專利名稱：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的穩(wěn)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉狀蛋白原纖維形成抑制劑。更具體地講，本發(fā)明涉及作為轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉狀蛋白原纖維形成抑制劑的衍生的二苯并呋喃類化合物。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)上不同的小分子轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)穩(wěn)定劑，其中特別令人關(guān)注的為二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)，圖1(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。該抑制劑(1；7.2μM)歷經(jīng)72小時后可以減少90％WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白形成(pH 4.4)。TTR·12的X射線共結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示該抑制劑通過特異性結(jié)合各個甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)的外部來發(fā)揮其抑制活性(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Bio2000，7，312-321)。需要用伸入甲狀腺素結(jié)合囊的內(nèi)腔中的亞結(jié)構(gòu)來修飾1以增強(qiáng)其在人血液中與TTR結(jié)合的親和力和選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了具有芳香取代基的二苯并呋喃-4，6-二羧酸母核結(jié)構(gòu)，該取代基通過三種不同類型的鍵于C1位與二苯并呋喃環(huán)連接，并且該母核結(jié)構(gòu)提供了極好的淀粉蛋白形成抑制劑，該抑制劑相對于母體化合物1顯示出對TTR較之對所有其它的血漿蛋白增強(qiáng)的親和力和顯著增強(qiáng)的結(jié)合選擇性(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。本發(fā)明還公開了這些化合物是通過賦予TTR四聚體動力學(xué)穩(wěn)定性來起作用。
轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)淀粉蛋白形成需要限制四聚體解離和部分單體變性的速率來產(chǎn)生具有錯聚集能力的物質(zhì)類型。該過程產(chǎn)生混濁，可用于鑒別轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)淀粉蛋白形成抑制劑，該抑制劑包括二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)。TTR·12的X射線共結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示其僅利用兩個甲狀腺素結(jié)合囊的外部進(jìn)行結(jié)合并且可以抑制TTR淀粉蛋白的形成。因此，通過對結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用三種不同的化學(xué)鍵在二苯并呋喃環(huán)的C1位引入芳基取代基來填補(bǔ)未使用的甲狀腺素結(jié)合囊的內(nèi)部。28個具有增強(qiáng)效力并且顯著增強(qiáng)血漿TTR結(jié)合選擇性的淀粉蛋白形成抑制劑通過賦予天然的TTR四聚體結(jié)構(gòu)動力學(xué)穩(wěn)定性來起作用，其建立了在生理?xiàng)l件下不能逾越的屏障。由于已知TTR天然狀態(tài)的動力學(xué)穩(wěn)定性可以通過等位基因間的反式抑制來改善疾病，因此優(yōu)化的基于二苯并呋喃的抑制劑也將起到該作用。預(yù)防淀粉蛋白形成的啟動是進(jìn)行臨床干預(yù)的最保守的策略，這是因?yàn)槿藗內(nèi)圆磺宄烤故悄姆NTTR錯聚集中間體產(chǎn)生毒性。極好的結(jié)合選擇性使這些抑制劑能夠在復(fù)雜的生物液(如血漿)中占據(jù)甲狀腺素的結(jié)合位點(diǎn)，這對于在人體中抑制淀粉蛋白形成是必要的?，F(xiàn)在明確了基于二苯并呋喃的淀粉蛋白形成抑制劑具有很高的選擇性、親和力和效力。
本發(fā)明的一方面涉及式I代表的化合物
(式I)。
在式I中，X不存在或是選自-O-、-S-和-NH-的二價(jià)基團(tuán)；并且R2、R3、R4和R5是獨(dú)立地選自-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3和-CO2H的基團(tuán)。在本發(fā)明第一方面的第一種情況中，該化合物是式II代表的化合物 (式II)。
在式II的情況中，優(yōu)選的實(shí)施方案可以包括其中R2是選自-H、-F、-Cl和CF3的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案可以包括其中R4是選自-H、-Cl和-CO2H的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案可以包括其中R5是選自-H、-F和-Cl的基團(tuán)的化合物；優(yōu)選的式II的化合物包括選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物
在本發(fā)明第一方面的第二情況中，該化合物是式III代表的化合物
(式III)。
在式III的情況中，優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R3是選自-H、-F、-Cl、-Br和CF3的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R5是選自-H、-F、-Cl和-Br的基團(tuán)的化合物；優(yōu)選的式III的化合物還包括選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物 在本發(fā)明第一方面的第三情況中，該化合物是式IV代表的化合物
(式IV)。
在式IV的情況中，優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R2是選自-H、-F和-Cl的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R3是選自-H、-F、-Cl、-CF3和-CO2H的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R4是選自-H和-CO2H的基團(tuán)的化合物；另外優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中R5是選自-H、-F、-Cl和-CF3的基團(tuán)的化合物。
