專利名稱：免疫原性改變的C1q家族成員蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫原性下降的C1q超家族(“C1q SF”)成員變體。特別地，公開了脂連蛋白和CTRP1的變體，其結(jié)合一種或多種人II型MHC分子的能力下降。
背景技術(shù)：
免疫原性是蛋白治療劑的開發(fā)和利用的主要障礙。盡管針對非人蛋白產(chǎn)生的免疫應(yīng)答通常是最嚴(yán)重的，而基于人的蛋白的治療劑也具有免疫原性。免疫原性是對被視為外來物的物質(zhì)所產(chǎn)生的一系列復(fù)雜的應(yīng)答，誘導(dǎo)生成中和抗體和非中和抗體，形成免疫復(fù)合物，活化補體，活化肥大細胞，產(chǎn)生炎癥和過敏性反應(yīng)。
數(shù)種因素會影響蛋白免疫原性，包括但不限于蛋白質(zhì)序列、給藥路徑和頻率，以及患者群體。免疫原性可能以多種方式限制蛋白質(zhì)治療劑的功效和安全性。中和抗體的形成會直接降低功效。由于結(jié)合中和抗體或者非中和抗體通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)治療劑被迅速從血清中清除，從而間接地降低其功效。當(dāng)發(fā)生免疫反應(yīng)時，可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，甚至死亡。當(dāng)中和抗體與內(nèi)源性蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)并阻斷其功能時，產(chǎn)生一類特定的副作用。
脂連蛋白也被稱作為30kDa的脂肪細胞補體相關(guān)蛋白(ACRP30)，是一種專門在分化的脂肪細胞中表達的分泌型血清蛋白。在脂連蛋白與補體因子C1q三個亞單位、西伯利亞花栗鼠蛋白(Siberian chipmunkprotein)HP-20、-25和-27、CORS26、CTRP-5以及G-蛋白偶聯(lián)受體互作蛋白之間存在很高的序列相似性。所有脂連蛋白類似物都含有相似的分子結(jié)構(gòu)，包括N-末端膠原結(jié)構(gòu)域，接著為C-末端球狀三聚結(jié)構(gòu)域。脂連蛋白的球狀三聚體的晶體結(jié)構(gòu)揭示了其與細胞因子TNF家族之間存在意想不到的同源性。盡管初級序列之間缺乏同源性，但TNF-α和脂連蛋白之間的結(jié)構(gòu)特征高度保守。脂連蛋白和TNF-α都通過關(guān)鍵的保守疏水殘基發(fā)生三聚化，都具有一種十鏈果凍卷餅型折疊拓撲結(jié)構(gòu)(ten-strand jelly-roll foldingtopology)，并且都形成鐘形同三聚合低聚物。參見，例如Scherer等人，J.Biol.Chem.270(45)26746-91995，完全引入作為參考。
代謝試驗已經(jīng)證明了脂連蛋白在調(diào)控葡萄糖和脂肪平衡中的作用。脂連蛋白通過增加組織脂肪氧化來提高胰島素敏感性，導(dǎo)致循環(huán)脂肪酸水平下降并且降低肝臟和肌肉中的細胞內(nèi)甘油三酯的含量。該蛋白還抑制血管內(nèi)皮細胞表達黏著分子，以及抑制由巨噬細胞生成細胞因子，從而抑制在動脈硬化癥早期中發(fā)生的炎癥過程。
脂連蛋白被推定具有抗高血糖、抗動脈粥樣化以及抗炎的特性，并且可能用于治療與胰島素抗性相關(guān)的疾病，包括2型糖尿病、肥胖、脂肪營養(yǎng)不良疾病，以及其它與葡萄糖和脂肪的代謝調(diào)控相關(guān)的狀況。脂連蛋白還被證明有利于預(yù)防心血管疾病，包括動脈硬化癥和冠狀動脈疾病，以及有利于預(yù)防和治療肌肉的疾病和肝臟疾病，參見，例如Berg等人，TrendsEndocrinol.Metab.1384-89(2002)，Diez和Iglesias Eur.J.Endocrinol.148293-300(2003)，Xu等人，J.Clin.Invest.11291-100(2003)，WO00192330以及WO02100427，全部引入作為參考。
已經(jīng)鑒定了球狀脂連蛋白和全長脂連蛋白的兩種受體，AdipoR1和AdipoR2。AdipoR1在骨骼肌中大量表達，而AdipoR2主要在肝臟中表達。這兩種受體被預(yù)測含有七個跨膜結(jié)構(gòu)域，但是在結(jié)構(gòu)和功能上完全不同于G蛋白偶聯(lián)受體。使用小干擾RNA進行的表達和抑制試驗表明，這些受體介導(dǎo)了脂連蛋白對脂肪酸氧化和葡萄糖攝取的作用，并且使AMP激酶增加。
C1q-TNF相關(guān)蛋白1(CTRP1)也被稱作為zsig37和C1QTNF1，在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌中高度表達，已經(jīng)證明其能夠結(jié)合暴露在急性血管損傷部位上的膠原。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CTRP1是膠原誘導(dǎo)的血小板活化的潛在抑制劑，在血管損傷部位局部起作用以防止形成阻礙動脈的凝塊。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在與心臟病發(fā)作和卒中相關(guān)的斑塊破裂的動物模型中，以及在血管手術(shù)如血管成形術(shù)的模型中，CTRP1處理會防止血流被阻斷。與用于抑制栓塞(thrombotic occlusion)的其它試劑不同，在動物模型中進行的試驗證明CTRP1對血液凝結(jié)沒有顯著的系統(tǒng)性作用。由于其在防止血小板活化和動脈阻塞的潛在作用，以及由于其施用顯然不會發(fā)生流血并發(fā)癥，在治療各種與血管損害相關(guān)的狀況中，包括冠狀血管成形術(shù)、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)和卒中(stroke)，CTRP1具有臨床用途。參見例如美國專利US6,803,450；US6,566,499；和US6,265,544，全部完全引入作為參考。其它C1q SF成員包括CTRP2、CTRP3、CTRP4、CTRP5、CTRP6和CTRP7。參見Wong等人，PNAS，第110卷，第28期10302-7(2004)，完全引入作為參考。
與所有蛋白質(zhì)一樣，當(dāng)C1q SF成員被用作治療劑時可能會引起不期望的免疫應(yīng)答。因此，可以通過預(yù)先完全(pre-emptively)降低C1q SF成員的潛在免疫原性，以便開發(fā)基于C1q SF成員的治療劑。已經(jīng)開發(fā)出多種方法來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的免疫原性。在某些情形下，已經(jīng)觀察到PEG化能夠通過從空間上阻礙接近抗體的抗原限制位，從而降低產(chǎn)生中和抗體的患者的比例(參見，例如Hershfield等人，PNAS 1991 887185-7189(1991)；Bailon.等人，Bioconjug.Chem.12195-202(2001)；He等人，Life Sci.65355-368(1999)，全部完全引入作為參考)。由于已經(jīng)觀察到聚合物的免疫原性高于可溶的蛋白質(zhì)，因此，提高蛋白質(zhì)治療劑的溶解特性的方法也可以降低免疫原性。
一種降低免疫原性的更常用方法包括以蛋白質(zhì)序列中的抗原限制位以及主要負責(zé)刺激免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)為靶點進行誘變。通過隨機替換溶劑暴露殘基來降低對多組已知中和抗體的結(jié)合親和性，已經(jīng)獲得部分成功(參見例如Laroche等人，Blood 961425-1432(2000)，完全引入作為參考)。由于抗體成員的高度多樣性，降低對已知抗體的親和性的突變通常會導(dǎo)致生成另一組抗體，而不是消除免疫原性。然而，在某些情形下，通過用極性中性殘基替換疏水性的和帶電荷的殘基，可能降低表面抗原性(參見Meyer等人，Protein Sci.10491-503(2001)，完全引入作為參考)。
另一種方法用于破壞T細胞活化。由于MHC分子的多樣性僅包括約103個等位基因，而抗體成員估計為約108并且T細胞受體成員更多，去除MHC-結(jié)合抗原限制位提供一種更容易處理的降低免疫原性的方法。通過在一條蛋白質(zhì)序列中鑒定和去除或者修飾II型MHC結(jié)合肽，可以避開分子水平的免疫原性。先前已經(jīng)報道了去除這種抗原限制位，以生成免疫原性較低的蛋白質(zhì)；參見例如WO98/52976、WO02/079232和WO00/3317，全部完全引入作為參考。
雖然可以鑒定預(yù)期能夠使免疫原性降低的MHC-結(jié)合抗原限制位中的突變，大部分氨基酸取代在功能上是不利的。結(jié)果，大部分用上述方法鑒定的免疫原性降低的序列將與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能不相容。為了使去除MHC抗原限制位成為一種降低免疫原性的可行方法，努力同時保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性是至關(guān)重要的。
仍然需要新的免疫原性下降的C1q SF成員蛋白。免疫原性下降的C1qSF成員變體可被用于治療大量C1q SF成員響應(yīng)的狀況。
發(fā)明概述按照上述目的，本發(fā)明提供新的C1q SF成員蛋白，與天然存在的C1q SF成員蛋白相比，其具有降低的免疫原性。在其它方面，本發(fā)明在于工程化或者設(shè)計用于治療用途的免疫原性較低的蛋白質(zhì)的方法，該蛋白質(zhì)具有治療用途所需的C1q SF成員活性。
本發(fā)明的一個方面是C1q SF成員變體，與親本C1q SF成員相比，其對一種或多種II型MHC等位基因的結(jié)合親和性下降，并且其顯著地保持天然的自然存在的C1q SF成員的活性。
在另一個方面，本發(fā)明提供編碼C1q SF成員蛋白變體的重組核酸、表達載體和宿主細胞。
在其它方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)C1q SF成員蛋白變體的方法，包括在適合表達C1q SF成員蛋白變體的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞。
在另一個方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含C1q SF成員蛋白變體或者本發(fā)明的核酸和藥學(xué)載體。
在另一個方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或者治療C1q SF成員響應(yīng)的異常的方法，包括給患者施用C1q SF成員蛋白變體或者本發(fā)明的核酸。
其它方面，本發(fā)明提供用于篩選II型MHC單體型潛在患者的方法，以鑒定極可能對野生型C1q SF成員或者C1q SF成員變體治療劑產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個體。
按照上述目的，本發(fā)明提供C1q SF成員變體蛋白，與野生型C1q SF成員蛋白相比，其包括具有至少一個氨基酸插入、刪除或取代的氨基酸序列。
附圖簡介

