個(gè)氨基酸突變的效果進(jìn)行評(píng)估從而在單獨(dú)評(píng)價(jià)時(shí)評(píng)價(jià)單個(gè)氨基酸的貢獻(xiàn)。這樣的評(píng)估可以通過(guò)，例如，通過(guò)體外飽和掃描(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利NO.6 180 341；Hilton等人，1996，“Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of theerythropoietin receptor”，J Biol Chem.2714699-4708)和位點(diǎn)定向突變(參見(jiàn)例如，Cunningham和Wells，1989，“High-resolution表位mappingof hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis，”Science2441081-1085；Bass等人，1991，“A systematic mutational analysis ofhormone-binding determinants in the human growth hormone receptor，”P(pán)rocNatl Acad Sci.USA 884498-4502)來(lái)完成。在丙氨酸掃描突變技術(shù)中，在分子中的多個(gè)殘基處導(dǎo)入單丙氨酸突變，測(cè)試所得分子的生物活性從而鑒定對(duì)于分子活性而言的關(guān)鍵氨基酸殘基。
還可以通過(guò)對(duì)根據(jù)，例如，核磁共振、結(jié)晶、電子衍射、或光親和標(biāo)記，確定的結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理分析以及結(jié)合對(duì)推定的接觸位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行突變(參見(jiàn)例如，de Vos等人，1992，“Human growth hormone和extracellular domain of its receptorcrystal structure of the complex”，Science 255306-312；Smith等人，1992，“Human interleukin 4.Thesolution structure of a four-helix bundle protein”，J Mol Biol.224899-904；Wlodaver等人，1992，“Crystal structure of human recombinant interleukin-4at 2.25 A resolution”，F(xiàn)EBS Lett.30959-64)來(lái)鑒定配體-受體或其它生物互作的位點(diǎn)。此外，可以通過(guò)比較相關(guān)多肽或類(lèi)似結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列來(lái)評(píng)價(jià)特定單個(gè)氨基酸、或氨基酸序列的重要性。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，親和勢(shì)(avidity)的提高可以補(bǔ)償親和力(affinity)的降低。細(xì)胞毒素對(duì)癌細(xì)胞受體的親和勢(shì)是對(duì)Ep-CAM-結(jié)合部分對(duì)Ep-CAM的結(jié)合強(qiáng)度的度量。Ep-CAM和Ep-CAM-結(jié)合部分間的功能性結(jié)合強(qiáng)度代表所有親和鍵的總強(qiáng)度，因此單個(gè)成分可以以相對(duì)較低的親和力結(jié)合，但是這樣的成分的多聚體則可以證實(shí)有效的生物效果。實(shí)際上，Ep-CAM-結(jié)合位點(diǎn)和Ep-CAM表位的多重結(jié)合可以比附加的生物效果更具證明力，也即，多價(jià)的優(yōu)勢(shì)在于平衡常數(shù)可能是許多個(gè)數(shù)量級(jí)。
類(lèi)似地，細(xì)胞毒素對(duì)癌細(xì)胞受體的親和勢(shì)是腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合強(qiáng)度的度量，該結(jié)合可能有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分的功能性結(jié)合強(qiáng)度代表所有親和鍵的總強(qiáng)度，因此單個(gè)成分可以以低親和力結(jié)合，但是這樣的成分的多聚體可以證明有效的生物效果。實(shí)際上，腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合位點(diǎn)與腫瘤相關(guān)抗原表位的多重互作比附加的生物活性更有說(shuō)明力，也即，多價(jià)的優(yōu)勢(shì)在于平衡常數(shù)可能是許多個(gè)數(shù)量級(jí)。
在一種非限制性實(shí)施方式中，Ep-CAM-結(jié)合部分具有與4D5MocB基本類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。這一基本類(lèi)似的結(jié)構(gòu)可以參照反映細(xì)胞毒素Ep-CAM-結(jié)合部分與Ep-CAM分子的結(jié)合點(diǎn)的表位圖來(lái)進(jìn)行特征描述。在另一種非限制性實(shí)施方式中，可以產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分的表位圖，這一基本類(lèi)似的結(jié)構(gòu)可以參照反映細(xì)胞毒素腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合部分與腫瘤相關(guān)抗原分子的結(jié)合點(diǎn)的表位圖來(lái)進(jìn)行特征描述。
本發(fā)明的細(xì)胞毒素可以利用蛋白質(zhì)化學(xué)中熟知的技術(shù)通過(guò)化學(xué)合成制備，比如固相合成(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.852149-2154(1964))或在同質(zhì)液中的合成(Houbenweyl，Methods of OrganicChemistry，ed.E.Wansch，第15I和II卷，Thieme，Stuttgart(1987))。
在一種實(shí)施方式中，癌結(jié)合配體和被修飾Bouganin都是蛋白質(zhì)，可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)耦聯(lián)。有上百種交聯(lián)劑可以耦聯(lián)這兩種蛋白質(zhì)。(參見(jiàn)例如“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”。1991，Shans Wong，CRC Press，Ann Arbor)。通?？梢愿鶕?jù)配體或毒素上可獲得的或所插入的反應(yīng)性官能團(tuán)選擇交聯(lián)劑。此外，如果沒(méi)有反應(yīng)性基團(tuán)，則可以使用可以光活化的交聯(lián)劑。在特定情況中，最好在配體和毒素間包括一個(gè)間隔子。本領(lǐng)域已知的交聯(lián)劑包括同雙功能劑戊二醛、二甲基adipimidate和Bis(di azobenzidine)和雜雙功能劑mMaleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide和Sulfo-m Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide。
還可以利用重組DNA技術(shù)制備配體-bouganin毒素融合蛋白。此時(shí)，將編碼癌結(jié)合配體的DNA序列與編碼被修飾Bouganin蛋白的DNA序列融合，從而產(chǎn)生嵌合DNA分子。將該嵌合DNA序列轉(zhuǎn)染進(jìn)能夠表達(dá)配體-bouganin融合蛋白的宿主細(xì)胞。可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化融合蛋白。
可以用常規(guī)技術(shù)制備比如Ep-CAM和腫瘤相關(guān)抗原這樣的對(duì)細(xì)胞表面蛋白有特異性的抗體。可以用在哺乳動(dòng)物中引發(fā)抗體應(yīng)答的肽免疫原性形式免疫哺乳動(dòng)物，(例如小鼠、倉(cāng)鼠或兔)。賦予肽免疫原性的技術(shù)包括與載體綴合或本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)。例如，肽可以在存在佐劑的情況下施用。可以通過(guò)探測(cè)血漿或血清中的抗體滴度來(lái)監(jiān)控免疫過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫檢測(cè)程序和作為抗原的免疫原來(lái)評(píng)估抗體水平。免疫后，可以獲得抗血清，如果需要的話(huà)，可以從血清中分離多克隆抗體。
為產(chǎn)生單隆抗體，可以從被免疫的動(dòng)物收獲抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合法將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而使得這些細(xì)胞不死并產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，(例如雜交瘤技術(shù)最初由Kohler和Milstein(Nature 256495-497(1975)開(kāi)發(fā))以及比如人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunol.Today 472(1983))、產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R.，Bliss，Inc.，pages 77-96(1985))、和篩選組合抗體文庫(kù)(Huse等人，Science 2461275(1989))這樣的其它技術(shù)。為產(chǎn)生與肽特異性反應(yīng)的抗體，可以對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)篩選，并分離單克隆抗體。
本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”意欲包括單克隆抗體和多克隆抗體、也能夠與一種細(xì)胞表面成分特異性反應(yīng)的抗體片段(例如Fab和F(ab′)2，和單鏈抗體(scFv))、和嵌合抗體?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)將抗體片段化，以與上述相同的方式篩選可用的片段。例如，F(xiàn)(ab’)2片段可以通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體來(lái)產(chǎn)生。所得F(ab’)2片段可以經(jīng)過(guò)處理以減少二硫鍵從而產(chǎn)生Fab′片段。單鏈抗體在一個(gè)穩(wěn)定折疊的多肽鏈上與抗體的抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合。單鏈抗體可以通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生。
嵌合抗體衍生物，即，與非人動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū)結(jié)合的抗體分子也考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。嵌合抗體分子可包括，例如，來(lái)自小鼠、大鼠或其它物種的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人恒定區(qū)?？捎贸Ｒ?guī)方法制備包含識(shí)別細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體(參見(jiàn)，例如，Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.816851(1985)；Takeda等人，Nature 314452(1985)，Cabilly等人，美國(guó)專(zhuān)利4 816 567；Boss等人，美國(guó)專(zhuān)利4 816 397；Tanaguchi等人，歐洲專(zhuān)利171 496；歐洲專(zhuān)利173,494，香港專(zhuān)利2177096B)。預(yù)期嵌合抗體在人中比對(duì)應(yīng)的非嵌合抗體具有更低的免疫原性。可以通過(guò)Pluckthun等人，WO 00/61635描述的方法來(lái)穩(wěn)定嵌合抗體。
通過(guò)產(chǎn)生人恒定區(qū)嵌合體可以進(jìn)一步使與細(xì)胞表面成分特異性反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體人源化，其中的可變區(qū)部分，尤其是抗原結(jié)合區(qū)的保守框區(qū)域，是人源的，并且只有超變區(qū)是非人源的。這樣的免疫球蛋白分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today 47279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，923-16(1982)和PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O92/06193或EP 239,400)制備。人源化抗體還可以通過(guò)商業(yè)化途徑制備(Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，GreatBritain.)。此外，通過(guò)減少與細(xì)胞表面成分特異性反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體上潛在的T-細(xì)胞表位數(shù)量可以使其免疫原性降低。
與細(xì)胞表面成分特異性反應(yīng)的特定抗體、或抗體片段或其部分還可以通過(guò)篩選編碼免疫球蛋白基因表達(dá)文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生、并在帶有細(xì)胞表面成分的細(xì)菌中表達(dá)。例如，完整Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)可以用噬菌體表達(dá)文庫(kù)在細(xì)菌中表達(dá)(參見(jiàn)例如Ward等人，Nature 341544-546(1989)；Huse等人，Science 2461275-1281(1989)；和McCafferty等人，Nature 348552-554(1990))。作為選擇，SCID-hu小鼠，例如由Genpharm開(kāi)發(fā)的模型，可用于產(chǎn)生抗體及其片段。
在所有將被修飾Bouganin蛋白與抗體序列融合的情況中，最好使用其中能夠結(jié)合II類(lèi)MHC分子或刺激T細(xì)胞或與II類(lèi)MHC分子共同結(jié)合T細(xì)胞的T細(xì)胞表位或序列已經(jīng)被除去的抗體序列。
