專利名稱：乙酰輔酶a羧化酶剪接變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含編碼乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體的核苷酸序列。還涉及由所述核酸編碼的對應(yīng)多肽，和鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定該化合物調(diào)節(jié)ACC2剪接變體復(fù)合物或其復(fù)合物的活性或量的能力。
背景技術(shù)：
許多最近的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)指向可變的信使RNA前體剪接，所述剪接作為蛋白多樣性的發(fā)生器，在有些情況下，其在由單基因產(chǎn)生的多樣性的程度上與免疫系統(tǒng)相匹敵?；诳勺兗艚拥娜蚪M分析，已經(jīng)預(yù)測多達(dá)40-60％人基因具有可變剪接形式。該過程允許在由組成型外顯子提供的恒定構(gòu)架中任選地包含或取代一些外顯子。得到的蛋白同種型通常在特定的功能結(jié)構(gòu)域存在不同，同時具有共同的功能(Lopez AJ.Annu Rev Genet，32279-305，1998；Graveley.TrendsGenet.17100-107，2001)。可變剪接也可以導(dǎo)致可讀框的過早終止，或甚至在2個不同的讀框中使用相同的mRNA序列(Quelle等，Cell.83993-1000，1995)。因此，可變剪接對蛋白具有重要的功能后果，且它在產(chǎn)生蛋白多樣性中的總體重要性，是由于它的普及和有些基因的極端組合輸出。
最近25年已經(jīng)表現(xiàn)出肥胖癥的發(fā)病率和嚴(yán)重性的令人擔(dān)憂的增加。這發(fā)生在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中的第三世界國家。例如，超過半數(shù)的美國人口受到超重的影響。過度的體重(在西方社會，BMI＞27，在亞洲，＞25)與2型糖尿病、高血壓、血脂異常(dyslipidaemia)、心血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎和一些癌癥的高危險有關(guān)。體重減輕可以對許多這樣的發(fā)病具有深遠(yuǎn)的影響，例如，幾乎可以預(yù)防2型糖尿病的進(jìn)展。但是，盡管可以容易地實(shí)現(xiàn)顯著的且有益的體重減輕，但最大的挑戰(zhàn)是維持；體重復(fù)得對絕大多數(shù)人而言是不可避免的。因此，能具體地解決該問題的抗肥胖劑會滿足重要的未得到滿足的臨床需要。
骨骼肌負(fù)責(zé)全部身體脂質(zhì)氧化的較大比例，且送遞給肌肉的脂質(zhì)的主要命運(yùn)是用作氧化燃料。在禁食或輕度鍛煉的過程中，血漿未酯化的游離脂肪酸(NEFA)占肌肉燃料需要的80-90％，而當(dāng)燃料需求長期維持時，循環(huán)的細(xì)胞間的或細(xì)胞內(nèi)的三酰基甘油酯(triacylglyceride)(TAG)-衍生的脂肪酸負(fù)責(zé)大多數(shù)的脂質(zhì)氧化。肌肉脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，依賴于底物可用性和隨后的細(xì)胞內(nèi)的游離脂肪酸的運(yùn)輸。游離脂肪酸底物向肌肉的送遞，依賴于以TAG的形式原始酯化的游離脂肪酸的動員和運(yùn)輸。在肥胖癥中，游離脂肪酸的過度供應(yīng)驅(qū)動向TAG合成的代謝和在肌肉中的儲存?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，胰島素抗性與骨骼肌中的過量的肌細(xì)胞內(nèi)(intramyocellular)的TAG密切相關(guān)(Krssak等，Diabetologia 42113-6，1999)。
在臨床上，難以維持體重減輕，與脂肪酸氧化的損傷緊密相關(guān)(Valtuena等，Int J.Obes.Relat.Metab.Disord.21811-7，1997a；Valtuena等，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.21267-732，1997b)，且代表著肥胖癥的藥物療法的主要障礙。在概念上，預(yù)期減少由乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)在氧化組織(例如骨骼肌)中生成的丙二酸單酰輔酶A，會提高脂肪酸氧化速度，并降低呼吸商(RQ)。因此，這可以提高體重減輕后的肥胖患者中的氧化電勢。相應(yīng)地，已經(jīng)將ACC2視作有前途的抗-肥胖癥靶，因?yàn)锳CC2的缺失導(dǎo)致小鼠的瘦表型(Abu-Elheiga等Science 2912613-2664，2001)，且它的抑制是苗條蛋白-誘導(dǎo)的通過降低丙二酸單酰輔酶A來增加脂肪酸氧化的最后步驟。
存在2種已知的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)同種型，ACC1(ACCα)，它是胞質(zhì)的，且主要在肝和脂肪組織中表達(dá)，和ACC2(ACCβ)，認(rèn)為它與線粒體有關(guān)，且主要在骨骼肌和心臟中表達(dá)。乙酰輔酶A羧化酶催化ATP-驅(qū)動的乙酰輔酶A的羧化，以形成丙二酸單酰輔酶A。在脂肪酸合成中使用由ACC1生成的丙二酸單酰輔酶A，而推測由ACC2在線粒體表面上局部地形成的丙二酸單酰輔酶A調(diào)節(jié)棕櫚酰輔酶A穿梭系統(tǒng)(CPT-1)。丙二酸單酰輔酶A是肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT-1)的有效抑制劑，且結(jié)果它降低向線粒體中的脂肪酸流量。因而，ACC2活性的降低，會降低局部的丙二酸單酰輔酶A水平，并增加脂肪酸β-氧化，并伴隨著減少三?；视?TAG)合成(Munday.Biochem Soc Trans.301059-64，2001)。
因而，乙酰輔酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)屬于碳鍵形成性連接酶的酶家族。使用生物素作為輔因子，ACC在ATP-驅(qū)動的多步反應(yīng)中羧化乙酰輔酶A，以形成丙二酸單酰輔酶A(1)ATP+HCO3-+ACC-生物素→ADP+P1+ACC-生物素-CO2(2)ACC-生物素-CO2+乙酰輔酶A→ACC-生物素+丙二酸單酰輔酶A認(rèn)為人乙酰輔酶A羧化酶2被疏水的N-末端錨定在線粒體外膜中(Abu-Elheiga等，Proc Natl Acad Sci USA.97(4)1444-9，2000)。該酶在2458個氨基酸的大單個多肽鏈(約280 kDa)上具有3個功能結(jié)構(gòu)域，用于協(xié)同實(shí)現(xiàn)上述的部分反應(yīng)。
已知ACC1受聚合、解聚合和磷酸化的短期調(diào)節(jié)。認(rèn)為檸檬酸鹽是ACC的生理變構(gòu)激活劑，且已經(jīng)證實(shí)，它會誘導(dǎo)ACC1原聚體向絲狀結(jié)構(gòu)的多步聚合。檸檬酸鹽結(jié)合造成無活性的ACC1原聚體的最初的構(gòu)象變化，這觸發(fā)隨后的二聚體形成(“二聚體”由4個ACC1肽構(gòu)成)。認(rèn)為該最初的復(fù)合物形成，是所有ACC聚合的限速步驟。還已經(jīng)證實(shí)，ACC2會被檸檬酸鹽激活。但是，機(jī)理尚不清楚，因?yàn)轭A(yù)期ACC2單體/原聚體向線粒體外膜的附著限制酶如何聚合。提出新發(fā)現(xiàn)的缺少膜結(jié)合序列的ACC2剪接變體ACC2(1b)，是與ACC2形成檸檬酸鹽誘導(dǎo)的多聚體復(fù)合物的胞質(zhì)配偶體。
但是，羧化酶反應(yīng)的檸檬酸鹽激活似乎在出現(xiàn)二聚體和多聚體形式的酶之前。該發(fā)現(xiàn)暗示著，酶周轉(zhuǎn)的啟動不依賴于酶復(fù)合物形成，且因而，在線粒體丙二酸單酰輔酶A形成中不需要假定的ACC2-ACC2(1b)配偶體關(guān)系。相反地，認(rèn)為聚合的功能和重要性是對ACC周轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)保護(hù)，以免于激酶(例如，AMPK和/或cAMP PK)的滅活磷酸化。因而，ACC2原聚體盡管最初由檸檬酸鹽激活，但會迅速地變得可接近上述的激酶，并被同時的磷酸化關(guān)閉，除非與ACC2(1b)相結(jié)合。因此，阻止ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物形成的化合物，不會阻止激活本身，而是通過細(xì)胞的能量調(diào)節(jié)機(jī)制，造成酶的下游抑制。因而，能以阻斷檸檬酸鹽誘導(dǎo)的復(fù)合物形成的方式與ACC2和/或ACC2(1b)相互作用的化合物，可以用于減緩線粒體表面上的丙二酸單酰輔酶A生成，并因此也用于增加線粒體中的脂肪酸氧化速度。在免疫沉淀研究中有ACC1和ACC2的異二聚體化的先例。在一項(xiàng)研究中(Dyck等Eur J Biochem 1999)，使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP，單獨(dú)地檢測到與大鼠心臟ACC2共沉淀的更低分子量產(chǎn)物，從而間接地鑒別出了具有ACC1大小但不是ACC1的生物素化的蛋白。當(dāng)使用SDS-PAGE分離時，預(yù)期ACC2(1b)以與ACC1大約相同的速度遷移。但是，應(yīng)當(dāng)指出，相同的研究人員還表明，當(dāng)使用針對ACC1的特異性的抗體時，ACC2會與ACC1共免疫沉淀。異二聚體形成的其它證明來自大鼠肝臟ACC1和ACC2的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(Winz等，JBC 269(20)14438-14445，1994)，其中報道了由2個同種型組成的1∶1復(fù)合物。另外證實(shí)，當(dāng)進(jìn)行非變性PAGE時，ACC1和ACC2會共遷移。ACC1在氧化組織(如骨骼肌和心臟)中的相對低豐度暗示著，在這些器官中存在可替代的調(diào)節(jié)配偶體，例如ACC2(1b)。
編碼ACC2的基因位于染色體12上，且在EMBL條目AC007637中公開了基因組序列。人ACC2 cDNA序列，見EMBL條目HSU89344。2個序列的比對表明，人ACC2基因由52個編碼外顯子組成。比對還鑒別出公布的ACC2的cDNA序列中的許多錯誤。因此，發(fā)明人已經(jīng)克隆了ACC2 cDNA，并重新測序。校正的序列如SEQ IDNO2所示。
相關(guān)的蛋白。認(rèn)為代表著ACC2基因的基因組小鼠序列證實(shí)了與人酶的最高同源性(約91％)。有錯誤的大鼠ACC2數(shù)據(jù)庫序列與人ACC2具有83％同一性。人ACC1和ACC2是76％相同的(相似性約82％)。
發(fā)明概述本發(fā)明源自ACC2的剪接變體的發(fā)現(xiàn)，所述變體在本文中稱作ACC2(1b)。已經(jīng)在人骨骼肌、心臟、脂肪組織和肝臟中檢測到ACC2(1b)mRNA。剪接變體缺少膜錨定結(jié)構(gòu)域，且被認(rèn)為是ACC2的調(diào)節(jié)配偶體，從而與膜錨定的ACC2形成檸檬酸鹽誘導(dǎo)的聚合物。另外，ACC2(1b)是上游/下游激酶和磷酸酶的調(diào)節(jié)作用的潛在介質(zhì)，所述激酶和磷酸酶構(gòu)成脂肪酸氧化控制的丙二酸單酰輔酶A軸的部分。本發(fā)明的目的是提供一種蛋白，其在代謝疾病的理解中具有重要作用，所述代謝疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了該目的，其中提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ ID NO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體缺少膜結(jié)合能力。該剪接變體可以用于與野生型ACC2相同的篩選、診斷、治療等。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了包含上述核酸的質(zhì)粒。另外，提供了生產(chǎn)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達(dá)多肽的條件下，培養(yǎng)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的多肽，其包含SEQ IDNo.1所述的氨基酸序列，或與其具有至少85％相似性的序列，該多肽不能膜結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了純化的抗體，其能選擇性地結(jié)合ACC2剪接變體。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了能調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調(diào)節(jié)ACC2剪接變體蛋白的活性或量的能力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物。因此，提供了鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調(diào)節(jié)包含ACC2和ACC2剪接變體的復(fù)合物的活性或量的能力。
而且，包含野生型ACC2和ACC2(1b)剪接變體的復(fù)合物構(gòu)成了生產(chǎn)丙二酸單酰輔酶A的酶的生理形式。因此，使用重組技術(shù)，現(xiàn)在可以首次體外制備該復(fù)合物。因此，該復(fù)合物可以用于篩選中，以鑒別在治療代謝疾病中具有潛在的治療益處的化合物，所述代謝疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
另外，提供了對ACC2剪接變體核酸選擇性的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的選擇性抗體在生產(chǎn)用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的藥物中的用途。另外，提供了對ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物選擇性的抑制性核酸分子在生產(chǎn)用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的藥物中的用途。
附圖簡述

圖1是包含新外顯子1b的人ACC2基因結(jié)構(gòu)的示意表示。該基因全長約130kb，且包含53個編碼外顯子，包括2個可替代地使用的含有起始ATG的起始外顯子，稱作外顯子1a和外顯子1b。
圖2顯示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比對。
圖3顯示了使用實(shí)時PCR測量的在人心臟、肝臟、骨骼肌、脾和脂肪組織中的ACC2(1b)RNA表達(dá)水平。
圖4顯示了檸檬酸鹽刺激的在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達(dá)的ACC2(1b)的活性。
圖5a至5b顯示了來自ACC2、ACC2(1b)和假轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE和隨后的蛋白印跡分析的結(jié)果。
圖6a至6f顯示了人心臟和骨骼肌的免疫染色。