優(yōu)選的式IV的化合物包括選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物 本發(fā)明的另一方面涉及有效抑制淀粉狀蛋白原纖維形成的方法，該方法包括使轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白與一定濃度的選自上述的式I-IV的化合物接觸的步驟。


圖1A是TTR·12的X射線晶體結(jié)構(gòu)(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。
圖1B是代表放入甲狀腺素結(jié)合囊中的1-取代的-二苯并呋喃-4，6-二羧酸的設(shè)計(jì)的線圖，其中X代表NH、O或直接的C芳基-C芳基鍵。R代表為填補(bǔ)TTR內(nèi)部結(jié)合腔而設(shè)計(jì)的芳環(huán)取代基。
圖2是突出了在pH 4.4(72小時)對抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖維形成(f.f.)的濃度依賴的酸取代的二苯并呋喃的活性的表。
圖3是顯示了對抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖維形成(pH 4.4，72小時)的基于二苯并呋喃的淀粉狀蛋白抑制劑活性(3.6μM)以及在人血漿中與TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量的概要的表。
圖4是合成1-羥基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相應(yīng)的三氟甲基磺酸酯的流程圖。
圖5是合成1-苯基-、苯氧基-和苯胺基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相應(yīng)的二羧酸酯的流程圖。
圖6是顯示在pH 4.4(72小時)對抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖維形成(f.f.)的基于二苯并呋喃的抑制劑的活性(7.2μM)的表。
圖7是說明二苯并呋喃血漿TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量對原纖維形成抑制劑效力的圖。
圖8是在與27(7.2μM)預(yù)培養(yǎng)后并且在另外的pH降低為4.4的72小時培養(yǎng)周期(在無抑制劑時引起最大淀粉狀蛋白形成的時間設(shè)計(jì))后，在TTR(3.6μM)沉降速率研究中，280nm的吸光度對與中心的距離的點(diǎn)圖。
圖9是在與27(7.2μM)預(yù)培養(yǎng)后并且在另外的pH降低為4.4的72小時培養(yǎng)周期(在無抑制劑時引起最大淀粉狀蛋白形成的時間設(shè)計(jì))后，在TTR(3.6μM)平衡超速離心研究中，280nm的吸光度對與中心的距離的點(diǎn)圖。
圖10是由部分酸變性誘導(dǎo)的WT-TTR(3.6μM)原纖維形成的時間過程分析的點(diǎn)圖，該分析在無(▲)和有7.2цM(◇)和3.6μM(○)抑制劑25、47和64的存在下進(jìn)行，通過在500nm處的濁度進(jìn)行測定(見圖中不同抑制劑的明暗標(biāo)記)。
圖11是WT-TTR(3.6μM)四聚體解離(6.0M尿素)的時間過程分析的點(diǎn)圖，該分析在無(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)濃度的抑制劑25、47和64的存在下進(jìn)行(見圖中不同抑制劑的顏色標(biāo)記)。
發(fā)明詳述C1-芳基取代的二苯并呋喃(7.2μM)除了一個外所有其他的二苯并呋喃均是體外(pH 4.4，37℃)極好的WT-TTR(3.6μM)酸介導(dǎo)的原纖維形成抑制劑，甚至那些帶有未取代的芳基環(huán)的二苯并呋喃(圖6)。唯一的對TTR淀粉蛋白形成無效的基于二苯并呋喃的抑制劑是34，其潛在地帶有四個負(fù)電荷。因?yàn)樗械幕衔锿耆种芓TR原纖維形成(在±5％試驗(yàn)誤差內(nèi))，所以從7.2μM抑制劑的數(shù)據(jù)沒有推導(dǎo)出構(gòu)效關(guān)系(SAR)。但是，圖3和7表明在抑制劑濃度等于TTR(3.6μM)時抑制效力的范圍，由此得到一些關(guān)于SAR的結(jié)論，但是其受到制備的31類似物和試驗(yàn)誤差的限制。具體地講，在3.6μM時所有的抑制劑(除了34外)相對于母體化合物(1)均具有增強(qiáng)的效力(圖3)。最重要的是，在30個顯示出增強(qiáng)的效力的抑制劑中，除了兩個(31和35)外所有其他的抑制劑均顯示出在人血漿中對TTR的顯著增強(qiáng)的結(jié)合選擇性。C1取代的抑制劑具有極好的結(jié)合選擇性對于在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中抑制TTR淀粉蛋白形成而言是非常理想的。
將所有三個抑制劑系列中發(fā)現(xiàn)的四種C1-芳基取代的形式(H、3-CF3、3，5-F2和3，5-Cl2)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，芳環(huán)直接與二苯并呋喃骨架的C1位相連的抑制劑(下文中稱為二芳基化物)相對于其二芳基胺和二芳基醚對應(yīng)物具有略微增強(qiáng)的抑制效力(圖3)。這可能是由于結(jié)構(gòu)的不同使環(huán)在內(nèi)部結(jié)合腔中的取向不同；但是，值得注意的是，該優(yōu)選可能不支持非常大的類似物系列。有人可能會爭辯，其它的兩個系列在血漿中產(chǎn)生選擇性最強(qiáng)的TTR結(jié)合物；但是，在此SAR被多至100種蛋白競爭該抑制劑這樣一個事實(shí)所混淆。而并不令人吃驚的是大多數(shù)潛在的抑制劑具有2-F或3，5-Cl2取代基(36、63和67)，其可能在甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)識別鹵素結(jié)合囊，略微令人吃驚的是3-CO2H取代的芳基抑制劑33和69是其中最具潛力的(盡管它們對TTR的血漿結(jié)合選擇性是中等的)。先前的簡單的二苯基和二苯基胺抑制劑的晶體學(xué)結(jié)果說明該化合物在內(nèi)部結(jié)合腔中優(yōu)選為具有帶有羧基的芳環(huán)(使H與S117和T119鍵合)(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374)。
在C1位引入芳基不僅增強(qiáng)了抑制劑的效力，更重要的是顯著增強(qiáng)了對TTR的血漿結(jié)合選擇性，這大概是通過相對于所有的其它血漿蛋白增強(qiáng)對TTR的結(jié)合親和力來實(shí)現(xiàn)的。在血漿中C1-芳基取代的基于二苯并呋喃的抑制劑對TTR的較高的結(jié)合選擇性清楚地被制備的～2/3的化合物顯示出TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量大于1的事實(shí)證明。非常有趣的是僅應(yīng)用TTR的外腔結(jié)合選中的1顯示出在血漿中測量不到的對TTR的結(jié)合選擇性。先前的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的淀粉蛋白形成抑制劑的經(jīng)驗(yàn)揭示極少的化合物顯示出超過1的結(jié)合化學(xué)計(jì)量(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew.Chem.2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998，95，12956-12960；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller S.R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。圖7中用灰色覆蓋的面積包括滿足高體外活性(＜40％原纖維形成)和高結(jié)合選擇性(在血漿中與TTR鍵合＞1當(dāng)量)標(biāo)準(zhǔn)的基于二苯并呋喃的化合物。最重要的是幾乎所有的基于二苯并呋喃的抑制劑、特別是那些在灰色正方形(圖7)中的抑制劑的活性和結(jié)合選擇性在血漿中在動力學(xué)方面對于穩(wěn)定TTR是足夠的，這些抑制劑顯示出令人滿意的口服生物利用度、藥物動力學(xué)和毒性特征。
