專利名稱：環(huán)磷酰胺抗體和免疫測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫測定領(lǐng)域，用于確定人生物樣本中活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的存在和/或?qū)ζ涠?，以在化學(xué)治療期間快速確定藥物的最佳濃度。
背景技術(shù)：
癌癥是一個術(shù)語，用于描述當(dāng)在身體的一部分中細(xì)胞開始不受控制地生長時，所有具有發(fā)展的共有性質(zhì)的一組惡性腫瘤。大多數(shù)的癌癥形成為腫瘤，但是也可以出現(xiàn)在血液中和循環(huán)通過其生長的其他組織。大多數(shù)情況下，惡性腫瘤最通常是用外科手術(shù)、化學(xué)療法、和/或放射療法聯(lián)合治療的。用于治療特定癌癥的治療方法的類型取決于數(shù)種因素包括惡性腫瘤的類型和在診斷時其所處的階段。
環(huán)磷酰胺是通常使用的一種細(xì)胞毒素劑。該化學(xué)治療劑的通用化學(xué)名稱是環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，具有如下通式 環(huán)磷酰胺是施用的活性4-羥基環(huán)磷酰胺(HCY)的前藥，HCY具有如下通式 當(dāng)把環(huán)磷酰胺作為治療劑施用于患者時，通式I的化合物環(huán)磷酰胺就在血液中代謝成為通式II-A的化合物。作為活性成分，通式II-A的化合物以其互變異構(gòu)體形式醛化磷酰胺存在，醛化磷酰胺具有如下通式 通式II-A的化合物和當(dāng)作為活性成分時的其互變異構(gòu)體通式II-B的化合物在血液外都是不穩(wěn)定的化合物。因此，為了給患者施用通式II-A和II-B的化合物，都必須以環(huán)磷酰胺的形式施用這些化合物。
由于通式II-A的化合物和其互變異構(gòu)體通式II-B的化合物不穩(wěn)定，因此檢測其存在的免疫測定是不實(shí)際的。為了通過免疫測定來檢測和/或定量在患者血液中通式II-A的化合物和其互變異構(gòu)體通式II-B的化合物的存在，有必要俘獲活性物質(zhì)，即通式II-A和II-B的化合物。這可以通過在存在于通式II-B上的活性物質(zhì)保護(hù)醛基來完成，而所述保護(hù)包括形成受保護(hù)的醛例如肟或腙。這些由醛磷酰胺的醛基而形成的保護(hù)基，可以通過形成受保護(hù)醛基的常規(guī)方法來完成，如Ludeman等人.J.Pharma.Sci.，84(4)PP 393-398，1995，Zon等人.J.Pharma.ScL，71(4)pp 443-446，1982，和McDonald等人.Blood，101(5)pp 2043-2048，2003所述，由該穩(wěn)定俘獲的衍生物來測定在血液中活性成分的存在。通過監(jiān)測在身體中活性環(huán)磷酰胺類物質(zhì)的水平和調(diào)整劑量，可以更好地控制和限制給患者施用環(huán)磷酰胺而導(dǎo)致的副作用。(Ren等人.Clin.Pharmacol.Ther.64(3)pp 289-301，1998；Petros等人.，Clin.Cancer Res.8pp 698-705，2002；和Chen等人.Cancer Research 55pp 810-815，1995)。
監(jiān)測的另一個原因是，施用的環(huán)磷酰胺的劑量和所產(chǎn)生的改變治療效果的血清藥物濃度之間通常存在高度可變的關(guān)系。環(huán)磷酰胺的個體內(nèi)和個體之間藥物代謝動力學(xué)差異程度可以高達(dá)9倍(Chang等人.Pharmacogenetics 7211-221，1997，Ren等人.Clin.Pharmacol.Ther.64(3)pp 289-301，1998)，并受到很多因素的影響，包括ο器官功能ο遺傳調(diào)節(jié)ο疾病情況ο年齡ο藥物-藥物之間的相互作用ο藥物攝取的時間ο施用方式，和ο相關(guān)技術(shù)的施用這些差異的結(jié)果是，在不同個體中，等劑量的相同藥物可以導(dǎo)致顯著不同的臨床結(jié)果(Hon等人.Clinical Chemistry 44，pp 388-400，1998)。根據(jù)在患者中個體的藥物清除率和最終的血清藥物濃度，相同環(huán)磷酰胺劑量的有效性顯著不同。治療性藥物的管理使得臨床醫(yī)生可以洞察在口服和靜脈施用時患者的差異。當(dāng)進(jìn)行治療性藥物的管理時，藥物劑量對于患者可以是適應(yīng)于個體需要的，有效治療癌癥而沒有不想要的副作用的機(jī)會將會高得多(Nieto，Current DrugMetabolism 2pp 53-66，2001)。另外，環(huán)磷酰胺的治療性藥物管理可以作為良好的工具來確保以實(shí)際的處方劑量執(zhí)行化學(xué)療法的順應(yīng)性和達(dá)到有效的血清濃度水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺的活性成分的血清濃度的差異不僅取決于生理因素，而且也是由施用技術(shù)的不同和身體吸收和代謝環(huán)磷酰胺的能力導(dǎo)致的。尤其在下列情況下，這是非常正確的對于所給的環(huán)磷酰胺，當(dāng)施用于患者時，患者通常通過不同途徑吸收和代謝其活性成分。因此，通過免疫測定的方法來監(jiān)測這些活性成分在患者中的水平時，重要的是，免疫測定能夠從通式I的化合物即環(huán)磷酰胺中辨別出通式II-A和II-B的化合物的活性成分。有關(guān)這些活性成分的抗體的問題在于，它們與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)，使得這些免疫測定法都失去作用。
環(huán)磷酰胺的常規(guī)治療性藥物管理需要簡單的自動的試驗(yàn)以適應(yīng)通常的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的有效性。與這些標(biāo)準(zhǔn)最佳擬合的試驗(yàn)是免疫測定。目前，對于環(huán)磷酰胺施用沒有有效的免疫測定法，監(jiān)測環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的水平是通過物理方法來完成的，例如高壓液相色譜法(HPLC)(Escoriaza等人.J.of Chromatography BBiomedical Sciencesand applications，736(1+2)pp 97-102，1999)。為了最有效地監(jiān)測藥物水平，該抗體對于穩(wěn)定形式的環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)是特異性的，并顯示非常低的交叉反應(yīng)性，而不會與相關(guān)的化合物，特別是環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)。
發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明，制備了一組新的抗體，其基本上選擇性地與通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式反應(yīng)，以結(jié)合到該穩(wěn)定形式上而與環(huán)磷酰胺沒有實(shí)質(zhì)上的交叉反應(yīng)性。選擇性地反應(yīng)，是指該抗體與通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式反應(yīng)，而基本上不與環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺的干擾性類似物反應(yīng)，其中最重要的是環(huán)磷酰胺。通過提供基本上不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)的抗體，允許人們進(jìn)行活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的免疫測定，以精確地監(jiān)測在用環(huán)磷酰胺治療的患者的治療性管理中活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物存在的水平。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用免疫原，其中該免疫原是免疫原的多胺聚合物和下列通式的化合物的共軛物 其中＝R形成醛保護(hù)基；Y是有機(jī)間隔基；X是能結(jié)合到多胺聚合物上的末端官能團(tuán)；P是0到1的整數(shù)，和N是1到6的整數(shù)，