發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ ID NO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體不能膜錨定。本發(fā)明還提供了包含所述序列的互補(bǔ)體的核酸分子。本發(fā)明還提供了含有要求保護(hù)的核酸分子的表達(dá)載體，和用所述核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于表達(dá)ACC2的野生型(膜錨定)和剪接變體形式兩者的表達(dá)系統(tǒng)，以便形成ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物。本發(fā)明還提供了該ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物在篩選調(diào)節(jié)所述復(fù)合物的活性的化合物中的用途。本發(fā)明還提供了純化的ACC2剪接變體多肽，具體地，具有SEQ ID No1所示的氨基酸序列的那些，與其具有至少85％序列同一性的那些，或其C-或N-末端截短的版本，該變體不能膜錨定。本發(fā)明還提供了用于鑒別調(diào)節(jié)本發(fā)明的ACC2剪接變體的表達(dá)或活性的化合物的測定，該化合物可以具有治療價值，尤其是對于肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列的ACC2剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQID NO1不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，其中該變體缺少膜錨定能力。在一個實(shí)施方案中，ACC2剪接變體包含SEQ ID NO3公開的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO3公開的N-末端16氨基酸序列的ACC2多肽，或在該16氨基酸區(qū)域具有少于4氨基酸取代的多肽，該變體不能錨定于膜。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的核酸分子，其包含編碼ACC2多肽的核苷酸序列，其中缺少由位置1至8代表的信號肽/靶向肽結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO4)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白的，遺傳密碼的簡并性允許給定的編碼序列中的許多核苷酸取代，其不會影響編碼的蛋白的氨基酸序列。因而，本發(fā)明也提供了分離的核酸，其與序列表中公開的編碼ACC2剪接變體的核苷酸序列中的任一個的不同之處僅在于，這樣的同義密碼子的取代。實(shí)施例10的多態(tài)性分析提供了在個體之間發(fā)現(xiàn)的差異的細(xì)節(jié)。
在本發(fā)明的一個特定的實(shí)施方案中，核酸包含根據(jù)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或與其具有至少85％序列同一性的核苷酸，其中所述核酸編碼具有SEQ ID NO3所示的N-末端的ACC2剪接變體多肽。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括能編碼SEQ ID NO3公開的多肽的變體的核苷酸序列，其中所述變體與其具有至少81％序列同一性。在一個實(shí)施方案中，核酸包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的ACC2(1b)多肽。在一個實(shí)施方案中，多肽具有根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列；或與其具有至少95％氨基酸序列同一性的序列；或其C-末端截短的版本。特定的實(shí)施方案是具有SEQ ID NO3所示的N-末端序列的變體。
在另一個方面，本發(fā)明提供了ACC2剪接變體蛋白，其中已對某些殘基進(jìn)行了保守的氨基酸取代，以生成非天然產(chǎn)生的剪接變體，其保留ACC2活性。保守的取代優(yōu)選地位于尚未參與催化的區(qū)域。
術(shù)語“分離的”指，從它的原始環(huán)境(例如，如果它是天然產(chǎn)生的，則指天然環(huán)境)取出材料。例如，存在于活動物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽是未分離的，但是與天然系統(tǒng)中的一些或所有共存材料分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽，是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的部分，且/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的部分，且仍然是分離的，因?yàn)樵撦d體或組合物不是它的天然環(huán)境的部分。
在另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達(dá)多肽的條件下，培養(yǎng)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。
可以從細(xì)胞本身回收這樣的蛋白，或者如果使用適當(dāng)?shù)漠愒捶置谛盘?例如來自SUC2或α-因子的)來確保多肽分泌進(jìn)培養(yǎng)基中，則可以從培養(yǎng)基回收。
在另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少95％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽也包含SEQ ID NO3所示的序列。該方法包含a)在適于表達(dá)多肽的條件下，培養(yǎng)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含核酸序列，所述核酸序列編碼ACC2剪接變體多肽，或與其具有至少95％序列同一性且包含SEQ ID NO3所示的N-末端16氨基酸的多肽，或其C-末端截短的版本；和b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。
因而，在另一個方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是，例如，哺乳動物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了制備ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物的方法，其包含，(a)在適于表達(dá)多肽的條件下，培養(yǎng)能表達(dá)ACC2的野生型和剪接變體形式的宿主細(xì)胞，(b)允許多肽形成復(fù)合物；和，(c)回收復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物。所述分離的蛋白復(fù)合物可以存在于膜制劑或級分上，或與其相結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了重組生產(chǎn)的ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物在篩選具有治療潛力的化合物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物在篩選具有治療潛力的化合物中的用途。
在另一個方面，本發(fā)明提供了純化的能選擇性地結(jié)合ACC2剪接變體的抗體，和制備能選擇性地結(jié)合本發(fā)明的ACC2剪接變體蛋白的抗體的方法。選擇性地結(jié)合是指，基本上不能結(jié)合天然的全長ACC2或其任何部分，或ACC2剪接變體以外的任何其它蛋白或多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能鑒別野生型ACC2和用于針對其設(shè)計和制備選擇性抗體的各種剪接變體形式之間的氨基酸序列差異。關(guān)鍵差異在于N-末端區(qū)域。如本文所使用的，關(guān)于抗體結(jié)合，可互換地使用詞語“選擇性的”和“特異性的”。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了能調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療疾病中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
通過例如改變的基因表達(dá)水平或信息穩(wěn)定性，可以實(shí)現(xiàn)化合物對本發(fā)明的ACC2剪接變體的量的調(diào)節(jié)。通過例如結(jié)合ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物的化合物，可以實(shí)現(xiàn)化合物對ACC2剪接變體的活性的調(diào)節(jié)。在一個實(shí)施方案中，ACC2剪接變體的調(diào)節(jié)包含能減少ACC2剪接變體的活性或量的化合物。在另一個實(shí)施方案中，ACC2剪接變體的調(diào)節(jié)包含能增加ACC2剪接變體的活性或量的化合物。在另一個實(shí)施方案中，通過能抑制ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物的活性或量、或復(fù)合物形成本身的化合物，實(shí)現(xiàn)ACC2活性的調(diào)節(jié)。能調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性的化合物的實(shí)例是抗體。使用任何合適的方法，可以制備抗體。例如，可以使用純化的多肽來制備特異性的抗體。術(shù)語“抗體”意在包括多克隆抗體、單克隆抗體和各種類型的抗體構(gòu)建體，例如F(ab’)2、Fab和單鏈Fv。如果抗體以大于或等于約107M-1的Ka結(jié)合，則將其定義為特異性地結(jié)合。使用常規(guī)技術(shù)，例如Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，51660(1949)所述的那些，可以測定結(jié)合的親和力。
使用本領(lǐng)域眾所周知的操作，可以從許多來源容易地產(chǎn)生多克隆抗體，例如，馬、母牛、山羊、羊、狗、雞、兔、小鼠或大鼠。通常，一般通過腸胃外的注射，將抗原施用給宿主動物。通過使用佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑，可以增強(qiáng)抗原的免疫原性。加強(qiáng)免疫后，收集少量血清樣品，并測試對抗原的反應(yīng)性。用于這樣的測定的各種測定的實(shí)例包括下述的那些AntibodiesALaboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；以及下述操作，例如逆流免疫電泳(CIEP)、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡測定和夾心測定，見美國專利號4,376,110和4,486,530。
使用眾所周知的操作，見例如美國專利號RE 32,011；4,902,614；4,543,439和4,411,993；Monoclonal Antibodies，HybridomasA NewDimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol(eds.)，(1980)所述的操作，可以容易地制備單克隆抗體。
使用替代技術(shù)，例如在本文引作參考的Alting-Mees等，“Monoclonal Antibody Expression LibrariesA Rapid Alternative toHybridomas”，Strategies in Molecular Biology31-9(1990)所述的那些，可以生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。類似地，使用重組DNA技術(shù)來整合編碼特異性的結(jié)合抗體的基因的可變區(qū)，可以構(gòu)建結(jié)合配偶體。這樣的技術(shù)記載在Larrick等(Biotechnology.7394，1989)。
一旦分離和純化，使用確立的測定方法，見例如D.M.Kemeny，Pergamon Press，Oxford，英國的“A Practical Guide to ELISA”，可以使用抗體來檢測抗原在樣品中的存在。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了能調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性或量的化合物在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
因而，本發(fā)明也提供了用于鑒別能調(diào)節(jié)本發(fā)明的ACC2剪接變體基因或蛋白的表達(dá)或活性的小分子或其它化合物的測定。使用未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、確立的細(xì)胞系或本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以體外地進(jìn)行這樣的測定，或使用正常的非人動物或轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)地進(jìn)行。
具體地，測定可以檢測是否存在本發(fā)明的核酸的改變的(增強(qiáng)的或減弱的)表達(dá)、由這樣的核酸編碼的蛋白產(chǎn)物的升高的或降低的水平或這樣的蛋白的升高的或降低的活性。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了鑒別對疾病的治療潛在地有用的化合物的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙，其包含測定化合物調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性或量的能力。優(yōu)選地，測定選自i)使用表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞系，或使用純化的ACC2剪接變體蛋白，測量ACC2剪接變體活性；ii)使用表達(dá)ACC2剪接變體和ACC2野生型的細(xì)胞系，或使用純化的ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物，測量ACC2活性；和iii)測量在表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞系中的ACC2剪接變體轉(zhuǎn)錄或翻譯。