本發(fā)明的又一種實(shí)施方式，被修飾Bouganin蛋白可與一種非抗體蛋白但仍然能夠?qū)蚺c特定靶細(xì)胞的特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)連接。這樣的蛋白質(zhì)部分包括各種存在特定細(xì)胞表面受體的多肽配體，且由此包括許多細(xì)胞因子、肽和多肽激素和其它生物應(yīng)答修飾物。主要例子包括比如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、heregulin、白介素、干擾素、腫瘤壞死因子和其它蛋白質(zhì)和糖蛋白分子這樣的蛋白質(zhì)。這些分子以及其它分子與本發(fā)明bouganin的融合蛋白也可以考慮，它們可以在蛋白質(zhì)配體結(jié)構(gòu)域的N-末端或C-末端方向包含被修飾Bouganin部分。同樣地，純化配體與被修飾Bouganin蛋白的化學(xué)交聯(lián)也可以考慮，并且落入本發(fā)明的范圍。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白可用作包含比如羥基丙基甲基丙烯酰胺這樣的水溶性聚合物或其它聚合物的復(fù)合物，其中被修飾Bouganin蛋白與聚合物共價(jià)結(jié)合或與聚合物以非共價(jià)結(jié)合互作。這樣的一種實(shí)施方式還可以包括與聚合物bouganin復(fù)合物結(jié)合的比如抗體或抗體片段這樣的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
(C)細(xì)胞毒素的用途本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白可用于特異性抑制或破壞感染癌癥的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。允許RIP進(jìn)入細(xì)胞并能有效殺死癌癥細(xì)胞，這是具有較低免疫原性的本發(fā)明細(xì)胞毒素的優(yōu)點(diǎn)。因此，該細(xì)胞毒素可用于特異性靶向癌細(xì)胞。一旦進(jìn)入癌細(xì)胞，bouganin則會(huì)使主要核糖體RNA脫嘌呤，由此破壞核糖體并導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止和細(xì)胞死亡。
相應(yīng)地，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種抑制或破壞癌癥細(xì)胞的方法，包括向需要本發(fā)明細(xì)胞毒素的動(dòng)物施用本發(fā)明的細(xì)胞毒素。本發(fā)明還包括本發(fā)明細(xì)胞毒素用于抑制或破壞癌細(xì)胞的用途。本發(fā)明還包括本發(fā)明的細(xì)胞毒素在制備抑制或破壞癌細(xì)胞的藥物中的用途。該細(xì)胞毒素所抑制或破壞的癌細(xì)胞類(lèi)型可以通過(guò)其抗體部分的抗原特異性來(lái)確定。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種抑制或破壞癌細(xì)胞的方法，包括制備本發(fā)明的細(xì)胞毒素并向細(xì)胞施用該細(xì)胞毒素的步驟。癌癥可以是任何類(lèi)型的癌癥，包括但不限于結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
可以利用動(dòng)物癌細(xì)胞系容易地在體外測(cè)試本發(fā)明細(xì)胞毒素選擇性抑制或破壞癌細(xì)胞的能力。本發(fā)明細(xì)胞毒素的選擇性抑制效果可以，例如，通過(guò)證實(shí)選擇性抑制癌細(xì)胞的增殖來(lái)確定。
可根據(jù)細(xì)胞活力來(lái)測(cè)定毒性，例如可以比較暴露于細(xì)胞毒素的正常和癌性細(xì)胞培養(yǎng)物的活力?？梢杂靡阎夹g(shù)來(lái)評(píng)估細(xì)胞活力，比如苔酚蘭排斥檢測(cè)法。
在另一個(gè)例子中，許多模型可用于測(cè)試細(xì)胞毒素的細(xì)胞毒性。Thompson，E.W等人(Breast Cancer Res.Treatment 31357-370(1994))描述了一種通過(guò)測(cè)定腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的胞外基質(zhì)酶解以及腫瘤細(xì)胞入侵重構(gòu)的基底膜(膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、Matrigel或明膠)來(lái)體外確定人乳腺癌細(xì)胞入侵的模型。其它的可應(yīng)用的癌細(xì)胞模型包括培養(yǎng)的卵巢腺瘤細(xì)胞(Young，T.N.等人，Gyneco.L.Oncol.6289-99(1996)；Moore，D.H.等人，Gyneco.L.Oncol.6578-82(1997))、人濾泡甲狀腺癌細(xì)胞(Demeure，M.J.等人，World J.Surg.16770-776(1992))、人黑素瘤(A-2058)和纖維肉瘤(HT-1080)細(xì)胞系(Mackay，A.R.等人Lab.Invest.70781-783(1994))、和肺鱗片狀(HS-24)和腺癌(SB-3)細(xì)胞系(Spiess，E.等人，J.Histochem.Cytochem.42917-929(1994))。包括腫瘤移植和測(cè)定無(wú)胸腺節(jié)小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)測(cè)試系統(tǒng)(Thompson，E.W等人，Breast CancerRes.Treatment 31357-370(1994)；Shi，Y.E等人，Cancer Res.531409-1415(1993))也已得到描述。
本發(fā)明還涉及治療癌癥的方法，包括向有需要的動(dòng)物施用有效量的一種或多種本發(fā)明細(xì)胞毒素。本發(fā)明包括本發(fā)明細(xì)胞毒素治療癌癥的用途。本發(fā)明還包括本發(fā)明細(xì)胞毒素在制備治療癌癥的藥物中的用途。
術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括動(dòng)物界的所有成員，其中包括人在內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“治療癌癥”指對(duì)癌細(xì)胞復(fù)制、癌癥擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)、腫瘤生長(zhǎng)的抑制，癌細(xì)胞數(shù)量和腫瘤生長(zhǎng)的減少，癌癥惡性級(jí)別的降低或癌癥相關(guān)癥狀的改善。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，動(dòng)物是人。在另一種實(shí)施方式中，癌癥選自結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
用本發(fā)明細(xì)胞毒素治療癌癥的臨床結(jié)果易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如醫(yī)師，來(lái)確定。例如，用于測(cè)量癌癥臨床標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)可以是治療效果的強(qiáng)指示劑。這樣的實(shí)驗(yàn)可包括，不限于，物理檢查、performance scales、疾病標(biāo)記、12-lead ECG、tumor measurements、活組織切片檢查、細(xì)胞檢查、細(xì)胞學(xué)、計(jì)算腫瘤最大直徑、放射線(xiàn)照相術(shù)、腫瘤數(shù)字成像、vital signs、重量、不利事件記錄、感染期評(píng)定、附隨藥物評(píng)定、疼痛評(píng)定、血液或血清化學(xué)、尿液分析、CT掃描、和藥物動(dòng)力學(xué)分析。此外，包括細(xì)胞毒素和另一癌癥治療劑的組合物療法的協(xié)同效果可以通過(guò)與未接受治療的患者的比較研究確定。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員接受的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估惡性腫瘤的去除。參見(jiàn)例如，Therasse等人，2000，“New guidelines to evaluate the response totreatment in solid tumors，European Organization for Research and Treatmentof Cancer，National Cancer Institute of the United States，National CancerInstitute of Canada，”J Natl Cancer Inst.Feb 2；92(3)205-16。
特定細(xì)胞毒素構(gòu)建體的有效劑量依賴(lài)于各種因素，包括癌癥類(lèi)型、腫瘤大小、癌癥階段、細(xì)胞毒素對(duì)患者的毒性、對(duì)癌細(xì)胞的靶特異性、以及患者的年齡、體重和健康。
可以根據(jù)細(xì)胞毒素在灌注物中的劑量和濃度，以i.v.灌注的方式以分鐘至?xí)r間間隔施用包含被修飾Bouganin的細(xì)胞毒素。
在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素以3小時(shí)的時(shí)間間隔灌注。
在一種實(shí)施方式中，i.v.灌注施用細(xì)胞毒素的有效劑量范圍是約1至100mg/kg/劑。在其它實(shí)施方式中，該劑量范圍是約2至5mg/kg/劑。在特定實(shí)施方式中、該劑量可以是至少約2、4、8、13、20、28、40、50mg/kg/劑。
在一種實(shí)施方式中，約每周單次給藥，施用約1、2、3、4、5或6周。單次給藥可以在連續(xù)周施用，或者作為選擇，可以跳過(guò)一或多周。這一循環(huán)之后，約1、2、4、6或12周后可以開(kāi)始下一循環(huán)。治療方案可包括1、2、3、4、5、6或更多循環(huán)，各循環(huán)間間隔約1、2、4、6或12周。
在另一種實(shí)施方式中，每月給藥一次，給藥約1、2、3、4、5或6連續(xù)月。該循環(huán)后，約1、2、4、6或12個(gè)月后可以開(kāi)始下一循環(huán)。治療方案包括1、2、3、4、5、6或更多循環(huán)，各循環(huán)間間隔約1、2、4、6或12個(gè)月。
在一定特定的非限制性實(shí)施方式，細(xì)胞毒素的有效劑量在約1和50mg/kg/腫瘤/日之間，其中對(duì)患者每天給藥一次。約每日單次給藥(可選地跳過(guò)一或多天)，給藥約1、2、3、4、5、6或7連續(xù)日。該循環(huán)后，約1、2、3、4、5或6周后開(kāi)始下一循環(huán)。治療方案可包括1、2、3、4、5、6或更多循環(huán)，各循環(huán)間間隔約1、2、3、4、5或6周。
注射體積優(yōu)選至少為有效量，它是對(duì)于腫瘤的類(lèi)型和/或位置而言的適宜量。單次給藥的最大體積介于約腫瘤體積的25％和75％之間，例如所估計(jì)的靶腫瘤體積的約四分之一、三分之一、或四分之三。在一種特定的非限制性實(shí)施方式中，單次給藥的最大注射體積約為腫瘤體積的30％。
在另一種實(shí)施方式中，以每小時(shí)100cc的速率灌注包含1至10mg細(xì)胞毒素/mL的溶液三小時(shí)。細(xì)胞毒素可稀釋于適宜的生理相容性溶液。
循環(huán)中與細(xì)胞毒素一起給藥的另一種癌腫治療劑的有效劑量也根據(jù)給藥方式變化。一或多種癌癥治療劑可運(yùn)送至腫瘤內(nèi)，或者通過(guò)其它的方式給藥。典型地，化療劑是全身給藥的。標(biāo)準(zhǔn)劑量和治療方案是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如，Merck Index和the Physician′s Desk Reference的最新版本；NCCN Practice Guidelines in Oncology))。
細(xì)胞毒素的組合療法可以使癌癥或腫瘤對(duì)施用其它癌癥治療劑變得敏感。相應(yīng)地，本發(fā)明考慮用于預(yù)防、治療和/或預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的組合療法，包括在施用劑量降低的癌癥治療機(jī)之前、之后、或同時(shí)施用有效量的細(xì)胞毒素。例如，用細(xì)胞毒素進(jìn)行的初期治療可以提高癌癥或腫瘤對(duì)隨后施用癌癥化療劑的敏感性。該劑量接近、或低于單獨(dú)施用癌癥治療劑時(shí)、或不存在細(xì)胞毒素時(shí)使用的標(biāo)準(zhǔn)劑量的下限范圍。同時(shí)施用時(shí)，細(xì)胞毒素可與癌癥治療劑分別施用，可選擇地，通過(guò)不同的給藥方式。
在另一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與至少一種其它免疫治療劑組合施用。
在另一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與放射療法方案組合施用。該療法還可以包括外科手術(shù)和/或化療。例如，細(xì)胞毒素可與放射療法以及cisplatin(Platinol)、氟尿嘧啶(5-FU，Adrucil)、carboplatin(Paraplatin)、和/或paclitaxel(Taxol)組合施用。用細(xì)胞毒素治療也可以使用較低的放射劑量和/或較不頻繁的放射治療，這可以例如減少阻礙吞咽功能并由此潛在地導(dǎo)致體重下降或脫水的嚴(yán)重咽喉疼痛的發(fā)病率。
在另一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與一或多種細(xì)胞因子組合給藥，細(xì)胞因子包括，不限于，淋巴因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子樣細(xì)胞因子、淋巴毒素、干擾素、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、及其變體，包括其藥學(xué)可接受鹽。
在又一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與癌癥疫苗組合給藥，癌癥疫苗包括但不限于自體細(xì)胞或組織、非-自體細(xì)胞或組織、癌胚抗原、α-胎兒蛋白、人絨毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑色素瘤細(xì)胞譜系蛋白、和突變的腫瘤腫瘤特異性抗原。
在又一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與激素療法組合給藥。激素治療劑包括，不限于，激素顯效劑、激素拮抗劑(例如，氟硝丁酰胺、三苯氧胺、leuprolide acetate(LUPRON))和類(lèi)固醇(例如，地塞米松、類(lèi)維生素A、倍他米松、氫化可的松、可的松、強(qiáng)的松、去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激素、孕酮)。
在又一種實(shí)施方式中，細(xì)胞毒素與治療或預(yù)防癌癥的基因治療方案組合施用。
在又一種實(shí)施方式中，Ep-CAM-靶向的細(xì)胞毒素與一或多種提高Ep-CAM在目的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的試劑組合給藥。優(yōu)選Ep-CAM表達(dá)得到提高以使得腫瘤細(xì)胞表面有更大數(shù)量的Ep-CAM分子表達(dá)。例如，該試劑可以抑制正常循環(huán)的Ep-CAM抗原內(nèi)吞作用。這樣的組合治療可以改善Ep-CAM-靶向的細(xì)胞毒素的單獨(dú)臨床效果，或者與其它癌癥治療劑或放射療法的臨床效果。在特定的非限制性實(shí)施方式中，提高Ep-CAM在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)的試劑是vinorelbine tartrate(Navelbine)和/或paclitax(Taxol)。參見(jiàn)例如，Thurmond等人，2003，“Adenocarcinoma cellexposed in vitro to Navelbine或Taxol increase Ep-CAM expression through anovel mechanism.”Cancer Immunol Immunother.Jul；52(7)429-37。