圖1顯示工程化免疫原性較低的C1q SF成員衍生物的方法。
圖2顯示使用IVV技術(shù)體外檢測C1q SF成員肽或蛋白質(zhì)的免疫原性的方法的圖示。
發(fā)明詳述“9-mer肽結(jié)構(gòu)(9-mer peptide frame)”和語法同等成分在此是指位于感興趣的蛋白質(zhì)中的9個氨基酸的線性序列。可以分析9-mer結(jié)構(gòu)結(jié)合一種或多種II型等位基因的傾向性。“等位基因”和語法同等成分在此是指基因的可替代形式。特別地，在II型MHC分子中，等位基因包括DRA、DRB1、DRB3/4/5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1分子的全部天然存在的序列變體?！懊小焙驼Z法上的相同詞匯在此是指在矩陣方法范圍內(nèi)，一種特定的肽被預(yù)期能夠結(jié)合特定的II型MHC等位基因。在優(yōu)選實施方案中，命中被定義為與隨機的肽序列具有結(jié)合分值最高約5％、3％或者1％的結(jié)合親和性的肽。在另一種實施方案中，命中被定義為具有超過某些域值的結(jié)合親和性的肽，例如被預(yù)測以至少100μM或10μM或1μM的親和性結(jié)合MHC等位基因的肽。“免疫原性”和語法上的同義詞在此是指蛋白質(zhì)引發(fā)免疫應(yīng)答的能力，包括但是不限于生成中和抗體和非中和抗體、形成免疫復(fù)合物、活化補體、活化肥大細胞、產(chǎn)生炎癥和過敏性反應(yīng)?！敖档偷拿庖咴浴焙驼Z法上的同義詞在此是指當(dāng)與野生型蛋白質(zhì)相比，活化免疫系統(tǒng)的能力下降。例如，如果與野生型蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)變體激發(fā)滴度較低的中和抗體或者非中和抗體或者在較少患者中激發(fā)中和抗體或者非中和抗體，則認為其具有“降低的免疫原性”。在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生中和抗體的可能性下降至少5％，下降至少50％或90％是特別優(yōu)選的。因此，如果野生型蛋白質(zhì)在10％患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，免疫原性降低的蛋白質(zhì)變體將在不多于9.5％的患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在少于5％或者少于1％的患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答是特別優(yōu)選的。如果與親本蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)變體與一種或多種MHC等位基因的結(jié)合下降，或者如果其在減少的部分患者中誘導(dǎo)T細胞活化，則認為該蛋白質(zhì)變體具有“降低的免疫原性”。在一個優(yōu)選實施方案中，T細胞活化的可能性下降至少5％，下降至少50％或者90％是特別優(yōu)選的?！熬仃嚪椒ā奔捌湔Z法上的同義詞在此是指使用矩陣來計算肽-MHC親和性的方法，該矩陣包含與特定的MHC等位基因相互作用的肽的各個位置上每個可能殘基的分值。通過對肽的各個位置上所觀察的氨基酸的矩陣值進行求和，可獲得特定的肽-MHC互作的結(jié)合分值?！癕HC-結(jié)合抗原限制位”和語法上的同義詞在此是指能夠以適當(dāng)?shù)挠H和性結(jié)合一種或多種II型MHC等位基因以形成MHC-肽-T細胞受體復(fù)合物并隨后使T細胞活化的肽。MHC-結(jié)合抗原限制位是線性的肽序列，該序列包括至少約9個殘基?！坝H本蛋白質(zhì)”用于此是指隨后被修飾以生成蛋白質(zhì)變體的蛋白質(zhì)。所述親本蛋白質(zhì)可以是野生型的或者天然存在的蛋白質(zhì)，或者變異的或者工程化形式的天然存在的蛋白質(zhì)?！坝H本蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)本身，包含該親本蛋白質(zhì)的組合物，或者編碼該親本蛋白質(zhì)的任何氨基酸序列。因此，“親本C1q SF成員蛋白”用于此是指被修飾來生成C1q SF成員蛋白變體的C1q SF成員蛋白?！盎颊摺痹诖耸侵溉撕推渌鼊游?，特別是哺乳動物和生物體。因此，該方法適用于人的治療和獸醫(yī)應(yīng)用。在優(yōu)選實施方案中，患者是哺乳動物，在最優(yōu)選實施方案中，患者是人?！暗鞍踪|(zhì)”在此是指至少兩個共價連接的氨基酸，其包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和肽。蛋白質(zhì)由天然存在的氨基酸和肽鍵或者合成的肽模擬結(jié)構(gòu)(peptidomimetic structure)制成，所述肽模擬結(jié)構(gòu)即，“類似物”如擬肽[參見Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(209367-71(1992))，這通常取決于合成方法。例如，同苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被認為可用于本發(fā)明目的?！?氨基酸”還包括氨基酸殘基，如脯氨酸和羥脯氨酸。D-和L-氨基酸都可以使用?！癈1q SF成員響應(yīng)的疾病或者狀況”和語法上的同義詞在此是指可以從用C1q SF成員處理中獲益的疾病、異常和狀況?？梢詮挠肅1qSF成員或者C1q SF成員的增強劑或抑制劑的處理中獲益的異常的例子包括但是不限于，與胰島素抗性相關(guān)的疾病如2型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受下降(IGT)、X綜合癥、脂肪營養(yǎng)不良疾病包括HIV相關(guān)的脂肪營養(yǎng)不良、厭食以及與葡萄糖和脂肪代謝調(diào)控相關(guān)的其它狀況、心血管疾病包括動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病，以及血管干涉后的血管狹窄(restenosis)。C1qSF成員是有益于促進肌肉生長、處理肌肉廢物和其它與肌肉相關(guān)的異常、預(yù)防和治療肝臟疾病以及多種與血管損傷相關(guān)的狀況，包括冠狀動脈成形術(shù)、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)和卒中?！疤幚怼痹诖耸侵赴ㄓ糜诩膊』虍惓５闹委熜蕴幚恚约邦A(yù)防性或抑制性措施。因此，例如，在患病之前成功施用C1qSF成員蛋白變體可能可以治療該疾病。作為另一個例子，在出現(xiàn)疾病的臨床癥狀后成功施用C1q SF成員蛋白變體以消除該疾病癥狀，包括對該疾病的“治療”。“處理”還包括在出現(xiàn)該疾病后施用C1q SF成員蛋白變體，以根除該疾病。在疾病發(fā)作后或者在已經(jīng)出現(xiàn)臨床癥狀后成功施用試劑，可能根除臨床癥狀以及可能緩解該疾病，進一步包括“治療”該疾病。“需要處理”的那些患者包括已經(jīng)患有疾病或異常的哺乳動物，以及那些趨向于患有該疾病或異常的那些個體，包括該疾病或異常將被預(yù)防的那些個體。“C1q SF成員變體核酸”和語法上的同義詞在此是指編碼C1q SF成員蛋白變體的核酸。由于遺傳密碼子的簡并性，通過不改變C1q SF成員變體的氨基酸序列的方式簡單地修飾該序列的一個或多個密碼子，可以制備極其多的核酸，這些核酸都編碼本發(fā)明的C1q SF成員蛋白?！癈1q SF成員蛋白變體”及其語法上的同義詞在此是指非天然存在的C1q SF成員蛋白，其與野生型或者親本C1q SF成員蛋白相差至少一個氨基酸的插入、刪除或者取代。C1q SF成員變體的特征在于預(yù)先確定的變異特性，一種使其不同于C1q SF成員蛋白序列的天然存在的等位基因變體或者種間變體的特征。C1q SF成員變體通常具有與天然存在的C1q SF成員相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活性或者已經(jīng)被特別地工程化以具有其它生物學(xué)特性。C1q SF成員蛋白變體可能在N末端、C末端或者內(nèi)部含有插入、刪除和/或取代。在優(yōu)選實施方案中，C1q SF成員蛋白變體具有至少1個區(qū)別于天然存在的C1q SF成員序列的殘基，有至少2個、3個、4個或5個不同殘基是更加優(yōu)選的。C1q SF成員蛋白變體可能具有進一步修飾，例如改變穩(wěn)定性或者可溶性或者使得能夠或者防止翻譯后修飾如PEG化或糖基化的突變。對C1q SF成員蛋白變體進行翻譯時修飾或者翻譯后修飾，包括但是不限于一條或多條側(cè)鏈或者末端合成衍生化、糖基化、PEG化、循環(huán)排列(circular permutation)、環(huán)化、與蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，以及添加肽標(biāo)簽或標(biāo)記?！耙吧突蛘遷t”或其語法上的同義詞在此是指存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列或者核苷酸序列，并且包括等位基因變體；也就是未故意修飾的氨基酸序列或者核苷酸序列。在優(yōu)選實施方案中，野生型的脂連蛋白序列為SEQ_ID NO1，而野生型CTRP1的序列為SEQ_ID NO2。
鑒定C1q SF成員中的MHC-結(jié)合抗原限制位通過所謂的抗原加工，從蛋白質(zhì)中獲得MHC-結(jié)合肽。首先，通過細胞內(nèi)吞或者吞噬作用，將蛋白質(zhì)運輸?shù)娇乖蔬f細胞(APC)中。然后多種蛋白質(zhì)水解酶將蛋白質(zhì)裂解為許多肽。然后將這些肽加載到II類MHC分子上，生成的肽-MHC復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細胞表面。相對穩(wěn)定的肽-MHC復(fù)合物被存在于幼稚型T細胞表面上的T細胞受體識別。該識別事件是起始免疫應(yīng)答所必需的。因此，阻斷形成穩(wěn)定的肽-MHC復(fù)合物是一種防止不期望的免疫應(yīng)答的有效方法。
決定肽-MHC互作親和性的因素已經(jīng)用生化方法和結(jié)構(gòu)方法表征。肽以延伸構(gòu)象結(jié)合的方式結(jié)合II型MHC分子中的溝槽。雖然結(jié)合II型MHC分子的肽通常長約13-18個殘基，而9個殘基區(qū)域負責(zé)大部分的結(jié)合親和性和特異性。肽結(jié)合溝槽被細分為“口袋”，一般命名為P1到P9，其中各個口袋包含與該肽中的特定殘基相互作用的MHC殘基組。大量多態(tài)殘基朝向MHC分子的肽-結(jié)合溝槽。鑒定位于各MHC分子的各個肽-結(jié)合口袋內(nèi)層的殘基，可確定該肽結(jié)合特異性。相反，肽的序列決定了其對各個MHC等位基因的親和性。
數(shù)種用于鑒定蛋白質(zhì)序列中的MHC-結(jié)合抗原限制位的方法在本領(lǐng)域是已知的，可用于鑒定C1q SF成員中的抗原限制位?？捎眯蛄行畔⒋_定特定的肽-MHC互作的結(jié)合分值(參見例如Mallios，Bioinformatics 15432-439(1999)；Mallios，Bioinformatics 17942-948(2001)；Sturniolo等人，Nature Biotech.17555-561(1999)，全部完全引入作為參考)?？赡懿捎没诮Y(jié)構(gòu)的方法，在該方法中，特定的肽按照計算被置于特定MHC分子的肽-結(jié)合溝槽中，并且確定互作能量(例如，參見WO98/59244和WO02/069232，全部完全引入作為參考)。這種方法被稱作為“穿引”法(threading)?？商娲?，可以采用純粹的實驗方法；例如，對一組來源于感興趣的蛋白質(zhì)的重疊肽進行實驗，測試其誘導(dǎo)T細胞活化和/或免疫應(yīng)答的其它方面的能力(參見例如WO02/77187，完全引入作為參考)。
在一個優(yōu)選實施方案中，用矩陣方法計算C1q SF成員序列中的各個9個殘基框架的MHC-結(jié)合傾向性分值(參見Sturniolo等人，同上文；Marshall等人，J.Immunol.1545927-5933(1995)，以及Hammer等人，J.Exp.Med.1802353-2358(1994)，全部完全引入作為參考)。也可能考慮僅一個亞組的這些殘基的分值，或者考慮鑒定位于感興趣的9個殘基框架之前和之后的肽殘基。該矩陣包括特定氨基酸與不同的人II型MHC分子中的肽結(jié)合口袋互作的結(jié)合分值。在最優(yōu)選實施方案中，矩陣中的分值從實驗性的肽結(jié)合研究中獲得。在可替代的優(yōu)選實施方案中，從實驗定性的等位基因到其它具有相同或者相似的位于口袋內(nèi)層的殘基的其它等位基因，推定得到特定氨基酸結(jié)合到特定口袋上的分值。通過推定產(chǎn)生的矩陣被稱作為“虛擬矩陣(virtual matrix)”。
在優(yōu)選實施方案中，用矩陣方法來計算各種感興趣的肽結(jié)合各種感興趣的等位基因的分值。然后可用數(shù)種方法確定特定的肽是否將以顯著的親和性結(jié)合特定的MHC等位基因。在一個實施方案中，將感興趣的肽的結(jié)合分值與一大組參比肽的結(jié)合傾向性分值比較。與參比肽相比具有大結(jié)合傾向性分值的肽可能結(jié)合MHC，并且被劃分為“命中者(hits)”。例如，如果結(jié)合傾向性分值處于對那個等位基因的可能結(jié)合分值的最高的1％中，其被評分為在1％的域值時的“命中”。計算各種肽在一種或多種域值時的命中總數(shù)。在某些情形下，結(jié)合分值可能直接對應(yīng)于預(yù)測的結(jié)合親和性。然后，命中者被定義為被預(yù)測以至少100μM或者10μM或者1μM的親和力結(jié)合的肽。
在優(yōu)選的實施方案中，使用范圍在0.5％到10％的一種或多種域值計算蛋白質(zhì)中的各個9-mer結(jié)構(gòu)的命中數(shù)量。在特別優(yōu)選的實施方案中，使用1％、3％和5％的域值計算命中數(shù)量。