該方法可以如下實(shí)現(xiàn)使用分離的ACC2和ACC2(1b)剪接變體的復(fù)合物，并測量所述復(fù)合物關(guān)于丙二酸單酰輔酶A生產(chǎn)的活性。使用由所述復(fù)合物形成的生成的無機(jī)磷酸鹽的孔雀綠檢測，或通過測量14CO2向14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合，可以在無細(xì)胞的測定中進(jìn)行測量。通過使用表達(dá)ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的細(xì)胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的活性，也可以在基于細(xì)胞的測定中進(jìn)行該方法。使用表達(dá)ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的細(xì)胞系，可以測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在一個實(shí)施方案中，疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病或血脂異常。
用于測定待測化合物對ACC2剪接變體的轉(zhuǎn)錄或翻譯的作用的測定，可以基于在表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞中，i)使用例如RNA印跡分析或定量實(shí)時PCR，測量形成的ACC2剪接變體mRNA的量，ii)使用例如蛋白印跡分析，或免疫化學(xué)分析例如ELISA，測量形成的ACC2剪接變體蛋白的量，或iii)測量如上所述的ACC2剪接變體活性。
在測定中使用的細(xì)胞可以是，天然地表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞，或表達(dá)重組的ACC2剪接變體的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。優(yōu)選地，ACC2剪接變體是人重組ACC2剪接變體。
ACC2剪接變體，無論是單獨(dú)的還是與野生型ACC2共表達(dá)的，可以在許多宿主中表達(dá)，所述宿主例如細(xì)菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞和人和動物細(xì)胞。真核重組宿主細(xì)胞是特別優(yōu)選的。實(shí)例包括酵母，哺乳動物細(xì)胞，包括人、牛、豬、猴和嚙齒類動物來源的細(xì)胞系，和昆蟲細(xì)胞，包括果蠅(Drosophila)和蠶衍生的細(xì)胞系。源自可以使用的且可商業(yè)上得到的哺乳動物物種的細(xì)胞系包括，L細(xì)胞L-M(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細(xì)胞L-M(ATCC CCL 1.2)、HEK 293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
通過許多技術(shù)中的任一種，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)化、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)化、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的脂轉(zhuǎn)染、電穿孔或感染，可以將包含編碼ACC2剪接變體(單獨(dú)的或與野生型ACC2共表達(dá)的)的核酸的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以表達(dá)多肽。
繁殖并克隆轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，例如通過有限稀釋，并分析，以測定重組ACC2剪接變體/野生型ACC2的表達(dá)水平。通過幾種方式，包括與抗體的免疫學(xué)反應(yīng)性和/或使用本文所述的測定檢測生物學(xué)活性，可以鑒別表達(dá)ACC2剪接變體(單獨(dú)的或與野生型ACC2共表達(dá)的)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)由指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的啟動子中的特定DNA元件介導(dǎo)，其從而介導(dǎo)該基因的轉(zhuǎn)錄。真核轉(zhuǎn)錄因子可以分成2大組i)基本轉(zhuǎn)錄因子，其與轉(zhuǎn)錄起始處近側(cè)的啟動子序列相互作用，從而在RNA聚合酶II的募集后啟動轉(zhuǎn)錄，和ii)轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)合特定的遠(yuǎn)側(cè)啟動子元件，從而調(diào)節(jié)與基本轉(zhuǎn)錄機(jī)制接觸后的轉(zhuǎn)錄。真核生物中的基本生理過程是，細(xì)胞可以與它們的環(huán)境通訊，并通過信號傳導(dǎo)分子，例如激素和生長因子，對細(xì)胞外的刺激作出響應(yīng)。這樣的信號傳導(dǎo)的最后事件是，轉(zhuǎn)錄因子與特定的遠(yuǎn)側(cè)啟動子元件的結(jié)合，從而導(dǎo)致例如上調(diào)的或組織特異性的基因表達(dá)。因?yàn)樗鼈兊恼{(diào)節(jié)作用，所以啟動子元件是篩選治療劑的推定靶。
合適的宿主細(xì)胞是已知表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞，或已知表達(dá)可以影響ACC2剪接變體的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞。優(yōu)選地，可以使用用編碼特定的轉(zhuǎn)錄因子的DNA轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以研究定義的轉(zhuǎn)錄因子和ACC2剪接變體啟動子的相互作用。
用于測定待測化合物對ACC2剪接變體的轉(zhuǎn)錄的作用的測定，可以基于，使用報告基因系統(tǒng)測量ACC2剪接變體啟動子的活性。報告基因系統(tǒng)是包含構(gòu)成ACC2剪接變體啟動子的核酸分子、或其片段的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)還包含報告基因，啟動子和報告基因被這樣放置，從而報告基因的表達(dá)由ACC2剪接變體啟動子調(diào)節(jié)。形成的報告蛋白的量用作ACC2剪接變體啟動子的活性的指示。
可以用于構(gòu)建報告基因系統(tǒng)的合適的報告基因是例如螢火蟲螢光素酶基因、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因和綠色熒光蛋白(GFP)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了制備藥物組合物的方法，其包含i)根據(jù)本文所述的方法，鑒別可以用于治療疾病的化合物，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙；和ii)將化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑相混合。
基于每種剪接變體形式的相對量的測定，可以存在診斷或預(yù)后應(yīng)用。通過調(diào)節(jié)各種剪接變體形式的表達(dá)或量，可以得到治療應(yīng)用的其它方法。
因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了測定個體對發(fā)展疾病的易感性的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙，其包含測量由個體表達(dá)的ACC2的野生型和剪接變體形式的相對量，和基于存在的相對量，測定個體對發(fā)展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了診斷患者中疾病的嚴(yán)重性的方法，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙，其包含測量由個體表達(dá)的ACC2的野生型和剪接變體形式的相對量，和基于存在的相對量，測定疾病的嚴(yán)重性。
在一個實(shí)施方案中，從肌肉活組織檢查樣品測量ACC2形式的量。在另一個實(shí)施方案中，可以使用診斷方法來測量治療性治療的類型。在另一個實(shí)施方案中，可以通過監(jiān)控治療性治療過程中由個體表達(dá)的全長和剪接變體形式的ACC2的相對量，使用該方法來評估個體的治療性治療的有效性。例如，通過在治療之前、過程中和之后進(jìn)行監(jiān)控。
在另一個方面，本發(fā)明也提供了診斷患有與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的障礙的個體的方法，其包含測定個體是否存在本發(fā)明的ACC2剪接變體，或其相對量。在一個特定的實(shí)施方案中，該障礙是肥胖癥。合適的測定包括基于核酸的測定(采用本發(fā)明的核酸或能特異性地鑒別本發(fā)明的核酸的那些)和基于蛋白的測定(采用本發(fā)明的抗體或多肽)。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了診斷方法，其包含分析從患者得到的DNA樣品中的ACC2剪接變體基因的序列、或其選擇性的部分，以用于測定對發(fā)展疾病的易感性，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
根據(jù)本發(fā)明的基因知識還提供了，通過例如使用反義DNA或RNA，調(diào)節(jié)它的體內(nèi)表達(dá)的能力。抑制或減弱特定基因或基因轉(zhuǎn)錄物(例如本文鑒別的ACC2剪接變體)的表達(dá)水平的一種治療方式是使用反義治療。反義治療利用反義核酸分子，后者是DNA或RNA(“寡核苷酸”)的合成片段，設(shè)計用于反映(mirror)特定的mRNA序列和阻斷蛋白生成。一旦形成，mRNA會結(jié)合核糖體，即細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)“工廠”，其能有效地閱讀RNA序列，并生產(chǎn)基因指令的特定蛋白分子。如果將反義分子送遞給細(xì)胞(例如作為天然寡核苷酸或通過合適的反義表達(dá)載體)，它會結(jié)合信使RNA，因?yàn)樗男蛄斜辉O(shè)計成靶堿基序列的互補(bǔ)體。兩條鏈一旦結(jié)合，則mRNA不再能指令核糖體對編碼的蛋白的生產(chǎn)，并被細(xì)胞的酶迅速破壞，從而釋放反義寡核苷酸，以尋找和破壞另一條相同的mRNA信使鏈。
利用本文教導(dǎo)的ACC2剪接變體基因和mRNA序列的知識，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能設(shè)計合適的反義核酸治療分子，并根據(jù)需要施用它們。
使用充分確定的技術(shù)，可以實(shí)驗(yàn)地測定具有治療潛力的反義寡核苷酸分子。為了使下調(diào)本發(fā)明的ACC2剪接變體基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)的方法可行，可以容易地構(gòu)建實(shí)例反義表達(dá)構(gòu)建體，例如使用pREP10載體(Invitrogen Corporation)。預(yù)期轉(zhuǎn)錄物抑制該基因在用該類構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的翻譯。反義轉(zhuǎn)錄物能有效地抑制天然基因轉(zhuǎn)錄物的翻譯，且能誘導(dǎo)本文所述的作用(例如，組織生理學(xué)的調(diào)節(jié))。與ACC2剪接變體基因mRNA的任何部分互補(bǔ)的且可雜交的寡核苷酸被預(yù)期用于治療性應(yīng)用。1997年6月17日授權(quán)的美國專利號5,639,595，“Identification of Novel Drugs and Reagents”，在本文中引作參考，其中充分描述了鑒別展示出體內(nèi)活性的寡核苷酸序列的方法。將含有源自ACC2剪接變體基因序列的隨機(jī)的寡核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞中。然后，測定細(xì)胞中源自所需的寡核苷酸活性的表型。一旦已經(jīng)鑒別出了具有所需的表型的細(xì)胞，就可以鑒別出具有所需的活性的寡核苷酸的序列。鑒別可以如下實(shí)現(xiàn)通過回收載體，或通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并對含有插入的核酸材料的區(qū)域測序。可以合成反義分子，以用于反義治療。這些反義分子可以是DNA、DNA的穩(wěn)定衍生物例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯、RNA、RNA的穩(wěn)定衍生物例如2′-O-烷基RNA或其它寡核苷酸模仿物(mimetics)。1997年7月29日授權(quán)的美國專利號5,652,355，“HybridOligonucleotide Phosphorothioates”，和1997年7月29日授權(quán)的美國專利號5,652,356,“Inverted Chimeric and HybridOligonucleotides”，引作參考，其描述了生理上穩(wěn)定的反義分子的合成和作用。通過顯微注射、脂質(zhì)體被囊化或通過從攜帶反義序列的載體的表達(dá)，可以將反義分子導(dǎo)入細(xì)胞中。
如上所述，也可以將反義核酸分子提供為RNA，在本領(lǐng)域現(xiàn)在已知具有長半衰期的RNA的一些穩(wěn)定形式，其可以直接施用，無需使用載體。另外，通過脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和本領(lǐng)域已知的其它方法，可以將DNA構(gòu)建體送遞給細(xì)胞。
通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)和/或通過如上所述的化學(xué)合成，使用常規(guī)方法，可以生產(chǎn)用于與靶基因協(xié)同作用的反義DNA或RNA。如果需要，可以化學(xué)地修飾反義DNA或反義RNA，以便預(yù)防體內(nèi)降解或促進(jìn)穿過細(xì)胞膜的運(yùn)輸，和/或可以與其連接能滅活mRNA的物質(zhì)，例如核酶，且本發(fā)明延伸至這樣的構(gòu)建體。
反義DNA或反義RNA可以用于治療人的疾病或障礙，其中已經(jīng)涉及到ACC2剪接變體基因產(chǎn)物的過度調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)不足的生產(chǎn)。