由此組合療法可以提高癌癥或腫瘤對(duì)所施用的細(xì)胞毒素和/或其它癌癥治療劑的敏感度。以這種方式，有可能只需要較短的治療循環(huán)從而減少毒性事件。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防的方法，包括向有需要的患者施用一個(gè)短治療循環(huán)的有效量的細(xì)胞毒素和至少一種其它癌癥治療劑。循環(huán)持續(xù)時(shí)間可根據(jù)所使用的特定癌癥治療劑而變化。本發(fā)明還考慮持續(xù)或不持續(xù)給藥，或者分成幾個(gè)部分施用的日給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解特定癌癥治療劑的適宜循環(huán)持續(xù)時(shí)間，本發(fā)明考慮對(duì)各癌癥治療劑的最理想治療時(shí)間進(jìn)行持續(xù)評(píng)估。特定指導(dǎo)方針是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)例如，Therasse等人，2000，“New guidelines toevaluate the response to treatment in solid tumors。European Organization forResearch和Treatment of Cancer，National Cancer Institute of the UnitedStates，National Cancer Institute of Canada，”J Natl Cancer Inst.Feb 2；92(3)205-16。
作為選擇，有可能需要更長(zhǎng)的治療循環(huán)。相應(yīng)地，循環(huán)持續(xù)時(shí)間可以在約10至56、12至48、14至28、16至24、或18至20天間變化。循環(huán)持續(xù)時(shí)間可以根據(jù)所使用的癌癥治療劑進(jìn)行變化。
本發(fā)明考慮至少一個(gè)循環(huán)，優(yōu)選多于一個(gè)循環(huán)，期間施用了一種癌癥治療劑或一系列治療劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解適當(dāng)?shù)难h(huán)總數(shù)和循環(huán)間隔。循環(huán)數(shù)可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)循環(huán)。循環(huán)間隔可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。本發(fā)明考慮對(duì)各細(xì)胞毒素和其它癌癥治療劑的最佳治療時(shí)程進(jìn)行持續(xù)評(píng)估。
在另一種實(shí)施方式中，提供一種制備治療患癌哺乳動(dòng)物的藥物的方法，包括步驟鑒定具有減弱的激活T-細(xì)胞傾向的bouganin T-細(xì)胞表位；制備帶有一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位的本發(fā)明細(xì)胞毒素和將該蛋白質(zhì)懸于藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑中。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明細(xì)胞毒素和藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑的治療患癌哺乳動(dòng)物的藥物組合物。
本發(fā)明細(xì)胞毒素可配制成向受試者施用的適于體內(nèi)給藥的生物相容形式的藥物組合物?！斑m于體內(nèi)給藥的生物相容形式”意指治療效果超過(guò)了任何毒性效果的給藥物質(zhì)形式。這些物質(zhì)可施用給包括人和動(dòng)物在內(nèi)的活生物體。施用治療活性量的本發(fā)明藥物組合物其定義為，在為達(dá)到目的結(jié)果所需的劑量和持續(xù)時(shí)間下的有效量。例如，物質(zhì)的治療活性量可根據(jù)比如疾病狀態(tài)、年齡、性別、個(gè)體體重、以及抗體在個(gè)體中引發(fā)目的應(yīng)答的能力這樣的因素變化。可以對(duì)劑量方案作出調(diào)整從而提供最理想的治療應(yīng)答。例如，可以每天分幾次給藥，或者根據(jù)治療狀況的緊急程度適當(dāng)減少劑量。
活性物質(zhì)可以通過(guò)比如注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等)、口服給藥、吸入、經(jīng)皮給藥(比如局部涂霜或膏等)、或栓劑這樣的便利方式施用。根據(jù)給藥途徑，可將活性物質(zhì)包被在物質(zhì)中以保護(hù)該化合物免受酶、酸和其它會(huì)使該化合物失活的天然條件的作用。
本文作描述的組合物可以通過(guò)已知的制備可向受試者施用的藥學(xué)可接受組合物的方法制備，由此將有效量的活性物質(zhì)與藥學(xué)可接受載體組合成混合物。適宜載體描述于，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences (Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA 1985)。基于此，該組合物包括，雖然不是專(zhuān)門(mén)限制，與一或多種藥學(xué)可接受載體、稀釋劑一起、包含在具有適宜pH和與生理液等滲的緩沖液中物質(zhì)。
該藥物組合物可用于治療包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，在內(nèi)的動(dòng)物的癌癥。預(yù)期這些組合物尤其適于治療結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。所施用的細(xì)胞毒素的劑量和類(lèi)型依賴(lài)于易于在人受體中監(jiān)控各種因素。這樣的因素包括瘤形成的病理學(xué)和嚴(yán)重程度(級(jí)別和階段)。
適合直接施用的藥物組合物包括，不限于，凍干粉末或水性或非水性無(wú)菌注射液或懸液，其還可以進(jìn)一步包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得該組合物與目的受體的血液基本等滲的溶質(zhì)。可存在于這樣的組合物中的其它成分包括，例如，水、乙醇、多元醇、丙三醇和植物油。臨時(shí)注射液和懸液可從無(wú)菌粉末、顆?；蚱瑒┲频?。細(xì)胞毒素可以，但不限于此，在向患者使用前與無(wú)菌水或鹽溶液重配的凍干粉的形式應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物組合物可包括藥學(xué)可接受載體。適宜的藥學(xué)可接受載體包括不干擾藥物組合物的生物活性的有效性的基本為化學(xué)惰性的非毒性組合物。適宜的藥學(xué)載體的例子包括，但不限于，水、鹽溶液、丙三醇溶液、乙醇、N-(1(2，3-dioleyloxy)propyl)N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、diolesylphosphotidyl-乙醇胺(DOPE)、和脂質(zhì)體。這樣的組合物應(yīng)當(dāng)包含治療有效率的化合物，以及適宜量的載體，從而得到向患者直接給藥的形式。
在另一種實(shí)施方式中，藥物組合物包含細(xì)胞毒素和一或多種附加的癌癥治療劑，可選地包含在藥學(xué)可接受載體中。
組合物可以是藥學(xué)可接受鹽形式，包括，不限于，那些用比如源自鹽酸、磷酸、醋酸、酢漿草的、酒石酸等的自由氨基形成的鹽，那些用比如源自鈉、鉀、胺、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-ethylarninoethanol、組氨酸、普魯卡因等的自由羧基形成的鹽。
本發(fā)明涉及被修飾Bouganin，包含這樣的被修飾Bouganin蛋白或被修飾Bouganin蛋白的片段的組合物及相關(guān)組合物應(yīng)視為落入本發(fā)明范圍。這方面的一個(gè)相關(guān)例子是開(kāi)發(fā)由肽介導(dǎo)的耐受誘導(dǎo)策略，其中以免疫治療目的向患者施用一種或多種公開(kāi)的肽。相應(yīng)地，合成肽分子，例如包含上述表位區(qū)R1～R3中任一的全部或部分的多種合成肽中的一種。這樣的肽視為本發(fā)明的實(shí)施方式。
本發(fā)明又一方面涉及用被修飾Bouganin組合物治療人的方法。為向個(gè)體給藥，任何一種被修飾組合物都應(yīng)被制成優(yōu)選至少80％純且不含熱原和其它污染物。
本發(fā)明還提供包含有效量細(xì)胞毒素的試劑盒，可選地，還包含一或多種其它癌癥治療劑，以及用其治療癌癥的說(shuō)明書(shū)。
(D)T-細(xì)胞表位肽本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式是T-細(xì)胞表位肽。該實(shí)施例中，T-細(xì)胞表位肽在T-細(xì)胞檢測(cè)中能夠激發(fā)大于1.8的刺激指數(shù)，更優(yōu)選2.0。本發(fā)明的T-細(xì)胞表位肽能夠與II類(lèi)MHC結(jié)合。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，該T-細(xì)胞表位肽包含R1、R2或R3(上述)任一序列的至少9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在另一種實(shí)施方式中，T-細(xì)胞表位肽序列與肽序列R1、R2或R3之中任一具有大于90％的氨基酸同一性；更優(yōu)選T-細(xì)胞表位肽與肽序列R1、R2或R3之中任一具有大于80％的氨基酸同一性。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“肽”是一種包括兩個(gè)及更多氨基酸的化合物。這些氨基酸通過(guò)肽鍵(如下文定義)相連。肽的生物合成中涉及20種不同的天然氨基酸，任何數(shù)量的這些氨基酸可以以任意順序相連形成肽鏈或肽環(huán)。肽的生物合成中所涉及的天然存在的氨基酸均為L(zhǎng)-構(gòu)型?？捎肔-氨基酸、D-氨基酸、或具有兩種不同構(gòu)型的各種不同的氨基酸組合用常規(guī)方法制備合成肽。短肽，例如，具有少于十個(gè)氨基酸單位的短肽，通常稱(chēng)為“寡肽”。其它肽包含大量氨基酸殘基，例如多達(dá)100個(gè)或更多，稱(chēng)為“多肽”。按照常規(guī)，“多肽”被視為包含三個(gè)或更多氨基酸的任何肽，而“寡肽”通常被視為“短”的特殊類(lèi)型。因此，如本文所使用的，可以理解，所提到的任何“多肽”都包括寡肽。此外，所提到的任何“肽”都包括多肽、寡肽、和蛋白質(zhì)。氨基酸的各種不同排列形成不同的多肽和蛋白質(zhì)?？梢孕纬傻亩嚯牡臄?shù)量——以及由此可形成的不同蛋白質(zhì)的數(shù)量——在實(shí)踐中是無(wú)限的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式是本發(fā)明的T-細(xì)胞表位肽制備本發(fā)明的被修飾Bouganin蛋白和被修飾T-細(xì)胞表位肽的用途。
本發(fā)明的又一實(shí)施方式是被修飾T-細(xì)胞表位肽，其經(jīng)過(guò)修飾從而使得被修飾T-細(xì)胞表位肽與非-被修飾T-細(xì)胞表位肽相比具有減弱的激活人T細(xì)胞的傾向。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的改良T-細(xì)胞表位肽包含使得該表位肽在T-細(xì)胞檢測(cè)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)能夠激發(fā)與非-改良的T-細(xì)胞表位肽相比更低的刺激指數(shù)的修飾。
在一種實(shí)施方式中本發(fā)明的改良T-細(xì)胞表位肽具有以下序列
AKX1DRKX2LX3LGVX4KL其中X1、X2、X3、和X4中的至少一種從非-被修飾序列修飾而來(lái)，如下X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；和X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQ IDNO8)。
在另一種實(shí)施方式中本發(fā)明的改良T-細(xì)胞表位肽具有以下序列LGVX4KLEFSIEAIHG其中X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQID NO9)。
在另一種實(shí)施方式中本發(fā)明的改良T-細(xì)胞表位肽具有以下序列NGQEX5AKFFLIVIQM其中X5是Q或A(SEQ ID NO10)。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的T-細(xì)胞表位肽或改良T-細(xì)胞表位肽的核酸序列。
提供以下附圖、序列表和實(shí)施例以幫助理解本發(fā)明?？梢岳斫猓梢詫?duì)所給出的方法作出修改而不背離本發(fā)明的精神。
以下的非限制性實(shí)施例是本發(fā)明的例證實(shí)施例實(shí)施例1用naive人T-細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)bouganin中的表位作圖的方法根據(jù)Den Hartog等人[ibid]所述合成覆蓋成熟Bouganin蛋白序列的肽。各肽的長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸，且相繼肽重疊12個(gè)殘基。這些肽的序列和它們的編號(hào)示于表1。
將這些肽與來(lái)自naive供體(也即沒(méi)有已知的bouganin致敏)的PBMC(外周血單核細(xì)胞)用于T-細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。收集了20份供體PBMC以獲得最理想的II類(lèi)MHC同種異型覆蓋率。同種異型覆蓋率超過(guò)85％。HLA-DR同種異型示于表2中。
在根據(jù)3H-胸腺嘧啶(3H-Thy)摻入測(cè)定增殖前，在三份培養(yǎng)物中用各單個(gè)肽刺激PBMC 7天。所有的肽均測(cè)試兩個(gè)不同的濃度(1μM和5μM)。刺激指數(shù)(S.I.)根據(jù)3H摻入量除以假刺激對(duì)照細(xì)胞中的3H摻入量來(lái)計(jì)算。
保存時(shí)間不超過(guò)12小時(shí)的人血液暗黃層獲自National Blood Service(Addenbrooks醫(yī)院，劍橋，英國(guó))。Ficoll-paque獲自AmershamPharmacia Biotech(Amersham，英國(guó))。用于培養(yǎng)初級(jí)人淋巴細(xì)胞的包含L-谷氨酸、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml慶大霉素和0.1％人血清白蛋白的無(wú)血清AIM V培養(yǎng)基Gibco-BRL(Paisley，英國(guó))。合成肽獲自Eurosequence(Groningen，The Netherlands荷蘭)和Babraham Technix(劍橋，英國(guó))。
通過(guò)對(duì)暗黃層進(jìn)行溫和離心從血漿和血小板中分離得到紅血球和白細(xì)胞。除去并丟棄最上相(包含血漿和血小板)。在將紅血球和白細(xì)胞鋪至15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia，Amersham UK)上之前，將其在磷酸緩沖鹽(PBS)中以1∶1稀釋。根據(jù)廠(chǎng)商推薦的條件進(jìn)行離心，從血清+PBS/ficoll paque表面收獲PBMC。將PBMC與PBS混合(1∶1)并離心收集。除去并丟棄上清液，將PBMC塊重懸于50ml PBS中。再次將細(xì)胞離心成塊，丟棄PBS上清液。用50ml AIM V培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，此時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)并用苔酚蘭染料排斥法評(píng)估活力。再次離心收集細(xì)胞并丟棄上清。重懸細(xì)胞，以3×107每毫升低溫保存。保存培養(yǎng)基為90％(v/v)熱失活A(yù)B人血清(Sigma，Poole，英國(guó))和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，英國(guó))。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受調(diào)控的冷凍容器(Sigma)，并置于-70℃過(guò)夜。需要使用時(shí)，在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml預(yù)熱的AIM V培養(yǎng)基中之前，在37℃水浴中使細(xì)胞快速解凍。