產(chǎn)生了抗體，該抗體對于通式II-A和II-B的活性代謝產(chǎn)物是特異性的，基本上不與環(huán)磷酰胺本身以及其它環(huán)磷酰胺的干擾性類似物反應(yīng)。基本上選擇性地與通式II-A和II-B的活性代謝產(chǎn)物反應(yīng)，并不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)的抗體的提供，允許人們進(jìn)行免疫測定，其特別是探測和監(jiān)測用環(huán)磷酰胺治療的患者的液體樣本中的活性代謝產(chǎn)物。本發(fā)明也包括用于所述免疫測定的試劑和試劑盒。環(huán)磷酰胺的存在是假陽性讀數(shù)的主要原因，假陽性讀數(shù)使得環(huán)磷酰胺的活性形式的免疫測定變得不適當(dāng)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，制備了一組新的抗體，其基本上選擇性地與通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物反應(yīng)，基本上不與環(huán)磷酰胺本身、環(huán)磷酰胺的干擾性類似物反應(yīng)或交叉反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用由通式III的化合物制備的免疫原，提供了本發(fā)明的新的一組抗體。通過使用該抗體，發(fā)展出了免疫測定法，包括用于在血液、血漿或其他體液樣本中檢測和/或定量環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的免疫測定的試劑和試劑盒。通過使用該免疫測定，可以檢測和/或定量在體液樣本，優(yōu)選血液或血漿樣本中活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的存在和量。在該方法中，可以在治療期間監(jiān)測用環(huán)磷酰胺治療的患者，并根據(jù)所述的監(jiān)測來調(diào)整其治療。通過本發(fā)明的方法，人們可以實(shí)現(xiàn)對施用環(huán)磷酰胺作為化學(xué)治療劑的癌癥患者進(jìn)行治療性藥物管理。
在本發(fā)明的免疫測定中利用的試劑是通式III的化合物和載體的共軛物。為完成該免疫測定，共軛試劑應(yīng)當(dāng)包含與在免疫原中存在的保護(hù)基R相同的保護(hù)基R，其中該免疫原用于在該免疫測定中形成抗體。
在本發(fā)明的免疫測定法中，這些共軛物是存在于樣本中的通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物的競爭性結(jié)合配偶體，用于和本發(fā)明的抗體結(jié)合。但是，由于這些活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，在進(jìn)行該免疫測定前，通過將醛基轉(zhuǎn)換成受保護(hù)的醛基來俘獲樣本中的這些代謝產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)該目的，包括在試劑收集后處理該樣本，其中該試劑通過將其轉(zhuǎn)換成下列通式的醛保護(hù)基而保護(hù)醛基
通式II-C的化合物是通式II-A和通式II-B的化合物的穩(wěn)定形式，該化合物可用于確定通式II-A和通式II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的測定中。在通過醛保護(hù)基R俘獲通式II-B的化合物的醛基中，在載體的共軛物和免疫原中使用的相同醛保護(hù)基R，應(yīng)當(dāng)用于在該免疫測定中俘獲樣本中即通式II-C的化合物的醛基。
在該免疫測定中，結(jié)合到抗體上的共軛試劑的量將與在樣本中存在的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的量成反比例。根據(jù)本發(fā)明，該測定利用所有的常規(guī)測定方法來檢測和測定結(jié)合或未結(jié)合到抗體上的所述共軛物的量。通過使用所述的方法，可以確定結(jié)合或未結(jié)合的共軛物的量。一般地，在樣本中通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的量的確定，包括將由樣本產(chǎn)生的結(jié)合或未結(jié)合的共軛物的測定量與標(biāo)準(zhǔn)或校正曲線樣本確定的結(jié)合或未結(jié)合共軛物相聯(lián)系，其中該標(biāo)準(zhǔn)和校正曲線樣本包含已知量的通式II-A和II-B的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物，其中已知量在試驗(yàn)樣本所期望的范圍內(nèi)。用與使用樣本時相同的免疫測定方法來確定用于產(chǎn)生校正曲線的研究。
共軛試劑和免疫原是由通式III的化合物制備的。在免疫原和載體中，多胺聚合物或載體與具有下列通式的配體部分連接
其中Y、R、p和n如上所述；和x′是-CH2-或官能連接基。
定義通過本說明，將會理解下列的定義術(shù)語“免疫原”和“免疫原的”涉及能在有機(jī)體中引導(dǎo)、制備或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
術(shù)語“共軛物”涉及兩部分結(jié)合到一起而形成任何物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明代表性的共軛物包括由小分子例如通式II-B的化合物，與大分子例如載體或多胺聚合物，特別是蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成的物質(zhì)。在該共軛物中，小分子可以結(jié)合到大分子的一個或多個活性位點(diǎn)上。
“半抗原”是部分或不完整的抗原。它們是不含蛋白質(zhì)的物質(zhì)，大部分是低分子量物質(zhì)，其不能調(diào)節(jié)抗體形成，但能與抗體反應(yīng)。后者的形成包括半抗原結(jié)合到高分子量的免疫原載體上，然后將該結(jié)合產(chǎn)物即免疫原注射到人或動物患者中。本發(fā)明的半抗原是通式II-C的化合物。
本文使用的“間隔基團(tuán)”或“間隔基”涉及化學(xué)結(jié)構(gòu)的一部分，該化學(xué)結(jié)構(gòu)通過-CH2-或官能連接基結(jié)合了兩種或更多亞結(jié)構(gòu)例如半抗原、載體、免疫原、指示物、或示蹤物。這些間隔基團(tuán)將會在本申請的下文中列舉。間隔基團(tuán)的原子和間隔基團(tuán)內(nèi)鏈上的原子本身通過化學(xué)鍵連接。優(yōu)選的間隔基是直鏈或支鏈、飽和或不飽和的碳鏈。這些碳鏈也包括在鏈中或鏈的末端的一個或多個雜原子?！半s原子”是指碳以外的其它原子，選自氧、氮和硫。間隔基團(tuán)也包括環(huán)或芳香基作為鏈的一部分或作為鏈中一個原子上的取代基。
在間隔基團(tuán)中原子數(shù)目通過計(jì)算除氫以外的原子來確定。在間隔基團(tuán)內(nèi)的鏈中的原子數(shù)目通過沿著連接亞結(jié)構(gòu)之間最短的途徑來計(jì)算除氫以外的原子數(shù)目來確定。官能連接基可以用于活化半抗原或間隔基團(tuán)，例如在其上提供有效的官能化位點(diǎn)來合成半抗原和指示物或載體或多胺聚合物的共軛物。
本文作為術(shù)語使用的“免疫原載體”是一種免疫原物質(zhì)，通常是蛋白質(zhì)，其可以與半抗原結(jié)合，所述半抗原在該情況下是通式II-C的化合物，因此能夠使這些半抗原衍生物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和引導(dǎo)能與這些半抗原特異性結(jié)合的抗體的產(chǎn)生。免疫原載體和連接基將在本申請的下文中列舉。在這些免疫原載體中包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、絡(luò)合的多胺-多糖、顆粒、和被識別為外源性的核酸，因此引導(dǎo)了宿主的免疫應(yīng)答。多胺-多糖可以由多糖使用任何已知用于該制備的常規(guī)手段來制備。
各種的蛋白質(zhì)類型也可以作為多(氨基酸)免疫原載體使用。這些類型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白等等。用作舉例性的蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、雞蛋卵白蛋白、牛甲狀腺球蛋白(BTG)等等?；蛘撸梢允褂煤铣傻亩?氨基酸)。
免疫原載體也可以包括多胺-多糖，其是由單糖的重復(fù)縮合構(gòu)建的高分子量聚合物。多糖的例子是淀粉、糖原、纖維素、碳水化合物膠例如阿拉伯膠、瓊脂等等。多糖也包含聚氨基酸殘基和/或脂殘基。
免疫原載體也可以是多(核苷酸)，其單獨(dú)或共軛到一種上述的多(氨基酸)或多糖上。
免疫原載體也可以包括固體顆粒。該顆粒的直徑通常至少約0.02微米(μm)，并且不大于約100μm，通常是約0.05μm到10μm。該顆?？梢允怯袡C(jī)的或無機(jī)的，可溶脹的或不可溶脹的，多孔的或非多孔的，密度最好接近于水，通常是約0.7到1.5g/mL，包括透明的、部分透明的、或不透明的材料。該顆粒可以是生物學(xué)材料例如細(xì)胞和微生物，包括非限制性例子例如紅血球、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、雜交瘤、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、和病毒。該顆粒也可以由有機(jī)和無機(jī)聚合物、脂質(zhì)體、膠乳、磷脂囊、或脂蛋白組成。
“多(氨基酸)”或“多肽”是由氨基酸形成的聚酰胺。多(氨基酸)通常的范圍是從約2,000分子量，而沒有分子量的上限，通常小于10,000,000，一般不超過約600,000道爾頓。根據(jù)是否包含免疫原載體或酶，它們通常是不同的范圍。
“肽”是兩個或多個氨基酸通過酰胺(肽)鍵連接而形成的任意化合物，通常是α-氨基酸的聚合物，其中每個氨基酸殘基(除了NH2末端)的α-氨基以直鏈形式連接到的下一個殘基的α-羧基上。術(shù)語肽、多肽和多(氨基酸)在本文中具有相同的含義，涉及該類的化合物而不限定其大小。該類的最大成員稱作蛋白質(zhì)。