或者，核酶分子可以被設(shè)計用于體內(nèi)地切割和破壞ACC2剪接變體mRNA。核酶是具有高度特異性的內(nèi)切核糖核酸酶活性的RNA分子。錘頭核酶包含雜交區(qū)，其核苷酸序列與靶RNA的至少部分互補(bǔ)，和催化區(qū)，其適用于識別和切割靶RNA。優(yōu)選地，雜交區(qū)含有至少9個核苷酸。這樣的核酶的設(shè)計、構(gòu)建和使用，是本領(lǐng)域眾所周知的，且更完整地記載在Haselhoff和Gerlach(Nature.334585-591，1988)。在另一個替代方案中，設(shè)計成與ACC2剪接變體基因的5’-區(qū)域雜交、以便形成三股螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，可以用于阻斷或減少ACC2剪接變體基因的轉(zhuǎn)錄。在另一個替代方案中，設(shè)計克隆進(jìn)質(zhì)粒載體中的RNA干擾(RNAi)寡核苷酸或短(18-25bp)RNAi ACC2剪接變體序列，以將雙鏈RNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，來抑制和/或?qū)е翧CC2剪接變體信使RNA的降解。ACC2剪接變體RNAi分子可以從腺嘌呤/腺嘌呤(AA)或至少(任意的堿基-A、U、C或G)A....開始，且可以包含18或19或20或21或22或23或24或25堿基對雙鏈RNA分子，優(yōu)選的長度是21堿基對，且對具有2核苷酸3’突出端的單個ACC2剪接變體序列或形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的45-50聚體RNA分子是特異性的。這樣的小抑制RNA分子的設(shè)計、構(gòu)建和使用，是本領(lǐng)域眾所周知的，且更完整地記載在下述文獻(xiàn)中Elbashir等，(Nature.411(6836)494-498，2001)；Elbashir等，(Genes&Dev.15188-200，2001)；Harborth，J.等(J.Cell Science 1144557-4565，2001)；Masters等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 988012-8017，2001)；和，Tuschl等，(Genes&Dev.133191-3197，1999)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了治療人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物的小分子藥物、或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子進(jìn)行治療，其中該方法包含i)測量從人得到的合適的樣品中的ACC2剪接變體mRNA的水平；ii)參考ACC2剪接變體mRNA的正常水平，確定人的狀態(tài)；和iii)施用有效量的藥物或抑制性核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了治療人的方法，所述人需要用作用于ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物的小分子藥物、或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子進(jìn)行治療，其中該方法包含i)測量從人得到的樣品中的ACC2剪接變體蛋白或ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物的水平；和ii)參考所述蛋白的正常水平，確定人的狀態(tài)；和iii)施用有效量的藥物或針對ACC2剪接變體mRNA起作用的抑制性核酸分子。
治療患有肥胖癥、2型糖尿病、血脂異?；蚺c受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙的患者的方法，其包含給患者施用能減少ACC2剪接變體的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的化合物或核酸分子。
治療患有肥胖癥、2型糖尿病、血脂異?；蚺c受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙的患者的方法，其包含給患者施用靶向ACC2剪接變體的mRNA的抑制性核酸分子。
針對ACC2剪接變體核酸的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的抗體在生產(chǎn)用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙。
在本發(fā)明的每一個上述方面，“抑制性核酸分子”選自反義、核酶、三股螺旋適體(aptemer)和RNAi分子。
除非另有定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在本文中提及的所有出版物都在本文中引作參考。
實(shí)驗(yàn)部分現(xiàn)在，將參考下面的非限制性實(shí)施例來闡明本發(fā)明。
使用AMPLITAQTM，其可從Perkin-Elmer Cetus得到，作為熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的來源。
除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐采用屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。在文獻(xiàn)中充分解釋了這樣的技術(shù)。見，例如，Sambrook等，編，MolecularCloningA Laboratory Manual(第3版)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel等，編，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NewYork，NY(2002)；Glover&Hames，編，DNA Cloning 3A PracticalApproach，Vols.I，II，&III，IRL Press，Oxford(1995)；Colowick&Kaplan，編，Methods in Enzymology，Academic Press；Weir等，編，Handbook of Experimental Immunology，第5版，Blackwell ScientificPublications，Ltd.，Edinburgh，(1997)；Fields，Knipe，&Howley，編，F(xiàn)ields Virology(第3版)Vols.I&II，Lippincott Williams&WilkinsPubs.(1996)；Flint，等，編，Principles of VirologyMolecular Biology，Pathogenesis，and Control，ASM Press，(1999)；Coligan等，編，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York，NY(2002)。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所述的特定方法、規(guī)程、細(xì)胞系、載體和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?br> 實(shí)施例1人乙酰輔酶A羧化酶2的新剪接變體ACC2(1b)的硅片上(insilico)預(yù)測使用新序列信息和硅片上預(yù)測方法的組合，鑒別了人ACC2的新剪接變體的序列。針對含有人基因組DNA的EMBL條目，blast人ACC2 EMBL條目HSU89344(Blast2 NCBI)。發(fā)現(xiàn)來自染色體12的人BAC克隆RCPI11-443D10含有編碼人ACC2的基因。在EMBL條目AC007637中發(fā)現(xiàn)了該克隆的基因組序列。
使用HSU89344和AC007637之間的比對，分析了人ACC2的基因結(jié)構(gòu)。使用比對，預(yù)測外顯子，并使用內(nèi)含子剪接共有位點(diǎn)，預(yù)測準(zhǔn)確的外顯子邊界。比對表明，人ACC2基因由52個編碼外顯子組成。在HSU89344的序列和AC007637的基因組序列之間，發(fā)現(xiàn)了多個錯配。通過將52個編碼外顯子的序列拼貼到一起，生成人ACC2的校正的序列，以得到預(yù)測的ACC2的編碼序列。在一種情況下，預(yù)測HSU89344的序列的部分由側(cè)接不規(guī)則的剪接信號的內(nèi)含子序列組成，并因此在預(yù)測的人ACC2的校正的編碼序列中缺失。
使用預(yù)測的針對EMBL的EST部分的人ACC2序列進(jìn)行的Blast2(NCBI)分析表明，存在2個鼠EST序列，其具有剪接到基因的外顯子2的序列上的新5′末端(鼠EST BB854145和BB866065)。這2個EST的新5′末端和人基因組DNA之間的比對表明，該序列在人中是保守的。同樣，發(fā)現(xiàn)該保守序列含有可變的起始ATG，且在小鼠和人基因組DNA中，其后是5′共有剪接位點(diǎn)。因此，該序列似乎能編碼ACC2的可替代地使用的獨(dú)特起始外顯子。該外顯子稱作外顯子1b(相對于含有在HSU89344中使用的起始ATG的外顯子1a)，且圖1顯示了包含新外顯子的示意基因結(jié)構(gòu)。
通過將外顯子1b的編碼序列剪接到預(yù)測的外顯子2-52的序列上，構(gòu)建了人ACC2(1b)的新剪接變體的編碼部分(SEQ ID NO5和1分別顯示了新剪接形式的預(yù)測的核苷酸序列和氨基酸序列)。
在圖2中，顯示了人ACC2和人ACC2(1b)的氨基酸序列的比對。使用具有下述參數(shù)的GCG Gap(Wisconsin)，進(jìn)行比對缺口權(quán)重8 平均匹配 2.912長度權(quán)重2 平均錯配 -2.003質(zhì)量11665 長度 2461比率5.171 缺口1百分比相似性99.512 百分比同一性99.423
實(shí)施例2人ACC2的克隆為了開發(fā)用于生產(chǎn)重組ACC2的方法，通過RT-PCR從人骨骼肌mRNA，克隆了編碼人ACC2的cDNA。PCR擴(kuò)增了覆蓋ACC2的7.5kb序列的共3個片段，并對多個克隆測序。
使用校正聚合酶pfu(Stratagene)，從人心臟cDNA文庫，PCR擴(kuò)增了第一個片段1至3925。PCR使用的引物分別是作為正向引物的5’-ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATC-3’(SEQ ID NO6)和作為反向引物的5’-GGCTGTTTAACACATAGGCGA-3’(SEQ ID NO7)。將產(chǎn)物克隆進(jìn)“TA”克隆載體pCR2.1，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)XL-10 Gold細(xì)胞(Stratagene)，并進(jìn)行完全雙鏈測序。
使用Taq-plus Precision(Stratagene)，從人骨骼肌cDNA，分別PCR擴(kuò)增了第二個和第三個片段，3250至5356 bp和5335至7302bp。對于第二個PCR片段，將5’-CAGAGCATGGTGCAGTTGGT-3’(SEQ ID NO8)用作正向引物，并將5’-CCATGTCTTCCAGGAGAGGTCC-3’(SEQ ID NO9)用作反向引物。對于第三個PCR片段，將5’-TCGTCATCGGCAATGACATA-3’(SEQ ID NO10)用作正向引物，并將5’-GGTCCACCTCCGGCCC-3’(SEQ ID NO11)用作反向引物。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Top 10細(xì)胞(Invitrogen)，并進(jìn)行雙鏈測序。
結(jié)果表明，所有克隆的核苷酸序列都與公開的cDNA序列(登記號NM_001993)明顯不同，但是與來自人類基因組計劃的基因組序列以及在公開的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的EST相當(dāng)好地匹配。
通過連接從pCR2.1-TOPO載體消化出的3個片段，將全長ACC2cDNA拼貼到一起。這些片段包括1至3288bp、3288至5323bp和5323至7302bp，并使用BamH1位點(diǎn)來將2個內(nèi)部位點(diǎn)連接到一起。將全長cDNA連接進(jìn)哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1(+)。
如通過針對人ACC2的抗體所檢測的，pcDNA-ACC2向COS-7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染導(dǎo)致ACC2表達(dá)的高水平。
使用iPSORT預(yù)測軟件(Bannai等，Bioinformatics 18∶2,298-305，2002)，在人ACC2 N-末端區(qū)域進(jìn)行N-末端分選信號的硅片上預(yù)測。分析了人ACC2(SEQ ID NO2)和人ACC2的硅片上N-末端截短，并通過iPSORT進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測全長人ACC2包含信號肽。序列MVLLL的截短，將iPSORT預(yù)測從“信號肽”變成“線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”。其它N-末端截短，排除了序列MVLLLCL，導(dǎo)致人ACC2 N-末端的靶向標(biāo)記的喪失。
實(shí)施例3人組織的TaqMan分析證實(shí)了ACC2(1b)轉(zhuǎn)錄物的存在使用Primer Express 1.5軟件(Applied Biosystems)，設(shè)計hACC2(1b)的寡核苷酸引物和探針。設(shè)計正向引物5′-AGTCCTGCCAAGTGCAAGATCT-3′(SEQ ID NO12)、反向引物5′-TCTGTGCAGGTCCAGCTTCTT-3′(SEQ ID NO13)和FAM-標(biāo)記的探針5′-TGATCGCGAAGTAAAGCCGAGCATGT-3′(SEQ IDNO14)，以覆蓋外顯子1B和外顯子2。人酸性核糖體磷蛋白(h36B4)引物和VIC-標(biāo)記的探針用作內(nèi)源對照。
使用來自100ng聚腺苷酸+RNA(脂肪組織)和1μg總RNA(心肌、骨骼肌和肝臟)的SuperscriptIII(Invitrogen)和oligoDt引物，合成了第一鏈cDNA。為了測定ACC2(1b)在人心肌(Ambion)、骨骼肌(Ambion)、肝臟(BD Biosciences)和脂肪組織(BD Biosciences)中的表達(dá)，使用了實(shí)時PCR(ABI prism 7500檢測系統(tǒng)，AppliedBiosystems)。使用Taqman Universal PCR Mastermix(AppliedBiosystems)，向其中加入引物和探針，進(jìn)行PCR，并在3％瓊脂糖凝膠上驗(yàn)證預(yù)期大小的實(shí)時PCR產(chǎn)物。使用7500實(shí)時PCR系統(tǒng)序列檢測軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。圖3中的結(jié)果表明ACC2(1b)轉(zhuǎn)錄水平是脂肪組織＞骨骼?。拘募。礁闻K，樣品(n＝3)之間幾乎沒有或沒有變化。
實(shí)施例4人ACC2(1b)的克隆為了制備ACC2(1b)克隆，我們利用了下述事實(shí)，即ACC2和剪接變體ACC2(1b)之間的差異僅僅是外顯子1。使用含有cDNA的載體作為原材料，所述cDNA編碼具有校正的序列的人ACC2(SEQ IDNO2)。使用2種限制酶Nhe1和Hind3的切割位點(diǎn)，切出ACC2 N-末端的序列，并用編碼獨(dú)特的ACC2(1b)N-末端的片段取代它。Nhe1識別序列存在于緊挨ACC2起始密碼子上游的載體的多克隆區(qū)域中，而Hind3位點(diǎn)存在于ACC2和ACC2(1b)共有的天然序列的下游。使用Taqplusprecision(Stratagene)，從人心臟cDNA，擴(kuò)增編碼獨(dú)特的ACC2(1b)N-末端且也包含隨后共有的ACC2/ACC2(1b)序列的cDNA。含有Nhe1位點(diǎn)的正向PCR引物是5′-ATAAGCTAGCGCCACCATGAGTCCTGCCAAGTGCA-3′(SEQ ID NO15)在天然的Hind3位點(diǎn)的下游的反向引物是5′-TCCTCCGCACTCTCAGCCTTCCGGATT-3′(SEQ ID NO16).