并不奇怪的是體外抑制劑效力(3.6μM)和在血漿中抑制劑對TTR的結(jié)合選擇性(10.8μM)并不相關(guān)(圖7)。對TTR比對其它血漿蛋白顯示出較高結(jié)合選擇性的化合物應(yīng)該是極好的原纖維形成抑制劑。但是，反之未必正確極好的抑制劑不一定顯示出很高的TTR血漿結(jié)合選擇性。顯示出很高的TTR血漿結(jié)合選擇性的極好的抑制劑是在人類中最有用的化合物，因?yàn)檫@些抑制劑可以選擇性地穩(wěn)定TTR的天然狀態(tài)而使其不處于解離過渡狀態(tài)并且在富含蛋白的生物液中賦予TTR動力學(xué)穩(wěn)定性。這些抑制劑與TTR的結(jié)合常數(shù)是很重要的，因?yàn)閯恿W(xué)穩(wěn)定性的程度與結(jié)合常數(shù)是成比例的。但是，關(guān)注結(jié)合常數(shù)和體外效力可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)，因?yàn)榛衔锟赡苁求w外極好的TTR淀粉蛋白形成抑制劑，但與其它的血漿蛋白可以結(jié)合，因此在人類中沒有作用(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。不顯示出對TTR很好的結(jié)合選擇性的體外有效的抑制劑很可能與其它的血漿蛋白、例如白蛋白相互作用(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。因?yàn)槎讲⑦秽种苿┳鳛橐唤M抑制劑相對于迄今為止已鑒定的抑制劑具有空前的結(jié)合選擇性和抑制效力(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew.Chem.2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.；Peterson，S.A.；Kelly，J.W.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nature Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller S.R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)，這些化合物對于進(jìn)一步的藥理學(xué)評價(jià)是很理想的。因?yàn)門TR是T4的三級載體(tertiary carrier)，其99％以上的結(jié)合位點(diǎn)是未被占據(jù)的；因此，結(jié)合TTR的抑制劑不應(yīng)該干擾T4的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
C1取代的基于二苯并呋喃的TTR淀粉蛋白形成抑制劑由于其體外淀粉狀蛋白抑制效力、其在血漿中對于TTR極好的結(jié)合選擇性、其降低TTR解離速率(這是通過本發(fā)明中應(yīng)用的方法可見高血漿選擇性的證據(jù))、它們賦予TTR四聚體動力學(xué)穩(wěn)定性的能力、其在血漿中的化學(xué)穩(wěn)定性以及其在低pH時的化學(xué)穩(wěn)定性(使其是極好的口服施用候選物)，因此這類抑制劑是有前途的。這些抑制劑用于治療TTR淀粉狀蛋白疾病，包括SSA、FAP和FAC，因?yàn)橐阎猅TR的動力學(xué)穩(wěn)定性可以改善FAP(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Coelho，T.等人.J.Rheumatol. 1993，20，179-179；Coelho，T.等人.Neuromuscular Disord.1996，6，27-27)。
設(shè)計(jì)與合成圖1A描述了在TTR甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)之一中1的兩種對稱等價(jià)結(jié)合方式(綠色和黃色)，該結(jié)合位點(diǎn)的表面用灰色畫出輪廓線(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。4和6位的羧酸基(carboxylate)與賴氨酸15和15，的ε-NH3+基團(tuán)在甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)的入口處發(fā)生靜電相互作用。除去其中一個羧酸基會使二苯并呋喃的活性大大降低，該活性在大多數(shù)情況下隨著羧酸基與芳環(huán)的間距而變化(圖2)。另外，二苯并呋喃環(huán)很好地填補(bǔ)了甲狀腺素結(jié)合腔外部的形狀和疏水性。觀察圖1A的TTR·12晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)在與1結(jié)合的甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)部具有大量的未占據(jù)的體積。基于此結(jié)構(gòu)，清楚的是取代基、例如芳環(huán)可以通過與1的二苯并呋喃環(huán)的C1位相連來伸入結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)部。如圖1B所示，該取代基可以通過雜原子(N或O)與二苯并呋喃骨架鍵合或直接通過C芳基-C芳基鍵與之鍵合(未示出)。選擇芳香族取代基(圖3)以使其在內(nèi)腔中與鹵素結(jié)合囊或氫鍵合亞結(jié)構(gòu)相互作用，其基于苯環(huán)在內(nèi)部結(jié)合腔中的預(yù)期的取向以及先前的來自于被認(rèn)為是類似決定其芳環(huán)位置的其它化學(xué)系列的SAR數(shù)據(jù)(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.Drug.Disc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。
如先前所述，C1取代的基于二苯并呋喃的抑制劑的合成開始于商購的2，4-二叔丁基-6-溴苯酚(2)的酚基全偶聯(lián)(homo-coupling)，得到二苯并呋喃衍生物3，此過程中應(yīng)用六氰合鐵(III)酸鉀(Tashiro，M.Y.等人.Synthesis1980，6，495-496)(圖4)。將該四-叔丁基二苯并呋喃衍生物在甲苯中進(jìn)行烷基轉(zhuǎn)移以形成1-羥基二苯并呋喃(4)，其從2的總收率為33％(已經(jīng)出現(xiàn)合成該中間體的選擇性策略)(Labiad，B.；Villemin，D.Synthesis 1989，143-144；Lee，Y.R.等人.Org.Lett.2000，2，1387-1389)。酚的保護(hù)之后，將甲硅烷基醚5在4-和6-位與仲丁基鋰選擇性地鄰位金屬化(1-氧上的三異丙基甲硅烷基使其不作為金屬化的主體)(Snieckus，V.Chem.Rev.1990，90，879-933)。將二價(jià)陰離子用氣態(tài)CO2淬滅并且酯化，得到6，然后，將6用TBAF脫保護(hù)并且以很高的總收率將其轉(zhuǎn)化為三氟甲基磺酸酯8。