“標(biāo)記”、“檢測分子”、或“示蹤物”是產(chǎn)生或能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可檢測信號的任意分子。標(biāo)記可以共軛到分析物、免疫原、抗體、或其它分子例如受體或可以與受體結(jié)合的分子例如配體，特別是半抗原上。標(biāo)記的非限制性例子包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制劑、輔酶、催化劑、熒光團(tuán)、染料、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)或致敏物；非磁性或磁性顆粒、固體載體、脂質(zhì)體、配體、或受體。
術(shù)語“抗體”涉及與抗體特異性蛋白結(jié)合的配偶體，是對于抗原具有特異性結(jié)合親和力，而排除了其它物質(zhì)的任何物質(zhì)或物質(zhì)組。統(tǒng)稱的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和抗體片段。
術(shù)語“衍生物”指由母體化合物通過一個或多個化學(xué)反應(yīng)制成的化合物或分子。
對于與通式III的化合物形成共軛物的術(shù)語“載體”，指的是固體顆粒和/或聚合的聚合物例如免疫原聚合物例如上述的那些。當(dāng)載體是固體顆粒時，該固體顆?？梢越Y(jié)合到多胺聚合物上、用多胺聚合物涂敷或附著到多胺聚合物上，以便為結(jié)合通式III的化合物中的末端官能團(tuán)X提供一個或多個反應(yīng)位點(diǎn)。
術(shù)語“試劑盒(reagent kit)”，或“試劑盒(test kit)”指在進(jìn)行測定時所使用的材料的集合。該試劑可以在相同或單獨(dú)的容器中以包裝組合的形式提供，這取決于它們的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性，并且也可以是液體或凍干形式?？梢赃x擇在該試劑盒中提供的試劑的量和比例，以便為特定的應(yīng)用提供最佳的結(jié)果。本發(fā)明的試劑盒的具體特征包括對通式II-C化合物特異性的抗體。該試劑盒也可以進(jìn)一步包含分析物的配體、校準(zhǔn)和對照物質(zhì)。該試劑可以保持液體形式或者可以是凍干的。
短語“校準(zhǔn)和對照物質(zhì)”指包含已知量的要測定藥物的任意標(biāo)準(zhǔn)或參照物質(zhì)。計(jì)算藥物的濃度，包括將未知樣本獲得的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品獲得結(jié)果進(jìn)行比較。這通?？梢酝ㄟ^構(gòu)建校準(zhǔn)曲線來完成。
術(shù)語“生物樣本”包括但不限于，任意量的來自活物或先前是活物的物質(zhì)。這些活物包括但不限于，人、小鼠、猴子、大鼠、兔、馬和其他動物。這些物質(zhì)包括但不限于，血液、血清、血漿、尿、細(xì)胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴、淋巴結(jié)、滑液組織、軟骨細(xì)胞、滑液巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和皮膚。
試劑和免疫原在構(gòu)建該免疫測定時，構(gòu)建由通式III的化合物形成的共軛試劑來與通式II-C的化合物競爭，通式II-C的化合物是由在樣本中俘獲處于其穩(wěn)定形式的通式II-A和II-B的化合物形成的，用作本發(fā)明的抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的免疫測定中，用于制備本發(fā)明的抗體的免疫原是由通式III的化合物制備的免疫原，連接子間隔基構(gòu)成該分子的-(CH2)n-(Y)p-X-部分。連接子X和間隔基-(CH2)n-(Y)p-在制備共軛物和免疫原中是常規(guī)性的。用于制備免疫測定的共軛物和免疫原的任何常規(guī)間隔基-連接基團(tuán)在通式III的化合物中都是可以利用的。這些常規(guī)連接子和間隔基在美國專利U.S.5,501,987和U.S.5,101,015中公開。優(yōu)選的間隔基團(tuán)包括上文所提到的間隔基團(tuán)，特別優(yōu)選的間隔基團(tuán)是例如包含1到6個碳原子的烯基， -NH-(CH2)m-， 或 或 特別優(yōu)選的間隔基是其中o是0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)的烷撐。
在與免疫原或載體連接的通式IV的配體部分中，X′是與間隔基連接的-CH2-或官能團(tuán)，優(yōu)選是聚合物或載體或免疫原上的胺基?；鶊F(tuán)X′是通式III的化合物的末端官能團(tuán)X的結(jié)果，其中通式III的化合物能與作為載體或免疫原使用的多胺聚合物的氨基結(jié)合。任意能與胺基反應(yīng)的末端官能團(tuán)都可以用作通式III的化合物的官能團(tuán)X。在X內(nèi)優(yōu)選包括的末端官能團(tuán)是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或與其附著的氧原子一起形成反應(yīng)性酯，R4是氧或硫，基團(tuán)-N＝C＝R4可以是異氰酸鹽或異硫氰酸鹽。由OR3形成的活性酯包括亞氨酸酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑和對硝基苯基酯。但是也可以使用任意的能與胺基反應(yīng)的活性酯。
通過常規(guī)方法將羧基和活性酯結(jié)合到載體或免疫原聚合物上。多胺聚合物例如蛋白質(zhì)上的胺基產(chǎn)生了酰胺基，其將間隔基結(jié)合到本發(fā)明的聚合物、免疫原或載體和/或共軛物上。
在本發(fā)明的免疫原和共軛物中，通式III的化合物的包含羧基的半抗原和載體或免疫原的多胺聚合物上的氨基之間的化學(xué)鍵可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來建立。通常優(yōu)選形成酰胺鍵。酰胺鍵的形成，包括首先通過羧基和離去基團(tuán)試劑(例如，N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑和對硝基苯酚等等)反應(yīng)活化通式III的化合物中的半抗原的羧酸部分?？梢允褂没罨噭├缍h(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺等等。然后，通式III的半抗原中羧基的活化形式與包含蛋白質(zhì)載體的緩沖溶液反應(yīng)。
當(dāng)通式III的半抗原衍生物包含伯氨基或仲氨基以及羧基時，在活化和偶合反應(yīng)期間必須使用胺基保護(hù)基，以防止共軛物自身發(fā)生反應(yīng)。典型地，共軛物上的胺基的保護(hù)，通過形成相應(yīng)的N-三氟乙酰胺、N-叔丁基氧羰基氨基甲酸酯(N-t-BOC氨基甲酸酯)、N-碳苯甲氧基氨基甲酸酯或類似的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)與免疫原聚合物或載體的結(jié)合反應(yīng)已經(jīng)完成時，如上所述，可以用不改變免疫原或共軛物結(jié)構(gòu)的試劑來除去胺基保護(hù)基。這些試劑和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括弱或強(qiáng)的含水或無水酸、弱或強(qiáng)的含水或無水堿、包含氫化物的試劑例如硼氫化鈉、或氰基硼氫化鈉和催化氫化作用。共軛半抗原和載體的各種方法在美國專利U.S.3,996,344和U.S.4,016,146中公開，在此將其引入本文作為參考。
另一方面，當(dāng)在通式III的化合物中X是末端的異氰酸鹽或硫異氰酸鹽時，這些基團(tuán)當(dāng)與多胺聚合物的游離胺反應(yīng)時產(chǎn)生了通式IV的共軛物或免疫原，其中X′是 其中R4同上，其與多胺載體或免疫原多肽上的氨基官能性結(jié)合。
當(dāng)在通式III的化合物中X是醛基時，這些化合物可以通過還原氨基化作用通過胺鍵與多胺多肽或載體的胺基結(jié)合?？梢允褂萌我獾挠冒坊s合醛基的常規(guī)方法例如通過還原氨基化作用來形成該連接。在該情況中，通式IV的配體部分的X′是-CH2-。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用形成醛保護(hù)基的任意常規(guī)方法來將通式II-A和II-B的化合物轉(zhuǎn)換成通式II-C的化合物。根據(jù)本發(fā)明，R可以形成常規(guī)的醛保護(hù)基。優(yōu)選的醛保護(hù)基包括縮醛和環(huán)狀縮醛，也即通式II-B的化合物中-CH＝R是 其中R5和R6是相同的低級烷基或一起形成包含2到6個碳原子的低級烯基橋。
根據(jù)本發(fā)明可以由R形成的另一組優(yōu)選的醛保護(hù)基是烷基腙和苯基腙例如2，4-二硝基苯基腙，肟和縮氨基脲。對于腙，通式II-C的化合物的-CH＝R部分形成下列通式的基團(tuán)-CH＝N-NR17R18其中R17是苯基、取代的苯基、低級烷基或 和R18是氫或低級烷基。
當(dāng)在通式II-C的化合物中醛保護(hù)基是肟時，通式II-C的化合物的CH＝R部分形成下列通式的基團(tuán)-CH＝N-OR8其中R8是低級烷基。
可以使用將醛基轉(zhuǎn)換成其中一種保護(hù)基的任意常規(guī)方法，來轉(zhuǎn)換通式II-B中的醛基，以俘獲通式II-A和II-B的化合物而成為通式II-C的化合物。