用限制酶Nhe1和Hind3消化使用上述的PCR引物的、包含ACC2 cDNA和PCR產(chǎn)物的載體，凈化切割的產(chǎn)物，然后將插入片段(PCR產(chǎn)物)連接進(jìn)載體。將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TOP-10細(xì)胞，并通過雙脫氧測序，證實(shí)ACC2(1b)序列向載體中的插入。
實(shí)施例5ACC2(1b)在HEK293細(xì)胞中的功能表達(dá)使用包含實(shí)施例1和3所述的cDNA的載體pcDNA3.1(+)，瞬時轉(zhuǎn)染HEK(人胚腎)293細(xì)胞。使用親脂的轉(zhuǎn)染試劑，用5μg上述質(zhì)粒/10cm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染時(第1天)，細(xì)胞單層是約60％匯合的，且在收獲時(第4天)，完全匯合。使用14CO2-固定測定，監(jiān)控來自這些轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞裂解物的乙酰輔酶A羧化酶活性。圖4所示的數(shù)據(jù)表明，檸檬酸鹽刺激表達(dá)的ACC2(1b)的活性。ACC2(1b)細(xì)胞裂解物和來自用ACC2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解物的SDS-PAGE分析表明2種蛋白之間的預(yù)期的分子量差異，前者比全長ACC2遷移得略快(未顯示數(shù)據(jù))。因而，ACC2剪接變體ACC2(1b)證實(shí)了檸檬酸鹽刺激的催化活性以及預(yù)期的凝膠電泳過程中更高的遷移速度。使用特異性地識別N-末端ACC2序列(表位＝氨基酸(a.a.)45-64)的抗體以及針對共有的ACC2/ACC2(1b)序列(表位＝氨基酸1335-1354)產(chǎn)生的抗體，進(jìn)行對比性的蛋白印跡分析。前一種抗體僅僅鑒別ACC2肽，而后者可鑒別ACC2和ACC2(1b)肽，因而，證實(shí)了2種蛋白之間的N-末端序列差異。
實(shí)施例6ACC2(1b)抗體在兔的免疫接種中，使用與獨(dú)特的人ACC2(1b)N-末端相同的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)。將相同的肽綴合到樹脂上，并在生成的血清的親和純化中使用，從而產(chǎn)生具有ACC2(1b)的特異性識別的IgG級分。將來自ACC2、ACC2(1b)和假轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，進(jìn)行SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF上，以用于使用1∶5000稀釋的生成的抗體(第二抗體＝山羊抗兔HRP綴合的，1∶25000稀釋的)，進(jìn)行蛋白印跡。使用ECL Plus(化學(xué)發(fā)光)的檢測，并隨后曝光于膠卷，會鑒別出與ACC2(1b)相對應(yīng)的特定條帶，而在假轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物或ACC2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物中沒有任何識別，盡管經(jīng)考馬斯染色證實(shí)存在ACC2肽(圖5)。
實(shí)施例7人心臟和骨骼肌的免疫染色圖6顯示了用實(shí)施例6所述的ACC2(1b)抗體(1∶100稀釋)和來自Ventana的山羊抗兔抗體(HRP-綴合物，1∶500稀釋)組合染色的人骨骼肌。在沒有(圖6A)或有(圖6B)10-倍過量的合成肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)存在的情況下，或在沒有第一抗體(圖6C)的情況下，進(jìn)行染色。圖6A和6B的對比表明，用肽預(yù)吸附阻斷染色，并從而證實(shí)ACC2(1b)抗體和內(nèi)源酶之間的特異性的相互作用。而且，圖6C證實(shí)，染色僅僅由第一抗體介導(dǎo)，因?yàn)樵谟袉为?dú)的第二抗體存在下，沒有顯色。但是，肽MSPAKCKICFPDREVK(SEQ ID NO3)的預(yù)吸附，沒有阻斷使用識別全長ACC2和剪接變體ACC2(1b)的抗體(ACC2-4，1∶100稀釋)的人骨骼肌免疫染色(圖6D)，這進(jìn)一步支持了ACC2(1b)抗體和內(nèi)源表位ACC2(1b)之間的相互作用的特異性。圖6E和F代表著使用1∶100稀釋的人心肌的(心房的)ACC2(1b)-Ab染色。因而，已經(jīng)表明ACC2(1b)剪接變體蛋白天然地存在，因?yàn)橥ㄟ^天然的人氧化組織例如骨骼肌和心臟的免疫染色，可以檢測ACC2(1b)實(shí)施例8ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物形成表達(dá)人ACC2，其具有融合到它的C-末端上的His-標(biāo)記(hACC2-6xHis)。在沒有檸檬酸鹽存在的情況下，使含有表達(dá)的融合蛋白的細(xì)胞裂解物用鎳樹脂柱平衡，并與其結(jié)合。在含有適當(dāng)量的檸檬酸鹽的介質(zhì)中，使包含重組人ACC2(1b)的細(xì)胞裂解物穿過柱，以誘導(dǎo)ACC2構(gòu)象轉(zhuǎn)移，和隨后的結(jié)合到鎳樹脂上的ACC2與添加的可溶的ACC2(1b)之間的復(fù)合物形成。使用平衡緩沖液洗掉任何過量的ACC2(1b)后，加入含有適當(dāng)濃度的咪唑的洗脫緩沖液，并收集ACC2-ACC2(1b)產(chǎn)物，并用于測試化合物。可以確立轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，以表達(dá)生理上有關(guān)的水平的ACC2和ACC2(1b)。
實(shí)施例9篩選通過ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物抑制丙二酸單酰輔酶A生產(chǎn)的化合物使用在催化過程中形成的生成的無機(jī)磷酸鹽的孔雀綠檢測，或通過直接測量14CO2向酸穩(wěn)定的14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合，可以監(jiān)控?zé)o細(xì)胞的測定中ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物的抑制。通過監(jiān)控來自處理的相對于對照細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中的丙二酸單酰輔酶A濃度，確定化合物在表達(dá)重組人ACC2-ACC2(1b)復(fù)合物的完整細(xì)胞中的作用。使用適于中間通量篩選的基于HPLC的規(guī)程，檢測丙二酸單酰輔酶A濃度。
實(shí)施例10ACC2基因的多態(tài)性的研究從14位歐洲來源的美國個體，得到肝臟RNA，并使用對ACC2(7336-7355)特異性的引物，從每個樣品制備ACC2 cDNA。為了得到最常見的ACC2序列，從單個cDNA，制備了11種重疊PCR產(chǎn)物。用M13F序列標(biāo)記正向引物，并用M13R序列標(biāo)記反向引物。還從來自5位無親屬關(guān)系的歐洲人的基因組DNA和來自60位無親屬關(guān)系的歐洲人的DNA庫，擴(kuò)增了外顯子1、36、41和51。通過使用M13F和M13R引物的染料-終止子(dye-terminator)測序，在兩個方向?qū)蝹€PCR產(chǎn)物測序。用polyphred/phrap/consed包進(jìn)行裝配和質(zhì)量調(diào)用(calling)后，分析序列痕跡的多態(tài)性。使用Seqman來比對與SEQ.ID 2公開的序列的共有序列。為了鑒別ACC2的最常見的單倍型，還從來自無親屬關(guān)系的歐洲人的28個類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系中的基因組DNA，對外顯子11、42和45測序。
表1在SEQ ID No.2上的指定位置的變體

在ACC2的編碼序列(SEQ ID No.2)中，觀察到11種多態(tài)性。除了這些多態(tài)性以外，在位置4506存在db SNP rs2241220，C-T。所有肝臟序列都是純合的C，而SEQ.ID No.2在該位置具有T。另外，SEQ.ID No.2在位置525和1791具有更低頻率的等位基因。但是，這3個位置不會影響氨基酸序列。我們還已經(jīng)鑒別出在具有約50％等位基因頻率的3’UTR的第9個堿基處的A-G多態(tài)性(rs2075262)，和在等位基因頻率為7％的內(nèi)含子10(rs7978168)和等位基因頻率為20％的內(nèi)含子41(rs2075259)中的SNP。
表23種共有的改變氨基酸的SNP的單倍型分析指示著5種單倍型

Seq.ID 2所示的序列代表著最常見的單倍型1。
14位個體會產(chǎn)生檢測10％頻率的等位基因的95％概率。不太可能存在影響估計哪個序列是最常見的序列的其它SNP。單倍型分析證實(shí)了5種不同的蛋白序列，其中3種序列可能是群體內(nèi)共有的。單倍型1是最常見的，但是僅僅代表著50％染色體。氨基酸取代是保守的。
序列表SEQ ID NO1人ACC2b多肽，2256個氨基酸，獨(dú)特的N-末端序列標(biāo)有下劃線。
MSPAKCKICFPDREVKPSMSGLHLVKRGREHKKLDLHRDFTVASPAEFVTRFGGDRVIEKVLIANNGIAAVKCMRSIRRWAYEMFRNERAIRFVVMVTPEDLKANAEYIKMADHYVPVPGGPNNNNYANVELIVDIAKRIPVQAVWAGWGHASENPKLPELLCKNGVAFLGPPSEAMWALGDKIASTVVAQTLQVPTLPWSGSGLTVEWTEDDLQQGKRISVPEDVYDKGCVKDVDEGLEAAERIGFPLMIKASEGGGGKGIRKAESAEDFPILFRQVQSEIPGSPIFLMKLAQHARHLEVQILADQYGNAVSLFGRDCSIQRRHQKIVEEAPATIAPLAIFEFMEQCAIRLAKTVGYVSAGTVEYLYSQDGSFHFLELNPRLQVEHPCTEMIADVNLPAAQLQIAMGVPLHRLKDIRLLYGESPWGVTPISFETPSNPPLARGHVIAARITSENPDEGFKPSSGTVQELNFRSSKNVWGYFSVAATGGLHEFADSQFGHCFSWGENREEAISNMVVALKELSIRGDFRTTVEYLINLLETESFQNNDIDTGWLDYLIAEKVQAEKPDIMLGVVCGALNVADAMFRTCMTDFLHSLERGQVLPADSLLNLVDVELIYGGVKYILKVARQSLTMFVLIMNGCHIEIDAHRLNDGGLLLSYNGNSYTTYMKEEVDSYRITIGNKTCVFEKENDPTVLRSPSAGKLTQYTVEDGGHVEAGSSYAEMEVMKMIMTLNVQERGRVKYIKRPGAVLEAGCVVARLELDDPSKVHPAEPFTGELPAQQTLPILGEKLHQVFHSVLENLTNVMSGFCLPEPVFSIKLKEWVQKLMMTLRHPSLPLLELQEIMTSVAGRIPAPVEKSVRRVMAQYASNITSVLCQFPSQQIATILDCHAATLQRKADREVFFINTQSIVQLVQRYRSGIRGYMKTVVLDLLRRYLRVEHHFQQAHYDKCVINLREQFKPDMSQVLDCIFSHAQVAKKNQLVIMLIDELCGPDPSLSDELISILNELTQLSKSEHCKVALRARQILIASHLPSYELRHNQVESIFLSAIDMYGHQFCPENLKKLILSETTIFDVLPTFFYHANKVVCMASLEVYVRRGYIAYELNSLQHRQLPDGTCVVEFQFMLPSSHPNRMTVPISITNPDLLRHSTELFMDSGFSPLCQRMGAMVAFRRFEDFTRNFDEVISCFANVPKDTPLFSEARTSLYSEDDCKSLREEPIHILNVSIQCADHLEDEALVPILRTFVQSKKNILVDYGLRRITFLIAQEKEFPKFFTFRARDEFAEDRIYRHLEPALAFQLELNRMRNFDLTAVPCANHKMHLYLGAAKVKEGVEVTDHRFFIRAIIRHSDLITKEASFEYLQNEGERLLLEAMDELEVAFNNTSVRTDCNHIFLNFVPTVIMDPFKIEESVRYMVMRYGSRLWKLRVLQAEVKINIRQTTTGSAVPIRLFITNESGYYLDISLYKEVTDSRSGNIMFHSFGNKQGPQHGMLINTPYVTKDLLQAKRFQAQTLGTTYIYDFPEMFRQALFKLWGSPDKYPKDILTYTELVLDSQGQLVEMNRLPGGNEVGMVAFKMRFKTQEYPEGRDVIVIGNDITFRIGSFGPGEDLLYLRASEMARAEGIPKIYVAANSGARIGMAEEIKHMFHVAWVDPEDPHKGFKYLYLTPQDYTRISSL