用蛋白質(zhì)和肽抗原在96孔平底板板中刺激密度為2×105每孔的PBMC。用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，英國(guó))脈沖之前，將PBMC在37℃下培養(yǎng)7天。各供體實(shí)驗(yàn)中，使用了兩個(gè)事先已經(jīng)顯示免疫原性的命名為C-32和C-49的對(duì)照肽以及一個(gè)潛在的全蛋白非-回憶抗原匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)。C-32＝來(lái)自血球凝集素殘基307-319的序列PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO127)。C-49＝來(lái)自衣原體HSP60的序列KVVDQIKKISKPVQH(SEQ ID NO128)。
將肽溶于DMSO至終濃度10mM，之后將這些貯存液在AIM V培養(yǎng)基中稀釋500倍(終濃度20μM)。將肽加入到平底96孔板中，至終濃度為1和5μM，體積100μl。用苔酚蘭染色排斥法評(píng)估熔融PBMC的活力，之后將細(xì)胞重懸至密度2×106細(xì)胞/ml，并將100μl(2×105PBMC/孔)轉(zhuǎn)移至含有肽的各孔中。各肽濃度均測(cè)定了三孔培養(yǎng)物。37℃下，將板在含5％CO2的濕潤(rùn)環(huán)境下培養(yǎng)7天。將細(xì)胞收獲至濾膜片上之前，以1μCi 3H-Thy/孔對(duì)其脈沖18-21小時(shí)。用Wallac microplate beta topplate counter(Perkin Elmer)測(cè)定CPM值。以刺激指數(shù)表示結(jié)果，刺激指數(shù)得自將對(duì)測(cè)試肽測(cè)定的增殖分?jǐn)?shù)(例如每分鐘放射活性計(jì)數(shù))除以對(duì)未接觸測(cè)試肽的細(xì)胞測(cè)定的分?jǐn)?shù)。
對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析揭示存在四種T細(xì)胞表位，它們對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的成熟加工區(qū)域中的肽41、44和50和未加工形式中的肽88。由于肽88不是成熟肽的一部分，因此在本發(fā)明的方案中將其忽略。
對(duì)于肽41(命名為表位區(qū)域R1)，對(duì)應(yīng)于該肽的供體有四個(gè)；供體4、5、10和11。它們?cè)?μM的S.I.分別為3.6、4.9、2.1和2.0。
對(duì)于肽44(命名為表位區(qū)域R2)，對(duì)應(yīng)于該肽的供體有兩個(gè)；供體4(S.I.＝3.5)和11(S.I.＝2.3)。相鄰的肽43和45由于與肽44有12個(gè)氨基酸的重疊，因此誘導(dǎo)出較低水平的T細(xì)胞增殖。
對(duì)于肽50，對(duì)應(yīng)于該肽的供體有兩個(gè)；供體4(S.I.＝2.9)和14(S.I.＝2.0)。肽51在供體14中誘導(dǎo)出較低水平的T細(xì)胞增殖(S.I.＞1.9)。
所有PBMC樣品的組織類(lèi)型均用可商業(yè)獲得的試劑系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定(Dynal，Wirral，英國(guó))。根據(jù)供應(yīng)商推薦的程序、標(biāo)準(zhǔn)輔助試劑和瓊脂糖電泳系統(tǒng)完成測(cè)定。各對(duì)應(yīng)供體樣品的同種異型特異性示于表2。
實(shí)施例2從Bougainvillea spectabilis克隆bouganin用‘SV總RNA分離系統(tǒng)和供應(yīng)商(Promega，南安普敦，英國(guó))提供的程序從Bougainvillea spectabilis葉中分離總RNA。在液氮下將新鮮葉組織研磨成細(xì)粉，并取約50mg研磨組織用于RNA分離。通過(guò)在1％瓊脂糖凝膠中可視化檢查RNA質(zhì)量和數(shù)量，并利用“Access RT-PCR System”(Promega)和特異引物OL1032和OL1033從總RNA中擴(kuò)增bouganin基因，各反應(yīng)使用約1μgRNA。引物序列示于下表3。該反應(yīng)產(chǎn)生了一個(gè)1242bp片段，包括天然引導(dǎo)序列和全長(zhǎng)bouganin序列。按照試劑盒說(shuō)明將該片段克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體(Promega)，并將其命名為pBoul。通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證序列。
以pBoul質(zhì)粒為模板，將bouganin基因經(jīng)PCR轉(zhuǎn)化進(jìn)pET21a(Novagen，諾丁漢，UK)。將pelB(pectate lyase果膠酶？)引導(dǎo)序列添加到5′末端，并將編碼6×組氨酸標(biāo)簽的序列添加到bouganin編碼序列3′末端。pelB引導(dǎo)序列是用引物OL1322(摻入了一個(gè)Ndel位點(diǎn))和引物OL1067從載體pPMI-his擴(kuò)增來(lái)的[Molloy，P.等人，(1995)J.Applied Bacteriology，78359-365]。bouganin-his片段是用OL1068和OL1323(摻入了一個(gè)Notl位點(diǎn))從pBoul擴(kuò)增而來(lái)的。用重疊PCR將pelB引導(dǎo)序列融合進(jìn)bouganin-his片段框，并將所得片段擴(kuò)增進(jìn)pGEM-TEasy(Promega)。經(jīng)序列驗(yàn)證后，將pelB-bouganin-his片段作為Ndel-Notl片段克隆進(jìn)經(jīng)Ndel-Notl消化的pET21a。將該克隆命名為pBou32。
實(shí)施例3構(gòu)建突變bouganin蛋白利用由T-細(xì)胞表位作圖方法提供的數(shù)據(jù)和利用能夠模擬肽與人類(lèi)II類(lèi)MHC結(jié)合溝間的結(jié)合的軟件，設(shè)計(jì)了許多種被修飾(突變)bouganin蛋白。后一種方法在其它地方有詳細(xì)描述[WO 02/069232]。構(gòu)建了變體基因，并測(cè)試了突變蛋白的功能活性。通常，首先構(gòu)建和測(cè)試各僅包含一個(gè)氨基酸取代的“單突變”蛋白，之后將有活性的被修飾蛋白的基因進(jìn)行組合來(lái)制備多重取代被修飾蛋白。
通過(guò)重疊PCR方法構(gòu)建了突變基因，該方法利用“重疊引物”中的突變將突變氨基酸密碼子引入基因。這一流程是本領(lǐng)域熟知的，在其它地方有詳細(xì)描述[Higuchi，等人(1900)Nucl.Acids Res.167351]。共構(gòu)建和測(cè)試了37個(gè)保留功能活性的單突變被修飾蛋白。此外，在所有實(shí)驗(yàn)中還構(gòu)建和測(cè)試了一個(gè)包含Y70A取代的陰性對(duì)照被修飾蛋白。實(shí)際上，在這37個(gè)“單突變”被修飾蛋白中有一個(gè)包含了兩個(gè)相鄰取代(E151T和I152E)，它在本文中也計(jì)為單突變。所測(cè)試的取代及相應(yīng)的活性值示于表4。
共構(gòu)建和測(cè)試了11個(gè)保留活性的多重取代被修飾蛋白。所測(cè)試的突變和對(duì)應(yīng)活性值示于表5。
表6描述取代被修飾蛋白的序列。表7列出一些特定序列。
在所有實(shí)施例中，均按照以下實(shí)施例4和5中給出的程序進(jìn)行蛋白質(zhì)純化和測(cè)試。
實(shí)施例4Bouganin蛋白的表達(dá)和純化按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，將質(zhì)粒pBou32轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)(Novagen)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞，并在包含50μg/ml羧芐青霉素的LB(Invitrogen，Paisley，英國(guó))板上進(jìn)行選擇。用從該轉(zhuǎn)化得到的一個(gè)新鮮克隆接種5ml 2×YT(Invitrogen)液體培養(yǎng)基，不含抗生素，37℃下以250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.5-2.0。之后于室溫下以2500rpm離心培養(yǎng)物15分鐘，并將細(xì)胞重懸于5ml加有1mM IPTG的新鮮2×YT中。將該培養(yǎng)物在30℃下以300rpm振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)，離心收集細(xì)胞，棄上清。
將細(xì)胞團(tuán)重懸于1ml PEB2(50mM Tris-HCl pH8，20％蔗糖，1mg/ml溶菌酶，1×Complete Protease Inhibitor Tablet(Roche，Lewes，英國(guó)))中，在冰上溫和攪拌培養(yǎng)1小時(shí)。4℃下14000rpm離心細(xì)胞碎片，棄去離心塊。所得上清即為“周質(zhì)級(jí)分”。用商業(yè)可獲得的“spincolumn”，按照生產(chǎn)商(Qiagen，Crawley，英國(guó))的說(shuō)明通過(guò)鎳親和柱層析從周質(zhì)級(jí)分中分離Bouganin蛋白。4℃下用10000分子量的cut-off‘Slide-A-Lyzer’(Pierce，Chester，英國(guó))將所得物質(zhì)對(duì)4升磷酸緩沖鹽溶液(0.138M NaCl，0.0027M KCl，pH7.4)透析過(guò)夜。透析后，用Micro BCA檢測(cè)試劑盒(Pierce)估計(jì)蛋白質(zhì)濃度，并將樣品保存于-20℃。
用基于ELISA的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步確定Bouganin蛋白濃度。簡(jiǎn)言之，通過(guò)用表達(dá)bouganin的質(zhì)粒對(duì)兩只大鼠進(jìn)行遺傳免疫，產(chǎn)生抗bouganin的抗血清(Genovac，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。為進(jìn)行ELISA，將重組bouganin通過(guò)其His-tag捕獲至Ni-瓊脂糖包被板上，之后用大鼠抗血清和二級(jí)HRP-偶聯(lián)的抗-大鼠Fc抗體(Sigma，Poole，英國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。作為標(biāo)準(zhǔn)，在各次測(cè)定中使用了大量制備的在大腸桿菌中表達(dá)并用總蛋白檢測(cè)法定量的野生型bouganin。
實(shí)施例5bouganin活性測(cè)定通過(guò)測(cè)定野生型和被修飾(突變)bouganin蛋白在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成測(cè)定中合成蛋白質(zhì)的能力測(cè)試了它們的活性。
將終體積為12.5μl的10μl TNT轉(zhuǎn)錄/翻譯聯(lián)合混合物(Promega)、20μM甲硫氨酸、120ng pT7熒光素酶DNA(Promega)以及WT和突變Bouganin蛋白系列稀釋液的混合物于30℃培養(yǎng)一小時(shí)，之后通過(guò)加入100μl“SteadyGlow”熒光素酶檢測(cè)試劑使反應(yīng)終止(Promega)。用Wallac發(fā)光計(jì)測(cè)定熒光素酶活性。有活性的Bouganin蛋白檢測(cè)為所測(cè)熒光素酶活性降低。各被修飾Bouganin蛋白測(cè)試至少5個(gè)濃度，各數(shù)據(jù)點(diǎn)設(shè)一重復(fù)。各實(shí)驗(yàn)中包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
單突變蛋白質(zhì)的結(jié)果示于表4。多重突變被修飾Bouganin蛋白的結(jié)果示于表5。在各情況中，結(jié)果表達(dá)為相對(duì)于野生型蛋白活性。所有的測(cè)定都包括一個(gè)帶有Y70A取代的失活突變Bouganin蛋白。
此外，也可以將熒光素酶測(cè)定結(jié)果作圖，顯示相對(duì)于對(duì)照的％熒光素酶活性與所添加的bouganin的蛋白質(zhì)濃度。這樣的圖的例子示于附圖1，它描繪了對(duì)兩個(gè)不同的多重突變bouganin蛋白測(cè)定的結(jié)果。
實(shí)施例6測(cè)定變體bouganin序列的T-細(xì)胞表位缺失。
選擇命名為Bou156的多重修飾蛋白通過(guò)免疫原性測(cè)定作進(jìn)一步測(cè)試。該變體包含取代V123A、D127A、Y133N和I152A。免疫原性測(cè)試包括使用可以被采用全Bouganin蛋白所作的測(cè)試破壞的活細(xì)胞，因此利用包含變體Bou156中所摻入的取代的合成肽來(lái)完成這些測(cè)定。所測(cè)試的肽列于表8。根據(jù)實(shí)施例1(上述)中所描述的程序利用20位個(gè)體的PBMC供體池完成這些測(cè)定。這些肽以?xún)蓚€(gè)不同的肽終濃度(1μM和5μM)對(duì)各供體樣品重復(fù)三次。
結(jié)果表示為SI每肽每供體樣品，且示于附圖2。DeI-41是肽序列AKADRKALELGVNKL(SEQ ID NO29)。Del-44是肽序列LGVNKLEFSIEAIHG(SEQ ID NO30)。DeI-50是肽序列NGQEAAKFFLIVIQM(SEQ ID NO31)。所有被修飾的肽在任一供體中都未誘導(dǎo)出T細(xì)胞應(yīng)答(S.I.＜2)。相反，免疫原性對(duì)照肽刺激了6位供體的T細(xì)胞(S.I.＞2)。
實(shí)施例7VB6-845用于最理想地運(yùn)送脫免疫bouganin(De-bouganin)的Ep-CAM-特異性Fab抗體的重組工程。
對(duì)本實(shí)施例和實(shí)施例8，所使用的脫免疫bouganin是Bou156。
腫瘤靶向細(xì)胞毒素由與細(xì)菌、真菌或植物毒素相連的抗體可變區(qū)組成。本研究對(duì)本發(fā)明的脫免疫bouganin構(gòu)建體作舉例說(shuō)明，包括連接于靶部分的的脫免疫bouganin具有降低的免疫原性，而同時(shí)仍然保持它們的生物活性。表12證明了Ep-CAM抗體與幾種類(lèi)型的腫瘤的結(jié)合，且由此顯示它能夠用于治療這些類(lèi)型的癌癥。
脫免疫Bouganin構(gòu)建體與de-bouganin相連的Ep-CAM指向的靶部分將VB5-845，抗-Ep-CAM scFv抗體的Fab version，遺傳連接于bouganin的脫免疫形式(de-bouganin)，Bou156，一種有效的、植物來(lái)源的、I型核糖體失活蛋白(RIP)，形成抗體-毒素構(gòu)建體VB6-845。附圖3圖示了構(gòu)建體VB6-845。附圖3A圖示pro-VB6-845帶pelB引導(dǎo)序列的雙順?lè)磫卧?。附圖3B提供氨基酸序列(SEQ ID NO16)和核酸編碼序列(SEQ ID NO15)。附圖3C圖示組裝VB6-845蛋白，以下將對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。對(duì)該構(gòu)建體的測(cè)試說(shuō)明，該構(gòu)建體保留了其生物活性(細(xì)胞毒性)和靶部分的特異性(Ep-CAM抗體)。