通式III的化合物可以由下列通式的化合物制備 在制備通式III的化合物時，通式V的化合物首先與下列通式的化合物反應(yīng)NH2-(CH2)n-(Y)p-X VI其中n、X、Y和p同上來制備下列通式的化合物 接著通式VII的化合物轉(zhuǎn)化成下列通式的化合物
其中X、Y、p和n同上。
通式V的化合物與通式VI的化合物的反應(yīng)可以使用氯縮合胺的任意常規(guī)方法來完成。在該合成中，氯化磷比附著到氮原子上的氯化乙烯上的其他氯更具有反應(yīng)性。因此，鹵化磷與通式IV的化合物上的胺基快速反應(yīng)。在進(jìn)行該反應(yīng)時，可以用各種保護(hù)基的方法來保護(hù)存在于取代基中用X和Y表示的反應(yīng)性官能團(tuán)，可以在該反應(yīng)方案的后續(xù)步驟中除去該保護(hù)基。在該方法中，制備出了通式VII的化合物。通過將雙鍵氧化成醛基取代基可以將通式VII的化合物轉(zhuǎn)換成通式VIII的化合物。可以使用將雙鍵轉(zhuǎn)換成醛基的任意常規(guī)方法來完成該反應(yīng)。氧化的優(yōu)選方法是ozonalysis?？梢允褂胦zonalysis的任意常規(guī)方法。通過把醛基轉(zhuǎn)換成醛保護(hù)基，通式VIII的化合物上的醛可以轉(zhuǎn)化成通式III的化合物。在該過程中可以使用任意的常規(guī)醛保護(hù)基。在形成通式III的化合物時，在其穩(wěn)定情況下，該化合物包含醛作為受保護(hù)的醛基。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用保護(hù)醛基的任意常規(guī)方法和常規(guī)的醛保護(hù)基來保護(hù)通式VIII的化合物中的游離醛，以制備通式III的化合物或通式II-B的化合物中的游離醛基。優(yōu)選的方法是通過通式VIII的化合物或通式II-B的化合物與下列通式的化合物反應(yīng)制備腙H2NNR7R9X其中R7是低級烷基、苯基、取代的苯基；和R9是氫或低級烷基。
制備通式III和II-C的化合物，其中＝R形成腙通過將通式VIII和II-B的化合物與通式X的化合物反應(yīng)而制備。在該轉(zhuǎn)換中可以使用將醛基轉(zhuǎn)換成腙的任意常規(guī)方法。在本文中，術(shù)語“低級烷基”是指包含1到7個碳原子的單價烷基例如甲基、乙基、丙基、異丁基、戊基等等。術(shù)語取代的苯基是指1到3個位置被取代的苯基部分，優(yōu)選1-2個位置被硝基或鹵素取代，特別優(yōu)選2，4-二硝基取代的苯基。
另外優(yōu)選的保護(hù)基是肟。它們通過將通式II-B和VIII的化合物中的游離醛基與下列通式的化合物反應(yīng)而制得NH2OR8XI其中R8是低級烷基。
這些肟通過使用將游離醛轉(zhuǎn)換成肟的常規(guī)方法形成。
另一方面，通式VIII和II-B的化合物中游離醛可以轉(zhuǎn)換成縮氨基脲，即，其中 通過與下列通式的化合物反應(yīng) 利用將醛基轉(zhuǎn)化成縮氨基脲的常規(guī)方法。
另一個優(yōu)選的保護(hù)基是縮醛基，即，其中＝R是
其中R8和R8同上；或其通過如下方法制備，將通式II-B或VIII的化合物與下列通式的醛反應(yīng)R8OHXV其中R8同上。
利用將醛基轉(zhuǎn)化成縮醛的常規(guī)方法。
另一個優(yōu)選的保護(hù)基是環(huán)狀縮醛基，即，其中＝R是 其中R11是低級烷撐其制備包括將通式II-B或VIII的化合物與下列通式的二醇反應(yīng)HO-R11-OH XVII其中R11同上利用將游離醛基轉(zhuǎn)化成環(huán)狀縮醛的常規(guī)方法。
術(shù)語“低級烷撐”是指具有2到7個碳原子的二價飽和烴，優(yōu)選在兩個不同的碳原子上具有二價結(jié)合，例如1，2亞乙基；1，3亞丙基；1，4亞丁基等等。
可以將通式III的化合物轉(zhuǎn)換成含本發(fā)明的共軛載體試劑的免疫原，包括將這些化合物與多胺、多肽或載體反應(yīng)。如果多胺或多肽是免疫活性的，也可以使用相同的多肽作為免疫原中的載體。但是，為了形成共軛物，這些聚合物不需要產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而免疫原則需要。根據(jù)本發(fā)明，在通式III的化合物中X所代表的各種官能團(tuán)可以共軛到聚合物材料上，包括使用將官能團(tuán)附著到在聚合物中包含的胺基上的常規(guī)方法。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案。在通式III的化合物中，X是羧酸基或其活性酯。
抗體本發(fā)明也涉及新的抗體，包括單克隆抗體到通式II-C的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式。這些抗體通過使用上述的免疫原而制備。根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，這些根據(jù)本發(fā)明制備的抗體與通式II-A和II-B的化合物的穩(wěn)定形式選擇性地反應(yīng)，而不與干擾免疫測定的環(huán)磷酰胺或其他環(huán)磷酰胺類似物反應(yīng)。
本發(fā)明涉及新的抗體和單克隆抗體到通式II-C的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式?？梢酝ㄟ^用本發(fā)明的免疫原使宿主動物免疫來方便地制備本發(fā)明的抗血清。適當(dāng)?shù)乃拗鲃游锇▏X類例如，小鼠、大鼠、兔、荷蘭豬等等，或高級哺乳動物例如山羊、綿羊、馬等等，特別優(yōu)選小鼠、大鼠和兔。根據(jù)可接受的規(guī)程，給予初始劑量、出血和加強(qiáng)注射，以在動物中引導(dǎo)免疫應(yīng)答，例如在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，小鼠接受的初始劑量是100μg免疫原/小鼠i.p.，在六個月的時間后給予一或多次后續(xù)的加強(qiáng)注射100μg免疫原/小鼠。通過周期性的出血，用常規(guī)的免疫測定觀測免疫小鼠的血樣，發(fā)現(xiàn)其對于與通式II-C的化合物的結(jié)合產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。這些方法提供了一種方便的方法來篩選能產(chǎn)生具有需要活性的抗血清的宿主。
根據(jù)上述的方案給Balb/c小鼠免疫，然后連續(xù)三天腹膜內(nèi)(i.p.)或靜脈內(nèi)(i.v.)或給小鼠注射100μg免疫原，其在細(xì)胞融合前三天開始，可以方便地制備出單克隆抗體?？贵w領(lǐng)域公知的其他規(guī)程當(dāng)然也可以利用。本文詳述的完整免疫規(guī)程為抗體對通式II-C的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式產(chǎn)生血清抗體應(yīng)答提供了最適宜的規(guī)程。
從宿主的脾、外周血、淋巴結(jié)或其他組織獲得的淋巴細(xì)胞可以作為單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞使用。最優(yōu)選是從脾獲得的B淋巴細(xì)胞。獲得能產(chǎn)生本發(fā)明的所需的單克隆抗體的雜交瘤，包括將該B淋巴細(xì)胞和無限增殖細(xì)胞系融合，其中無限增殖細(xì)胞系是在雜交細(xì)胞上傳遞長期組織培養(yǎng)穩(wěn)定性的細(xì)胞系。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，無限增殖細(xì)胞可以是淋巴樣干細(xì)胞或漿細(xì)胞瘤細(xì)胞例如骨髓瘤細(xì)胞，其自身是產(chǎn)生抗體的細(xì)胞但也是惡性的。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的鼠的雜交瘤的形成通過融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞來完成，其中脾細(xì)胞來自對通式III的化合物的蛋白共軛物免疫的小鼠。嵌合的和人化的單克隆的抗體的制備，可以包括從雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體表達(dá)基因，使用現(xiàn)在本領(lǐng)域公知的重組DNA方法來把小鼠可變區(qū)的亞序列結(jié)合到人恒定區(qū)，或者將人框架區(qū)和來自供體小鼠或大鼠免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR′s)組合。實(shí)現(xiàn)鼠單克隆抗體的人化的改進(jìn)方法，所述單克隆抗體提供了親合力增加的抗體，公開于國際專利申請WO 92/11018中?？梢灾苽鋬H包含初級抗體結(jié)構(gòu)的一部分的多肽片段，其中該片段具有一種或多種免疫球蛋白活性。制備這些多肽片段，包括用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行完整抗體的溶蛋白性裂解，或用定向誘變在包含抗體基因的表達(dá)載體中的所需區(qū)域插入終止密碼子，以產(chǎn)生Fab片段或(Fab′)2片段。單鏈抗體的制備，包括將VL和VH區(qū)與DNA連接子連接(見Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，855879-5883(1988)和Bird等人，Science，242423-426(1988))。