在優(yōu)選實施方案中，MHC-結(jié)合抗原限制位被確定為結(jié)合數(shù)個II類MHC等位基因的9-mer結(jié)構(gòu)。在特別優(yōu)選的實施方案中，MHC-結(jié)合抗原限制位被預(yù)測在5％域值時結(jié)合至少10個等位基因，和/或在1％域值時結(jié)合至少5個等位基因。這種9-mer結(jié)構(gòu)尤其可能在人群的許多成員中引發(fā)免疫應(yīng)答。
在優(yōu)選實施方案中，MHC-結(jié)合抗原限制位被預(yù)測結(jié)合在至少0.01-10％人群中存在的MHC等位基因?？商娲?，為了處理與特定II型MHC等位基因相關(guān)的狀況，MHC-結(jié)合抗原限制位被預(yù)測結(jié)合在至少0.01-10％相關(guān)患者群體中存在的MHC等位基因。
一些小組已經(jīng)獲得了關(guān)于在不同人種和種族中存在的不同MHC等位基因的數(shù)據(jù)，例如National Marrow Donor Program(NMDP)；例如參見Mignot等人，Am.J.Hum.Genet.68686-699(2001)，Southwood等人，J.Immunol.1603363-3373(1998)，Hurley等人，Bone Marrow Transplantation 25136-137(2000)，Sintasath Hum.Immunol.601001(1999)，Collins等人，TissueAntigens 5548(2000)，Tang等人，Hum.Immunol.63221(2002)，Chen等人，Hum.Immunol.63665(2002)，Tang等人，Hum.Immunol.61820(2000)，Gans等人，Tissue Antigens 59364-369，和Baldassarre等人，TissueAntigens 61249-252(2003)，全部完全引入作為參考。
在優(yōu)選實施方案中，預(yù)測包含十分普遍的MHC等位基因的MHC異二聚體的MHC結(jié)合抗原限制位。在至少10％的美國人群中存在的II型MHC等位基因包括但是不限于DPA1*0103，DPA1*0201，DPB1*0201，DPB1*0401，DPB1*0402，DQA1*0101，DQA1*0102，DQA1*0201，DQA1*0501，DQB1*0201，DQB1*0202，DQB1*0301，DQB1*0302，DQB1*0501，DQB1*0602，DRA*0101，DRB1*0701，DRB1*1501，DRB1*0301，DRB1*0101，DRB1*1101，DRB1*1301，DRB3*0101，DRB3*0202，DRB4*0101，DRB4*0103，和DRB5*0101.
在優(yōu)選實施方案中，預(yù)測包含適度普遍的MHC等位基因的MHC異二聚體的MHC結(jié)合抗原限制位。在1％到10％的美國人群中存在的II型MHC等位基因包括但是不限于DPA1*0104，DPA1*0302，DPA1*0301，DPB1*0101，DPB1*0202，DPB1*0301，DPB1*0501，DPB1*0601，DPB1*0901，DPB1*1001，DPB1*1101，DPB1*1301，DPB1*1401，DPB1*1501，DPB1*1701，DPB1*1901，DPB1*2001，DQA1*0103，DQA1*0104，DQA1*0301，DQA1*0302，DQA1*0401，DQB1*0303，DQB1*0402，DQB1*0502，DQB1*0503，DQB1*0601，DQB1*0603，DRB1*1302，DRB1*0404，DRB1*0801，DRB1*0102，DRB1*1401，DRB1*1104，DRB1*1201，DRB1*1503，DRB1*0901，DRB1*1601，DRB1*0407，DRB1*1001，DRB1*1303，DRB1*0103，DRB1*1502，DRB1*0302，DRB1*0405，DRB1*0402，DRB1*1102，DRB1*0803，DRB1*0408，DRB1*1602，DRB1*0403，DRB3*0301，DRB5*0102，和DRB5*0202.
還預(yù)測包含較不普遍的等位基因的MHC異二聚體的MHC-結(jié)合抗原限制位。例如，可以從IMGT/HLA序列數(shù)據(jù)庫中獲得在人和其它物種中存在的MHC等位基因的信息。
在特別優(yōu)選的實施方案中，確定各種肽的免疫原性分值，其中所述分值取決于具有一種或多種在多種域值時被命中的MHC等位基因的人群比例。例如，可以使用方程Iscore＝N(W1P1+W3P3+W5P5)，其中，P1是在1％時命中的人群比例，P3是在3％時命中的人群比例，P5是在5％時命中的人群比例，各個W是加權(quán)因子，而N是校正因子。在優(yōu)選實施方案中，W1＝10，W3＝5，W5＝2，選擇N使得可能分值的范圍在1到100。在該實施方案中，Iscore大于或者等于10的抗原限制位是優(yōu)選的，Iscore大于或者等于25的抗原限制位是特別優(yōu)選的。
在其它優(yōu)選實施方案中，MHC結(jié)合抗原限制位被確定為位于“嵌套的(nested)”抗原限制位中的9-mer結(jié)構(gòu)，或者重疊的9個堿基結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)被預(yù)測會結(jié)合極其多個等位基因。這種序列尤其可能引發(fā)免疫應(yīng)答。
優(yōu)選的MHC結(jié)合抗原限制位是那些被預(yù)測在3％域值時結(jié)合在至少5％的人群中存在的MHC等位基因的抗原限制位。脂連蛋白中的優(yōu)選MHC結(jié)合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1殘基109-117；抗原限制位2殘基111-119；抗原限制位3殘基122-130；抗原限制位6殘基157-165；抗原限制位8殘基160-168；抗原限制位9殘基166-174；抗原限制位11殘基175-183；抗原限制位12殘基175-184；抗原限制位13殘基202-210。
特別優(yōu)選的MHC結(jié)合抗原限制位是那些被預(yù)測在1％的域值時結(jié)合在至少10％的人群中存在的MHC等位基因的抗原限制位。脂連蛋白中的特別優(yōu)選MHC結(jié)合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1殘基109-117；抗原限制位2殘基111-119；抗原限制位3殘基122-130；抗原限制位9殘基166-174。
CTRP1中的優(yōu)選的MHC-結(jié)合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1殘基150-158；抗原限制位3殘基172-180；抗原限制位5殘基185-193；抗原限制位11殘基202-210；抗原限制位13殘基209-217；抗原限制位14殘基218-226；抗原限制位16殘基230-238；抗原限制位17殘基247-255；抗原限制位19殘基267-275。
CTRP1中的特別優(yōu)選的MHC-結(jié)合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位3殘基172-180；抗原限制位14殘基218-226；抗原限制位16殘基230-238；抗原限制位17殘基247-255。
MHC-結(jié)合抗原限制位的確認在優(yōu)選實施方案中，通過測量包含各個被預(yù)測的抗原限制位的肽引發(fā)對該肽的免疫應(yīng)答的程度，實驗證實上面預(yù)期MHC-結(jié)合抗原限制位的免疫原性。然而，可能從抗原限制位預(yù)測進行到去除抗原限制位，而不需要證實抗原限制位的中間步驟。
數(shù)種在下面更加詳細討論的方法可被用于實驗性證實抗原限制位。例如，來自相匹配的供體的數(shù)組幼稚型T細胞和抗原呈遞細胞用含有感興趣的抗原限制位的肽刺激，可監(jiān)控T細胞活化。還可能首先用感興趣的完整蛋白刺激T細胞，然后再用來源于完整蛋白的肽刺激。如果可以從已經(jīng)對脂連蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的患者中獲得血清，可能檢測對特定表位應(yīng)答的成熟T細胞。在優(yōu)選實施方案中，采用Elispot分析，監(jiān)控由被激活的T細胞生成干擾素λ或者IL-5，還可能使用T細胞活化或者增殖的其它指示劑，例如含氚的胸苷摻入或者生成其它細胞因子。
患者基因型的分析和篩選HLA基因型是對特定自體免疫性疾病(參見例如NepomClin.Immunol.Immunopathol.67S50-S55(1993)，完全引入作為參考)和感染(參見例如Singh等人，Emerg.Infect.Dis.341-49(1997)，完全引入作為參考)的易感性的主要決定因素。此外，存在于個體中的MHC等位基因組會影響某些疫苗的功效(參見例如Cailat-Zucman等人，KidneyInt.531626-1630(1998)和Poland等人，Vaccine 20430-438(2001))，全部完全引入作為參考)。HLA基因型還賦予個體對脂連蛋白治療劑產(chǎn)生不期望的免疫應(yīng)答的易感性。
在優(yōu)選實施方案中，確定與引發(fā)對脂連蛋白的免疫應(yīng)答的易感性升高或降低相關(guān)的II型MHC等位基因。例如，檢測用脂連蛋白治療劑處理的患者中是否存在抗脂連蛋白的抗體，并對II型MHC進行基因分型。可替代地，使用來源于大量被基因分型的供體的細胞，進行T細胞活化分析，如上面描述的那些分析。賦予對脂連蛋白免疫原性的易感性的等位基因被定義為是與那些不引發(fā)免疫應(yīng)答的個體相比，更普遍存在于那些引發(fā)免疫應(yīng)答的個體中的等位基因。類似地，賦予對脂連蛋白免疫原性的抗性的等位基因被定義為與那些引發(fā)免疫應(yīng)答的個體相比，極不常見于那些不引發(fā)免疫應(yīng)答的個體中的那些等位基因。還可能采用純粹的計算技術(shù)來鑒定可能識別脂連蛋白治療劑的等位基因。
在實施方案中，用基因型相關(guān)數(shù)據(jù)來鑒定極其可能或者特別不可能對脂連蛋白治療劑產(chǎn)生免疫應(yīng)答的患者。
活性的、免疫原性較低的變體的設(shè)計在優(yōu)選實施方案中，上面確定的MHC-結(jié)合抗原限制位用可替代的氨基酸序列替換，生成免疫原性降低或者消除的活性脂連蛋白變體?？商娲?，修飾MHC-結(jié)合抗原限制位來導(dǎo)入一個或者多個在蛋白質(zhì)加工過程中容易被裂解的位點。如果抗原限制位在結(jié)合MHC分子之前被裂解，其將不能引發(fā)免疫應(yīng)答。有數(shù)種可能策略用于整合鑒定免疫原性較低的序列的方法和鑒定結(jié)構(gòu)和活性序列的方法，包括但是不限于下面提供的那些方法。
在實施方案中，針對一個或多個上面鑒定的9-mer抗原限制位，分析一種或多種可能的可替代9-mer序列的免疫原性以及結(jié)構(gòu)的和功能的相容性。然后，將優(yōu)選的可替代9-mer序列定義為那些具有低的預(yù)測的免疫原性和極可能保持構(gòu)造和活性的序列?？赡軆H考慮最可能包括被保持構(gòu)造的(structured)、活性的、低免疫原性的變體的9-mer序列亞組。例如，不必考慮包含高度不保守的突變或者提高可預(yù)測的免疫原性的突變的序列。
在優(yōu)選實施方案中，與野生型抗原限制位相比，各個抗原限制位的免疫原性較低的變體被預(yù)測結(jié)合在較小部分的人群中存在的MHC等位基因。在特別優(yōu)選的實施方案中，各個抗原限制位的免疫原性較低的變體被預(yù)測結(jié)合在不多于5％的人群中存在的MHC等位基因，結(jié)合在不多于1％或0.1％的人群中存在的MHC等位基因是最優(yōu)選的。
取代矩陣在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，取代矩陣或者其它基于知識的評分方法被用于鑒定可能保留野生型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的其它序列。這種評分方法可用于量化特定取代或者一組取代的保守程度。在大多數(shù)情形下，保守突變不會顯著地破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能(參見例如，Bowie等人，Science 2471306-1310(1990)，Bowie和Sauer Proc.Nat.Acad.Sci.USA 862152-2156(1989)，以及Reidhaar-Olson和Sauer Proteins 7306-316(1990)，全部完全引入作為參考)。然而，非保守性突變會動搖蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并降低活性(參見例如，Lim等人，Biochem.314324-4333(1992)，完全引入作為參考)。包括但是不限于BLOSUM62的取代矩陣定量測量序列和靶結(jié)構(gòu)之間的相容性，可用于預(yù)測非破壞性的取代突變(參見Topham等人，Prot.Eng.107-21(1997)，完全引入作為參考)。使用取代矩陣來設(shè)計性能改進的肽已經(jīng)被公開；參見Adenot等人，J.Mol.Graph.Model.17292-309(1999)，完全引入作為參考。
取代矩陣包括但是不限于，BLOSUM矩陣(Henikoff和Henikoff，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8910917(1992)，完全引入作為參考，PAM矩陣，Dayhoff矩陣等等。對取代矩陣的綜述，參見例如HenikoffCurr.Opin.Struct.Biol.6353-360(1996)，完全引入作為參考。構(gòu)建基于感興趣的特定蛋白質(zhì)及其類似物的比對的取代矩陣也是可能的；參見例如Henikoff知Henikoff Comput.Appl.Biosci.12135-143(1996)，完全引入作為參考。
在優(yōu)選實施方案中，各個被考慮的取代突變的BLOSUM 62分值為零或者更高。按照該衡量標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選的取代包括，但是不限于