將選擇的苯胺應(yīng)用Buchwald和Hartwig開發(fā)的鈀介導(dǎo)的N-芳基化反應(yīng)與三氟甲基磺酸酯8偶聯(lián)，得到基于二苯并呋喃的二芳基胺類似物9-23(圖5)(Louie，J.D等人。J.Org.Chem.1997，62，1268-1273；Wolfe，J.P.B.，Stephen L.Tetrahedron Lett.1997，38，6359-6362)。為了將芳基醚引入到二苯并呋喃的C1位上，應(yīng)用Chan和Evan的銅介導(dǎo)的二芳基醚偶聯(lián)方法將酚7與數(shù)種苯基硼酸交聯(lián)，得到化合物39-43(Chan，D.M.T.等人.Tetrahedron Lett.1998，39，2933-2936；Evans，D.A.等人.Tetrahedron Lett.1998，39，2933)。在數(shù)種苯基硼酸的存在下使化合物8經(jīng)歷Suzuki偶聯(lián)條件，得到基于二苯并呋喃的二芳基類似物49-59(Suzuki，A.Modern AreneChemistry 2002，53-106)。在這些前體中將甲基酯皂化獲得所需的二苯并呋喃-4，6-二羧酸胺(24-38)、醚(44-48)和二芳基化物(60-70)，這些化合物被評價(jià)為潛在的TTR淀粉蛋白形成抑制劑。
結(jié)果有效的小分子淀粉蛋白形成抑制劑的兩個最重要的特征是它們必須能夠在血中以高親和力和選擇性與TTR結(jié)合并且穩(wěn)定TTR天然的四聚體結(jié)構(gòu)(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Razavi，H.等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。應(yīng)用重組TTR在促進(jìn)淀粉蛋白形成的部分變性緩沖液(pH 4.4，37℃)中首次評價(jià)抑制效力(化合物24-38、44-48以及60-70)。然后，評價(jià)在人類血漿中相對于其它蛋白與TTR選擇性結(jié)合的有效的抑制劑的能力。
評價(jià)作為淀粉蛋白形成抑制劑的基于二苯并呋喃的化合物。
應(yīng)用前述的靜止原纖維(stagnat fibril)形成分析研究TTR淀粉狀蛋白抑制效力，其中部分變性是通過酸化(pH 4.4，37℃)引發(fā)的(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-8660)。簡言之，將試驗(yàn)化合物(7.2或3.6μM)與TTR(3.6μM)在pH 7的緩沖液中溫育30分鐘。然后，通過將pH降低至4.4啟動淀粉蛋白形成，72小時(37℃)之后可觀察到WT-TTR的最大的原纖維形成。潛在的抑制劑中出現(xiàn)的濁度(T試驗(yàn))與不加入試驗(yàn)化合物的溶液的濁度(T對照)比較。極好的抑制劑顯示出0％原纖維形成，而無抑制作用的化合物將顯示出100％的原纖維形成。從經(jīng)驗(yàn)可知，極好的抑制劑在小分子濃度為7.2цM時僅有＜10％原纖維形成，在濃度等于WT-TTR的濃度(3.6μM)時有＜40％原纖維形成(Hammarstrom，P.等人.Science2003，299，713-716；Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321；Razavi，H等人.Angew Chem 2003，42，2758-2761；Miroy，G.J.等人.Proc.Naal.Acad.Sci. USA 1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，12956-12960；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Baures，P.W.等人.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Petrassi，H.M.等人.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；McCammon，M.G.等人.Structure 2002，10，851-863；Oza，V.B.等人.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Sacchettini，J.C.等人.Nature Rev.DrugDisc.2002，1，267-275；Green，N.S.等人.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Adamski-Werner，S.L.等人.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Miller Sean，R.等人.Lab.Inv.2004，84，545-552)。在被評價(jià)的31個化合物中，在濃度為TTR濃度的二倍(7.2μM抑制劑)時除了一個(34)外均完全抑制原纖維形成，圖6(在7.2μM時加入足夠的試驗(yàn)化合物以占據(jù)TTR的兩個結(jié)合位點(diǎn)(TTR·I2)，前提是在pH 4.4時它們的解離常數(shù)均在低nM范圍內(nèi))。小分子典型地以負(fù)協(xié)同性與TTR結(jié)合，因此Kd1和Kd2通常會有一或兩個數(shù)量級的差別。因此，當(dāng)配體與TTR濃度相等時，可以觀察到由解離常數(shù)決定的TTR·I組、TTR·I2組和無配體的TTR組。由其它的研究表明僅占據(jù)兩個TTR結(jié)合位點(diǎn)之一的抑制劑對于穩(wěn)定全部的四聚體不進(jìn)行淀粉蛋白形成是足夠的(Wiseman，R.L.等人.J.Am.Chem.Soc.2005，inpress)。該結(jié)論也被本發(fā)明中觀察到的在濃度等于TTR的濃度(各3.6μM，圖3)時26個二苯并呋喃是極好的TTR淀粉蛋白形成抑制劑(＜40％原纖維形成)所支持。使來自于所有三個系列的代表性的小分子(25、26、27、30、45、47、62；3.6μM)經(jīng)歷無TTR的情況下酸介導(dǎo)的淀粉蛋白形成條件(pH4.4，37℃，72小時)，未顯示出可測量的沉淀。
評價(jià)基于二苯并呋喃的抑制劑的血漿TTR結(jié)合選擇性。