本發(fā)明的抗體對于通式II-C的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式是選擇性的，不會與環(huán)磷酰胺或其他環(huán)磷酰胺類似物有任何實(shí)質(zhì)的交叉反應(yīng)性。沒有實(shí)質(zhì)的交叉反應(yīng)性，是指相對于通式II-C的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式，本發(fā)明的抗體與環(huán)磷酰胺或其他的環(huán)磷酰胺類似物的交叉反應(yīng)性不大于10％，優(yōu)選小于5％。
免疫測定根據(jù)本發(fā)明，可以利用通式III的化合物和載體的共軛物，和免疫原產(chǎn)生的抗體作為試劑來確定在患者樣本中環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的存在，其中該免疫原是由免疫原蛋白和通式III的化合物共軛形成的。在所形成的試劑中，在用于形成抗體的免疫原中存在的R基應(yīng)當(dāng)與在免疫測定中用作試劑的通式III的化合物和載體的共軛物中的R基是相同的。
當(dāng)首先進(jìn)行免疫測定時，用某一方法來處理樣本，該方法可以以通式II-C的化合物的形式保護(hù)在樣本中存在的通式II-B的游離醛代謝產(chǎn)物中的游離醛。可以利用處理在通式II-B的環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物中存在的游離醛的任意方法來完成該處理過程。優(yōu)選的方法是現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法，例如如前所述。在該方法中，保護(hù)可能在樣本中存在的活性代謝產(chǎn)物的游離醛，以使該代謝產(chǎn)物穩(wěn)定。通過將通式II-B的游離代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成通式II-C的受保護(hù)的代謝產(chǎn)物，通式II-A的互變異構(gòu)體通過這兩種互變異構(gòu)體平衡存在的方法轉(zhuǎn)換成了它另外的互變異構(gòu)體，這樣通過該處理，通式II-A的互變異構(gòu)體經(jīng)通式II-B的互變異構(gòu)體轉(zhuǎn)換成了通式II-C的受保護(hù)的醛。
當(dāng)用上述方法處理了該樣本后，將該處理過的樣本用于免疫測定，以確定在樣本中可能存在的環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的存在和/或?qū)ζ涠俊Ｔ谌我獾某Ｒ?guī)免疫測定中，只要其中通式III的化合物和載體形成的試劑共軛物與樣本中的通式II-A的穩(wěn)定的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物競爭，以結(jié)合到根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗體的結(jié)合位點(diǎn)上，都可以用來確定患者樣本中環(huán)磷酰胺即通式II-A和/或II-B的存在和/或?qū)ζ涠?。?gòu)建該測定的方法，其中該測定用于在懷疑包含活性代謝產(chǎn)物的樣本中測定活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物，包括在含水培養(yǎng)基中合并a)樣本，其已經(jīng)過處理以保護(hù)在活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物中存在的游離醛基；b)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的通式II-C的化合物的抗體；和c)試劑，其是載體和通式II的化合物的共軛物。當(dāng)進(jìn)行該免疫測定時，重要的是在用于形成試劑和抗體的通式III的化合物中的醛保護(hù)基，與用于保護(hù)在樣本中可能存在的游離醛活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的醛保護(hù)基是相同的。
環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的量可以通過在已處理的樣本中使用通式II-C的化合物來確定，方法是測定抑制與已知量的共軛試劑結(jié)合的特異性抗體的量，加入樣本和抗體的混合物。抑制未知樣本的已知量的共軛試劑的結(jié)合的結(jié)果與在相同測定中獲得的結(jié)果相比較，其中該相同測定利用了包含已知量通式II-C的化合物形式的活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的已知標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)在未知樣本中確定活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的量時，該樣本經(jīng)處理將通式II-A和II-B的化合物轉(zhuǎn)換成了通式II-C的化合物，試劑是通式III的化合物形成的共軛物，其中樣本、試劑和抗體可以任意順序加入。
可以利用各種方法來測定結(jié)合到抗體上的所加入的由通式III的化合物形成的試劑共軛物的量。一種方法是，加入的試劑共軛物與抗體的結(jié)合導(dǎo)致了熒光團(tuán)共軛物的轉(zhuǎn)速降低。在液體混合物中熒光團(tuán)共軛物的轉(zhuǎn)速降低的量可以通過例如美國專利U.S.4,269,511和U.S.4,420,568公開的熒光極化技術(shù)來檢測。
另一方面，抗體可以涂敷或吸收到納米顆粒上以使得當(dāng)這些顆粒與加入的由通式III的化合物形成的試劑共軛物反應(yīng)時，這些納米顆粒就形成了聚集物。但是當(dāng)涂敷或吸附抗體的納米顆粒與樣本中的通式II-C的化合物反應(yīng)時，與這些納米顆粒結(jié)合的樣本中的通式II-C不會導(dǎo)致抗體納米顆粒的聚集。聚集體或凝集的量可以根據(jù)吸光度在試驗(yàn)混合物中測定。
另一方面，這些測定可以通過將抗體或試劑共軛物附著到固體載體例如微量滴定板上，或任意其他的常規(guī)固體載體包括固體顆粒上而進(jìn)行。將抗體和蛋白質(zhì)附著到固體顆粒上是本領(lǐng)域公知的技術(shù)?？梢允褂萌我獬Ｒ?guī)的方法來完成該附著。在許多情況中，為了有助于測定，標(biāo)記例如放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記必須置于抗體、共軛物或固體顆粒上，以測定結(jié)合或未結(jié)合到抗體上的通式III的化合物形成的試劑共軛物的量。其他適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括生色團(tuán)、熒光團(tuán)等等。
為了方便，本發(fā)明的測定組件可以以試劑盒提供，其是包含預(yù)定量試劑的包裝組合，該試劑用于測定通式II-C的化合物。這些試劑包括本發(fā)明的抗體，以及通式III的化合物形成的共軛物試劑。該試劑盒也可以包含其他的試劑、與游離醛基反應(yīng)在通式III的配體中生成相同醛保護(hù)基R的反應(yīng)物，其中通式III的化合物形成共軛物試劑和形成用于產(chǎn)生抗體試劑的免疫原。
除了這些必需的試劑外，可以包括添加劑例如輔助試劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑等等。各種試劑的相對量可以廣泛地不同，從而提供可以基本上最優(yōu)化測定靈敏度的試劑溶液的各種濃度。試劑可以在溶液中提供，或作為干粉末，通常是凍干的，包括賦形劑，當(dāng)賦形劑溶解時將會為試劑溶液提供適當(dāng)?shù)臐舛纫赃M(jìn)行測定。
實(shí)施例在實(shí)施例中，下列的縮寫是用于表示下列含義HCY4-羥基環(huán)磷酰胺HCY肟 醛磷酰胺的O-甲基肟DMF二甲基酰胺EA 乙醇DCM二氯甲烷DMAP 二甲基氨基吡啶
DMSO 二甲基亞砜POCl3磷酰氯NHSN-羥基琥珀酰亞胺EDC鹽酸1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺DCC二環(huán)己基碳二亞胺TLC薄層色譜法ANS8-苯胺基-1-萘磺酸i.p. 腹膜內(nèi)HRP馬辣根過氧化物酶TMB3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺TRIS 鹽酸三羥甲氨基甲烷BSA牛血清白蛋白KLH匙孔血藍(lán)蛋白BTG牛甲狀腺球蛋白PBS磷酸鹽緩沖鹽水di 去離子水在實(shí)施例中，臨時專利的方案1和方案2列出了所制備具體化合物，并按照實(shí)施例的序號引用。這些方案如下
方案1
方案2 實(shí)施例1HCY肟活性酯6的制備(方案1)室溫下，取N-丁基鋰(8.8mL，22.0mmol)滴加到在THF(100mL)中的3-丁基-1-醇(1.44g，20.0mmol)中，將溶液攪拌30分鐘，然后冷卻至0℃?？焖偌尤雭喠柞０仿萚1](5.44g，21.0mmol)的THF(50mL)溶液，繼續(xù)攪拌1小時。在30分鐘內(nèi)滴加N-(2-氨乙基)-2，2，2，-三氟乙酰胺的THF(80mL)溶液。加熱反應(yīng)混合物至室溫，繼續(xù)攪拌過夜。通過Celite過濾除去沉淀的鹽，濃縮濾液。用快速色譜法(乙酸乙酯/己烷；50，60，和65％)純化粗產(chǎn)品，得到呈無色油狀的[3](3.35g，40％)。