此外，當(dāng)與野生型的9個殘基的抗原限制位的BLOSUM 62分值相比，9個殘基的MHC-結(jié)合抗原限制位的替代序列的BLOSUM 62總分優(yōu)選僅適度地下降。在優(yōu)選實施方案中，9-mer變體的分值至少為野生型分值的50％，至少67％、75％、80％或90％是特別優(yōu)選的。
可替代地，選擇替代序列，使得BLOSUM分值的絕對下降最小化；例如各個9-mer的分值優(yōu)選下降小于20，分值下降小于約10或者約5是特別優(yōu)選的。選擇精確值來生成替代序列庫，該序列庫容易進行實驗處理，并且充分多樣化以包含大量活性的、穩(wěn)定的、免疫原性較低的變體。
在優(yōu)選實施方案中，在充分暴露于溶劑的位置上優(yōu)先導(dǎo)入取代突變。如本領(lǐng)域所知，暴露于溶劑的位置通常比位于蛋白質(zhì)核心中的位置更耐受突變。
在優(yōu)選實施方案中，在非高度保守的位置上優(yōu)先導(dǎo)入取代突變。如本領(lǐng)域所知，對于蛋白質(zhì)功能、穩(wěn)定性或者結(jié)構(gòu)來說，在蛋白質(zhì)家族成員中高度保守的位置通常是重要的，而通常修飾非高度保守的位置而不顯著地影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的或功能的特性。
丙氨酸取代在可替代的實施方案中，進行一個或多個丙氨酸取代，無論丙氨酸取代是保守的或者非保守的。如本領(lǐng)域所知，插入充足的丙氨酸取代來破壞分子間的互作。
在優(yōu)選實施方案中，選擇9-mer變體，使得已經(jīng)被或者可以被鑒定為用于維持脂連蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的特別關(guān)鍵的殘基保持其野生型的特性。在可替代的實施方案中，生成不保持野生型活性的脂連蛋白變體可能是期望的。在這種情形下，已經(jīng)被鑒定為對功能來說是至關(guān)重要的殘基被特別地靶向來進行修飾。
與人的糖尿病和/或脂連蛋白減少癥(hypoadiponectinemia)相關(guān)的脂連蛋白殘基包括G84、G90、R92、Y111、R112和I164；C36(小鼠中的C39)參與二硫鍵，并且一般認為其對于六聚體和大分子量(HMW)的多聚體的組裝來說來說是關(guān)鍵的；殘基G84和G90也參與了HMW多聚體的形成；R112、I164和Y159可能影響三聚體形成，這些位置上的突變會導(dǎo)致來自細胞的分泌減少。已經(jīng)報道，六聚體和HMW同種型能夠激活NF-κB路徑，而三聚體不具有該性能；寡聚狀態(tài)還影響激活A(yù)MP活化的蛋白激酶的能力(參見Waki等人，J.Biol.Chem.27840352-40363(2003)，Tsao等人，J.Biol.Chem.27850810-50817(2003)，以及Kishida等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.306286-292(2003)完全引入作為參考)。球狀結(jié)構(gòu)域而不是全長的六聚體脂連蛋白增加小鼠肌肉中的脂肪酸氧化并且導(dǎo)致體重下降(參見Tomas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9916309-16313(2002)，F(xiàn)ruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)完全引入作為參考)，已經(jīng)報道，較高層次的寡聚形式在減少葡萄糖輸出的活性較低(參見Pajvani等人，J.Biol.Chem.2789073-9085(2003)完全引入作為參考)。HMW形式的脂連蛋白與抑制內(nèi)皮細胞凋亡和賦予其血管保護活性相關(guān)(參見Kobayashi等人，Circ.Res.94e27-31(2004)完全引入作為參考)。膠原結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸(小鼠殘基68、71、80和104)的羥基化和糖基化與哺乳動物細胞中的全長脂連蛋白的胰島素致敏化作用相關(guān)(參見Wang等人，J.Biol.Chem.27719521-19529(2002)完全引入作為參考)。
蛋白質(zhì)設(shè)計方法共同使用蛋白質(zhì)設(shè)計方法和MHC抗原限制位鑒定方法來鑒定穩(wěn)定的、活性的和免疫原性最小化的蛋白質(zhì)序列(參見WO03/006154，完全引入作為參考)。由于大部分用其它技術(shù)鑒定的免疫原性降低的序列不能夠保持足夠的活性和穩(wěn)定性以用作治療劑，上述方法的組合提供了顯著優(yōu)于降低免疫原性的現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點。
蛋白質(zhì)設(shè)計方法可以鑒定非保守的或者不可預(yù)期的突變，該突變賦予期望的功能特性和降低的免疫原性，還鑒定了保守突變。非保守突變在此被定義為不包括在上述表1中的所有取代；非保守突變還包括意外地存在于特定結(jié)構(gòu)中的突變，例如蛋白質(zhì)表面上的疏水殘基的突變和蛋白質(zhì)核心中的極性殘基的突變。
此外，蛋白質(zhì)設(shè)計方法可以鑒定補償性突變。例如，如果被導(dǎo)入來降低免疫原性的特定的第一個突變還降低穩(wěn)定性或活性，那么蛋白質(zhì)設(shè)計方法可用于尋找一個或多個在使免疫原性降低的同時還起恢復(fù)穩(wěn)定性和活性的其它突變。類似地，蛋白質(zhì)設(shè)計方法可以鑒定使免疫原性降低而同時保持活性和穩(wěn)定性的兩個或多個突變的組，即使其中的一個或多個突變孤立地不能賦予期望的特性。
大量多種用于生成和評價序列的方法是已知的。這些方法包括但是不限于，序型分析(sequence profiling)(Bowie and Eisenberg，Science 253(5016)164-70，(1991))，殘基配對潛能(Jones，Protein Science 3567-574，(1994))，以及旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫選擇(Dahiyat和Mayo，Protein Sci 5(5)895-903(1996)；Dahiyat和Mayo，Science 278(5335)82-7(1997)；Desjarlais和Handel，Protein Science 42006-2018(1995)；Harbury等人，PNAS USA92(18)8408-8412(1995)；Kono等人，ProteinsStructure，F(xiàn)unction andGenetics 19244-255(1994)；Hellinga和Richards，PNAS USA 915803-5807(1994))全部完全引入作為參考。
蛋白質(zhì)設(shè)計自動化_(PDA_)技術(shù)在特別優(yōu)選的實施方案中，使用蛋白質(zhì)設(shè)計自動化(PDA_)技術(shù)，實現(xiàn)改進的脂連蛋白變體的合理設(shè)計(參見美國專利US6,188,965；US6,269,312；US6,403,312；WO98/47089和USSN09/058,459、09/127,926、60/104,612、60/158,700、09/419,351、60/181,630、60/186,904、09/419,351、09/782,004和09/927,790、60/347,772和10/218,102；以及PCT/US01/218,102和U.S.S.N.10/218,102、U.S.S.N.60/345,805；U.S.S.N.60/373,453和U.S.S.N.60/374,035，全部完全引入作為參考)。
PDA_技術(shù)結(jié)合了生成大量序列多樣性的計算設(shè)計算法結(jié)合實驗性的高通量篩選來發(fā)現(xiàn)具有改進特性的蛋白質(zhì)。計算部分使用原子水平的評分函數(shù)(function)，側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體取樣以及高級優(yōu)化方法，以精確地捕獲蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。該計算以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)開始，采用優(yōu)化蛋白質(zhì)的一種或多種特性的策略。然后，PDA_技術(shù)探究包括在被靶向用于設(shè)計的位置上的所有相關(guān)氨基酸(如果需要，包括非天然的氨基酸)的序列空間。這通過對允許的氨基酸的構(gòu)象狀態(tài)進行取樣并用參數(shù)化的和實驗確認的函數(shù)進行評分來實現(xiàn)，上述函數(shù)描述控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理力和化學(xué)力。然后用強大的組合搜索算法來搜索最初的序列空間，其可能構(gòu)成1050條序列或更多，并迅速返回易處理數(shù)量的預(yù)期滿足設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)的序列。有用模式的技術(shù)從組合序列設(shè)計到區(qū)分優(yōu)先的選擇優(yōu)化單個位點取代。
PDA_技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于許多系統(tǒng)中，包括重要的藥學(xué)蛋白和工業(yè)蛋白，并且在蛋白質(zhì)優(yōu)化中具有被證實的成功記錄。
PDA_利用三維結(jié)構(gòu)信息。在最優(yōu)選實施方案中，用X射線結(jié)晶學(xué)或者NMR技術(shù)確定脂連蛋白的結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。小鼠脂連蛋白的球狀三聚體(氨基酸110-247)的晶體結(jié)構(gòu)以2.1_的分辨率分辨(參見Shapiro和Scherer Curr.Biol.8335-338(1998)完全引入作為參考)；人脂連蛋白的結(jié)構(gòu)用本領(lǐng)域已知的同源建模方法來衍生化。
在優(yōu)選實施方案中，矩陣方法計算結(jié)果用于鑒定抗原限制位中的哪個9個氨基酸位置對各個特定的等位基因“命中”的全部結(jié)合傾向性的貢獻最大。該分析考慮哪個位置(P1-P9)被這樣的氨基酸占據(jù)，該氨基酸始終對評分中域值以上的等位基因的MHC結(jié)合親和性具有顯著貢獻。然后，矩陣方法計算用于鑒定所述位置上的氨基酸取代，該取代將降低或者消除預(yù)測的免疫原性，而PDA_技術(shù)用于確定哪種具有降低的或被消除的免疫原性的替代序列與維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相容。
在可替代的優(yōu)選實施方案中，首先由本領(lǐng)域技術(shù)人員分析各個抗原限制位中的殘基，鑒定可能與維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相容的替代殘基。然后，計算篩選生成的序列組，鑒定免疫原性最小的變體。最后，在PDA_技術(shù)蛋白質(zhì)設(shè)計計算中，更徹底地分析各條免疫原性較小的序列，鑒定保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能并且降低免疫原性的蛋白質(zhì)序列。
在可替代的優(yōu)選實施方案中，分析對抗原限制位的親和性具有重要貢獻的各個殘基，鑒定氨基酸取代亞組，其可能與保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相容?？梢詳?shù)種方式實施該步驟，包括PDA_計算或者由本領(lǐng)域技術(shù)人員觀察。生成含有所有可能的氨基酸組合的序列，這些氨基酸在各個位置上被選擇考慮?？梢杂镁仃嚪椒ㄓ嬎銇泶_定各種序列的免疫原性。對結(jié)果進行分析，鑒定免疫原性顯著下降的序列?？梢赃M行其它的PDA_計算來確定哪種免疫原性最小的序列與保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相容。
在可替代的優(yōu)選實施方案中，將來自肽結(jié)合傾向矩陣的偽能級(pseudo-energy terms)結(jié)合到PDA_技術(shù)計算中。這樣，可能在單個計算步驟中選擇活性的并且免疫原性較低的序列。
組合的免疫原性降低策略在優(yōu)選實施方案中，用多種方法生成具有期望的功能特性和免疫學(xué)特性的蛋白變體。例如，將取代矩陣與PDA_技術(shù)計算聯(lián)合。用于降低免疫原性的策略包括但是不限于，那些在2004年12月3日申請的USSN11/004,590中公開的那些，完全引入作為參考。
在優(yōu)選實施方案中，對一種或多種II型MHC等位基因的結(jié)合親和性降低的蛋白質(zhì)變體被工程化，以提高可溶性。由于蛋白質(zhì)聚合會引起不期望的免疫應(yīng)答，因此，提高蛋白質(zhì)的溶解性可以降低免疫原性。
在其它優(yōu)選實施方案中，對一種或多種II型MHC等位基因的結(jié)合親和性降低的蛋白質(zhì)變體進一步用PEG或者另一種分子衍生化來修飾。如本領(lǐng)域所知，PEG會從空間上干擾抗體結(jié)合或者改善蛋白質(zhì)溶解性，從而降低免疫原性。在特別優(yōu)選的實施方案，采用理性PEG化方法，2004年9月30日申請的USSN 10/956,352，完全引入作為參考。在優(yōu)選實施方案中，用PDA_技術(shù)和矩陣方法計算，從感興趣的蛋白質(zhì)中去除多個MHC-結(jié)合抗原限制位。
生成變體用大量本領(lǐng)域知曉的方法制備本發(fā)明的脂連蛋白變體以及編碼其的核酸。
在優(yōu)選實施方案中，通過總基因合成，或者通過定點突變編碼親本脂連蛋白的核酸，制備編碼脂連蛋白變體的核酸。包括模板指導(dǎo)的連接、循環(huán)PCR、盒式誘變、定點誘變或者其它技術(shù)的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且可被使用(參見例如Strizhov等人，PNAS 9315012-15017(1996)，Prodromou和Perl，Prot.Eng.5827-829(1992)，Jayaraman和Puccini，Biotechniques 12392-398(1992)，以及Chalmers等人，Biotechniques 30249-252(2001)，全部完全引入作為參考)。