NSVHCKHIEEGGESRYMITDIIGKDDGLGVENLRGSGMIAGESSLAYEEIVTISLVTCRAIGIGAYLVRLGQRVIQVENSHIILTGASALNKVLGREVYTSNNQLGGVQIMHYNGVSHITVPDDFEGVYTILEWLSYMPKDNHSPVPIITPTDPIDREIEFLPSRAPYDPRWMLAGRPHPTLKGTWQSGFFDHGSFKEIMAPWAQTVVTGRARLGGIPVGVIAVETRTVEVAVPADPANLDSEAKIIQQAGQVWFPDSAYKTAQAIKDFNREKLPLMIFANWRGFSGGMKDMYDQVLKFGAYIVDGLRQYKQPILIYIPPYAELRGGSWVVIDATINPLCIEMYADKESRGGVLEPEGTVEIKFRKKDLIKSMRRIDPAYKKLMEQLGEPDLSDKDRKDLEGRLKAREDLLLPIYHQVAVQFADFHDTPGRMLEKGVISDILEWKTARTFLYWRLRRLLLEDQVKQEILQASGELSHVHIQSMLRRWFVETEGAVKAYLWDNNQVVVQWLEQHWQAGDGPRSTIRENITYLKHDSVLKTIRGLVEENPEVAVDCVIYLSQHISPAERAQVVHLLSTMDSPASTXSEQ ID NO2人ACC2的核苷酸序列ATGGTCTTGCTTCTTTGTCTATCTTGTCTGATTTTCTCCTGTCTGACCTTTTCCTGGTTAAAAATCTGGGGGAAAATGACGGACTCCAAGCCGATCACCAAGAGTAAATCAGAAGCAAACCTCATCCCGAGCCAGGAGCCCTTTCCAGCCTCTGATAACTCAGGGGAGACACCGCAGAGAAATGGGGAGGGCCACACTCTGCCCAAGACACCCAGCCAGGCCGAGCCAGCCTCCCACAAAGGCCCCAAAGATGCCGGTCGGCGGAGAAACTCCCTACCACCCTCCCACCAGAAGCCCCCAAGAAACCCCCTTTCTTCCAGTGACGCAGCACCCTCCCCAGAGCTTCAAGCCAACGGGACTGGGACACAAGGTCTGGAGGCCACAGATACCAATGGCCTGTCCTCCTCAGCCAGGCCCCAGGGCCAGCAAGCTGGCTCCCCCTCCAAAGAAGACAAGAAGCAGGCAAACATCAAGAGGCAGCTGATGACCAACTTCATCCTGGGCTCTTTTGATGACTACTCCTCCGACGAGGACTCTGTTGCTGGCTCATCTCGTGAGTCTACCCGGAAGGGCAGCCGGGCCAGCTTGGGGGCCCTGTCCCTGGAGGCTTATCTGACCACAGGTGAAGCTGAGACCCGCGTCCCCACTATGAGGCCGAGCATGTCGGGACTCCACCTGGTGAAGAGGGGACGGGAACACAAGAAGCTGGACCTGCACAGAGACTTTACCGTGGCTTCTCCCGCTGAGTTTGTCACACGCTTTGGGGGGGATCGGGTCATCGAGAAGGTGCTTATTGCCAACAACGGGATTGCCGCCGTGAAGTGCATGCGCTCCATCCGCAGGTGGGCCTATGAGATGTTCCGCAACGAGCGGGCCATCCGGTTTGTTGTGATGGTGACCCCCGAGGACCTTAAGGCCAACGCAGAGTACATCAAGATGGCGGATCATTACGTCCCCGTCCCAGGAGGGCCCAATAACAACAACTATGCCAACGTGGAGCTGATTGTGGACATTGCCAAGAGAATCCCCGTGCAGGCGGTGT
GGGCTGGCTGGGGCCATGCTTCAGAAAACCCTAAACTTCCGGAGCTGCTGTGCAAGAATGGAGTTGCTTTCTTAGGCCCTCCCAGTGAGGCCATGTGGGCCTTAGGAGATAAGATCGCCTCCACCGTTGTCGCCCAGACGCTACAGGTCCCAACCCTGCCCTGGAGTGGAAGCGGCCTGACAGTGGAGTGGACAGAAGATGATCTGCAGCAGGGAAAAAGAATCAGTGTCCCAGAAGATGTTTATGACAAGGGTTGCGTGAAAGACGTAGATGAGGGCTTGGAGGCAGCAGAAAGAATTGGTTTTCCATTGATGATCAAAGCTTCTGAAGGTGGCGGAGGGAAGGGAATCCGGAAGGCTGAGAGTGCGGAGGACTTCCCGATCCTTTTCAGACAAGTACAGAGTGAGATCCCAGGCTCGCCCATCTTTCTCATGAAGCTGGCCCAGCACGCCCGTCACCTGGAAGTTCAGATCCTCGCTGACCAGTATGGGAATGCTGTGTCTCTGTTTGGTCGCGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCATCAGAAGATCGTTGAGGAAGCACCGGCCACCATCGCCCCGCTGGCCATATTCGAGTTCATGGAGCAGTGTGCCATCCGCCTGGCCAAGACCGTGGGCTATGTGAGTGCAGGGACAGTGGAATACCTCTATAGTCAGGATGGCAGCTTCCACTTCTTGGAGCTGAATCCTCGCTTGCAGGTGGAACATCCCTGCACAGAAATGATTGCTGATGTTAATCTGCCGGCCGCCCAGCTACAGATCGCCATGGGCGTGCCACTGCACCGGCTGAAGGATATCCGGCTTCTGTATGGAGAGTCACCATGGGGAGTGACTCCCATTTCTTTTGAAACCCCCTCAAACCCTCCCCTCGCCCGAGGCCACGTCATTGCCGCCAGAATCACCAGCGAAAACCCAGACGAGGGTTTTAAGCCGAGCTCCGGGACTGTCCAGGAACTGAATTTCCGGAGCAGCAAGAACGTGTGGGGTTACTTCAGCGTGGCCGCTACTGGAGGCCTGCACGAGTTTGCGGATTCCCAATTTGGGCACTGCTTCTCCTGGGGAGAGAACCGGGAAGAGGCCATTTCGAACATGGTGGTGGCTTTGAAGGAACTGTCCATCCGAGGCGACTTTAGGACTACCGTGGAATACCTCATTAACCTCCTGGAGACCGAGAGCTTCCAGAACAACGACATCGACACCGGGTGGTTGGACTACCTCATTGCTGAGAAAGTGCAGGCGGAGAAACCGGATATCATGCTTGGGGTGGTATGCGGGGCCTTGAACGTGGCCGATGCGATGTTCAGAACGTGCATGACAGATTTCTTACACTCCCTGGAAAGGGGCCAGGTCCTCCCAGCGGATTCACTACTGAACCTCGTAGATGTGGAATTAATTTACGGAGGTGTTAAGTACATTCTCAAGGTGGCCCGGCAGTCTCTGACCATGTTCGTTCTCATCATGAATGGCTGCCACATCGAGATTGATGCCCACCGGCTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCTCCTACAATGGGAACAGCTACACCACCTACATGAAGGAAGAGGTTGACAGTTACCGAATTACCATCGGCAATAAGACGTGTGTGTTTGAGAAGGAGAACGATCCTACAGTCCTGAGATCCCCCTCGGCTGGGAAGCTGACACAGTACACAGTGGAGGATGGGGGCCACGTTGAGGCTGGGAGCAGCTACGCTGAGATGGAGGTGATGAAGATGATCATGACCCTGAACGTTCAGGAAAGAGGCCGGGTGAAGTACATCAAGCGTCCAGGTGCC
GTGCTGGAAGCAGGCTGCGTGGTGGCCAGGCTGGAGCTCGATGACCCTTCTAAAGTCCACCCGGCTGAACCGTTCACAGGAGAACTCCCTGCCCAGCAGACACTGCCCATCCTCGGAGAGAAACTGCACCAGGTCTTCCACAGCGTCCTGGAAAACCTCACCAACGTCATGAGTGGCTTTTGTCTGCCAGAGCCCGTTTTTAGCATAAAGCTGAAGGAGTGGGTGCAGAAGCTCATGATGACCCTCCGGCACCCGTCACTGCCGCTGCTGGAGCTGCAGGAGATCATGACCAGCGTGGCAGGCCGCATCCCCGCCCCTGTGGAGAAGTCTGTCCGCAGGGTGATGGCCCAGTATGCCAGCAACATCACCTCGGTGCTGTGCCAGTTCCCCAGCCAGCAGATAGCCACCATCCTGGACTGCCATGCAGCCACCCTGCAGCGGAAGGCTGATCGAGAGGTCTTCTTCATCAACACCCAGAGCATCGTGCAGTTGGTCCAGAGATACCGCAGCGGGATCCGCGGCTATATGAAAACAGTGGTGTTGGATCTCCTGAGAAGATACTTGCGTGTTGAGCACCATTTTCAGCAAGCCCACTACGACAAGTGTGTGATAAACCTCAGGGAGCAGTTCAAGCCAGACATGTCCCAGGTGCTGGACTGCATCTTCTCCCACGCACAGGTGGCCAAGAAGAACCAGCTGGTGATCATGTTGATCGATGAGCTGTGTGGCCCAGACCCTTCCCTGTCGGACGAGCTGATCTCCATCCTCAACGAGCTCACTCAGCTGAGCAAAAGCGAGCACTGCAAAGTGGCCCTCAGAGCCCGGCAGATCCTGATTGCCTCCCACCTCCCCTCCTACGAGCTGCGGCATAACCAGGTGGAGTCCATTTTCCTGTCTGCCATTGACATGTACGGCCACCAGTTCTGCCCCGAGAACCTCAAGAAATTAATACTTTCGGAAACAACCATCTTCGACGTCCTGCCTACTTTCTTCTATCACGCAAACAAAGTCGTGTGCATGGCGTCCTTGGAGGTTTACGTGCGGAGGGGCTACATCGCCTATGAGTTAAACAGCCTGCAGCACCGGCAGCTCCCGGACGGCACCTGCGTGGTAGAATTCCAGTTCATGCTGCCGTCCTCCCACCCAAACCGGATGACCGTGCCCATCAGCATCACCAACCCTGACCTGCTGAGGCACAGCACAGAGCTCTTCATGGACAGCGGCTTCTCCCCACTGTGCCAGCGCATGGGAGCCATGGTAGCCTTCAGGAGATTCGAGGACTTCACCAGAAATTTTGATGAAGTCATCTCTTGCTTCGCCAACGTGCCCAAAGACACCCCCCTCTTCAGCGAGGCCCGCACCTCCCTATACTCCGAGGATGACTGCAAGAGCCTCAGAGAAGAGCCCATCCACATTCTGAATGTGTCCATCCAGTGTGCAGACCACCTGGAGGATGAGGCACTGGTGCCGATTTTACGGACATTCGTACAGTCCAAGAAAAATATCCTTGTGGATTATGGACTCCGACGAATCACATTCTTGATTGCCCAAGAGAAAGAATTTCCCAAGTTTTTCACATTCAGAGCAAGAGATGAGTTTGCAGAAGATCGCATTTACCGTCACTTGGAACCTGCCCTGGCCTTCCAGCTGGAACTTAACCGGATGCGTAACTTCGATCTGACCGCCGTGCCCTGTGCCAACCACAAGATGCACCTTTACCTGGGTGCTGCCAAGGTGAAGGAAGGTGTGGAAGTGACGGACCATAGGTTCTTCATCCGCGCCATCATCAGGCACTCTGACCTGATCACAAAG