將[3](3.35g，8.08mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液冷卻至-78℃(干冰/丙酮浴)，從溶液中冒出臭氧氣泡，直至明顯呈藍(lán)色(約25分鐘)。用氮?dú)鈴娜芤褐邢慈ミ^量的臭氧，通過加入二甲基硫(713μL，9.70mmol)還原臭氧化物。加熱溶液至-30℃，加入三乙胺(1.64mL，20.2mmol)，然后加入鹽酸甲氧基胺(1.48g，17.78mmol)。加熱反應(yīng)混合物至室溫，繼續(xù)攪拌3小時。過濾混合物，用快速色譜法(乙酸乙酯/己烷，3∶2)純化濃縮的濾液和所得到的油，得到呈粘稠無色的油狀的[5]的TFA保護(hù)的前體(1.86g，52％)。在NH3中，該產(chǎn)品(603mg，1.36mmol)的MeOH(30mL，～10M)和含水NH3(30mL，30％)溶液攪拌過夜。濃縮該混合物。所得到胺[5]與甲苯共沸，以除去微量的水。獲得黃色油狀的粗制的[5]，不經(jīng)純化用于下一步驟。
在0℃下，將在THF(10mL)中的上面粗制的[5]和三乙胺(0.378mL，2.72mmol)滴加到[7](0.494g，1.77mmol)的THF(20mL)溶液中。加熱反應(yīng)至室溫，攪拌2小時。過濾混合物，用干醚洗滌，濃縮濾液。用乙酸乙酯通過硅膠的小塞過濾來進(jìn)一步純化粗產(chǎn)品，得到無色膠狀的[6](0.528g，69％)。
實(shí)施例2HCY肟異硫氰酸鹽8的制備(方案2)在0℃下，將在THF(10mL)中的粗制的[5](由603mg(1.36mmol)的TFA保護(hù)的前體制備)和三乙胺(0.378mL，2.72mmol)滴加到4-異硫氰酸苯甲酰氯(0.404g，2.04mmol)的THF(20mL)溶液中。加熱反應(yīng)至室溫，攪拌2小時。過濾混合物，用干醚洗滌，濃縮濾液。用快速色譜法(乙酸乙酯/己烷9∶1)純化粗產(chǎn)品，得到黃色膠狀的[8](0.528g，76％)。
實(shí)施例3HCY肟的制備根據(jù)文獻(xiàn)方法(Borch，R.F.；Valente，R.R.J.Med.Chem.1991，34(10)，3052-3058)制備HCY肟。以44％的收率分離產(chǎn)品。
實(shí)施例4a用活化的半抗原6制備BTG免疫原向6.06mL BTG(32.9mg/mL)的50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中，滴加入1.0mL的實(shí)施例1制備的化合物[6](33mg/mL在DMSO中)，再檢驗(yàn)pH為7.5?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?8小時。然后通過透析(10％DMSO-磷酸緩沖液用作第一次透析，純凈的緩沖液用于隨后的變化)純化免疫原共軛物，根據(jù)先前所述的方法(Wu等人.，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)表征其特征。
實(shí)施例4b用活化的半抗原6制備KLH免疫原向6.5mL KLH(9mg/mL)的50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中，滴加入0.29mL的實(shí)施例1制備的化合物[6](33mg/mL在DMSO中)，再檢驗(yàn)pH為7.5。混合物在室溫下攪拌18小時。然后通過透析(10％DMSO-磷酸緩沖液用作第一次透析，純凈的緩沖液用于隨后的變化)純化免疫原共軛物，根據(jù)先前所述的方法(Wu等人.，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)表征其特征。
實(shí)施例5用活化的半抗原8制備BSA共軛物(1∶1的比例)向20mL BSA(50mg/mL)的50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中，滴加入如實(shí)施例2制備的活化異硫氰酸鹽[8](0.258mL 33mg/mL的DMSO溶液)。混合物在室溫下攪拌過夜(18小時)以產(chǎn)生用于篩選目的的1∶1的板共軛物。然后通過透析(10％DMSO-磷酸緩沖液用作第一次透析，純凈的緩沖液用于隨后的變化)純化該共軛物，根據(jù)先前所述的方法(Wu等人.，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)表征其特征。
實(shí)施例6HCY肟抗體的制備用弗氏完全佐劑乳化的實(shí)施例4a和4b制備的HCY肟-BTG或HCY肟-KLH免疫原以100μg/小鼠i.p.給10只雌性BALB/c小鼠免疫。在初始注射后4周，給小鼠用弗氏完全佐劑乳化的相同免疫原以100μg/小鼠追加注射一次。在追加后10天，通過眶出血獲得每只小鼠的試驗(yàn)出血。這些試驗(yàn)出血的抗血清包含實(shí)施例8a和9評價的HCY肟抗體。對于融合前4天開始的單克隆抗體，用在PBS中的100μgHCY肟-BTG或HCY肟-KLH(根據(jù)主要注射)連續(xù)三天給小鼠i.p.注射。從所選的小鼠中分離脾細(xì)胞，根據(jù)Coligan，J.E.等人，eds.，CurrentProtocols in Immunology，2.5.1-2.5.8，(1992)，Wiley & Sons，NY的方法與含50％聚乙二醇1500的2×107SP2/O細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞涂敷到10個96孔板上，其中96孔板用20％FetalClone I，2％L-谷氨酸(100mM)和2％50X HAT補(bǔ)充。2周后，通過ELISA(實(shí)施例8b)測定雜交瘤上清液中抗-HCY肟抗體的存在。展開陽性孔，通過相同方法再篩選。通過競爭性ELISA(實(shí)施例8a和9)驗(yàn)證陽性克隆體與HCY肟的結(jié)合。根據(jù)Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols inImmunology，2.5.8-2.5.17，(1992)，Wiley & Sons，NY所述的方法通過有限稀釋將ELISA陽性的克隆體亞克隆一次或兩次。
實(shí)施例7用HCY肟衍生物6-BSA共軛物進(jìn)行微量滴定板致敏法在針對蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行優(yōu)化和每個板包含96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8免疫模塊)中進(jìn)行測定HCY肟濃度的ELISA法。用HCY肟-BSA共軛物(如實(shí)施例5制備)涂敷每個孔，包括加入300μL 1.25μg/mL(表1)或5μg/mL(表2)HCY肟-BSA共軛物的0.05M碳酸氫鈉液pH＝9.6，在室溫下培養(yǎng)3小時。用0.05M碳酸氫鈉液pH＝9.6洗滌孔，然后在室溫下用400μL 5％蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液阻斷30分鐘。在除去涂層后的溶液后，板在37℃干燥過夜。
實(shí)施例8a抗體篩選法-滴定篩選HCY肟抗體(在實(shí)施例6中制備)的ELISA法是用微量滴定板進(jìn)行的，該微量滴定板是用實(shí)施例5所述的HCY肟-BSA致敏的。該抗體篩選測定通過如下方法進(jìn)行在包含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸鹽緩沖鹽水中將包含HCY肟抗體的抗血清稀釋成1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。為了評價單克隆抗體，將通過實(shí)施例8b的方法發(fā)現(xiàn)的對于存在的抗體呈陽性的實(shí)施例6的雜交瘤上清液，稀釋成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16等等。向HCY肟-BSA致敏孔(在實(shí)施例7中制備)的每個孔中，加入100μL的稀釋抗體，振蕩下在室溫下培養(yǎng)10分鐘。在培養(yǎng)期間，抗體結(jié)合到了在孔中的HCY肟-共軛物上。用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％吐溫-80和0.001％硫柳汞，pH 7.8將該板的孔洗滌3次以除去任何未結(jié)合的抗體。為了檢測在孔中結(jié)合到HCY肟-BSA共軛物上的HCY肟抗體的量，在包含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中將100μL山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物(Jackson Immunoresearch)稀釋成1/2400，該共軛物能與鼠免疫球蛋白特異性結(jié)合，當(dāng)與底物培養(yǎng)時會產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，向每個孔中加入該共軛物。室溫下振蕩培養(yǎng)10分鐘后，在此期間山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物結(jié)合到孔中的HCY肟抗體上，將板再洗滌3次以除去未結(jié)合的山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物。為了在孔中產(chǎn)生可測定的顏色，在洗滌后，加入100μL TMB(TMB液體底物，Sigma)，以在室溫下震蕩培養(yǎng)的10分鐘期間產(chǎn)生顏色，其中TMB是HRP的底物。在培養(yǎng)產(chǎn)生顏色后，向每個孔中加入50μL停止溶液(在去離子水中的1.5％氟化鈉)以停止顏色的產(chǎn)生，振蕩10秒后在650nm處(Molecular Devices Plate Reader)確定吸光度。在一個孔中抗體的量與所測定的吸光度是成比例的，可以用導(dǎo)致1.5的吸光度的稀釋(滴定度)來表示。確定滴定度，包括用圖表記錄所測定抗體的抗體稀釋(x-軸)vs.650nm的吸光度(y-軸)并推斷吸光度1.5時的滴定度。滴定度確定了用于實(shí)施例9所述的不直接競爭性微量板測定的抗體的濃度(稀釋)。