在優(yōu)選實施方案中，將脂連蛋白變體克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，并且在大腸桿菌中表達(參見McDonald，J.R.，Ko，C.，Mismer，D.，Smith，D.J.和Collins，F(xiàn).Biochim.Biophys.Acta 109070-80(1991)，完全引入作為參考)。在可替代的優(yōu)選實施方案中，在哺乳動物細胞、酵母細胞、桿狀病毒或者在體外表達系統(tǒng)中表達脂連蛋白。大量表達系統(tǒng)以及用于其中的方法在本領(lǐng)域是已知的(參見Current Protocols in Molecular Biology，Wiley &Sons，and Molecular Cloning-A Laboratory Manual-第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(2001)，完全引入作為參考)。對密碼子、合適的表達載體和合適的宿主細胞的選擇將取決于大量因素，并且容易按需要優(yōu)化。
在優(yōu)選實施方案中，在表達后純化或者分離脂連蛋白變體。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括電泳、分子的、免疫學(xué)的和層析技術(shù)，包括離子交換層析、疏水層析、親和層析和反向HPLC層析，以及層析聚焦。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的抗重組蛋白的抗體柱，純化脂連蛋白變體。超濾和雙過濾技術(shù)結(jié)合蛋白濃縮也是有用的。對合適的純化技術(shù)的一般指導(dǎo)參見Scopes，R.，ProteinPurification，Springer-Verlag，紐約，第3版(1994)，完全引入作為參考。所需的純化程度將隨著期望用途而改變，有些情形下必需是不純化的。
已經(jīng)公開了在細菌中表達并純化脂連蛋白的操作(參見Ouchi等人，Circulation 1002473-2476(1999)，F(xiàn)ruebis等人，Proc Natl Acad Sci USA982005-2010(2001)，F(xiàn)ruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)，Yamauchi等人，Nat Med 7941-946(2001)，Yamauchi等人，Nat.Med.7941-946(2001)，Hu等人，Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu WuLi Xue Bao(上海)351023-1028(2003)，全部完全引入作為參考)，以及哺乳動物表達系統(tǒng)(參見Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)，Tsao等人，J.Biol.Chem.27729359-29362(2002)，全部完全引入作為參考)。
分析變體活性用大量方法中的任何一種檢測本發(fā)明的脂連蛋白變體的活性，包括但，是不限于本文描述的那些。用酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)測量脂連蛋白濃度(參見例如Arita等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.25779-83(1999)完全引入作為參考)。分析與動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的過程的體外方法包括單核細胞附著到內(nèi)皮上、髓樣分化、巨噬細胞因子生成和吞噬作用(Ouchi等人，Circulation 1002473-2476(1999)完全引入作為參考)，脂肪在培養(yǎng)的巨噬細胞中的沉積Ouchi等人，Circulation 1031057-1063(2001)完全引入作為參考)，人大動脈平滑肌細胞增殖和遷移(參見Arita等人，Circulation 1052893-2898(2002)，Waki等人，J.Biol.Chem.27840352-40363(2003)完全引入作為參考)。體外測量胰島素敏感性的方法包括分析胰島素介導(dǎo)的對原代肝細胞中產(chǎn)生葡萄糖的抑制(參見Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)完全引入作為參考)。已經(jīng)使用各種小鼠模型，包括大量攝取脂肪/蔗糖飲食的野生型小鼠、ob/ob(肥胖糖尿病)、NOD(非肥胖糖尿病)或者鏈脲霉素處理的小鼠(參見Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)，F(xiàn)ruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)，Yamauchi等人，Nat.Med.7941-946(2001)，全部完全引入作為參考)，進行胰島素敏感性和脂肪代謝的體外分析；測量項目包括體重下降、血漿葡萄糖、游離脂肪酸和甘油三酯水平，以及肝臟和肌肉中的甘油三酯含量。
確定變體的免疫原性在優(yōu)選實施方案中，實驗確定脂連蛋白變體的免疫原性，證實該變體相對于親本蛋白，具有下降的或者被消除的免疫原性。
在優(yōu)選實施方案中，用離體T細胞活化分析來實驗測定免疫原性。在這種方法中，來自匹配供體的抗原呈遞細胞和幼稚T細胞用肽或者完整的感興趣蛋白攻擊一次或多次。然后，用大量方法檢測T細胞活化，例如，通過監(jiān)控細胞因子的生成或者測量含氚胸苷的攝取。在最優(yōu)選的實施方案中，用Elispot分析監(jiān)控干擾素γ生成(參見Schmittel等人，J.Immunol.Meth.，2417-24(2000)，完全引入作為參考)。其它的合適T細胞分析包括公開在Meidenbauer等人，Prostate 43，88-100(2000)；Schultes，B.C和Whiteside，T.L.，J.Immunol.Methods 279，1-15(2003)；以及Stickler等人，J.Immunotherapy，23，654-660(2000)中的那些方法，全部完全引入作為參考。
在優(yōu)選實施方案中，用于上述T細胞活化分析中的PBMC供體將包含通常存在于需要治療脂連蛋白響應(yīng)的異常的患者中的II型MHC等位基因。例如，對于大多數(shù)疾病和異常來說，期望檢測包含在人群中普遍存在的全部等位基因的供體。然而，對于與特定MHC等位基因相關(guān)的疾病或異常來說，篩選賦予對脂連蛋白應(yīng)答異常的易感性的等位基因是更加合適的。
在優(yōu)選實施方案中，將PBMC供體或者對野生型脂連蛋白或者脂連蛋白變體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的患者的MHC單體型與未產(chǎn)生應(yīng)答的患者的單體型比較。用該數(shù)據(jù)指導(dǎo)臨床前的和臨床的研究，以及輔助鑒定極可能對脂連蛋白治療劑有利地或者不利地應(yīng)答的患者。
在可替代的優(yōu)選實施方案中，在轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)中測量免疫原性。例如，可以使用完全或者部分表達人II型MHC分子的小鼠。
在其它實施方案中，通過將脂連蛋白變體施用給一種或多種動物，包括嚙齒類和靈長類，并監(jiān)控抗體形成，來檢測免疫原性。由于非人靈長類中的MHC分子的序列以及肽結(jié)合特異性與人的序列以及肽結(jié)合特異性十分相似，具有定義的MHC單體型的非人靈長類是特別有用的。類似地，使用表達人MHC肽-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳工程化小鼠模型(參見例如Sonderstrup等人，Immunol.Rev.172335-343(1999)以及Forsthuber等人，J.Immunol.167119-125(2001)，全部完全引入作為參考)。
制劑和施用給患者一旦被制備，本發(fā)明的C1q SF成員蛋白變體和核酸可用于許多應(yīng)用中。在優(yōu)選實施方案中，將C1q SF成員蛋白變體施用給患者，治療C1q SF成員響應(yīng)的異常。
本發(fā)明的藥物組合物包括適合施用給患者的形式的C1q SF成員蛋白變體。在優(yōu)選實施方案中，藥物組合物是水溶形式的，例如以藥學(xué)上可接受的鹽提供，這是指包括酸加成鹽和堿加成鹽?！八帉W(xué)上可接受的酸加成鹽”是指那些與有機酸和無機酸形成的鹽，并且保持游離堿的生物有效性，并且在生物學(xué)上或者其它方面不會是不期望的，所述無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而有機酸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸，乙磺酸、p-甲苯磺酸、水楊酸等?！八帉W(xué)上可接受的堿加成鹽”包括來源于無機堿的那些鹽，無機堿如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽等等。特別優(yōu)選的是銨、鉀、鈉、鈣和鎂鹽。來源于藥學(xué)上可接受的無毒性的有機堿的鹽包括伯胺鹽、仲胺鹽和叔胺鹽，取代的胺包括天然存在的被取代的胺、環(huán)胺和堿金屬離子交換樹脂，如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。
藥物組合物還包括一種或多種如下成分載體蛋白如血清白蛋白；緩沖液如NaOAc；濾膜如微晶纖維素、乳糖、玉米和其它淀粉；結(jié)合劑；甜味劑和其它調(diào)味品；著色劑；和聚乙二醇。添加劑在本領(lǐng)域是熟知的，可用于各種制劑中。
組合施用藥物組合物。此外，該組合物可以與其它治療劑組合施用。
本發(fā)明的C1q SF成員蛋白變體，優(yōu)選為無菌水溶液形式，可以用各種方式施用，包括但是不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、胃腸外、肺內(nèi)、陰道、直腸或者眼內(nèi)施用。在某些情形下，例如，Clq SF成員蛋白變體作為一種溶液或者噴霧劑直接應(yīng)用。根據(jù)導(dǎo)入的方式，可用各種方法配制藥物組合物。在優(yōu)選實施方案中，將治療有效量的C1q SF成員蛋白變體施用給需要處理的患者。“治療有效量”在此是指一種對所施用的對象產(chǎn)生作用的劑量。精確劑量將取決于處理的目的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)確定。在優(yōu)選實施方案中，制劑中的治療活性的C1q SF成員蛋白變體的濃度在約0.1-約100重量％之間變化。在另一個優(yōu)選實施方案中，C1q SF成員蛋白變體的濃度在0.003-1.0摩爾的范圍內(nèi)，劑量為每公斤體重0.03、0.05、0.1、0.2和0.3毫摩爾是優(yōu)選的。如本領(lǐng)域所知，根據(jù)C1q SF成員蛋白變體的降解、全身性和局部呈遞和新蛋白酶合成速度、以及年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥時間、藥物互作和狀況的嚴(yán)重性進行調(diào)整是必需的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗來確定。
在可替代的實施方案中，可施用C1q SF成員變體的核酸；即，可使用“基因治療”方法。在該實施方案中，將C1q SF成員變體的核酸導(dǎo)入患者的細胞中，以體內(nèi)合成治療有效量的C1q SF成員蛋白變體。導(dǎo)入C1q SF成員變體的核酸，可使用許多方法，包括但是不限于用脂質(zhì)體、病毒(通常是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體轉(zhuǎn)染，病毒衣殼蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau等人，Trends in Biotechnology 11205-210(1993)，完全引入作為參考)。在有些情形下，期望用靶向靶細胞的試劑提供核酸來源，例如特異于細胞表面膜蛋白或者靶細胞的抗體，靶細胞上的受體的配體等。當(dāng)使用脂質(zhì)體時，結(jié)合與內(nèi)吞作用相關(guān)的細胞表面膜蛋白的蛋白質(zhì)被用于靶向和/或用于促進攝取，例如，趨向于特定細胞類型的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中發(fā)生內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、靶向細胞內(nèi)定位和提高細胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用技術(shù)已公開，例如，Wu等人，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；以及Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.873410-3414(1990)，全部完全引入作為參考。關(guān)于基因標(biāo)記和基因治療的操作的綜述參見Anderson等人，Science 256808-813(1992)，完全引入作為參考。
實施例實施例1.鑒定C1q SF成員中的MHC-結(jié)合抗原限制位使用親本C1q SF成員序列脂連蛋白(SEQ_ID_NO1)和CTRP1(SEQ)_ID_NO2)，進行矩陣方法計算(Sturniolo，同上文)。
預(yù)測如下等位基因的抗原限制位，這些等位基因的每一種在至少1％的美國人群存在中DRB1*0101，DRB1*0102，DRB1*0301，DRB1*0401，DRB1*0402，DRB1*0404，DRB1*0405，DRB1*0408，DRB1*0701，DRB1*0801，DRB1*1101，DRB1*1102，DRB1*1104，DRB1*1301，DRB1*1302，DRB1*1501，和DRB1*1502.
表2.預(yù)測存在于C1q SF成員中的MHC-結(jié)合抗原限制位。給出了Iscore、等位基因的數(shù)量以及在1％、3％和5％的域值時命中的群體的百分比。當(dāng)采用1％的域值時，特別優(yōu)選的抗原限制位被預(yù)期影響至少10％的群體。