應(yīng)用先前建立的抗體捕獲方法評價(jià)在人血漿中抑制劑對TTR的結(jié)合選擇性(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)。在該評價(jià)中，將抑制劑(10.8μM，～2-3×天然濃度的TTR)在人血漿中37℃培養(yǎng)24小時。然后將淬滅的瓊脂糖樹脂加入到血漿中以除去將與樹脂結(jié)合而不與TTR結(jié)合的任何小分子。然后應(yīng)用與瓊脂糖樹脂共價(jià)連接的多克隆TTR抗體將TTR和任何鍵合小分子的TTR免疫捕獲。洗滌樹脂(5×10分鐘洗滌)后，將抗體-TTR復(fù)合物在高pH下解離并且通過RP-HPLC分析。然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線從TTR和抑制劑之間的HPLC峰面積計(jì)算二者的相對化學(xué)計(jì)量?？傻湫偷赜^察到對于具有很高的解離速率的抑制劑的與洗滌相關(guān)的損失；因此，該分析可能低估了TTR和具有很高的解離速率的抑制劑之間的真實(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量，但給出了對于顯示出低解離常數(shù)和解離速率的化合物的可信結(jié)果。在濃度為3.6μM時，21個抑制劑顯示出大于1的結(jié)合化學(xué)計(jì)量(最大的結(jié)合化學(xué)計(jì)量為2)，19個抑制劑顯示出＜40％原纖維形成(圖7，覆蓋的正方形)。由于母核二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)不顯示出對TTR的結(jié)合選擇性，因此觀察到的高血漿TTR結(jié)合選擇性是顯著的，這說明C1芳基取代基在相對于所有其它血漿蛋白賦予對TTR結(jié)合選擇性方面的重要性。
在淀粉蛋白形成條件下四聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
為了通過天然狀態(tài)穩(wěn)定性(即四聚體穩(wěn)定性)確保這些C1-芳基化的二苯并呋喃抑制TTR原纖維形成，發(fā)明人通過在淀粉蛋白形成條件下(pH4.4，37℃)的72小時預(yù)培養(yǎng)周期后的分析超速離心研究了TTR四聚體結(jié)構(gòu)。在27(7.2μM)的存在下，與預(yù)期的四聚體TTR分子量(55.0kDa)相比，分別通過沉降速率(圖8)和平衡分析超速離心(圖9)發(fā)現(xiàn)TTR(3.6μM)具有流體動力學(xué)的分子量為57.1±0.3和55.1±0.4kDa。在無27的存在下，TTR聚集為分子量很大的低聚物，該低聚物在超速離心試驗(yàn)中快速沉降(數(shù)據(jù)未示出)。
基于二苯并呋喃的抑制劑是否賦予TTR動力學(xué)穩(wěn)定性？通過評價(jià)TTR四聚體解離速率來最佳評價(jià)這些抑制劑影響四聚體TTR的動力學(xué)穩(wěn)定性的能力(Hammarstrom，P.等人.Science 2003，299，713-716；Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002，99，16427-16432)。在酸性條件下四聚體的解離引起淀粉蛋白形成，而在離液劑(6M尿素)的存在下，四聚體的解離引起單體解折疊。探測了代表基于二苯并呋喃抑制劑的三種結(jié)構(gòu)的抑制劑25、47和64在酸性介導(dǎo)的和尿素介導(dǎo)的變性條件下對四聚體的解離速率的影響。與對照(無抑制劑)相比，部分酸化介導(dǎo)的TTR淀粉蛋白形成在25、47和64的劑量依賴方式中顯著降低(圖4A)。通過將慢四聚體結(jié)構(gòu)改變與快四聚體結(jié)構(gòu)改變(這兩種結(jié)構(gòu)改變通過光譜學(xué)方法監(jiān)控)相關(guān)聯(lián)來監(jiān)控TTR四聚體在6M尿素中的解離速率(Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002，99，16427-16432)。通過遠(yuǎn)-UV CD監(jiān)控的TTR四聚體(3.6μM)的解離速率在25、47和64的劑量依賴方式中顯著降低。這些結(jié)果與背景狀態(tài)對通過25、47和64的結(jié)合的解離過渡狀態(tài)的差別穩(wěn)定性一致。
試驗(yàn)用于TTR細(xì)菌表達(dá)的方法(Lai，Z.等人.Biochemistry 1996，35，6470-6482)、靜止原纖維形成分析(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry1992，31，8654-8660；Lai，Z.等人Biochemistry 1996，35，6470-6482)、血漿結(jié)合選擇性分析(Purkey，H.E.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，5566-5571)和分析超速離心(Lashuel，H.A.等人.Biochemistry 1998，37，17851-17864)均已在先前詳細(xì)描述。
化合物25、47和64對WT-TTR原纖維形成抑制的時間過程分析。將化合物25、47和64溶解于DMSO中，得到7.2mM一級儲備液(10×儲備液)，由該儲備液進(jìn)行5-和10-倍DMSO稀釋，得到1.44mM(2×)和0.72mM(1×)二級儲備液。將495μL 0.4mg/mL(7.2μM)WT-TTR溶液(10mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA，pH7.2)和5μL1.44或0.72mM抑制劑二級儲備液加入到一次性UV比色杯中，簡單渦旋，然后在25℃下培養(yǎng)30分鐘。然后通過加入500μL酸性緩沖液(100mM乙酸鹽、100mMKCl、1mM EDTA，pH 4.2)將pH調(diào)節(jié)至4.4，將最終的1mL溶液再次渦旋并且在37℃暗處培養(yǎng)而無攪拌。在酸化后0、4、8、12、25、49、74、100、122、145和169小時時，將溶液渦旋并且在500nm處測定濁度。制備包含5μL純DMSO的對照樣品并且按照上述進(jìn)行分析以作為比較。制備10組小分子和TTR對照樣品以防止在培養(yǎng)中比色杯的干擾。在測定濁度后將樣品丟棄。
通過鍵合的單體在尿素中解折疊評價(jià)的化合物25、47和64的WT-TTR四聚體解離抑制的時間過程分析。將化合物25、47和64溶解于DMSO中，得到10mM一級儲備液，由該儲備液進(jìn)行10-倍EtOH稀釋，得到1mM二級儲備液。將200μL 1.0mg/mL(18μM)WT-TTR溶液(50mM磷酸鈉、100mM KCl和1mM EDTA，pH 7.2)和7.2或3.6μL(分別為2×和1×)的1mM抑制劑二級儲備液加入到2mL eppendorf管中，簡單渦旋并且在25℃下培養(yǎng)15分鐘。將100μL TTR·抑制劑溶液加入到900μL尿素緩沖液(6.67M尿素、50mM磷酸鈉、100mM KCl、1mM EDTA，pH 7.2)中，將最終的1mL溶液再次渦旋并且在25℃暗處培養(yǎng)而無攪拌。在與尿素混合后的0、4、11、24、49、73、97、122、146和170小時時，在218和215nm之間測定圓二色譜，每0.5nm掃描一次并且平均為5秒。測定后，將樣品放回各自的eppendorf管中并且繼續(xù)培養(yǎng)。制備包含7.2μL10％DMSO的EtOH溶液的對照樣品并且按照上述進(jìn)行分析以作為比較。將CD振幅值在215和218nm之間平均以確定在試驗(yàn)過程中β-折疊損失程度。在β-折疊損失中測定的TTR四聚體解離與快速(～500,000×更快)單體變性相關(guān)(Hammarstrom，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 2002，99，16427-16432)。