脫免疫bouganin構(gòu)建體的Orientation取向?yàn)榇_定最理想的抗體-de-bouganin取向，產(chǎn)生、表達(dá)了幾種形式的雙順?lè)醋颖磉_(dá)單元，并測(cè)試了它們的效力。
在各種情況中，將雙順?lè)醋訂卧寺∵M(jìn)pING3302載體(附圖4)使其處于樹(shù)膠醛糖-可誘導(dǎo)的araBAD啟動(dòng)子的控制下，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)E104大腸桿菌。誘導(dǎo)時(shí)，pelB引導(dǎo)序列的存在指導(dǎo)Fab-de-bouganin融合蛋白分泌進(jìn)培養(yǎng)物上清液?？汕懈罱宇^使de-bouganin能夠從靶部分切割下來(lái)，并發(fā)揮其生物活性。在一種實(shí)施方式中，該接頭是成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶接頭，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解其它的可切割接頭也可能是適宜的。優(yōu)選接頭可以根據(jù)靶特異性、和環(huán)境進(jìn)行選擇。構(gòu)建體樣品的制備和測(cè)試按照如下進(jìn)行附圖3VB6-845，其中de-bouganin(Bou156)通過(guò)成對(duì)堿性氨基酸蛋白酶接頭與CH結(jié)構(gòu)域的C-末端相連。附圖3A顯示原序列的雙順?lè)醋訂卧?，附圖3B顯示原序列的核酸編碼序列(SEQ ID NO15)和氨基酸序列(SEQ ID NO16)以及附圖3C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845蛋白。
附圖5顯示不含植物毒素的對(duì)照Fab抗-Ep-CAM構(gòu)建體，de-bouganin(VB5-845)。附圖5A顯示原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖5B顯示原序列的核酸編碼序列(SEQ ID NO17)和氨基酸序列(SEQ IDNO18)，以及附圖5C顯示所組裝的不含pelB序列的VB5-845蛋白。
附圖6顯示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin構(gòu)建體，VB6-845-CL-de-bouganin，其中Bou156連接于CL結(jié)構(gòu)域的C-末端。附圖6A顯示原序列的雙順?lè)蹲訂卧綀D6B顯示原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO19)和氨基酸序列(SEQ ID NO20)，以及附圖6C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-CL-de-Bouganin蛋白。
附圖7顯示Fab抗Ep-CAM，de-bouganin構(gòu)建體，VB6-845-NVH-de-bouganin，其中Bou156連接于VH結(jié)構(gòu)域的N-末端。附圖7A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧綀D7B顯示原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO21)和氨基酸序列(SEQ ID NO22)，以及附圖7C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-NVH-de-Bouganin蛋白。
附圖8顯示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin構(gòu)建體，VB6-845-NVL-de-bouganin，其中Bou156連接于VL結(jié)構(gòu)域的N-末端。附圖8A顯示編碼原序列的雙順?lè)蹲訂卧?，附圖8B顯示原序列的核酸編碼序列(SEQ IDNO23)和氨基酸序列(SEQ ID NO24)，以及附圖8C顯示不含pelB序列的組裝VB6-845-NVL-de-Bouganin蛋白。
在一種實(shí)施方式中，de-bouganin分子與重鏈或輕鏈C-末端相連。最理想的構(gòu)型包括與VH-CH結(jié)構(gòu)域相鄰的pelB引導(dǎo)序列和N-末端組氨酸親和標(biāo)簽作為第一個(gè)單元。緊接著的是包括通過(guò)一個(gè)蛋白酶敏感接頭與de-bouganin相連的pelB-VL-CL結(jié)構(gòu)域的第二單元。(附圖6)對(duì)于其中de-bouganin重定位于N-末端的構(gòu)建體，蛋白質(zhì)印跡分析顯示沒(méi)有可探測(cè)的產(chǎn)物，只有C-末端連接的de-bouganin(附圖3和6的構(gòu)建體)產(chǎn)生了一個(gè)完整的與Ep-CAM-陽(yáng)性細(xì)胞系具有良好結(jié)合特性的可溶蛋白(附圖9)，正如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中所顯示的。在蛋白質(zhì)印跡分析中，附圖9顯示在實(shí)驗(yàn)室水平VB6-845和VB6-845 CL-de-bouganin在所誘導(dǎo)的E104細(xì)胞上清液中的表達(dá)。在非誘導(dǎo)條件下，將16微升的上清液等分量載樣到SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠中，并利用兔多克隆抗-4D5抗體及之后的山羊抗-兔(1/2000)、或利用山羊抗-人κ-輕鏈-HRP抗體(1/1000)作蛋白質(zhì)印跡分析，來(lái)驗(yàn)證重組蛋白質(zhì)的同一性和大小。箭頭指示全長(zhǎng)VB6-845(的構(gòu)建體附圖3)和VB6-845-CL-de-bouganin(的構(gòu)建體附圖6)。對(duì)非-誘導(dǎo)的E104培養(yǎng)物上清液的蛋白質(zhì)印跡顯示無(wú)對(duì)應(yīng)條帶，這證明了抗體的特異性(未顯示)。
VB6-845(附圖3)和VB6-845-CL-de-bouganin(附圖6)與對(duì)照(Ep-CAM-陰性細(xì)胞系，A-375)相比對(duì)Ep-CAM陽(yáng)性細(xì)胞系CAL27和NIHOVCAR-3的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于附圖10A。這些結(jié)果與用另一抗-Ep-CAM構(gòu)建體，VB6-845-白樹(shù)毒蛋白，所作的相同反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)相當(dāng)，在該構(gòu)建體中用另一植物毒素白樹(shù)毒蛋白取代了de-bouganin(參見(jiàn)顯示其氨基酸序列(SEQ ID NO26)和核酸序列(SEQ ID NO25)的附圖14C)。用白樹(shù)毒蛋白構(gòu)建體作的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于附圖10B。在具有最理想取向的分子中加入第二個(gè)de-bouganin結(jié)構(gòu)域未產(chǎn)生產(chǎn)物。
在冰上將構(gòu)建體或?qū)φ张c0.45×106細(xì)胞培養(yǎng)一小時(shí)完成流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。洗滌后，用兔抗-bouganin(附圖10A)或小鼠抗-His標(biāo)簽(附圖10B)在冰上對(duì)結(jié)合有構(gòu)建體的細(xì)胞表面進(jìn)行檢測(cè)。洗滌細(xì)胞，并將之與FITC-綴合的綿羊抗-兔IgG(附圖10A)和FITC-綴合的綿羊抗-小鼠(IgG)(附圖10B)在冰上培養(yǎng)30分鐘。之后洗滌細(xì)胞，將之重懸于包含碘化丙啶的PBS 5％FCS中用于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行抗體結(jié)合評(píng)估。VB6-845和VB6-845-CL-de-bouganin與A-375培養(yǎng)之后未探測(cè)到熒光中值的改變。相反，用Ep-CAM陽(yáng)性細(xì)胞系，CAL27和NIHOVCAR-3觀(guān)察到了熒光中值的顯著變化(附圖10A)。如上述，VB6-845的結(jié)果與白樹(shù)毒蛋白構(gòu)建體的結(jié)果相似(附圖10B)。
Ep-CAM特異性VB6-845(的構(gòu)建體附圖3)與ProxiniumTM，ProxiniumTM是VB6-845的一種scFv形式，但其包含假單胞桿菌外毒素A，的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)VB6-845被工程化為Fab形式中時(shí)其Ep-CAM特異性未發(fā)生改變(附圖11)。
附圖11圖示了競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，1和10μg/mL的VB6-845和濃度逐漸升高(濃度范圍未0至100μg/mL)的ProxiniumTM與NIHOVCAR-3細(xì)胞(Ep-CAM陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系)共培養(yǎng)。4℃下培養(yǎng)一小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，用生物素化兔抗-bouganin及隨后用鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)結(jié)合的VB6-845。用作為陰性對(duì)照的4B5-PE做了相同的實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件示于附圖11。
效力(生物活性)此外，無(wú)細(xì)胞(附圖12)和MTS(附圖13A和B)測(cè)定證明，當(dāng)de-bouganin與Fab片段耦聯(lián)后仍保持其效力。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)完成用于測(cè)定效力的MTS測(cè)定法，其更詳細(xì)地描述于以下實(shí)施例8。用Ep-CAM-陽(yáng)性細(xì)胞系，CAL27和NIH:OVCAR-3，VB6-845的IC50分別是3至4nM和2至3nM。對(duì)于VB6-845-CL-de-bouganin，測(cè)定了其對(duì)于1至2nM的CAL27的效力以及對(duì)于NIH:OVCAR-3的效力。其中包括與脫免疫bouganin連接的人腫瘤靶抗體片段的Fab抗-Ep-CAM構(gòu)建體的開(kāi)發(fā)，應(yīng)當(dāng)允許該藥重復(fù)系統(tǒng)的施用，且由此能夠產(chǎn)生較大的臨床益處。
構(gòu)建體的收獲可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離構(gòu)建體。例如，如果His標(biāo)簽位于肽構(gòu)建體的N-末端，可以用Ni2+-螯合捕獲法純化Fab-Bouganin蛋白。例如可以采用以下方案。
用TB培養(yǎng)基在15L CHEMAP發(fā)酵器中完成對(duì)VB6-845變體的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)。OD600為20時(shí)(mid-log)，用飼料和包含50％丙三醇和200g/l L-樹(shù)膠醛糖的誘導(dǎo)劑對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后30小時(shí)，收集培養(yǎng)物，8000rpm離心30分鐘min，以及用CM瓊脂糖凝膠和Metal-Charged螯合瓊脂糖凝膠柱、以及之后用大小排阻柱純化VB6-845變體。簡(jiǎn)言之，濃縮上清液，并相對(duì)于20mM磷酸鈉pH6.9±0.1進(jìn)行滲濾。之后將滲濾濃縮上清液加入到用20mM磷酸鈉平衡的CM瓊脂糖凝膠柱上，25mM NaCl pH6.9±0.1。用20mM磷酸鈉，25mM NaCl pH6.9±0.1，洗滌柱，之后用20mM磷酸鈉，150mM NaCl pH7.5±0.1將結(jié)合的VB6-845洗脫。調(diào)節(jié)CM瓊脂糖凝膠洗脫物使其包含終濃度為0.25％的Triton-X100，并將該洗脫物用于帶電螯合瓊脂糖凝膠柱。之后從20mM磷酸鈉、150mM NaCl、0.25％triton-X100 pH7.5±0.1，之后用20mM磷酸鈉、150mM NaCl pH7.5±0.1，接著用20mM磷酸鈉、150mMNaCl、10mM咪唑pH7.5±0.1依次用3個(gè)不同濃度的洗滌緩沖液洗滌螯合瓊脂糖凝膠柱。之后用20mM磷酸鈉、150mM NaCl、250mM咪唑pH7.5±0.1將VB6-845洗脫，并在2mL級(jí)分中對(duì)其進(jìn)行收集。為使純度＞80％，測(cè)定了各級(jí)分在A280的吸收，并將各級(jí)分以及所收集的物質(zhì)應(yīng)用于大小排阻柱S200上。在一種實(shí)施方式中，為提高蛋白質(zhì)純度和除去內(nèi)毒素，將所收集的SEC級(jí)分用20mM NaPO4，pH7.5稀釋五倍，并以約5ml/min的速率通過(guò)用20mM NaPO4，25mM NaCl pH7.5平衡的Q-瓊脂糖凝膠15ml快流柱。樣品過(guò)柱后，用10CV平衡緩沖液洗滌柱，將洗液與最初Q-瓊脂糖凝膠流經(jīng)液混合收集。用30kDa MWCO膜(Sartorius hydrosart membrane)將流出物濃縮十倍使終濃度達(dá)到7.5mg/ml。之后加入終濃度為0.1％Tween-80。終產(chǎn)物過(guò)濾滅菌，保存于-80℃。與抗-4D5抗體免疫雜交后用蛋白質(zhì)印跡法分析該方法中各步驟所使用的樣品。膠質(zhì)蘭染色驗(yàn)證純度。蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA測(cè)定VB6-845變體的表達(dá)水平。
實(shí)施例8與脫免疫Bouganin(de-bouganin)遺傳連接的重組Ep-CAM-特異性Fab抗體，VB6-845的功能和生物學(xué)特征。
化療劑是高細(xì)胞毒性試劑，其常常代表許多固體腫瘤癌癥治療中的care標(biāo)準(zhǔn)。這些藥物的細(xì)胞毒性作用迅速靶向分裂細(xì)胞，無(wú)論是正常的還是腫瘤細(xì)胞，因此引發(fā)各種臨床副作用。VB6-845是一種連接于植物來(lái)源毒素的bouganin的脫免疫形式的Fab抗體。不同于缺少精確腫瘤靶特異性的化療劑，VB6-845只將其細(xì)胞毒性效應(yīng)限制于Ep-CAM-陽(yáng)性腫瘤靶。本研究中，測(cè)定了流式細(xì)胞分析和細(xì)胞毒性以評(píng)估VB6-845的效力和選擇性。
流式細(xì)胞術(shù)本研究中所使用的腫瘤細(xì)胞系購(gòu)自ATCC，并按照ATCC的推薦進(jìn)行增殖，除了分別在補(bǔ)加有10％FCS的RPMI 1640或DMEM中生長(zhǎng)的細(xì)胞系C-4I和TOV-112D。鋪滿(mǎn)率達(dá)到60-70％、活力超過(guò)90％時(shí)收集腫瘤細(xì)胞。人正常乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)購(gòu)自CAMBREX，并根據(jù)CAMBREX提供的程序在特定培養(yǎng)基中維持。鋪滿(mǎn)率達(dá)到70％、活力超過(guò)90％時(shí)收集細(xì)胞。