實(shí)施例8b抗體篩選法-單克隆篩選篩選HCY肟單克隆抗體(在實(shí)施例6中制備)的ELISA法是用微量滴定板進(jìn)行的，該微量滴定板是用實(shí)施例5所述的HCY肟-BSA致敏的。向HCY肟-BSA致敏孔(在實(shí)施例7中制備)的每個孔中，加入包含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的50μL磷酸鹽緩沖鹽水，然后加入50μL單克隆培養(yǎng)上清液，振蕩下在室溫下培養(yǎng)10分鐘。在培養(yǎng)期間，抗體結(jié)合到了在孔中的HCY肟-共軛物上。用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％吐溫-80和0.001％硫柳汞，pH 7.8將該板的孔洗滌3次以除去未結(jié)合的抗體。為了檢測在孔中結(jié)合到HCY肟-BSA共軛物上的HCY肟抗體的量，在包含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中將100μL山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物(JacksonImmunoresearch)稀釋成1/2400，該共軛物能與鼠免疫球蛋白特異性結(jié)合，當(dāng)與底物培養(yǎng)時會產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，向每個孔中加入該共軛物。室溫下振蕩培養(yǎng)10分鐘后，在此期間山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物結(jié)合到孔中的HCY肟抗體上，將板再洗滌3次以除去未結(jié)合的山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物。為了在孔中產(chǎn)生可測定的顏色，在洗滌后，加入100μL TMB(TMB液體底物，Sigma)，以在室溫下震蕩培養(yǎng)的10分鐘期間產(chǎn)生顏色，其中TMB是HRP的底物。在產(chǎn)生顏色的培養(yǎng)后，向每個孔中加入50μL停止溶液(在去離子水中的1.5％氟化鈉)以停止顏色的產(chǎn)生，振蕩10秒后在650nm處(Molecular Devices PlateReader)確定吸光度。在一個孔中抗體的量與所測定的吸光度是成比例的。指定吸光度大于2倍背景的樣本為陽性。
實(shí)施例9確定IC50和抗體與HCY肟衍生物6共軛物的交叉反應(yīng)的間接競爭性微量滴定板免疫測定法測定HCY肟濃度的ELISA法是用微量滴定板進(jìn)行的，該微量滴定板是用實(shí)施例5所述的HCY肟-BSA致敏的。HCY肟、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖和氮芥在PBS中稀釋10倍，濃度范圍為0.01到10,000ng/mL或100,000ng/mL。該測定通過如下方法進(jìn)行用50μl稀釋至實(shí)施例8a中確定的滴定度的抗體(在實(shí)施例6中用實(shí)施例4a和4b的免疫原性)培養(yǎng)待測的50μl分析物。在10分鐘的培養(yǎng)(R.T.，并振蕩)期間，抗體競爭地與孔中的HCY肟共軛物和溶液中的分析物結(jié)合。培養(yǎng)后，用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％吐溫-80和0.001％硫柳汞，pH 7.8將該板的孔洗滌3次以除去未結(jié)合的所有物質(zhì)。為了檢測在孔中結(jié)合到HCY肟-BSA共軛物上的HCY肟抗體的量，在包含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中將100μL山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物(Jackson Immunoresearch)稀釋成1/2400，該共軛物能與鼠免疫球蛋白特異性結(jié)合，當(dāng)與底物培養(yǎng)時會產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，向每個孔中加入該共軛物。室溫下振蕩培養(yǎng)10分鐘培養(yǎng)后，在此期間山羊抗-小鼠抗體-HRP酶共軛物結(jié)合到孔中的HCY肟抗體上，將板再洗滌3次以除去未結(jié)合的次要共軛物。為了在孔中產(chǎn)生可測定的顏色，在洗滌后，加入100μL TMB(TMB液體底物，Sigma)，以在室溫下震蕩培養(yǎng)的10分鐘期間產(chǎn)生顏色，其中TMB是HRP的底物。在產(chǎn)生顏色的培養(yǎng)后，向每個孔中加入50μL停止溶液(在去離子水中的1.5％氟化鈉)以停止顏色的產(chǎn)生，振蕩10秒后在650nm處(Molecular Devices Plate Reader)確定吸光度。在一個孔中抗體的量與所測定的吸光度是成比例的，而與樣本中HCY肟的量成反比例。包含分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的吸光度相比較，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。給定分析物的IC50定義為抑制50％不包含分析物的孔的吸光度所需的分析物的濃度。給定分析物的交叉反應(yīng)性用HCY肟的IC50與環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖和氮芥的IC50的比例來評價，該比例用百分?jǐn)?shù)來表達(dá)。當(dāng)用實(shí)施例6中制備的抗體和實(shí)施例4a和b的免疫原測定時，環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖和氮芥相對于HCY肟的交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)小于1％。結(jié)果在下表1和2中。
表1使用HCY肟-BTG(實(shí)施例4a)的抗體和板涂敷HCY肟-BSA共軛物(實(shí)施例5)的競爭性免疫測定的交叉反應(yīng)性
表2使用HCY肟-KLH(實(shí)施例4b)的單克隆抗體和板涂敷HCY肟-BSA共軛物(實(shí)施例5)的競爭性免疫測定的交叉反應(yīng)性
化合物苯丁酸氮芥、美法侖和氮芥，與環(huán)磷酰胺類似，都是化學(xué)治療藥物，在它們的結(jié)構(gòu)中包含芥基團(tuán)，即包含用氯乙基取代基二取代的胺的基團(tuán)。從該表中可以看出，本發(fā)明的抗體基本上選擇性地與環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定形式反應(yīng)，基本上不與包含用氯乙基取代基二取代的胺的環(huán)磷酰胺和其他環(huán)磷酰胺類似物交叉反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.用于在樣本中檢測環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物存在的免疫測定，該代謝產(chǎn)物可以以包含下列通式的化合物的游離醛的形式存在 該測定包括處理所述樣本，以保護(hù)下列通式的受保護(hù)醛的形式的所述化合物中的游離醛 其中＝R形成醛保護(hù)基，提供所述處理的樣本、抗體以及下列通式的配體和載體的共軛物的混合液，其中抗體基本上選擇性地與所述受保護(hù)醛反應(yīng)并且基本上不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)，通式是 其中R同上；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；n是1到6的整數(shù)；和p是0到1的整數(shù)，導(dǎo)致在所述混合物中，受保護(hù)的醛存在于與所述抗體結(jié)合的所述處理的樣本和所述共軛物中，然后測定所述混合物中所述共軛物的量，其中所述共軛物結(jié)合到所述抗體上，其中可以確定在樣本中存在活性環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的免疫測定，其中樣本是人樣本。
3.權(quán)利要求2的免疫測定，其中抗體是由免疫原產(chǎn)生的，該免疫原包含與所述配體連接的免疫原聚合物，其中在形成免疫原和共軛物的配體中和在受保護(hù)的醛中R是相同的。
4.權(quán)利要求3的免疫測定，其中該抗體附著到固體載體上。
5.權(quán)利要求4的免疫測定，其中固體載體是微量滴定板。