GAAGCCTCCTTCGAATACCTGCAGAACGAGGGTGAGCGGCTGCTCCTGGAGGCCATGGACGAGCTGGAGGTGGCGTTCAATAACACCAGCGTGCGCACCGACTGCAACCACATCTTCCTCAACTTCGTGCCCACTGTCATCATGGACCCCTTCAAGATCGAGGAGTCCGTGCGCTACATGGTTATGCGCTACGGCAGCCGGCTGTGGAAACTCCGTGTGCTACAGGCTGAGGTCAAGATCAACATCCGCCAGACCACCACCGGCAGTGCCGTTCCCATCCGCCTGTTCATCACCAATGAGTCGGGCTACTACCTGGACATCAGCCTCTACAAAGAAGTGACTGACTCCAGATCTGGAAATATCATGTTTCACTCCTTCGGCAACAAGCAAGGGCCCCAGCACGGGATGCTGATCAATACTCCCTACGTCACCAAGGATCTGCTCCAGGCCAAGCGATTCCAGGCCCAGACCCTGGGAACCACCTACATCTATGACTTCCCGGAAATGTTCAGGCAGGCTCTCTTTAAACTGTGGGGCTCCCCAGACAAGTATCCCAAAGACATCCTGACATACACTGAATTAGTGTTGGACTCTCAGGGCCAGCTGGTGGAGATGAACCGACTTCCTGGTGGAAATGAGGTGGGCATGGTGGCCTTCAAAATGAGGTTTAAGACCCAGGAGTACCCGGAAGGACGGGATGTGATCGTCATCGGCAATGACATCACCTTTCGCATTGGATCCTTTGGCCCTGGAGAGGACCTTCTGTACCTGCGGGCATCCGAGATGGCCCGGGCAGAGGGCATTCCCAAAATTTACGTGGCAGCCAACAGTGGCGCCCGTATTGGCATGGCAGAGGAGATCAAACACATGTTCCACGTGGCTTGGGTGGACCCAGAAGACCCCCACAAAGGATTTAAATACCTGTACCTGACTCCCCAAGACTACACCAGAATCAGCTCCCTGAACTCCGTCCACTGTAAACACATCGAGGAAGGAGGAGAGTCCAGATACATGATCACGGATATCATCGGGAAGGATGATGGCTTGGGCGTGGAGAATCTGAGGGGCTCAGGCATGATTGCTGGGGAGTCCTCTCTGGCTTACGAAGAGATCGTCACCATTAGCTTGGTGACCTGCCGAGCCATTGGGATTGGGGCCTACTTGGTGAGGCTGGGCCAGCGAGTGATCCAGGTGGAGAATTCCCACATCATCCTCACAGGAGCAAGTGCTCTCAACAAGGTCCTGGGAAGAGAGGTCTACACATCCAACAACCAGCTGGGTGGCGTTCAGATCATGCATTACAATGGTGTCTCCCACATCACCGTGCCAGATGACTTTGAGGGGGTTTATACCATCCTGGAGTGGCTGTCCTATATGCCAAAGGATAATCACAGCCCTGTCCCTATCATCACACCCACTGACCCCATTGACAGAGAAATTGAATTCCTCCCATCCAGAGCTCCCTACGACCCCCGGTGGATGCTTGCAGGAAGGCCTCACCCAACTCTGAAGGGAACGTGGCAGAGCGGATTCTTTGACCACGGCAGTTTCAAGGAAATCATGGCACCCTGGGCGCAGACCGTGGTGACAGGACGAGCAAGGCTTGGGGGGATTCCCGTGGGAGTGATTGCTGTGGAGACACGGACTGTGGAGGTGGCAGTCCCTGCAGACCCTGCCAACCTGGATTCTGAGGCCAAGATAATTCAGCAGGCAGGACAGGTGTGGTTCCCAGACTCAGCCTACAAAACCGCCCAGGCCATCAAGGACTTCAACCGGGAGAAGTTGCCCCTGATGATCTTTGCCAACTG
GAGGGGGTTCTCCGGTGGCATGAAAGACATGTATGACCAGGTGCTGAAGTTTGGAGCCTACATCGTGGACGGCCTTAGACAATACAAACAGCCCATCCTGATCTATATCCCGCCCTATGCGGAGCTCCGGGGAGGCTCCTGGGTGGTCATAGATGCCACCATCAACCCGCTGTGCATAGAAATGTATGCAGACAAAGAGAGCAGGGGTGGTGTTCTGGAACCAGAGGGGACAGTGGAGATTAAGTTCCGAAAGAAAGATCTGATAAAGTCCATGAGAAGGATCGATCCAGCTTACAAGAAGCTCATGGAACAGCTAGGGGAACCTGATCTCTCCGACAAGGACCGAAAGGACCTGGAGGGCCGGCTAAAGGCTCGCGAGGACCTGCTGCTCCCCATCTACCACCAGGTGGCGGTGCAGTTCGCCGACTTCCATGACACACCCGGCCGGATGCTGGAGAAGGGCGTCATATCTGACATCCTGGAGTGGAAGACCGCACGCACCTTCCTGTATTGGCGTCTGCGCCGCCTCCTCCTGGAGGACCAGGTCAAGCAGGAGATCCTGCAGGCCAGCGGGGAGCTGAGTCACGTGCATATCCAGTCCATGCTGCGTCGCTGGTTCGTGGAGACGGAGGGGGCTGTCAAGGCCTACTTGTGGGACAACAACCAGGTGGTTGTGCAGTGGCTGGAACAGCACTGGCAGGCAGGGGATGGCCCGCGCTCCACCATCCGTGAGAACATCACGTACCTGAAGCACGACTCTGTCCTCAAGACCATCCGAGGCCTGGTTGAAGAAAACCCCGAGGTGGCCGTGGACTGTGTGATATACCTGAGCCAGCACATCAGCCCAGCTGAGCGGGCGCAGGTCGTTCACCTGCTGTCTACCATGGACAGCCCGGCCTCCACCTGASEQ ID NO3ACC2(1b)N-末端MSPAKCKICFPDREVKPSEQ ID NO4如硅片上預(yù)測的人ACC2膜/線粒體靶向必需的序列MVLLLCLSSEQ ID NO5ACC2(1b)的核苷酸ATGAGTCCTGCCAAGTGCAAGATCTGTTTCCCTGATCGCGAAGTAAAGTCGGGACTCCACCTGGTGAAGAGGGGACGGGAACACAAGAAGCTGGACCTGCACAGAGACTTTACCGTGGCTTCTCCCGCTGAGTTTGTCACACGCTTTGGGGGGGATCGGGTCATC
GAGAAGGTGCTTATTGCCAACAACGGGATTGCCGCCGTGAAGTGCATGCGCTCCATCCGCAGGTGGGCCTATGAGATGTTCCGCAACGAGCGGGCCATCCGGTTTGTTGTGATGGTGACCCCCGAGGACCTTAAGGCCAACGCAGAGTACATCAAGATGGCGGATCATTACGTCCCCGTCCCAGGAGGGCCCAATAACAACAACTATGCCAACGTGGAGCTGATTGTGGACATTGCCAAGAGAATCCCCGTGCAGGCGGTGTGGGCTGGCTGGGGCCATGCTTCAGAAAACCCTAAACTTCCGGAGCTGCTGTGCAAGAATGGAGTTGCTTTCTTAGGCCCTCCCAGTGAGGCCATGTGGGCCTTAGGAGATAAGATCGCCTCCACCGTTGTCGCCCAGACGCTACAGGTCCCAACCCTGCCCTGGAGTGGAAGCGGCCTGACAGTGGAGTGGACAGAAGATGATCTGCAGCAGGGAAAAAGAATCAGTGTCCCAGAAGATGTTTATGACAAGGGTTGCGTGAAAGACGTAGATGAGGGCTTGGAGGCAGCAGAAAGAATTGGTTTTCCATTGATGATCAAAGCTTCTGAAGGTGGCGGAGGGAAGGGAATCCGGAAGGCTGAGAGTGCGGAGGACTTCCCGATCCTTTTCAGACAAGTACAGAGTGAGATCCCAGGCTCGCCCATCTTTCTCATGAAGCTGGCCCAGCACGCCCGTCACCTGGAAGTTCAGATCCTCGCTGACCAGTATGGGAATGCTGTGTCTCTGTTTGGTCGCGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCATCAGAAGATCGTTGAGGAAGCACCGGCCACCATCGCCCCGCTGGCCATATTCGAGTTCATGGAGCAGTGTGCCATCCGCCTGGCCAAGACCGTGGGCTATGTGAGTGCAGGGACAGTGGAATACCTCTATAGTCAGGATGGCAGCTTCCACTTCTTGGAGCTGAATCCTCGCTTGCAGGTGGAACATCCCTGCACAGAAATGATTGCTGATGTTAATCTGCCGGCCGCCCAGCTACAGATCGCCATGGGCGTGCCACTGCACCGGCTGAAGGATATCCGGCTTCTGTATGGAGAGTCACCATGGGGAGTGACTCCCATTTCTTTTGAAACCCCCTCAAACCCTCCCCTCGCCCGAGGCCACGTCATTGCCGCCAGAATCACCAGCGAAAACCCAGACGAGGGTTTTAAGCCGAGCTCCGGGACTGTCCAGGAACTGAATTTCCGGAGCAGCAAGAACGTGTGGGGTTACTTCAGCGTGGCCGCTACTGGAGGCCTGCACGAGTTTGCGGATTCCCAATTTGGGCACTGCTTCTCCTGGGGAGAGAACCGGGAAGAGGCCATTTCGAACATGGTGGTGGCTTTGAAGGAACTGTCCATCCGAGGCGACTTTAGGACTACCGTGGAATACCTCATTAACCTCCTGGAGACCGAGAGCTTCCAGAACAACGACATCGACACCGGGTGGTTGGACTACCTCATTGCTGAGAAAGTGCAGGCGGAGAAACCGGATATCATGCTTGGGGTGGTATGCGGGGCCTTGAACGTGGCCGATGCGATGTTCAGAACGTGCATGACAGATTTCTTACACTCCCTGGAAAGGGGCCAGGTCCTCCCAGCGGATTCACTACTGAACCTCGTAGATGTGGAATTAATTTACGGAGGTGTTAAGTACATTCTCAAGGTGGCCCGGCAGTCTCTGACCATGTTCGTTCTCATCATGAATGGCTGCCACATCGAGATTGATGCCCACCGGCTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCTCCTACAATGGG
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AAGAGAAAGAATTTCCCAAGTTTTTCACATTCAGAGCAAGAGATGAGTTTGCAGAAGATCGCATTTACCGTCACTTGGAACCTGCCCTGGCCTTCCAGCTGGAACTTAACCGGATGCGTAACTTCGATCTGACCGCCGTGCCCTGTGCCAACCACAAGATGCACCTTTACCTGGGTGCTGCCAAGGTGAAGGAAGGTGTGGAAGTGACGGACCATAGGTTCTTCATCCGCGCCATCATCAGGCACTCTGACCTGATCACAAAGGAAGCCTCCTTCGAATACCTGCAGAACGAGGGTGAGCGGCTGCTCCTGGAGGCCATGGACGAGCTGGAGGTGGCGTTCAATAACACCAGCGTGCGCACCGACTGCAACCACATCTTCCTCAACTTCGTGCCCACTGTCATCATGGACCCCTTCAAGATCGAGGAGTCCGTGCGCTACATGGTTATGCGCTACGGCAGCCGGCTGTGGAAACTCCGTGTGCTACAGGCTGAGGTCAAGATCAACATCCGCCAGACCACCACCGGCAGTGCCGTTCCCATCCGCCTGTTCATCACCAATGAGTCGGGCTACTACCTGGACATCAGCCTCTACAAAGAAGTGACTGACTCCAGATCTGGAAATATCATGTTTCACTCCTTCGGCAACAAGCAAGGGCCCCAGCACGGGATGCTGATCAATACTCCCTACGTCACCAAGGATCTGCTCCAGGCCAAGCGATTCCAGGCCCAGACCCTGGGAACCACCTACATCTATGACTTCCCGGAAATGTTCAGGCAGGCTCTCTTTAAACTGTGGGGCTCCCCAGACAAGTATCCCAAAGACATCCTGACATACACTGAATTAGTGTTGGACTCTCAGGGCCAGCTGGTGGAGATGAACCGACTTCCTGGTGGAAATGAGGTGGGCATGGTGGCCTTCAAAATGAGGTTTAAGACCCAGGAGTACCCGGAAGGACGGGATGTGATCGTCATCGGCAATGACATCACCTTTCGCATTGGATCCTTTGGCCCTGGAGAGGACCTTCTGTACCTGCGGGCATCCGAGATGGCCCGGGCAGAGGGCATTCCCAAAATTTACGTGGCAGCCAACAGTGGCGCCCGTATTGGCATGGCAGAGGAGATCAAACACATGTTCCACGTGGCTTGGGTGGACCCAGAAGACCCCCACAAAGGATTTAAATACCTGTACCTGACTCCCCAAGACTACACCAGAATCAGCTCCCTGAACTCCGTCCACTGTAAACACATCGAGGAAGGAGGAGAGTCCAGATACATGATCACGGATATCATCGGGAAGGATGATGGCTTGGGCGTGGAGAATCTGAGGGGCTCAGGCATGATTGCTGGGGAGTCCTCTCTGGCTTACGAAGAGATCGTCACCATTAGCTTGGTGACCTGCCGAGCCATTGGGATTGGGGCCTACTTGGTGAGGCTGGGCCAGCGAGTGATCCAGGTGGAGAATTCCCACATCATCCTCACAGGAGCAAGTGCTCTCAACAAGGTCCTGGGAAGAGAGGTCTACACATCCAACAACCAGCTGGGTGGCGTTCAGATCATGCATTACAATGGTGTCTCCCACATCACCGTGCCAGATGACTTTGAGGGGGTTTATACCATCCTGGAGTGGCTGTCCTATATGCCAAAGGATAATCACAGCCCTGTCCCTATCATCACACCCACTGACCCCATTGACAGAGAAATTGAATTCCTCCCATCCAGAGCTCCCTACGACCCCCGGTGGATGCTTGCAGGAAGGCCTCACCCAACTCTGAAGGGAACGTGGCAGAGCGGATTCTTTGACCACGGC
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權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有根據(jù)SEQ ID NO1的氨基酸序列的乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體，或與其具有至少85％序列同一性的變體，或與SEQ IDNO1中公開的序列不同之處僅在于同義密碼子的取代的變體，該變體缺少膜結(jié)合能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO3的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼SEQ ID NO3公開的多肽的變體，其中所述變體與其具有至少85％序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的核酸，其包含SEQ ID NO5所述的核苷酸序列。
5.質(zhì)粒，其包含權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)的核酸。
6.分離的細(xì)胞或細(xì)胞系，其包含權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)的核酸。
7.用權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7中的任一項(xiàng)的細(xì)胞或細(xì)胞系，其是哺乳動物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞或細(xì)胞系。
9.生產(chǎn)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列、與其具有至少85％序列同一性的序列、或其C-末端截短的版本的多肽的方法，所述多肽不能膜錨定，該方法包含a)在適于表達(dá)多肽的條件下，培養(yǎng)含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼ACC2剪接變體多肽、或與其具有至少85％序列同一性的多肽、或其C-末端截短的版本的核酸序列，該多肽不能膜錨定；和b)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。
10.分離的多肽，其包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或與其具有至少85％相似性的序列，該多肽不能膜結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的多肽，其包含SEQ ID No1所示的氨基酸序列。
12.分離的ACC2-ACC2(1b)蛋白復(fù)合物。
13.純化的抗體，其能選擇性地結(jié)合ACC2剪接變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求的抗體，其能選擇性地結(jié)合ACC2(1b)剪接變體。
15.權(quán)利要求10或11的多肽在鑒別調(diào)節(jié)所述多肽的化合物的測定中的用途。
16.能調(diào)節(jié)ACC2剪接變體的活性或量的化合物在治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙中的用途。
17.如權(quán)利要求16要求保護(hù)的用途，其中與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病和血脂異常。
18.鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調(diào)節(jié)ACC2剪接變體蛋白的活性或量的能力。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述測定選自i)使用表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞系，或使用純化的ACC2剪接變體蛋白，測量ACC2剪接變體活性；和ii)在表達(dá)ACC2剪接變體的細(xì)胞系中，測量ACC2剪接變體轉(zhuǎn)錄或翻譯。
20.通過權(quán)利要求18或19中的任一項(xiàng)的方法鑒別出的化合物。
21.鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調(diào)節(jié)包含ACC2和ACC2剪接變體的復(fù)合物的活性或量的能力。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中使用分離的ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物，并測量所述復(fù)合物關(guān)于丙二酸單酰輔酶A生產(chǎn)的活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法包含測量由所述復(fù)合物形成的生成的無機(jī)磷酸鹽的孔雀綠檢測。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述方法包含測量14CO2向14C-丙二酸單酰輔酶A中的整合。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其包含使用表達(dá)ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的細(xì)胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其包含使用表達(dá)ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的細(xì)胞系，測量ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
27.根據(jù)權(quán)利要求18-19或21-26中的任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病或障礙選自肥胖癥、2型糖尿病或血脂異常。
28.通過權(quán)利要求21-27中的任一項(xiàng)的方法鑒別出的化合物。
29.制備藥物組合物的方法，其包含(i)根據(jù)權(quán)利要求18-19或21-27中的任一項(xiàng)的方法，鑒別可以用于治療疾病的化合物，所述疾病例如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常和與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的其它障礙；和(ii)將化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑相混合。
30.對ACC2剪接變體核酸選擇性的抑制性核酸分子或針對ACC2剪接變體蛋白的選擇性抗體在生產(chǎn)用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的藥物中的用途。
31.對ACC2和ACC2(1b)剪接變體復(fù)合物選擇性的抑制性核酸分子在生產(chǎn)用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶2(ACC2)剪接變體。還涉及由所述核酸編碼的對應(yīng)多肽，和鑒別潛在地可用于治療與受損的氧化脂肪酸的能力有關(guān)的疾病或障礙的化合物的方法，其包含測定化合物調(diào)節(jié)ACC2剪接變體復(fù)合物或其復(fù)合物的活性或量的能力。
文檔編號C07K16/40GK1981034SQ200580022746
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者J·克拉法姆, B·科尼利厄森, S·哈倫 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司