表3.預(yù)測存在于C1q SF成員中的MHC-結(jié)合抗原限制位。預(yù)測在1％、3％、5％和10％的截止值時結(jié)合各個等位基因的DRB1等位基因分別用“1”、“3”、“5”或者“10”標(biāo)示。


實施例2.鑒定C1q SF成員中的MHC-結(jié)合抗原限制位的免疫原性適當(dāng)降低的序列對采用1％的域值時被預(yù)測會結(jié)合在至少10％的美國人群中存在的等位基因的MHC-結(jié)合抗原限制位進行分析，鑒定免疫原性適當(dāng)降低的變體。在各個抗原限制位上，在滿足如下要求條件下考慮所有可能的氨基酸取代組合(1)各個取代在BLOSUM62取代矩陣中的分值為零或更高，(2)各個取代能夠使得對至少一個所考慮的MHC等位基因的結(jié)合能力下降，并且(3)一旦將足夠的取代完全導(dǎo)入以防止任何等位基因在1％的域值時的命中時，不在該序列中增加其它取代。
對替代序列的免疫原性和結(jié)構(gòu)相容性進行評分。優(yōu)選的替代被定義為是那些被預(yù)測不結(jié)合上述在1％的域值所檢測的17種等位基因的任何一種的序列，其BLOSUM62總分至少為野生型分值的80％。
表4.免疫原性適當(dāng)較低的C1q SF成員變體。B(wt)是野生型9-mer的BLOSUM62分值，I(alt)是含有一種或多種被預(yù)測在1％域值時結(jié)合其它9-mer的MHC等位基因的美國人群的百分比，對于表4所列的所有變體來說，該百分比為零，B(alt)是替代9-mer的BLOSUM62分值。
表4.A.i免疫原性適當(dāng)較低的脂連蛋白抗原限制位A1變體(殘基109-117；YVYRS AFSV)；B(wt)＝45。