在流式細(xì)胞儀上測(cè)試來(lái)自子宮內(nèi)膜卵巢和宮頸癌跡象的婦科細(xì)胞系與VB6-845的結(jié)合(表9)。向各細(xì)胞系(3×105細(xì)胞)中加入10微克/mL VB6-845，并于4℃培養(yǎng)2小時(shí)。A-375和CAL27分別用作陰性和陽(yáng)性細(xì)胞系對(duì)照。洗掉未結(jié)合物質(zhì)后，加入在含10％FCS的PBS中稀釋了800倍的小鼠單克隆抗-組氨酸抗體(Amersham Pharmacia，Cat#27471001)，在4℃繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。之后加入在PBS-10％FCS中稀釋了100倍的FITC-標(biāo)記的抗-小鼠IgG(The Binding Site，Cat#AF271)，培養(yǎng)30分鐘。最后，經(jīng)碘化丙啶染色除去死細(xì)胞后，在FACS Calibur上分析細(xì)胞。
細(xì)胞毒性流式細(xì)胞研究中列出的VB6-845在細(xì)胞中的殺傷水平示于表10，表明該構(gòu)建體保留了其對(duì)抗Ep-CAM-陽(yáng)性細(xì)胞系的de-bouganin細(xì)胞毒性活性。該細(xì)胞毒性與另一包含一個(gè)不同的植物來(lái)源的毒素，白樹(shù)毒蛋白的Fab VB6-845變體的活性相當(dāng)(附圖14)。附圖14A比較了白樹(shù)毒蛋白，F(xiàn)ab抗-Ep-CAM-白樹(shù)毒蛋白構(gòu)建體(VB6-845-白樹(shù)毒蛋白)和Fab抗-Ep-CAM-de-bouganin(Bou156)構(gòu)建體(VB6-845)在CAL27(附圖14A)和NIHOVCAR-3細(xì)胞(附圖14B)中的毒性。VB6-845-白樹(shù)毒蛋白構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列示于附圖14C。
為研究VB6-845的特異性和選擇性(附圖3的構(gòu)建體)，測(cè)試了VB6-845(90％純度)以及17種化療藥物(LKB Laboratories Inc.)對(duì)Ep-CAM-陽(yáng)性(NIHOVCAR-3)和Ep-CAM-陰性(HMEC，DAUDI，A-375)細(xì)胞系的細(xì)胞毒性(表11)。
用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成MTS檢測(cè)。具體是，每孔接種50微升細(xì)胞(2×104細(xì)胞/ml)，37℃下將板在5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。之后向培養(yǎng)基中加入50微升濃度逐漸升高的spiked drug(也即construct to betested或control)。分別以含或不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。將板在37℃、5％CO2下保留5天。第5天時(shí)，通過(guò)加入20微升MTS試劑(Promega，Cat#G5430)來(lái)評(píng)估對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。將板繼續(xù)在37℃、5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)，用plate reader spectrophotometer讀取490nm處的OD值。將對(duì)各濃度得到的樣品值中減掉背景值，結(jié)果以活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示。計(jì)算各藥物對(duì)細(xì)胞系的IC50。
當(dāng)用一組標(biāo)準(zhǔn)化療劑，測(cè)定對(duì)NIHOVCAR-3(一種Ep-CAM-陽(yáng)性卵巢肉瘤)的細(xì)胞毒性時(shí)，VB6-845比這被測(cè)試的17種中的12中更有效(表11)。盡管有五種化療劑更具細(xì)胞毒性，但由于它們?nèi)鄙偃魏渭?xì)胞特異性殺傷因而顯示出更強(qiáng)的毒性。在所推薦的五種用于治療卵巢癌的化療劑(Paclitaxel、Carboplatin、Cisplatin、Doxorubicin和Topotecan)中，只有兩種(Paclitaxel和Topotecan)更具細(xì)胞毒性。盡管VB6-845在1至2nM證實(shí)了更有效的溶細(xì)胞活性，這一有效殺傷僅限于對(duì)Ep-CAM-陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系NIH:OVCAR-3。盡管VB6-845對(duì)Ep-CAM-陰性細(xì)胞系表現(xiàn)了一些殺傷，但其細(xì)胞毒性效應(yīng)至少低220倍和至多低大于1000倍。VB6-845因此代表了替代與其它較低毒性的profile組合使用的化療劑的一種有效的抗體導(dǎo)向治療劑，在對(duì)許多不同類(lèi)型的固體腫瘤的治療中極具前景。
實(shí)施例9VB6-011用于最理想地運(yùn)送脫免疫bouganin(De-bouganin)的腫瘤相關(guān)抗原特異性Fab抗體的重組工程。
腫瘤靶向細(xì)胞毒素由連接于細(xì)菌、真菌或植物毒素的可變區(qū)構(gòu)成。本研究說(shuō)明，本發(fā)明的脫免疫bouganin構(gòu)建體，包括與靶部分相連的脫免疫bouganin，具有降低的免疫原性，而同時(shí)仍然保持其生物活性。表13證明了腫瘤相關(guān)抗原抗體與幾種類(lèi)型的腫瘤的結(jié)合，并由此顯示它可用于治療這些類(lèi)型的癌癥。
脫免疫Bouganin構(gòu)建體與de-bouganin相連的腫瘤相關(guān)抗原導(dǎo)向的靶部分
H11抗體，將一種識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體，遺傳連接于bouganin的一種脫免疫形式(de-bouganin)，Bou156，一種有效的、植物來(lái)源的、I型核糖體失活蛋白(RIP)，從而形成抗體-毒素構(gòu)建體VB6-011。附圖15顯示核酸編碼序列和氨基酸序列。對(duì)該構(gòu)建體的測(cè)試說(shuō)明，該構(gòu)建體保持了其生物活性(細(xì)胞毒性)。
效力(生物活性)MTS檢測(cè)證實(shí)，de-bouganin與Fab片段耦聯(lián)后仍保持其效力(附圖16)。用于測(cè)定效力的MTS檢測(cè)是用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成的，如實(shí)施例8中詳細(xì)描述。
細(xì)胞毒性為研究VB6-011的特異性和和選擇性，測(cè)試了其對(duì)MB-435S細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成MTS檢測(cè)。具體是，每孔接種50微升細(xì)胞(2×104細(xì)胞/ml)，37℃下將板在5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。之后向培養(yǎng)基中加入50微升濃度逐漸升高的spiked drug(也即construct to be tested或control)。分別以含或不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。將板在37℃、5％CO2下保留5天。第5天時(shí)，通過(guò)加入20微升MTS試劑(Promega，Cat#G5430)來(lái)評(píng)估對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。
將板繼續(xù)在37℃、5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)，用plate readerspectrophotometer讀取490nm處的OD值。將對(duì)各濃度得到的樣品值中減掉背景值，結(jié)果以活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果顯示，VB6-011的IC50值是350nM。
盡管已經(jīng)參照目前認(rèn)為的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開(kāi)的這些例子。相反，本發(fā)明意欲覆蓋在本發(fā)明所權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種修飾和等同安排。
所有公開(kāi)文獻(xiàn)、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)均以其全文引入本文作為參考，如同各獨(dú)立的公開(kāi)文獻(xiàn)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)被特別或單獨(dú)指出以其全文作為參考。
表1
Bouganin序列肽。下劃線(xiàn)殘基在成熟肽中不含。
表2
PBMC供體的MHC同種異型表3引物SEQ ID NO序列OL1032 121 CATTACAAACGTCTACCAAGTTTOL1033 122 TTACAAAAGTAGATAAGTAATGTGOL1322 123 GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGOL1067 124 TGACACAGTGTTGTACGCTGGTTGGGCAGCGAGTAAOL1068 125 GCTGCCCAACCAGCGTACAACACTGTGTCATTTAACOL1323 126 CGAGTGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGGTGT構(gòu)建WT bouganin基因中所使用的引物序列表4所構(gòu)建和測(cè)試的單取代bouganin變體。
*熒光素酶測(cè)定中的活性++＝等于或高于WT蛋白。+＝WT活性的2倍以?xún)?nèi)。+/-＝WT活性的3倍以?xún)?nèi)。--＝少于WT活性的三分之一。WT＝野生型蛋白。
**克隆ID。只對(duì)有功能活性的變體命名。
表5所構(gòu)建和測(cè)試的多取代bouganin變體。
*熒光素酶測(cè)定中的活性++＝等于或高于WT蛋白。+＝WT活性的2倍以?xún)?nèi)。+/-＝WT活性的3倍以?xún)?nèi)。--＝少于WT活性的三分之一。WT＝野生型蛋白。
表6
*從bouganin閱讀框的殘基1開(kāi)始的編號(hào)，由此排除了在大多數(shù)構(gòu)建體中所包括的PelB引導(dǎo)序列。
表7
表8在T細(xì)胞檢測(cè)中進(jìn)一步測(cè)試酶被修飾和WT Bouganin。
*被取代(突變)的殘基用下劃線(xiàn)表示。
表9VB6-845經(jīng)流式細(xì)胞儀與婦科細(xì)胞系的結(jié)合結(jié)果以MF±SEM.表示增殖倍數(shù)
表10通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)定的VB6-845-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性
表11VB6-845相比化療劑的特異性和選擇性
表12VB6-845腫中瘤細(xì)胞指征
1N表示每個(gè)指征中所測(cè)試的細(xì)胞系的數(shù)量。
2意指各指征中來(lái)自所有細(xì)胞系的中值熒光對(duì)對(duì)照抗體的增殖倍數(shù)。
表13VB6-011 Tumor Cell Indications
1N表示每個(gè)指征中所測(cè)試的細(xì)胞系的數(shù)量。
2值表示從各指征中來(lái)自所有細(xì)胞系的中值熒光對(duì)對(duì)照抗體的平均增殖倍數(shù)的總數(shù)計(jì)算得到的平均值。零值意味著相對(duì)于對(duì)照活性沒(méi)有可測(cè)量的活性。
<110>馬修·貝克弗朗西斯·J·卡爾柯恩·赫倫多姆吉恩尼克·西茲爾尤格倫·克里斯多佛·麥克唐納喬伊斯林·恩特韋斯特爾丹尼斯·喬治沙·鮑斯克尼古拉斯·羅納德·格羅沃<120>被修飾Bouganin蛋白、細(xì)胞毒素及其方法和用途<130>10241-43<140>
<141>
<150>US 60/554,580<151>2004-03-19<150>US 60/630,571<151>2004-11-26<160>129<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>250<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis Wild<400>1Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr1 5 10 15Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys20 25 30Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val35 40 45Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile50 55 60Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly65 70 75 80Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser85 90 95Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly
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<400>52Lys Val Ala Ile Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln1 5 10 15<210>53<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>53Ile Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp1 5 10 15<210>54<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>54Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys1 5 10 15<210>55<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>55Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala1 5 10 15<210>56<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>56Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu1 5 10 15<210>57<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>57Asp Lys Trp Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val1 5 10 15
<210>58<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>58Asp Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val1 5 10 15<210>59<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>59Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser1 5 10 15<210>60<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>60Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe1 5 10 15<210>61<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>61Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe Pro Gly Val1 5 10 15<210>62<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>62Pro Thr Val Ala Thr Ser Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg1 5 10 15<210>63<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis
<400>63Ala Thr Ser Lys Leu phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu1 5 10 15<210>64<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>64Lys Leu phe pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp1 5 10 15<210>65<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>65Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr1 5 10 15<210>66<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>66Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu1 5 10 15<210>67<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>67Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala1 5 10 15<210>68<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>68Thr Phe Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val1 5 10 15
<210>69<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>69Gly Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys1 5 10 15<210>70<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>70Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu1 5 10 15<210>71<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>71Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val1 5 10 15<210>72<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>72Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu1 5 10 15<210>73<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>73Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser1 5 10 15<210>74<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>74
Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu phe Ser Ile Glu Ala1 5 10 15<210>75<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>75Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly1 5 10 15<210>76<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>76Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile1 5 10 15<210>77<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>77Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln1 5 10 15<210>78<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>78Ile Glu Ala Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala1 5 10 15<210>79<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>79Ile His Gly Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe1 5 10 15<210>80
<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>80Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val1 5 10 15<210>81<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>81Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met1 5 10 15<210>82<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>82Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu1 5 10 15<210>83<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>83Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg1 5 10 15<210>84<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>84Leu Ile Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg phe Lys Tyr1 5 10 15<210>85<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>85
Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr1 5 10 15<210>86<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>86Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val1 5 10 15<210>87<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>87Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly1 5 10 15<210>88<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>88Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly1 5 10 15<210>89<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>89Ile Glu Thr Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser phe Lys1 5 10 15<210>90<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>90Glu Val Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser phe Lys Pro Asn Phe1 5 10 15<210>91<211>15
<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>91Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu1 5 10 15<210>92<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>92Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu1 5 10 15<210>93<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>93Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp1 5 10 15<210>94<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>94Pro Asn Phe Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile1 5 10 15<210>95<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>95Lys Val Leu Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala1 5 10 15<210>96<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>96Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys
1 5 10 15<210>97<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>97Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro1 5 10 15<210>98<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>98Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr1 5 10 15<210>99<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>99Ser Asp Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn1 5 10 15<210>100<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>100Ile His Lys Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu1 5 10 15<210>101<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>101Ser Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile1 5 10 15<210>102<211>15<212>PRT
<213>Bougainvillea spectabilis<400>102Gln Cys Thr Thr Ile Asn pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser1 5 10 15<210>103<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>103Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro1 5 10 15<210>104<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>104Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val1 5 10 15<210>105<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>105Gln Leu Ile Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val1 5 10 15<210>106<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>106Ser Pro Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile1 5 10 15<210>107<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>107Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp1 5 10 15
<210>108<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>108Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser pro Asp Met Gly Ile1 5 10 15<210>109<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>109Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe1 5 10 15<210>110<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>110Ser Gln Ile Ser pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser1 5 10 15<210>111<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>111Ser Pro Asp Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr1 5 10 15<210>112<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>112Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala1 5 10 15<210>113<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis
<400>113Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile1 5 10 15<210>114<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>114Lys Ser Ser Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala1 5 10 15<210>115<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>115Lys Leu Thr Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu1 5 10 15<210>116<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>116Gln Phe Ala Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp1 5 10 15<210>117<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>117Thr Met Ile Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu1 5 10 15<210>118<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>118Arg Ser Ala Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile1 5 10 15<210>119