抑制劑合成除非其它說明，用于化學(xué)合成的試劑均是商購的并且可以應(yīng)用而無需進(jìn)一步純化。應(yīng)用在硅膠60 F254包被的鋁板(EM Sciences)上的薄層色譜或分析性反相柱高效液相色譜(HPLC)監(jiān)控反應(yīng)過程。應(yīng)用Waters 600E多溶劑輸送系統(tǒng)進(jìn)行HPLC，該系統(tǒng)應(yīng)用Waters 486可變波長紫外檢測器和Waters 717加自動進(jìn)樣器。對于所有反相HPLC分析應(yīng)用C18 Western Analytical柱(型號033-715，150孔徑，3μm顆粒)。應(yīng)用乙腈/水/三氟乙酸溶劑體系；溶劑A比例分別為4.8％、95％和0.2％，而溶劑B分別為95％、4.8％和0.2％。在2分鐘的100％A等度流動后，進(jìn)行歷經(jīng)8分鐘的0至100％B的線性梯度，流速為1.5mL/分鐘。應(yīng)用230-400目硅膠60(EM Sciences)完成所有的快速色譜。1H和13C-NMR譜在Bruker光譜儀上300、400、500或600MHz記錄。化學(xué)位移以低場區(qū)距內(nèi)標(biāo)(Me4Si，0.0ppm)的百萬份給出。
(二苯并呋喃-1-基氧基)-三異丙基-硅烷(5)。向干燥的250mL圓底燒瓶中加入酚4(Tashiro，M.Y.等人.Synthesis 1980，6，495-496)(492mg，2.67mmol)和攪拌棒并且將燒瓶用封口膜封好。加入CH2Cl2(5mL)，然后加入DMAP(391mg，3.2mmol)和三異丙基甲硅烷基氯(800μL，3.73mmol)。產(chǎn)生的無色溶液過夜后變?yōu)榘咨鞈乙?。將反?yīng)物轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗中并且用H2O洗滌(3×10mL)。將水層合并并且用CH2Cl2(3×30mL)萃取。將有機(jī)層合并，用MgSO4干燥，并且在減壓下濃縮，得到淺黃色油狀物。將該油狀物通過經(jīng)硅膠的快速色譜(100％己烷)純化，得到0.70g(77％)的5，為無色油狀物。MALDI-FTMS 341.1932m/z(M+H)+，C21H29O2Si理論值為341.1931。
1-三異丙基硅烷基氧基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(6)。將甲硅烷基醚5(654mg，1.92mmol)加入到干燥的50mL圓底燒瓶中，接著加入Et2O(7.4mL)和TMEDA(0.87mL，5.77mmol)。將燒瓶在丙酮/CO2(固體)浴中冷卻至-78℃達(dá)10分鐘，然后歷經(jīng)10分鐘加入仲丁基鋰(4.44mL的1.3M環(huán)己烷溶液，5.77mmol)。將產(chǎn)生的橙色混懸液溫至室溫并且攪拌24小時。如上所述將燒瓶再次冷卻至-78℃并且將15psi的CO2(氣體)氣流以氣泡通過反應(yīng)混懸液(CO2通過將其經(jīng)過含有活化硅膠的干燥管干燥)。在最初加入CO2(氣體)后，除去冷卻浴并且將反應(yīng)物攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物傾倒至1L包含冰水(50mL)的燒杯中。通過緩慢加入0.05M KOH將溶液調(diào)節(jié)至pH 9，然后將其用冰/H2O浴冷卻至0℃。將溶液用0.5M HCl酸化至pH 2，產(chǎn)生白色固體沉淀。將水混懸液(pH 2)轉(zhuǎn)移至1L分液漏斗中并且用EtOAc(5×50mL)萃取。將合并的萃取物用MgSO4干燥并且在減壓下濃縮，得到粗的二酸，為油狀物。將100mL包含粗的二酸的燒瓶安裝上攪拌棒，用封口膜封好并且抽真空。然后將燒瓶用氬氣反填。通過注射器加入無水MeOH(2mL)和ACS試劑級的苯(8mL)。穿過膜通過注射器緩慢加入三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMSCHN2；2.5mL的2M己烷溶液，5mmol)。完成TMSCHN2的加入后將反應(yīng)物攪拌10分鐘并且在減壓下除去溶劑，得到紅色油狀物。將殘留物通過經(jīng)硅膠的快速色譜(15％EtOAc的己烷溶液)純化，得到0.36g(43％)的6，為白色固體。MALDI-FTMS 479.1874m/z(M+Na)+，C25H32O6SiNa理論值為479.1860。
1-羥基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(7)。將干燥的100mL圓底燒瓶安裝上攪拌棒，裝入6(363mg，0.95mmol)，用封口膜封好，抽真空并且用氬氣反填。通過注射器將無水THF(6.3mL)和四丁基氟化銨(1M的THF溶液，1.2mL，1.19mmol)加入到反應(yīng)物中。將反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時，然后將其傾倒至含有30mL H2O的250mL分液漏斗中。將水層用CHCl3(4×20mL)萃取。將有機(jī)層合并，用MgSO4干燥并且在減壓下濃縮。將殘留物通過經(jīng)硅膠的快速色譜(30％EtOAc的己烷溶液)純化，得到0.23g(97％)的7，為白色固體。LC-MS m/z 301，C16H12O6理論值為301。
1-三氟甲磺?；趸?二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(8)。應(yīng)用先前由Stille描述的三氟甲基磺酸酯化過程來合成8(Echavarren，A.M.等人.J.Am.Chem.Soc.1987，109，5478-5486)。將酚7(120mg，0.4mmol)加入到干燥的10mL圓底燒瓶中，然后將其用封口膜封好。通過封口膜用注射器加入溶劑-無水吡啶(2mL)。將反應(yīng)混合物用冰/H2O浴冷卻至0℃。為了使反應(yīng)開始，通過封口膜用注射器加入三氟甲磺酸酐(81μL，12mmol)。除去冰浴并且將反應(yīng)物溫至室溫并攪拌過夜。將反應(yīng)混合物傾倒至250mL包含30mL冰/H2O淤漿的燒杯中并且將其轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中。將水層用Et2O(4×40mL)萃取。將有機(jī)層合并，用飽和的CuSO4(4×20mL)和鹽水(2×20mL)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，然后在減壓下除去Et2O，獲得淡黃色固體。將該固體通過經(jīng)硅膠的快速色譜(30％EtOAc的己烷溶液)純化，獲得159mg(92％)的8，為白色固體。FAB-MS(NBA/NaI)m/z 433.0215(M+H)+，C17H12F3O8S理論值為433.0205。
8與取代的苯胺的鈀催化交聯(lián)的代表性過程。
應(yīng)用Buchwald和Hartwig報(bào)道的芳基偶聯(lián)過程制備化合物9-23。將火焰干燥的10mm×13cm硼硅酸鹽試驗(yàn)管安裝上攪拌棒并且用封口膜封好，向其中加入8(140mg，0.324mmol)，二亞芐基丙酮化鈀，Pd2(dba)3(15mg，0.016mmol)、(±)-binap(15mg，0.024mmol)、Cs2CO3(147mg，0.456mmol)和苯胺(32μL，0.356mmol)。在加入所有試劑后將該管用氬氣清洗10分鐘。然后通過封口膜加入無水甲苯(2.4mL)并且在油浴中將混合物加熱至100℃達(dá)36小時。反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾并且在減壓下將溶劑從濾液中除去。將產(chǎn)生的深色油狀物通過經(jīng)硅膠的快速色譜(30％EtOAc的己烷溶液)純化，獲得二芳基胺17，為白色固體(0.12g，68％)。涉及化合物10-23的具體合成細(xì)節(jié)和特征數(shù)據(jù)的支持信息與下面的9中描述的類似。