表4.A.ii免疫原性適當(dāng)較低的脂連蛋白抗原限制位A2變體(殘基111-119；YRSAFSVGL)；B(wt)＝44。


表4.A.iii免疫原性適當(dāng)較低的脂連蛋白抗原限制位A3變體(殘基122-130；YVTIPNMPI)；B(wt)＝49。


表4.A.iv免疫原性適當(dāng)較低的脂連蛋白抗原限制位A9變體(殘基166-174；VYMKDVKVS)；B(wt)＝44。


表4.B.1.免疫原性適當(dāng)較低的CTRP1抗原限制位B3變體(殘基172-180，VNLYDHFNM)；B(wt)＝52。


表4.B.ii.免疫原性適當(dāng)較低的CTRP1抗原限制位B14變體(殘基218-226，VVILFAQVG)；B(wt)＝41。

表4.B.iii.免疫原性適當(dāng)較低的CTRP1抗原限制位B16變體(殘基230-238，IMQSQSLML)；B(wt)＝40。

表4.B.iv.免疫原性適當(dāng)較低的CTRP1抗原限制位B17變體(殘基247-255，WVRLYKGER)；B(wt)＝52。

實施例3鑒定由PDA_技術(shù)確定的MHC-結(jié)合抗原限制位的免疫原型適當(dāng)較低的序列表5.對感興趣的抗原限制位中的各個位置進行分析，鑒定可能與維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相容的氨基酸取代亞組。對各個9-mer抗原限制位的每個位置進行PDA_技術(shù)計算，并保存各個位置的相容氨基酸。在這些計算中，在感興趣位置的5_范圍內(nèi)的側(cè)鏈允許改變構(gòu)象，但是不允許改變氨基酸的同一性。然后分析抗原限制位變體的免疫原性。將野生型9-mer抗原限制位的PDA_能量和Iscore值與變體比較，記錄被預(yù)測的免疫原性較低的并且PDA_能量在野生型的5.0 kcal/mol之內(nèi)的變體序列亞組。在下面的表格中，E(PDA)是用PDA_技術(shù)計算確定的能量，與野生型相比，Iscore錨定(Anchor)是針對抗原限制位的Iscore，而Iscore重疊(Overlap)是所有重疊抗原限制位的Iscore的總和。
表5.A.i.脂連蛋白抗原限制位A1的免疫原性較低變體。