6.權(quán)利要求5的免疫測定，其中固體載體是納米顆粒。
7.權(quán)利要求3的免疫測定，其中保護(hù)基是腙，其中＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-NR7R9其中R7是低級烷基、苯基或取代的苯基；和R9是低級烷基或氫。
8.權(quán)利要求7的免疫測定，其中R7是2，4-二硝基苯基。
9.權(quán)利要求3的免疫測定，其中保護(hù)基是肟，以使得＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-OR8其中R8是低級烷基。
10.一種免疫測定，用于在樣本中檢測下列通式的受保護(hù)的環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的存在 其中＝R形成受保護(hù)的醛基，包括提供所述樣本、抗體以及下列通式的配體和載體的共軛物的混合液，其中抗體基本上選擇性地與所述受保護(hù)環(huán)磷酰胺代謝物反應(yīng)并且基本上不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)，通式是 其中R同上；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；n是1到6的整數(shù)；和p是0到1的整數(shù)，導(dǎo)致在所述混合物中，在所述樣本中的受保護(hù)的環(huán)磷酰胺代謝物和所述共軛物與所述抗體結(jié)合，此后測定在所述混合物中結(jié)合到所述抗體的所述共軛物的量，由此確定受保護(hù)的環(huán)磷酰胺代謝物的存在。
11.權(quán)利要求9的免疫測定，其中樣本取自人。
12.權(quán)利要求11的免疫測定，其中抗體是由免疫原產(chǎn)生的，該免疫原包含與所述配體連接的免疫原聚合物，其中在形成免疫原和共軛物的配體中和在受保護(hù)的醛中R是相同的。
13.權(quán)利要求12的免疫測定，其中該抗體附著到固體載體上。
14.權(quán)利要求13的免疫測定，其中固體載體是微量滴定板。
15.權(quán)利要求14的免疫測定，其中固體載體是納米顆粒。
16.權(quán)利要求12的免疫測定，其中保護(hù)基是腙，其中＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-NR9R7其中R7是低級烷基、苯基或取代的苯基；和R9是氫或低級烷基。
17.權(quán)利要求16的免疫測定，其中R7是2，4-二硝基苯基。
18.權(quán)利要求12的免疫測定，其中保護(hù)基是肟，以使得＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-OR8其中R8是低級烷基。
19.一種抗體，其基本上選擇性地結(jié)合到下列通式的受保護(hù)醛環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物上 而基本上不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)。
20.權(quán)利要求19的抗體，其中所述抗體衍生自免疫原多胺聚合物和下列通式的配體的免疫原 其中R同上；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；n是1到6的整數(shù)；和p是0到1的整數(shù)。
21.權(quán)利要求20的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
22.權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體來自小鼠、兔、山羊、綿羊或大鼠。
23.權(quán)利要求19的抗體，其中所述保護(hù)基是腙，其中＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-NR9R7其中R7是低級烷基、苯基或取代的苯基；和R9是氫或低級烷基。
24.權(quán)利要求23的抗體，其中R7是2，4-二硝基苯基。
25.權(quán)利要求19的抗體，其中所述保護(hù)基是肟以使得＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-OR8其中R8是低級烷基。
26.下列通式的化合物 其中＝R形成醛保護(hù)基；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；p是0到1的整數(shù)；和n是1到6的整數(shù)。
27.權(quán)利要求26的化合物，其中p是0。
28.權(quán)利要求27的化合物，其中X是 -N＝C＝R4， 其中R3是氫或與其連接的氧原子一起形成反應(yīng)性酯，和R4是氧或硫。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中X是 并且R3是氫。
30.權(quán)利要求28的化合物，其中X是 并且R3形成反應(yīng)性酯。
31.權(quán)利要求30的化合物，其中所形成的酯是低級烷基酯、酰亞胺酯或酰胺酯。
32.權(quán)利要求26的化合物，其中p是1。
33.權(quán)利要求32的化合物，其中Y是包含1到10個碳原子的烷撐 其中o是0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
34.權(quán)利要求33的化合物，其中保護(hù)基是腙，由此＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-NR9R7其中R7是低級烷基、苯基或取代的苯基；和R9是氫或低級烷基。
35.權(quán)利要求34的化合物，其中R7是2，4-二硝基苯基。
36.權(quán)利要求33的化合物，其中保護(hù)基是肟以使得＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-OR8其中R8是低級烷基。
37.載體和下列通式化合物的共軛物，其中通式是 其中＝R形成醛保護(hù)基；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；p是0到1的整數(shù)；和n是1到6的整數(shù)。
38.權(quán)利要求37的共軛物，其中p是0。
39.權(quán)利要求38的共軛物，其中X是 -N＝C＝R4， 其中R3是氫或與其附著的氧原子一起形成反應(yīng)性酯，和R4是氧或硫。
40.權(quán)利要求37的共軛物，其中p是1并且Y是包含1到10個碳原子的烷撐 其中o是0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
41.權(quán)利要求40的共軛物，其中該載體包含一個或多個通過 或 連接的氨基，其中R4是氧或硫。
42.權(quán)利要求37的共軛物，其中保護(hù)基是腙，由此＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-NR9R7其中R7是低級烷基、苯基或取代的苯基；和R9是氫或低級烷基。
43.權(quán)利要求42的共軛物，其中R7是2，4-二硝基苯基。
44.權(quán)利要求37的共軛物，其中保護(hù)基是肟以使得＝R形成下列通式的基團(tuán)＝N-OR8其中R8是低級烷基。
45.權(quán)利要求37的共軛物，其中該載體是免疫原聚合物。
46.一種用于在患者樣本中確定活性環(huán)磷酰胺存在的試劑盒，其包含在單獨(dú)容器中的試劑，一種試劑是載體和下列通式的配體的共軛物 其中＝R形成醛保護(hù)基；Y是有機(jī)間隔基團(tuán)；X是能與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團(tuán)；p是0到1的整數(shù)；和n是1到6的整數(shù)并且，第二容器包含抗體，該抗體基本上選擇性地與所述配體反應(yīng)并且基本上不與環(huán)磷酰胺交叉反應(yīng)。
47.權(quán)利要求46的試劑盒，其中所述共軛物以預(yù)定量存在于所述第一容器中。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述試劑盒用于確定在所述樣本中環(huán)磷酰胺的量。
49.權(quán)利要求46的試劑盒，其中所述抗體是由與下列通式的化合物連接的免疫原多胺多肽的免疫原產(chǎn)生的 其中R，n，p，X和Y同上，在所述免疫原中的R和在共軛物中的R相同。
50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述試劑盒包括包含反應(yīng)物的其他試劑，其中該反應(yīng)物與游離醛反應(yīng)形成醛保護(hù)基，該保護(hù)基與形成共軛物試劑的配體是相同的保護(hù)基R。
全文摘要
新的環(huán)磷酰胺的受保護(hù)醛基活性代謝產(chǎn)物的共軛物，包括試劑和其免疫原，和這些免疫原產(chǎn)生的單克隆抗體，所述試劑和免疫原在監(jiān)測患者的環(huán)磷酰胺的活性代謝產(chǎn)物的免疫測定中是有用的，其中患者用環(huán)磷酰胺治療。
文檔編號C07K1/13GK101052877SQ200580025508
公開日2007年10月10日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月29日
發(fā)明者S·薩拉蒙, J·B·庫爾特尼, D·斯托克 申請人:薩拉達(dá)克斯生物醫(yī)療公司