1-苯基氨基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(9)。
MALDI-FTMS 375.1094 m/z(M·)+，C22H17NO5理論值為375.1106。
酚7與取代的苯基硼酸的銅介導(dǎo)的交聯(lián)以獲得1-苯氧基二苯并呋喃39-43的代表性過程。
二芳基醚的偶聯(lián)采用改進(jìn)的Chan和Evans報(bào)道的方法。在安裝有磁力攪拌棒的20mL閃爍瓶中裝入酚7(150mg，0.50mmol)、乙酸銅(II)(91mg，0.5mmol)、新活化的4分子篩(～250mg)和苯基硼酸(180mg，1.5mmol)。加入二氯甲烷(5mL)，然后加入吡啶(201μL，2.5mmol)，產(chǎn)生淺綠色混懸液。應(yīng)用的蓋非常松以便反應(yīng)混懸液部分暴露于大氣中。通過TLC監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)完成后，使反應(yīng)混合物吸附于～6g硅膠上-將硅膠加入至反應(yīng)混合物中，然后在減壓下除去溶劑。反應(yīng)混合物經(jīng)硅膠色譜(30％EtOAc的己烷溶液)獲得二芳基醚39，為白色固體(29mg，15％)。涉及化合物40-43的具體合成細(xì)節(jié)和特征數(shù)據(jù)的支持信息與下面的39中描述的類似。
1-苯氧基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯(39)。
MALDI-FTMS 399.0825 m/z(M+Na)+，C22H16O6Na理論值為399.0839。
三氟甲基磺酸酯8和取代的苯基硼酸的鈀催化的交聯(lián)的代表性過程。
將火焰干燥的10mm×13cm試管安裝上攪拌棒并且用封口膜封好，向其中加入8(100mg，0.23mmol)、Pd(PPh3)4(14mg，0.01mmol)、LiCl(29mg，0.69mmol)、Na2CO3(300μL 2M水溶液)和甲苯(3mL)。將苯基硼酸(43mg，0.35mmol)溶解于EtOH(0.5mL)中并且將其加入到反應(yīng)混合物中。對于所有其它化合物，在該過程中MeOH代替了EtOH，因?yàn)榭梢杂^察到酯交換；因此分離的化合物49為二乙酯，而所有其它的化合物為二甲酯。加入試劑后，將該管用氬氣清洗并且將反應(yīng)混合物在油浴中加熱至100℃達(dá)12小時。然后將反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾。在減壓下從濾液中除去溶劑并且將產(chǎn)生的深色殘留物通過經(jīng)硅膠的快速色譜純化，獲得二芳基化物49，為白色固體(52mg，63％)。涉及化合物50-59的具體合成細(xì)節(jié)和特征數(shù)據(jù)的支持信息與下面的49中描述的類似。
1-苯基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二乙酯(49)。MALDI-FTMS 411.1197m/z(M+Na)+，C24H20O5Na理論值為411.1203。
酯水解以獲得最終的抑制劑24-38、44-48和60-70的代表性過程在安裝有攪拌棒的20mL閃爍瓶中將甲酯9(25mg，0.067mmol)在THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，1mL)中皂化。將LiOH·H2O(22mg，0.53mmol)加入到混懸液中并且攪拌反應(yīng)物直到反應(yīng)完成(典型地為4小時)，該反應(yīng)完成是通過TLC或分析性反相HPLC的監(jiān)控確定的。將反應(yīng)混合物用鹽水(2mL)稀釋并且將其用1M HCl酸化至pH2(pH試紙)，產(chǎn)生二相溶液。將上層(THF)除去并且將水層用THF(3×3mL)萃取。合并的有機(jī)層用MgSO4干燥，然后在減壓下濃縮，獲得二酸24，為白色固體(21mg，92％)。涉及化合物25-38、44-48和60-70的具體合成細(xì)節(jié)和特征數(shù)據(jù)的支持信息與下面的24中描述的類似。
1-苯基氨基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸(24)。MALDI-FTMS 347.0794 m/z(M·)+，C20H13NO5理論值為347.0788。
圖1A是TTR·12的X射線晶體結(jié)構(gòu)(Klabunde，T.等人.Nature Struct.Biol.2000，7，312-321)。在結(jié)合位點(diǎn)排列成行的殘基顯示為棒狀模型(氧為紅色，氮為藍(lán)色并且碳為灰色)，蛋白的Connolly表面表示為灰色。化合物1在其兩種C2對稱等價(jià)結(jié)合方式中均有顯示(黃色和綠色)。結(jié)合通道具有三組凹陷，即鹵素結(jié)合囊(HBP)，因?yàn)槠渑c甲狀腺素的碘相互作用?；衔?僅占據(jù)結(jié)合囊的外部并且填入HBP1和1’。1的羧酸接近K15和K15，的e-NH3+。
圖1B是代表放入甲狀腺素結(jié)合囊中的1-取代的-二苯并呋喃-4，6-二羧酸的設(shè)計(jì)的線圖，其中X代表NH、O或直接的C芳基-C芳基鍵。R代表為填補(bǔ)TTR內(nèi)部結(jié)合腔而設(shè)計(jì)的芳環(huán)的取代基。
圖2是突出了在pH4.4(72小時)對抗WT-TTR(3.6μM))淀粉狀蛋白原纖維形成(f.f.)的濃度依賴性酸取代的二苯并呋喃的活性的表。值代表f.f.的程度，因此抑制劑的效力是相對于無抑制劑的WT-TTR原纖維形成(賦值100％)完全抑制相當(dāng)于0％f.f.。
圖3是顯示了對抗WT-TTR(3.6mM)淀粉狀蛋白原纖維形成(pH 4.4，72小時)的基于二苯并呋喃的淀粉狀蛋白抑制劑活性(3.6mM)以及在人血漿中與TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量的概要的表。中間欄的％原纖維形成(f.f.)值代表f.f.的程度，因此抑制劑的效力是相對于無抑制劑的WT-TTR原纖維形成(賦值100％)。完全抑制相當(dāng)于0％f.f.。右欄表示觀察到的在血漿中抑制劑(劑量為10.8mM，～2-3×血漿TTR濃度)結(jié)合TTR的化學(xué)計(jì)量，應(yīng)用抗體捕獲方法測定。
圖4是合成1-羥基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相應(yīng)的三氟甲基磺酸酯的流程圖a)K3[Fe(CN)6]、KOH、H2O、苯；b)AlCl3、甲苯、各步驟均為33％；c)TIPSCl、DMAP、CH2Cl2、77％；d)仲-BuLi、Et2O，-78℃、氣態(tài)CO2、TMSCHN2、43％；e)TBAF、THF、97％；f)Tf2O、吡啶、92％。
圖5是合成1-苯基-、苯氧基-和苯胺基-二苯并呋喃-4，6-二羧酸二甲酯及其相應(yīng)的二羧酸酯的流程圖a)Pd2(DBA)3、(±)binap、Cs2CO3、甲苯、100℃；b)LiOH·H2O、THF/MeOH/H2O(3∶1∶1)；c)CuII(OAc)2、吡啶、4MS、CH2Cl2；d)Pd(PPh3)4、LiCl、含水Na2CO3、甲苯、MeOH、80℃。