表5.A.ii.脂連蛋白抗原限制位A2的免疫原性較低變體。

表5.A.iii.脂連蛋白抗原限制位A3的免疫原性較低變體。

表5.A.iv.脂連蛋白抗原限制位A9的免疫原性較低變體。

表5.B.i.CTRP1抗原限制位B3的免疫原性較低變體。


表5.B.ii.CTRP1抗原限制位B14的免疫原性較低變體。

表5.B.iii.CTRP1抗原限制位B16的免疫原性較低變體。

表5.B.iv.CTRP1抗原限制位B17的免疫原性較低變體。

雖然上面已經(jīng)描述了前述發(fā)明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然可以在不背離本發(fā)明的保護范圍下進行各種改變和實施其它實施方案。包括專利、專利申請(臨時的、有效的和PCT)以及出版物的所有在此引用的參考文獻都全部完全引入作為參考。
對C1q超家族成員的規(guī)則的、細胞外結(jié)構(gòu)域(下劃線)進行分析，這些結(jié)構(gòu)域是通過檢查蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)來確定的。
脂連蛋白(SEQ_ID1)
MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNCTRP1(SEQ_ID2)MGSRGQGLLLAYCLLLAFASGLVLSRVPHVQGEQQEWEGTEELPSPPDHAERAEEQHEKYRPSQDQGLPASRCLRCCDPGTSMYPATAVPQINITILKGEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGERcKSHYAAFSVGRKKPMHSNHYYQTVIFDTEFVNLYDHFNMFTGKFYCYVPGLYFFSLNVHTWNQKETYLHIMKNEEEWILFAQVGDRSIMQSQSLMLELREQDQVWVRLYKGERENAIFSEELDTYITFSGYLVKHATEA
權(quán)利要求
1.非天然存在的脂連蛋白變體，其與野生型脂連蛋白(SEQ.ID.1)相比具有降低的免疫原性，其中所述蛋白變體包含至少兩個氨基酸修飾。
2.權(quán)利要求1的蛋白變體，其中至少一個氨基酸修飾是對選自如下的抗原限制位進行的抗原限制位A1(殘基109-117)、抗原限制位A2(殘基111-119)、抗原限制位A3(殘基122-130)、抗原限制位A4(殘基128-136)、抗原限制位A5(殘基136-144)、抗原限制位A6(殘基157-165)、抗原限制位A7(殘基158-166)、抗原限制位A8(殘基160-168)、抗原限制位A9(殘基166-174)、抗原限制位A10(殘基167-175)、抗原限制位A11(殘基175-183)、抗原限制位A12(殘基176-184)和抗原限制位A13(殘基202-210)。
3.權(quán)利要求1的蛋白變體，其中至少一個修飾選自如下位置109、110、111、112、113、114、115、117、119、122、123、124、125、127、128、130、166、167、168、169、171、172和174；其中位置109上的可能修飾選自Q、H、N、R、E、K、G、A、D、T、S、L、P、V、M和I；其中位置110上的可能修飾選自Q、K、N、L、D、A、E、T、S、P、Y、H、F、G、M、I和W；其中位置111上的可能修飾選自P、N、H、A、W、S、D、R、K、T、E、Q、G和V；其中位置112上的可能修飾選自K、D和G；其中位置113上的可能修飾是A；其中位置114上的可能修飾是G；其中位置115上的可能修飾選自Y、H和M；其中位置117上的可能修飾選自T、S和A；其中位置119上的可能修飾選自Q、K、E、T、S、R、A、N和D；其中位置122上的可能修飾選自K、E、H、D、R和Q；其中位置123上的可能修飾選自I、P、E、T、A、Q、S和N；其中位置124上的可能修飾選自E和D；其中位置125上的可能修飾選自E、D、Y、Q、N、S、V、T、L、H、K、R、W、F、G和P；其中位置127上的可能修飾選自K、D和G；其中位置128上的可能修飾選自V、T、Q、A、S、H、N、L、E、D、I、G、K和R；其中位置130上的可能修飾選自L、V、N、Q、E、M、D和A；其中位置166上的可能修飾選自T、S和A；其中位置1 67上的可能修飾選自F、H、A、E、G、D和W；其中位置168上的可能修飾選自A和G；其中位置169上的可能修飾選自A、E、W和T；其中位置171上的可能修飾選自T、A、S、G和N；其中位置172上的可能修飾選自R、Q、G、E和D；其中位置174上的可能修飾選自A和G。
4.權(quán)利要求1的蛋白變體，其中至少一個修飾是選自位置109、110、111、112、122和166；其中位置109上的可能修飾選自Q、H、N、R、E、K、G、A、D、T、S和P；其中位置110上的可能修飾選自D、A、E、T、S、P、G和W；其中位置111上的可能修飾選自P、N、H、A、S、D、R、K、T、E、Q和G；其中位置112上的可能修飾是D；其中位置122上的可能修飾選自K、E、H、D、R、Q；其中位置166上的可能修飾選自T、S和A。
5.非天然存在的CTRP1蛋白變體，其與野生型CRTP-1蛋白(SEQ.ID.2)相比具有降低的免疫原性，其中所述蛋白變體包含至少兩個氨基酸修飾。
6.權(quán)利要求5的蛋白變體，其中至少一個氨基酸修飾是對選自如下的抗原限制位進行的B1(殘基150-158)、抗原限制位B2(殘基171-179)、抗原限制位B3(殘基172-180)、抗原限制位B4(殘基178-186)、抗原限制位B5(殘基185-193)、抗原限制位B6(殘基186-194)、抗原限制位B7(殘基188-196)、抗原限制位B8(殘基192-200)、抗原限制位B9(殘基193-201)、抗原限制位B10(殘基194-202)、抗原限制位B11(殘基202-210)、抗原限制位B12(殘基208-216)、抗原限制位B13(殘基209-217)、抗原限制位B14(殘基218-226)、抗原限制位B15(殘基220-228)、抗原限制位B16(殘基230-238)、抗原限制位B17(殘基247-255)、抗原限制位B18(殘基248-256)和抗原限制位B19(殘基267-275)。
7.權(quán)利要求5的蛋白變體，其中至少一個修飾選自位置172、174、175、177、178、180、218、219、220、221、223、224、226、230、231、232、233、235、236、238、247、248、249、250、252、253和255；并且其中位置172上的可能修飾選自A、D、G、N、S和T；其中位置174上的可能修飾選自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V和W；其中位置175上的可能修飾選自A、D、E、G、I、K、L、M、N、P和T；其中位置177上的可能修飾選自D、E、G和Q；其中位置178上的可能修飾選自H、K和Y；其中位置180上的可能修飾選自A、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；其中位置218上的可能修飾選自A、G、N、S和T；其中位置219上的可能修飾選自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S和T；其中位置220上的可能修飾選自A、D、G、L、N、S、T和V；其中位置221上的可能修飾選自A、D、E、F、G、I、K、N、P、Q、S、T、W和Y；其中位置223上的可能修飾選自E、N和Q；其中位置224上的可能修飾選自D、E和G；其中位置226上的可能修飾選自D和E；其中位置230上的可能修飾選自A、D、G、H、E、Q和K；其中位置23 1上的可能修飾選自T、N、S、E、A、D和G；其中位置232上的可能修飾選自E和D；其中位置233上的可能修飾選自A、P和G；其中位置235上的可能修飾選自P、E、A、T、K和Q；其中位置236上的可能修飾選自E、A、P、D、G、Q、I、M和H；其中位置238上的可能修飾選自K、M、A、Q、S、T、N、G、D、V、R和E；其中位置247上的可能修飾選自G、S、A、D、N、P、E、Q、M、K和L；其中位置248上的可能修飾選自M、A、S、T、G和P；其中位置249上的可能修飾選自K、S、Q、T、V、A、N、P、E、D和G；其中位置250上的可能修飾選自E、T、Q、N、V、S、A、K、G和P；其中位置252上的可能修飾選自L、R、T、N、P、E、S、H、Q、A、D、G、W、Y和F；其中位置253上的可能修飾是E；其中位置255上的可能修飾選自K、N、P、T、D、E、H和L。
8.權(quán)利要求5的蛋白變體，其中至少一個修飾選自位置172、174、175、218、219、220、230、235、236、238、247、248、249、250和252；并且其中位置172上的可能修飾選自A、D、G、N、S和T；其中位置174上的可能修飾選自D和E；其中位置175上的可能修飾選自E和P；其中位置218上的可能修飾選自A、G、N、S和T；其中位置219上的可能修飾是D；其中位置220上的可能修飾是D；其中位置230上的可能修飾選自A、D、G、H、E、Q和K；其中位置235上的可能修飾是E；其中位置236上的可能修飾是D；其中位置238上的可能修飾選自T、N、G、D、R和E；其中位置247上的可能修飾選自G、S、A、D、N、P、E、Q和K；其中位置248上的可能修飾選自A、S、T和P；其中位置249上的可能修飾選自E和D；其中位置250上的可能修飾選自E和P；其中位置252上的可能修飾選自E、D、W、Y和F。
全文摘要
本發(fā)明涉及非天然存在的Clq超家族成員蛋白質(zhì)變體，其具有降低的免疫原性。更具體地，本發(fā)明涉及免疫原性下降的脂連蛋白變體和CTRP1蛋白變體。
文檔編號C07K14/74GK101018807SQ200580024618
公開日2007年8月15日 申請日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者香農(nóng)·A·馬歇爾, 格雷戈里·L·穆爾, 阿瑟·J·奇里諾, 約翰·R·德斯賈萊斯 申請人:贊科股份有限公司