<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>119Ile Val Glu Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile Leu Glu Pro1 5 10 15<210>120<211>15<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>120Asp Leu Asp Gly Asp Glu Leu Glu Ile Leu Glu Pro Asn Ile Ala1 5 10 15<210>121<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OL1032<400>121cattacaaac gtctaccaag ttt23<210>122<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OL1033<400>122ttacaaaagt agataagtaa tgtg 24<210>123<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OL1322<400>123gatatacata tgaaatacct attgcctacg 30<210>124<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物OL1067<400>124tgacacagtg ttgtacgctg gttgggcagc gagtaa 36<210>125<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OL1068<400>125gctgcccaac cagcgtacaa cactgtgtca tttaac 36<210>126<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物OL1323<400>126cgagtgcggc cgctcaatgg tgatggtgat ggtgt 35<210>127<211>13<212>PRT<213>流感病毒<400>127Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10<210>128<211>15<212>PRT<213>衣原體sp.
<400>128Lys Val Val Asp Gln Ile Lys Lys Ile Ser Lys Pro Val Gln His1 5 10 15<210>129<211>250<212>PRT<213>Bougainvillea spectabilis<400>129
Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr1 5 10 15Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys20 25 30Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val35 40 45Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile50 55 60Asp Val Thr Asp Val Ala Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly65 70 75 80Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser85 90 95Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly100 105 110Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu115 120 125Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly130 135 140Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile145 150 155 160Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val165 170 175Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn phe Lys Val Leu180 185 190Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser195 200 205Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro210 215 220Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp225 230 235 240Met Gly Ile Leu Lys phe Lys Ser Ser Lys245 250
權(quán)利要求
1.一種被修飾Bouganin蛋白，其中所述的被修飾Bouganin具有減弱的激活免疫應(yīng)答傾向。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的被修飾Bouganin，其中所述的bouganin具有減弱的激活T-細(xì)胞的傾向且在T-細(xì)胞表位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處被修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的被修飾Bouganin，其中所述的bouganin在選自以下的T-細(xì)胞表位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處被修飾d)AKVDRKDLELGVYKL(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO2)，e)LGVYKLEFSIEAIHG(表位區(qū)域R2，SEQ ID NO3)；和f)NGQEIAKFFLIVIQM(表位區(qū)域R3，SEQ ID NO4))。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的被修飾Bouganin，其中所述的bouganin在以下X1、X2、X3、X4或X5中的一處或多處被修飾a)AKX1DRKX2LX3LGVX4KL(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO5)b)LGVX4KLEFSIEAIHG(表位區(qū)域R2，SEQ ID NO6)；和c)NGQEX5AKFFLIVIQM(表位區(qū)域R3，SEQ ID NO7)其中X1至X5可以是任何氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的被修飾Bouganin，其中X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S；和X5是Q或A(SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的被修飾Bouganin，其中被修飾Bouganin蛋白的氨基酸序列包含YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEAIHGKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ IDNO11)其中X1至X5可以是任何氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的被修飾Bouganin，其中X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S；和X5是Q或A(SEQ ID NO12)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的被修飾Bouganin，其中被修飾Bouganin蛋白包含以下序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ ID NO13)。
9.一種細(xì)胞毒素，包含(a)根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一的被修飾Bouganin蛋白；(b)附著于(a)的靶部分。
10.一種細(xì)胞毒素，包含(a)根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一的被修飾Bouganin蛋白；(b)附著于(a)的能夠結(jié)合癌細(xì)胞的配體。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞毒素，其中的配體是與癌細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片段。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞毒素，其中的抗體或抗體片段與癌細(xì)胞表面的Ep-CAM結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞毒素，其中與Ep-CAM結(jié)合的抗體或抗體片段是與人Ep-CAM的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合、且包含源自MOC-31抗體的互補(bǔ)決定區(qū)序列的人源化抗體或抗體片段。
14.權(quán)利要求12的細(xì)胞毒素，其中附著于被修飾Bouganin蛋白的癌結(jié)合配體的可變區(qū)是4D5MOCB。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞毒素，包含SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求11的細(xì)胞毒素，其中的抗體或抗體片段結(jié)合癌細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原。
17.權(quán)利要求16的細(xì)胞毒素，包含SEQ ID NO28中所示的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求9～17之中任一的細(xì)胞毒素在制備抑制或破壞癌細(xì)胞的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求18的用途，其中的癌細(xì)胞選自結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
20.根據(jù)權(quán)利要求9～17之中任一的細(xì)胞毒素在制備治療癌癥的藥物中的用途。
21.權(quán)利要求20的用途，其中的癌細(xì)胞選自結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
22.包含根據(jù)權(quán)利要求9～17之中任一的細(xì)胞毒素和藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
23.制備治療患癌動(dòng)物的藥物的方法，包括(a)鑒定bouganin的T-細(xì)胞表位；(b)對(duì)T-細(xì)胞表位中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾以制備具有減弱的激活T-細(xì)胞傾向的被修飾Bouganin；(c)制備具有附著于被修飾Bouganin的癌結(jié)合配體的細(xì)胞毒素；和(d)將該細(xì)胞毒素懸于藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑中。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的癌癥選自結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、黑素瘤、胃腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、和T-和B-細(xì)胞淋巴瘤。
25.編碼根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一的被修飾Bouganin的核酸分子。
26.編碼根據(jù)權(quán)利要求9～17中任一的被細(xì)胞毒素的核酸分子。
27.具有以下序列的T-細(xì)胞表位肽(a)AKVDRKDLELGVYKL(表位區(qū)域R1，SEQ ID NO2)，(b)LGVYKLEFSIEAIHG(表位區(qū)域R2，SEQ ID NO3)；or(c)NGQEIAKFFLIVIQM(表位區(qū)域R3，SEQ ID NO4)。
28.權(quán)利要求27的T-細(xì)胞表位肽，它具有包括以下的被修飾序列AKX1DRKX2LX3LGVX4K其中X1、X2、X3、和X4中至少一個(gè)是從非-被修飾序列修飾而來(lái)的，比如以下X1是T或A或Q；X2是G或A；X3是Q或G；和X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQ IDNO8)。
29.權(quán)利要求27的T-細(xì)胞表位肽，它具有包括以下的被修飾序列LGVX4KLEFSIEAIHG其中X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQID NO9)。
30.權(quán)利要求27的T-細(xì)胞表位肽，它具有包括以下的被修飾序列NGQEX5AKFFLIVIQM其中的X5是Q或A(SEQ ID NO10)。
31.編碼根據(jù)權(quán)利要求27～30之中任一的T-細(xì)胞表位肽的核酸分子。
32.一種被修飾Bouganin蛋白，其第70位的酪氨酸被修飾。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的被修飾Bouganin蛋白，其中的酪氨酸被丙氨酸取代。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的被修飾Bouganin蛋白，它具有以下序列YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK[SEQ ID NO129]。
全文摘要
本發(fā)明提供被修飾形式的Bouganin蛋白，它與非－被修飾Bouganin蛋白相比具有生物活性和減弱的激活T－細(xì)胞傾向。本發(fā)明還提供Bouganin的T－細(xì)胞表位肽，和被修飾的Bouganin的T－細(xì)胞表位肽，后者與非－被修飾的T－細(xì)胞表位肽相比具有減弱的激活人T－細(xì)胞傾向。本發(fā)明還提供細(xì)胞毒素，它具有能夠與附著于被修飾Bouganin蛋白的癌細(xì)胞結(jié)合的配體。還提供用本發(fā)明的細(xì)胞毒素抑制或破壞哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和治療人癌癥的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1954073SQ200580015900
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者馬修·貝克, 弗朗西斯·J·卡爾, 柯恩·赫倫多姆, 吉恩尼克·西茲爾優(yōu), 格倫·克里斯多佛·麥克唐納, 喬伊斯林·恩特韋斯特爾, 丹尼斯·喬治沙·鮑斯克, 尼古拉斯·羅納德·格羅沃 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利股份有限公司