圖6是顯示在pH 4.4(72小時)對抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖維形成(f.f.)的基于二苯并呋喃的抑制劑的活性(7.2μM)的表。值代表f.f.的程度，因此抑制劑的效力是相對于無抑制劑的WT-TTR原纖維形成(賦值100％)完全抑制相當(dāng)于0％f.f.。
圖7是說明二苯并呋喃血漿TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量對原纖維形成抑制劑效力的點(diǎn)狀圖。淺陰影區(qū)域相應(yīng)于高活性和高選擇性(＜40％原纖維形成并且結(jié)合化學(xué)計(jì)量＞1)，而深陰影區(qū)域相應(yīng)于極好的化合物(＜30％原纖維形成并且結(jié)合化學(xué)計(jì)量＞1.25)。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三種不同的鍵合NH(▲)、(○)和直接的C芳基-C芳基鍵(●)。示出二苯并呋喃-4，6-二羧酸(1)的數(shù)據(jù)點(diǎn)作比較。
圖8是在與27(7.2mM)預(yù)培養(yǎng)后并且在另外的pH降低為4.4的72小時培養(yǎng)周期(在無抑制劑時引起最大淀粉狀蛋白形成的時間設(shè)計(jì))后，在TTR(3.6mM)沉降速率研究中，280nm的吸光度對與中心的距離的點(diǎn)圖。速率分析-在50,000rpm下分離15分鐘獲得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)(符號)適合分子量為57.1±0.2kDa的單一的理想個體模型(實(shí)線)。
圖9是在與27(7.2mM)預(yù)培養(yǎng)后并且在另外的pH降低為4.4的72小時培養(yǎng)周期(在無抑制劑時引起最大淀粉狀蛋白形成的時間設(shè)計(jì))后，在TTR(3.6mM)平衡超速離心研究中，280nm的吸光度對與中心的距離的點(diǎn)圖。平衡分析-在以17,000rpm的速率對樣品使用離心力24小時后觀察平衡濃度梯度。數(shù)據(jù)(○)適合分子量為55.0±0.2kDa的單一的理想個體模型(實(shí)線)。殘差(試驗(yàn)和理論數(shù)據(jù)的不同)在小圖中表示。
圖10是由部分酸變性誘導(dǎo)的WT-TTR(3.6μM)原纖維形成的時間過程分析的點(diǎn)圖，該分析在無(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)抑制劑25、47和64的存在下進(jìn)行，通過在500nm處的濁度進(jìn)行測定(見圖中不同抑制劑的明暗標(biāo)記)。很難辨別黑點(diǎn)和白點(diǎn)的哪個化合物最有效。在點(diǎn)的最終或169小時后，化合物47顯示最大的原纖維形成，其次是化合物64，再其次是化合物25。
圖11是WT-TTR(3.6μM)四聚體解離(6.0M尿素)的時間過程分析的點(diǎn)圖，該分析在無(▲)和有7.2μM(◇)和3.6μM(○)濃度的抑制劑25、47和64的存在下進(jìn)行(見圖中不同抑制劑的顏色標(biāo)記)。通過遠(yuǎn)-UV CD檢測不到慢四聚體解離，但是該方法與快速(～500,000×更快)單體變性相關(guān)，可以通過由圓二色譜得到的β-折疊損失容易地監(jiān)控。很難辨別黑點(diǎn)和白點(diǎn)的哪個化合物最有效。在點(diǎn)的最終或169小時后，化合物25在解離四聚體中最有效，其次是化合物64，再其次是化合物47。
權(quán)利要求
1.式I代表的化合物 (式I)其中X不存在或是選自-O-、-S-和-NH-的二價(jià)基團(tuán)；并且R2、R3、R4和R5是獨(dú)立地選自-H、-OH、-F、-Cl、-Br、-CF3和-CO2H的基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的化合物，其為式II代表的化合物 (式II)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的化合物，其中R2是選自-H、-F、-Cl和-CF3的基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的化合物，其中R4是選自-H、-Cl和-CO2H的基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的化合物，其中R5是選自-H、-F和-Cl的基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的化合物，其選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的化合物，其為下式代表的化合物 (式III)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的化合物，其中R3是選自-H、-F、-Cl、-Br和-CF3的基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的化合物，其中R5是選自-H、-F、-Cl和-Br的基團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的化合物，其選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物
11.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的化合物，其為下式代表的化合物 (式IV)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的化合物，其中R2是選自-H、-F和-Cl的基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的化合物，其中R3是選自-H、-F、-Cl、-CF3和-CO2H的基團(tuán)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的化合物，其中R4是選自-H和-CO2H的基團(tuán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的化合物，其中R5是選自-H、-F、-Cl和-CF3的基團(tuán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的化合物，其選自以下結(jié)構(gòu)式代表的化合物
17.有效抑制淀粉狀蛋白原纖維形成的方法，該方法包括使轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白與一定濃度的選自權(quán)利要求1-16的化合物接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有芳香取代基的二苯并呋喃－4，6－二羧酸母核結(jié)構(gòu)，所述取代基是應(yīng)用三種不同類型的鍵在C1位引入的，并且該母核結(jié)構(gòu)提供了極好的淀粉蛋白形成抑制劑，該抑制劑相對于母體化合物1顯示出對TTR比對所有其它血漿蛋白具有增強(qiáng)的親和力和顯著增強(qiáng)的結(jié)合選擇性。本發(fā)明還公開了這些化合物通過利用在TTR四聚體上的動力學(xué)穩(wěn)定性來起作用。
文檔編號C07F5/02GK1976693SQ200580021723
公開日2007年6月6日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者J·W·凱利, M·H·彼德拉西 申請人:斯克里普斯研究所